Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления



Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
Определение снижения уровня мрнк генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления

 


Владельцы патента RU 2403575:

Федеральное государственное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии имени Н.Н. Петрова по высокотехнологичной медицинской помощи" (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к методам диагностики в онкологии. Предложено в качестве маркеров для диагностики плоскоклеточнго рака легкого (ПКРЛ) и аденокарциномы легкого (АК) использовать уровень мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2. Сниженный уровень мРНК данных генов в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легкого. Предложенное изобретение позволяет с высокой достоверностью диагностировать немелкоклеточный рак легкого типа АК и ПКРЛ, в том числе на самой ранней клинической стадии опухолевого заболевания. 3 табл., 1 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и молекулярной биологии и может быть использовано для ранней диагностики.

Уровень техники

Рак легкого (РЛ) остается одной из основных причин смерти онкологических больных в мире. Смертность от этого заболевания превышает смертность от рака молочной железы, толстой кишки и простаты, вместе взятых [Jemal A., Siegel R., Ward Е., Murray Т., Xu J., Smigal С., Thun M.J. 2006. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 56, 6-30]. В России показатели смертности от рака легкого у мужчин 68,2 случая на 100 тысяч населения, у женщин - 6,8 случая [Заридзе Д.Г. 2004. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований, стр.29-85 - в кн. Канцерогенез / под ред. Д.Г.Заридзе. - М.: Медицина]. Различают два основных вида РЛ: мелкоклеточный (MPЛ) и немелкоклеточный (НМРЛ), составляющих 15-20 и 75-80% соответственно. К НМРЛ относят плоскоклеточный рак легкого (ПКРЛ), аденокарциному легкого (АКЛ) и крупноклеточный рак. Среди разных форм РЛ по частоте встречаемости ПКРЛ занимает первое место, АКЛ - второе.

Диагноз в половине случаев РЛ устанавливают на далеко зашедшей стадии опухолевого процесса, что делает малоэффективным радикальное излечение. Современные методы лечения повышают среднюю пятилетнюю продолжительность жизни больных РЛ не более чем на 15%. Этот показатель может быть существенно улучшен с помощью разработки методов ранней диагностики.

Основными методами диагностики РЛ служат инструментальные - рентгеновские и эндоскопические. Используют также анализ мокроты на атипичные клетки, биопсию тканей легких, компьютерную томографию, флуоресцентную фиброскопию. Иммунологические методы диагностики находят пока ограниченное клиническое применение. Практическую значимость имеет определение опухолевых маркеров: СЕА - раково-эмбриональный антиген - онкомаркер рака прямой кишки, но может использоваться в оценке РЛ; NSE - нейрон-специфическая энолаза - в ряде случаев используют в оценке состояния пациентов с РЛ; тканевой полипептидный антиген (TPА) - фрагмент цитокератина, более специфичный маркер РЛ. Эти маркеры применяют для контроля лечения, выявления рецидивов, но не для диагностики РЛ на ранней стадии. Для диагностики НМРЛ широко используют маркеры SCCA или SCC - антиген плоскоклеточной карциномы (SCC - squamous cell carcinoma) и фрагмент цитокератина 19 (CYFRA 21.1 - cytokeratin fragment) [Pastor A., Menendez R., Cremades M.J., Pastor V., Llopis R., Aznar J. 1997. Diagnostic value of SCC, CEA and CYFRA 21.1 in lung cancer: a Bayesian analysis. Eur Respir J. 10, 603-609; Buccheri G., Torchio P., Ferrigno D. 2003. Clinical Equivalence of Two Cytokeratin Markers in Non-small Cell Lung Cancer. A Study of Tissue Polypeptide Antigen and Cytokeratin 19 Fragments. Chest. 124, 622-632], которые, однако, малопригодны для ранней диагностики РЛ.

Диагностическими признаками злокачественной трансформации клеток могут служить также изменения генома в опухолевых клетках - точечные мутации в кодирующих и регуляторных участках генов, микросателлитная нестабильность, аллельные потери, изменение уровня транскрипции генов, метилирование промоторных участков генов и др., а также изменения функциональной активности белков, кодируемых генами. В отличие от белковых молекулярно-генетические маркеры обладают значительно большей чувствительностью. В числе перспективных потенциальных маркерных генов, вовлеченных в канцерогенез разных форм РЛ, рассматривают новые гены, потенциальные супрессоры опухолевого роста (TSG, tumor suppressor genes) на коротком плече хромосомы 3 человека [Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. 2002. Tumor Suppressor Genes on Chromosome 3p Involved in the Pathogenesis of Lung and Other Cancers. Oncogene. 21, 6915-6935; Киселев Л.Л., Сенченко B.H., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. 2005. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина. 3, 17-28]. Цитогенетический район 3р21 по сравнению с другими обогащен белок-кодирующими генами [Bertone Р., Stole V., Royce Т.Е., Rozowsky J.S., Urban A.E., Zhu X., Rinn J.L., Tongprasit W., Samanta M., Weissman S., Gerstein M., Snyder M., 2004. Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays. Science. 24, 2242-46]. С целью идентификации новых TSG проведено детальное картирование геми- и гомозиготных делеций на 3р при мелкоклеточном и немелкоклеточном РЛ и других карциномах человека с использованием различных методов [Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. 2004. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей. Молекулярная биология. 38, 145-154]. Полученные данные подтвердили существенную роль генов из района 3р21 в канцерогенезе, как и предполагали ранее [Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. 2002. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathagenesis of lung and other cancers. Oncogene. 21, 6915-35]. В критичных областях LUCA (32р21.3) и АР20 (3р22-р21.33), для которых характерна высокая частота делеций в вышеперечисленных опухолях, картированы участки гомозиготных делеций, содержащие около 60 генов [Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. 2005. Chromosome 3 abnormalities in lung cancer. In: Lung Cancer: Principles and Practice. Third Edition. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. 118-134]. В число этих генов входят гены ITGA9, HYAL1 и HYAL2. Ген ITGA9 (NM_002207, другие обозначения: ALPHA-9, ALPHA-RLC) из области АР20 протяженностью 371 т.п.н., содержащий 28 экзонов и кодирующий транскрипты длиной 9,5 и 4,1 т.п.н., которые экспрессируются во всех нормальных тканях, самый высокий уровень транскрипции гена обнаружен в эмбриональных тканях легкого. Белковый продукт гена ITGA9 обнаружен в скелетных и гладких мышцах, клетках печени, плоскоклеточном эпителии, а также эпителиальных клетках воздухоносных путей человека [Palmer Е.L., Ruegg, С., Ferrando R., Pytela R., Sheppard D. 1993. Sequence and tissue distribution of the integrin alpha-9 subunit, a novel partner of beta-1 that is widely distributed in epithelia and muscle. J. Cell Biol. 123: 1289-1297; Hibi K., Yamakawa K., Ueda R., Horio Y., Murata Y., Tamari M., Uchida K., Takahashi T., Nakamura Y., Takahashi T. 1994. Abberant upregulation of a novel integrin alpha subunit gene at 3p21.3 in small cell lung cancer. Oncogene. 9: 611-619]. Продуктом гена ITGA9 является мембранный белок, состоящий из 1035 а.о., относящийся к семейству интегринов - поверхностных гликопротеинов клетки, обеспечивающих адгезию между клетками, а также клетками и матриксом [Киселев Л.Л., Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. 2005. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина. 3, 17-28].

Гены HYAL1 (NM_007312, другие обозначения: LUCA1) и HYAL2 (NM_003773 другие обозначения: LUCA2) из области LUCA. Ген HYAL1 протяженностью 3,5 т.п.н., содержащий 6 экзонов, кодирует 8 изоформ мРНК. Ген HYAL2 протяженностью 4,9 т.п.н., содержащий 5 экзонов, кодирует 2 изоформы мРНК. Для генов не характерная узкая тканеспецифичность, они образуют мРНК и белок практически во всех тканях человека, исключая мозг [Lerman M.I. and Minna J.D. 2000. The International Lung Cancer Chromosome 3p21.3 Tumor Suppressor Gene Consortium. The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome 3p21.3: identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor genes. Cancer Res. 60: 6116-6133]. Гены HYAL1 и HYAL2 кодируют белки, относящиеся к семейству эндоглюкозаимнидаз. Эти ферменты расщепляют гиалуроновую кислоту (ГК) - важный компонент внеклеточного матрикса, представляющий собой полисахарид, повторяющейся единицей которого является N-ацетил-D-глюкозамин. ГК выполняет такие важные функции в клетке, как поддержание водного баланса в тканях, а также участие в регуляции пролиферации и миграции клеток посредством передачи сигналов между клетками через взаимодействие с их поверхностными рецепторами CD44 и RHAMM [Toole BP. 2004. Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue. Nat. Rev. Cancer. 4, 528-539]. В опухолях ГК участвует в их прорастании и метастазировании. Постоянный уровень ГК в тканях поддерживается ферментами гиалуронсинтазами и гиалуронидазами. Расщепление ГК происходит в два этапа: 1) расщепление ГК на фрагменты размером до 20 кДа; 2) полное расщепление ГК. Первый этап катализирует белок HYAL2, а второй - HYAL1 [Hesson L.B., Cooper W.N., Latif F. 2007. Evaluation of the 3p21.3 tumour-suppressor gene cluster. Oncogene. 15: 7283-7301]. Потеря гиалуронидазной активности приводит к накоплению ГК, что возможно является одним из этапов на пути малигнизации и инвазии клеток [Csoka А.В., Frost G.I., Stern R. 2001. The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. Matrix Biol. 20: 499-508]. Высокое содержание ГК в опухоли часто коррелирует с ее агрессивностью и плохим прогнозом [Zhang L., Underhill С.В., Chen L. 1995. Hyaluronan on the surface of tumor cells is correlated with metastatic behavior. Cancer Res. 55, 428-433; Bertrand P., Courel M.N., Maingonnat C., Jardin F., Tilly H., Bastard C. 2005. Expression of HYAL2 mRNA, hyaluronan and hyaluronidase in B-cell non-Hodgkin lymphoma: relationship with tumor aggressiveness. Int J Cancer. 10: 207-212].

Для выявления супрессорной активности белковых продуктов TSG, т.е. способности к частичному или полному подавлению роста опухолевых клеток, существует несколько методов [Li J., Protopopov A.I., Gizatullin R.Z., Kiss С., Kashuba V.I., Winberg G., Klein G., Zabarovsky E.R. 1999. Identification of new tumor suppressor genes based on in vivo functional inactivation of a candidate gene. FEBS Lett. 3, 289-294; Imreh S., Klein G., Zabarovsky E. 2003. Search for unknown tumor antagonizing genes. Genes Chromosomes & Cancer. 38, 307-321; Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. 2004. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей. Молекулярная биология. 38, 145-154; Ito L, Ji L., Tanaka F., Saito Y., Gopalan B., Branch C.D., Xu K., Atkinson E.N., Bekele B.N., Stephens L.C., Minna J.D., Roth J.A., Ramesh R. 2004. Liposomal vector mediated delivery of the 3p FUS1 gene demonstrates potent antitumor activity against human lung cancer in vivo. Cancer Gene Therapy. 11, 733-739]. Сравнительно новый функциональный тест GIT (Gene Inactivation Test) основан на инактивации TSG в опухолевых клетках in vivo и in vitro. Инактивация TSG осуществляется с помощью эукариотических векторов с регулируемой экспрессией, при этом тестируемые гены подвергаются мутациям или делециям в экспериментальных опухолях у иммуннодефицитных SCID-мышей или в опухолевых клеточных линиях. Потеря способности к подавлению роста опухолевых клеток мутантными трансгенами может служить свидетельством принадлежности гена к TSG. «Супрессорная» активность белковых продуктов генов HYAL1 и HYAL2 показана in vivo, но не in vitro по отношению к клеткам мелкоклеточного рака легкого [Zabarovsky et al., 2008 in press]. Относительно супрессорной активности белка ITGA9 литературные данные отсутствуют. Данные по количественной оценке уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 при РЛ и в том числе ПКРЛ отсутствуют. Таким образом, до последнего времени детальное сравнение уровня мРНК этих генов в опухолях и нормальных тканях легкого не проводилось. Согласно данным литературы для нескольких генов показано снижение уровня РНК при НМРЛ. В работе [Terauchi К., Shimada J., Uekawa N., Yaoi Т., Maruyama M., Fushiki S. 2006. Cancer-associated loss of TARSH gene expression in human primary lung cancer. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 132, 28-34] выявлено уменьшение транскрипции гена TARSH, одного из генов, связанных со старением клеток, в опухолевых клеточных линиях и образцах НМРЛ по сравнению с нормой. На основе полученных результатов авторы выдвинули предположение о возможном использовании этого гена в качестве биомаркера для диагностики НМРЛ. Однако в данной работе проведен анализ только 8 образцов ПКРЛ - наиболее распространенной формы РЛ, и необходимы дальнейшие исследования.

Изобретение, предлагающее способ диагностики различных карцином человека, в том числе РЛ, а также лимфом и лейкемий, основано на выявлении цитогенетических изменений и аллельных потерь для 10 генов-супрессоров опухолевого роста, расположенных в критичной области LUCA хромосомы 3, в том числе и HYAL1 и HYAL2 [Ji L., Minna J., Roth J., Lerman M. Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors. 2002. Международные патенты № WO 0204511, № US 2004016006].

Изобретение, относящееся к способу диагностики рака молочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, основано на обнаружении повышения уровня мРНК множественных сплайсированных форм гена поверхностного гликопротеина CD44 в опухолевых тканях, соответствующих метастазах и биоптатах по сравнению с нормальными тканями, предполагает проведение ПЦР с радиоактивно мечеными праймерами [Tarin D., Matsumura Y. Diagnostic method. 1994. Международный патент № WO 94/02633].

Изобретение, предлагающее способ диагностики лимфом, основано на сравнении относительного уровня мРНК генов легких λ- и κ-иммуноглобулинов, вовлеченных в развитие лимфом, методом ПЦР-РВ [Stalberg A., Kubista М. Method to measure gene expression ratio of key genes. 2002. Патент №20004100112 РФ, международный патент № WO 02/099135 А1]. Данный аналог наиболее близок по технической сущности заявленному изобретению и принят за прототип.

В указанных выше, а также других изобретениях не использовали снижение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, в том числе с использованием метода ПЦР-РВ, для диагностики РЛ.

Для оценки уровня мРНК генов используют различные методы. Современный высокочувствительный метод ПЦР-РВ отличается от традиционных качественных и полуколичественных методов тем, что позволяет быстро и точно определить количество копий ДНК или кДНК в широком диапазоне концентраций [Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 4, 357-362]. Метод широко используют в мире, как для научных, так и клинических целей, благодаря высокой производительности, обычно проводят 96 реакций в одном опыте и в последних моделях приборов - 384 реакции. В отличие от обычной ПЦР, когда количество продуктов определяют на конечной стадии реакции, ПЦР-РВ позволяет следить за накоплением продуктов в экспоненциальной фазе реакции. В этой системе наряду с праймерами используют зонд (пробу), меченный флуоресцентным красителем. Зонд является олигонуклеотидом, который гибридизуется с последовательностью ДНК/кДНК между двумя фланкирующими праймерами. ПЦР-РВ состоит из двух основных этапов: 1) гибридизации исследуемой матрицы с зондом и 2) ПЦР, катализируемой TaqДHK-пoлимepaзoй, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, расщепляющей зонд, что приводит к появлению и нарастанию флуоресцентного сигнала. Обычно реакция продолжается около 2 часов (40 циклов), в приборах нового поколения - всего 40 мин. Результаты анализа становятся доступными сразу после завершения реакции. На мировом рынке представлены различные модели приборов для ПЦР-РВ, разработанные известными фирмами-изготовителями - Applied Biosystems, Bio-Rad, Invitrogene, Eppendorf и др., а также отечественные приборы ДТ-322 (ДНК-Технология), АНК-32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, http://www.syntol.ru/productank.htm). Несмотря на широкое использование ПЦР-РВ, основного метода количественной оценки уровня транскрипции генов на сегодняшний день, в России этот метод еще не получил достаточного распространения как в фундаментальных исследованиях, так и в клинике. Основная причина, ограничивающая его использование, относительно высокая стоимость приборов и реактивов. Обнадеживает появление на отечественном рынке недорогих приборов, разработанных российскими фирмами, а также недорогих отечественных наборов реактивов («Синтол», «ДНК-Технологии», «Изоген» и др.), сравнимых по эффективности с зарубежными наборами [Манзенюк О.Ю., Малахо С.Г., Пехов В.М., Косорукова И.С., Полтараус А.Б. Характеристика универсальных отечественных наборов реагентов для ПЦР в реальном времени. Опыт использования в молекулярной онкодиагностике. 2006. Молекулярная биология. 40, 349-356].

Методики и протоколы, описанные в данной заявке, предполагают, в основном, использование отечественных наборов и, хотя выполнены на приборе ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, США), могут быть адаптированы для отечественных приборов. Сочетание недорогих приборов и отечественных наборов реактивов позволит сделать доступным этот технологичный метод для отечественных научных и клинических лабораторий.

Из изложенного ясно, что дифференциальный уровень транскрипции как молекулярный маркер для диагностики эпителиальных опухолей и, в частности РЛ, пока не нашел широкого практического применения в клиниках. В данной области существует настоятельная потребность в поиске новых диагностических маркеров РЛ, позволяющих достоверно и уже на ранних стадиях диагностировать заболевание, а также в разработке на их основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики РЛ.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение стало возможным в результате проведенного авторами сравнительного анализа уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в двух типах НМРЛ (АК и ПКРЛ) на разных клинических стадиях и открытия того факта, что уже на ранних стадиях ПКРЛ происходит значительное и частое снижение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2.

Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к новым маркерам для диагностики ПКРЛ, которые представляют собой снижение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2. Снижение уровня мРНК генов в предположительно пораженных раком тканях легкого человека по сравнению с их уровнем в нормальных/здоровых тканях служит диагностическим маркером ПКРЛ.

В одном из воплощений рак легкого, маркером которого является снижение уровня мРНК набора 3-х генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, является ПКРЛ.

В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению снижений уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в качестве маркера для диагностики ПКРЛ.

Данный способ включает следующие стадии:

а) получение исходной пары образцов тканей от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженных раком тканей, а второй получен из прилегающих гистологически нормальных (условно-нормальных) тканей;

б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;

в) синтез одноцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;

г) проведение количественной реакции амплификации фрагментов генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зонда;

д) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в образце, полученном из предположительно пораженных раком тканей легкого, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК в образце, полученном из нормальных тканей, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают уровень мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, причем уменьшение транскрипции генов служит диагностическим маркером рака легкого.

В одном из воплощений заявленный способ предназначен для диагностики плоскоклеточного рака легкого.

В одном из воплощений способа изобретения на стадии в) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dT)-содержащих праймеров, случайных гексамеров, или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.

В следующем воплощении способа настоящего изобретения для амплификации кДНК на стадии г) используют олигонуклеотидные праймеры и зонд, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК.

В отдельном предпочтительном воплощении данного изобретения последовательности праймеров и зондов представлены SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.

В еще одном воплощении способа настоящего изобретения на стадии г) количественная реакция амплификации фрагментов генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 представляет собой ПЦР в реальном времени.

В одном воплощении заявленного способа на стадии г) в качестве контрольных генов используют ген GAPDH, кодирующий белок глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу и ген RPN1, кодирующий белок рибофорин 1.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является набор праймеров и зондов для осуществления полимеразной цепной реакции в реальном времени с целью оценки изменения уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.

Перечень чертежей и таблиц

Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные примеры и чертежи, где

Фиг.1 показывает незначительную вариабельность уровня мРНК гена GAPDH при использовании в реакции образцов кДНК из опухоли и нормы. Согласно представленным данным изменение величины R (относительного уровня мРНК, см. формулу) для гена GAPDH не превышало 1.5-2 раз (Р<0.05) в опухоли и норме, что свидетельствует о приемлемости этого гена для нормирования данных ПЦР-РВ.

Фиг.2 показывает изменение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 при АК и ПКРЛ по сравнению с нормой относительно контрольного гена GAPDH. Как видно, снижение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 обнаружено в большинстве исследованных образцов НМРЛ, в первую очередь ПКРЛ. С помощью непараметрического теста Манна-Уитни показано, что в образцах АК и ПКРЛ изменение уровня мРНК контрольного гена RPN1 достоверно отличается от изменения уровня мРНК генов ITGA9 (Р<0.001), HYAL1 (Р<0.001) и HYAL2 (Р<0.001). Нормирование данных для каждого из 4 генов проведено относительно контрольного гена GAPDH.

Таблица 1 включает данные по клинической характеристике исследованных опухолей легкого.

Таблица 2 включает сводные данные, в том числе данные ПЦР-РВ по изменению уровня мРНК (R) генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в образцах АК и ПКРЛ по сравнению с нормой. Таблица 3 включает суммарные данные анализа частоты снижения уровней мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в образцах АК и ПКРЛ.

Осуществление изобретения

Данное изобретение обеспечивает новые молекулярно-генетические маркеры для диагностики плоскоклеточного рака легкого (ПКРЛ), основанные на определении изменения уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2. Это простой, надежный способ диагностики ПКРЛ на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные. Достоверно обнаруживаемое различие уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в нормальных и опухолевых тканях может быть использовано для обнаружения ПКРЛ.

Образцы тканей легких для анализа

В качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы биоптаты, пунктаты, в том числе материал, полученный при бронхоскопии с прямой биопсией (центральный рак легкого) и трансторакальной (чрезкожной) пункции опухоли (периферический рак).

Выделение РНК из образцов тканей легких

Способы выделения суммарной РНК из образцов тканей млекопитающих хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков тканей можно проводить вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например Omni Mixer или Micro-Dismembrator U фирмы Sartorius (Германия). Для выделения РНК могут быть использованы различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular Cloning. A laboratory Manual 2nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с использованием реагента Trizol [GIBCO/Life Technologies]. Для предотвращения разрушения РНК РНКазами могут быть использованы ингибиторы, такие как игибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.

Быстрое и качественное выделение РНК можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт-Петербург; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (США) и т.д.). Использование различных приборов, например QuickGene-810 (Life Science, Япония), позволяет исключить работу с агрессивными агентами, ускорить и упростить выделение РНК. Для экстракции РНК в этом приборе используют 80 мкм пористую мембрану, которая в 12,5 раз тоньше обычно используемого в таких приборах стеклянного фильтра (1000 мкм), что позволяет уменьшить деградацию РНК и увеличить ее выход.

Реакция обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов тканей легких, перевод в двуцепочечную форму

Реакцию обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, можно проводить с использованием коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), С.Therm Polymerase и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиною до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Мn2+.

Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:

1) Олиго(dТ)n-содержащие праймеры связываются с эндогенным полиА-хвостом на 3'-конце мРНК (число n обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К олиго(dТ)-последовательности часто добавляют на 3'-конце нуклеотиды А, С или G, чтобы «заякорить» праймер на границу транскрипта и поли-А тракта;

2) Случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки) гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных со вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-областей мРНК;

3) Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олигоdТ-содержащими праймерами;

4) Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.

Выбор специфических праймеров и зондов для ПЦР-РВ

Выбор специфических праймеров и зондов осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области, для чего используют имеющиеся программы, многие из которых находятся в свободном доступе в Интернете. Среди таких программ можно упомянуть Oligo (версия 6.42), PrimerSelect из пакета Lasergene (www.dnastar.com), Primer Express (Applied Biosystems, USA), Primer Designer (ИМБ), FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest

(http://scitools.idtdna.com/Primerquest/) и др.

Высокая специфичность ПЦР-РВ обеспечивается за счет использования зонда, содержащего на 5'-конце флуорофор или флуоресцентный краситель (в данном случае, FAM-6-carboxy-fluoroscein), а на 3'-конце - т.н. гаситель (в данном случае - RTQ1). В процессе ПЦР их взаимодействие нарушается за счет расщепления зонда Taq ДНК полимеразой благодаря ее 5'-экзонуклеазной активности, при этом происходит эмиссия флуоресценции (Протоколы фирмы Applied Biosystems, http://docs.appliedbiosystems.com). Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ осуществляется в соответствии со стандартными рекомендациями и требованиями метода.

В предпочтительном воплощении используют праймеры и зонды:

Оценка уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 методом ПЦР-РВ.

Количественная оценка уровня мРНК достигается с помощью параллельного проведения ПЦР-РВ с тестируемым и контрольным образцами. В качестве внутренних контролей, относительно которых проводилось нормирование продуктов амплификации исследуемых генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, выбран ген GAPDH, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу, и ген RPN1, кодирующий рибофорин 1. Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки уровня мРНК генов необходимо выбрать контрольный ген, имеющий незначительную вариабельность уровня мРНК в опухолевых и нормальных тканях легкого по сравнению с вариабельностью уровня мРНК исследуемых генов. Выбору подходящего контрольного гена для нормирования количественных данных посвящено много обзоров [Radonic А., Thulke S., Mackay I.M., Landt О., Siegert W., Nitsche A. 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313, 856-862; Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. 2005. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes and Immunity. 6. 279-284; Wong M.L, Medrano J.F. 2005. Real-time PCR for mRNA quantification. BioTechniques. 39, 1-11]. Чаще всего в качестве контрольных выбирают гены «домашнего хозяйства», хотя для этой цели может быть использован любой ген с относительно постоянным уровнем транскрипции в исследуемых образцах. Решение о выборе того или иного гена в качестве контрольного на самом деле зависит от степени выбранной/требуемой точности. В настоящем изобретении один из выбранных контрольных генов - традиционный и часто используемый ген GAPDH. Согласно данным литературы, этот ген наиболее приемлем в качестве контрольного для образцов НМРЛ и нормальных тканей легкого [D.W.Liu, S.T.Chen, Н.Р.Liu. Choice of endogeneous control for gene expression in nonsmall lung cancer. 2005. Eur. Respir. J. 26, 1002-1008]. Однако вариабельность уровня мРНК необходимо проверять для каждой исследуемой выборки образцов данного типа тканей. В качестве дополнительного контрольного гена для нормирования ПЦР-РВ данных впервые выбран ген RPN1. Согласно данным SAGE для этого гена выявлено незначительное изменение его уровня мРНК, которое не превышает 3-х раз в нормальных и опухолевых тканях легкого.

Оценка уровня мРНК генов может быть основана на абсолютном и относительном измерении количества копий исследуемых транскриптов - абсолютный метод (метод стандартной кривой) и метод относительных измерений (ΔΔCt-метод) (http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf). Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки уровня мРНК генов в качестве основного метода измерений выбран второй из них, позволяющий проводить двойное сравнение данных для исследуемого и контрольного генов в опухоли и норме и не требующий выравнивания концентраций опухолевых и нормальных образцов РНК/кДНК, которое необходимо при использовании других методов, например ОТ-ПЦР.

Выбор образцов сравнения

Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки уровня мРНК генов важно проверить пригодность образцов сравнения, в данном случае условных норм. «Условной нормой» принято считать образец ткани легкого с отсутствующими макро- и микроскопическими признаками опухолевого роста. При «непригодности» образца условно-нормальной ткани (т.е. в случаях, когда при микроскопии обнаруживали опухолевые клетки, или материал был трудно интерпретируемый) использовали или усредненные нормы нескольких имеющихся условных норм.

Поскольку не для всех опухолевых образцов имелись пригодные парные условные нормы, расчеты относительного количества копий транскриптов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 (RкДНК) проводили, используя разные образцы сравнения, - парные условные нормы, если они были, и усредненные условные нормы от нескольких больных, если парных норм не было, для этого усредняли значение ΔCt=Ct (исследуемый ген) - Ct (контрольный ген) и далее проводили расчеты RкДНК.

Учет эффективностей реакций

Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки изменения уровня мРНК генов необходимо учитывать эффективности проводимых реакций, которые могут оказать значительное влияние на конечный результат. Для этого разработана программа математической обработки экспериментальных данных ПЦР-РВ с расчетом эффективностей реакций. Программа совместима с файлами экспериментальных данных (Ct, ΔRn и др.) из программного обеспечения Applied Biosystems (ABI Prism SDS Software) и также позволяет проводить статистическую оценку достоверности измеряемых изменений и оценку пригодности выбранного контрольного гена.

Далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры, представляющие собой наиболее предпочтительные воплощения изобретения. Изобретение не ограничивается описанными воплощениями, напротив, предполагается, что оно включает любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности и объема изобретения.

Пример 1. Образцы тканей легкого

Образцы опухолевых тканей легкого I-III стадий (АК, ПКРЛ) (Т), прилегающие к опухолям морфологически нормальные ткани (N) (т.н. условные нормы) собраны и охарактеризованы в НИИ КО ГУ РОНЦ им Н.Н.Блохина РАМН. Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологического исследований биоптатов (полученных при фибробронхоскопии, трансторакальных пункциях) и операционного материала. Образцы тканей легкого (опухоль, условно-нормальная ткань) получены непосредственно после удаления опухоли. Каждый образец делили примерно на 3 равные части и хранили в жидком азоте. Общая коллекция опухолевых образцов, подлежащих исследованию, составила 29 образцов, из которых 11 образцов АК, 18-ПКРЛ, а также 29 образцов условной нормы. «Морфологически нормальной» принято считать ткань, в которой при микроскопическом исследовании не определялись признаки клеточной атипии, ткань могла быть представленной клетками мерцательного эпителия, кубического эпителия, альвеолярными макрофагами, лимфоидными элементами. Средний возраст пациентов, среди которых 23 мужчины и 6 женщин, составляет около 60 лет (диапазон 31-76 лет). Диагноз в каждом случае устанавливали на основании результатов клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследований. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей TNM, где Т (tumor) - Т04-категории, отражающие нарастание размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (nodules) - N0-N3-категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; М (metastasis) - М01 - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации TNM объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса.

Пример 2. Выделение РНК из образцов тканей

Методика 1

РНК из нормальных и опухолевых тканей человека выделяли с использованием набора реагентов Trizol RNA Prep («Лаборатория Изоген», Москва). Основные этапы включали: 1) разрушение ткани, замороженной в жидком азоте, с использованием микродесмембратора («Sartorius», Германия) и гомогенизацию разрушенного образца в лизирующем растворе, содержащем гуанидинизотиоцианат и фенол; 2) добавление смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении их объемов 49:1 и центрифугирование 5 мин при 14000 об/мин (4°С); 3) повторную депротеинизацию водной фазы, содержащей РНК, фенолом и центрифугирование в течение 5 минут при 14000 об/мин (4°С); 4) осаждение РНК равным объемом изопропанола из водной фазы, образующейся после центрифугирования. Далее осадок РНК после повторного центрифугирования промывали водным 75% этиловым спиртом, высушивали и растворяли в стабилизирующем реагенте ЭкстраГен Е («Лаборатория Изоген»). Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически («NanoDrop Technogies Inc.», США). Качество выделенной РНК проверяли электрофорезом в 1% агарозе в присутствии бромистого этидия и по соотношению длин волн 260/280 нм.

Методика 2

РНК из нормальных и опухолевых тканей человека выделяли с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия) согласно протоколу. Основные этапы включали: 1) разрушение ткани, замороженной в жидком азоте, с использованием микродесмембратора («Sartorius» Германия) и гомогенизацию разрушенного образца в лизирующем буфере RLT в расчете 600 мкл на 30 мкг ткани; 2) центрифугирование 3 минуты при 14000 об/мин (4°С); 2) добавление равного объема водного 70% этилового спирта к супернатанту; 3) нанесение на колонку; 4) промывание колонки после сорбции РНК один раз буфером RW1 объемом 700 мкл и дважды буфером RPE объемом 500 мкл; 5) элюцию РНК водой, свободной от РНКаз. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрчески («NanoDrop Technogies Inc.», США) при длине волны 260 нм. Качество выделенной РНК проверяли электрофорезом в 1% агарозе в присутствии бромистого этидия.

Нуклеотидный состав ампликонов подтверждали секвенированием на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer ("Applied Biosystems"). Секвенирование проводили отдельно с 5' и 3'-концевого праймеров с использованием реактивов DYEnamic ЕТ Terminator Cycler Sequencing Kit ("Amersham"). Все праймеры и зонды были специфичны в условиях ПЦР-РВ, ампликоны имели ожидаемые нуклеотидные последовательности и размер.

Пример 3. Реакция обратной транскрипции

Для проведения реакции обратной транскрипции брали по 1 мкг РНК, полученной одним из двух вышеописанных методов с использованием наборов реагентов Trizol RNA Prep («Лаборатория Изоген») или реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen»), предварительно обработанной не содержащей РНКаз ДНКазой I (Invitrogene), 100 нг гексануклеотидных праймеров, 1 мМ dNTP, 1х реакционный буфер («Fermentas», Литва), содержащий 250 мМ Tns-HCl (pH 8.3, 25°С), 250 мМ КСl, 20 мМ MgCl2, 50 мМ DTT, и 200 единиц обратной транскриптазы M-MuLV (Fermentas.). Реакцию проводили в объеме 20 мкл при следующем температурном режиме: 25°С - 10 мин, 42°С - 60 мин, 50°С - 10 мин, 70°С - 10 мин.

Пример 4. Подбор условий для количественной оценки изменений уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в опухолях легкого (АК и ПКРЛ)

Для проведения ПЦР-РВ подобраны оптимальные концентрации праймеров и зондов исследуемого и контрольного генов. Концентрации праймеров варьировали в диапазоне 250-400 nМ при постоянной концентрации зондов, равной 100 nМ, затем концентрацию зондов варьировали при подобранной оптимальной концентрации праймеров в диапазоне 150-250 nМ. Для ITGA9 оптимальная концентрация праймеров составила 250 нМ, зонда - 150 нМ, для HYAL1 и HYAL2 концентрация праймеров - 300 нМ, зонда - 300 нМ, для GAPDH и RPN1 концентрация праймеров - 300 нМ, зонда - 150 нМ.

Пример 5. Количественная оценка уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2

Для количественных измерений использовали прибор ABI PRISM ® 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, США.

Протокол определения изменения уровня мРНК методом ПЦР-РВ

1. Готовили реакционные смеси для исследуемого гена (ITGA9, HYAL1 и HYAL2) и контрольных генов GAPDH и RPN1, осторожно смешав все компоненты реакции, кроме матрицы (кДНК), праймеры и зонд в оптимальных концентрациях, из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца + 1 дополнительная реакция по 25 мкл.

Состав реакционной смеси для генов GAPDH и RPN1:
Реагент Концентрация исходных растворов (мМ) Объем в расчете на одну реакцию (мкл) Конечные концентрации в реакции (мМ)
ПЦР буфер 5
dNTPs 2.5 2.5 0.250
Прямой праймер 1.0·10-5 0.75 3·10-4
Обратный праймер 1.0·10-5 0.75 3·10-4
Зонд 1.0·10-5 0.38 1.5·10-4
ROX 1.0·10-3 0.13 5·10-4
кДНК 5
ТаqДНК-полимераза 1 ед/мкл 2 0.02 ед/мкл
Н2О 8.49
Состав реакционной смеси для гена ITGA9
Реагент Концентрация исходных растворов (мМ) Объем в расчете на одну реакцию (мкл) Конечные концентрации в реакции (мМ)
ПЦР буфер 5
dNTPs 2.5 2.5 0.250
Прямой праймер 1.0·10-5 0.63 2,5·10-4
Обратный праймер 1.0·10-5 0.63 2,5·10-4
Зонд 1.0·10-5 0.38 2·10-4
ROX 1.0·10-3 0.13 5·10-4
кДНК 5
TaqДНК-полимераза 1 ед/мкл 2 0.02 ед/мкл
Н2О 8.73
Состав реакционной смеси для генов HYAL1 и HYAL2
Реагент Концентрация исходных растворов (мМ) Объем в расчете на одну реакцию (мкл) Конечные концентрации в реакции (мМ)
ПЦР буфер 5
dNTPs 2.5 2.5 250 µМ
Прямой праймер 1.0·10-5 0.75 3·10-4
Обратный праймер 1.0·10-5 0.75 3·10-4
Зонд 1.0·10-5 0.75 3·10-4
ROX 1.0·10-3 0.13 5·10-4
кДНК 5
Taq ДНК-полимераза 1 ед/мкл 2 0.02 ед/мкл
Н2О 8.12

2. В 96-луночную планшету добавляли по 20 мкл приготовленных реакционных смесей без матрицы.

3. Вносили по 5 мкл матрицы, плотно закрывали планшету пленкой.

4. Помещали планшету в приборное отделение, задавали названия ячеек, температурный режим для 40 циклов: 95°С - 10 мин - денатурация и активация фермента, 95°С - 15 с - денатурация, 60°С - 1 мин - отжиг зонда и полимеризация, затем запускали прибор.

5. Реакции проводили в режиме относительных количественных измерений (программное обеспечение RQ (Relative Quantification, Applied Biosystems).

6. После завершения реакции амплификации сохраняли данные на CD-диске.

7. Нуклеотидный состав ампликонов подтверждали секвенированием на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США). Секвенирование проводили отдельно с 5' и 3'-концевого праймеров с использованием реактивов DYEnamic ЕТ Terminator Cycler Sequencing Kit ("Amersham").

8. Проводили математическую обработку данных ПЦР-РВ и представляли результаты в графическом и/или табличном виде.

Пример 7. Математическая обработка данных ПЦР-РВ

Данные ПЦР-РВ переносили в виде текстового файла в Microsoft Excel и проводили математическую обработку данных. Относительный уровень транскрипции RкДНК (далее R), представляющий отношение количества копий исследуемой последовательности кДНК к количеству копий контрольной последовательности в опухоли (Т) по сравнению с нормой (N), связана с основными параметрами ПЦР-РВ пороговым циклом Ct и эффективностью реакции Е общим выражением (Бюллетень 2, Applied Biosystems):

Интервал крайних значений R вычисляли с учетом рассчитанных отклонений е для значений Ct:

где i=1, 2, …, n, где n - число повторов реакции (в нашем случае n=3). При суммировании величин отклонения вычисляют по формуле:

j=1, 2, …, k, где k - число суммируемых величин.

Эффективность ПЦР-РВ (Е) для генов GAPDH, RPN1, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 рассчитывалась с помощью оригинальной программы, разработанной в лаборатории (Программа «Сравнительный анализ генных транскриптов», свидетельство о регистрации №2006613816, Роспатент). В данной программе эффективность реакции рассчитывается по тангенсу угла наклона прямой, которая аппроксимирует кинетическую кривую на ее линейном участке с помощью метода наименьших квадратов. При дальнейшей обработке данных учитывали полученные значения эффективностей, которые составили для гена

ITGA9 Еопухольнорма=(85±10)%, для гена HYAL1 Еопухольнорма=(85±7)%, для гена HYAL2 Еопухольнорма=(86±9)%, для гена GAPDH Еопухольнорма=(91±6)%, для гена RPN1 Еопухольнорма=(80±10)%.

Достоверность наблюдаемых изменений оценивали исходя из нормального распределения данных. Данные считали достоверными при Р<0,05, где Р - показатель статистической значимости данных.

Результаты оценки уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2

Для количественной оценки изменения уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 использовали как зарубежные, так и отечественные наборы реактивов. Характеристика всех образцов тканей НМРЛ, из которых получены РНК и кДНК, приведена в таблице 1.

Оценивали частоту снижения (FD, Frequency of Decrease of mRNA level) и уровень снижения мРНК (LD, Level Decrease of mRNA) исследуемых генов. В объединенной выборке опухолей легкого (АК+ПКРЛ) с высокой частотой выявлено достоверное заметное снижение уровней мРНК каждого из 3-х генов (от 2 до 100 раз) по сравнению с уровнем мРНК контрольных генов. Для каждого опухолевого образца количественные данные приведены в табл.2. В целом, у больных НМРЛ значения FD и LDcp для генов составили: 93% (27/29) и 9 раз для ITGA9, 76% (22/29) и 9 раз для HYAL1, 93% (27/29) и 7 раз для гена HYAL2 (во всех случаях Р<0.001). Суммарные результаты (значения FD и LDcp) для двух гистологических типов НМРЛ представлены в табл.3. Частота снижений была высокой для всех генов как при АК, так и ПКРЛ, хотя при АК значения FD несколько ниже. Минимальное значение LDcp, равное шести, наблюдали для генов ITGA9 и HYAL2 в группе пациентов с диагнозом АК, а максимальное - для гена HYAL1 (12 раз) в группе пациентов с диагнозом АК и гена ITGA9 (11 раз) в группе пациентов с диагнозом ПКРЛ. В целом, уровни мРНК исследуемых генов снижаются значительнее у пациентов с диагнозом ПКРЛ и АК с метастазами. Кроме того, отмечены отдельные случаи повышения уровня мРНК гена HYAL1 в образцах АК I-ой клинической стадии.

При сравнении уровней мРНК каждого из генов в различных группах пациентов (с диагнозом АК и ПКРЛ; АК и ПКРЛ с метастазами и без метастазов в регионарных лимфоузлах) обнаружены характерные особенности. Для гена ITGA9 выявлено достоверное снижение LDcp при ПКРЛ по сравнению с АК (11 раз против 6, Р=0.033, тест Манна-Уитни), при близких значениях FD. Для гена HYAL2 отмечена та же тенденция. Для гена HYAL1 не выявлено достоверных различий между LDcp и FD при АК и ПКРЛ. При анализе групп пациентов с различным уровнем метастатического поражения регионарных лимфоузлов отмечено, что в образцах АК от пациентов без метастазов (образцы I -ой клинической стадии) частота и уровень снижений мРНК генов незначительны по сравнению с образцами АК от пациентов с метастазами (II и III клинические стадии): для гена 1TGA9 (10 раз и 100% против 3 раз и 67%, Р<0.05), для генов HYAL1 и HYAL2 отмечена же та тенденция. Напротив, при ПКРЛ частое и заметное снижение уровня мРНК генов происходит уже в образцах от пациентов без метастазов, более того, для генов ITGA9 и HYAL2 значения FD составляют 100% (чертеж).

В результате анализа данных показано, что одновременное снижение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 происходит в 72% (21/29) исследуемых опухолей, причем при ПКРЛ данное событие происходит в 83% (15/18) случаев, а при АК в 55% (6/11).

Таким образом, в большинстве образцов НМРЛ уже на I-ой клинической стадии происходит значительное снижение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, в первую очередь при ПКРЛ, для которого частота снижения уровня мРНК генов ITGA9, HYAL2 достигает 100%. Для АК характерно увеличение частоты снижений уровня мРНК генов при опухолевой прогрессии. Достоверно более низкий уровень мРНК гена ITGA9 при ПКРЛ по сравнению с АК можно считать характерным признаком ПКРЛ. Одновременное и частое снижение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 при ПКРЛ перспективно для создания набора маркеров раннней диагностики этого заболевания.

Настоящим изобретением также предусмотрено, что определение изменения уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 будет полезным при мониторинге эффективности проводимой противораковой терапии, причем анализ способом настоящего изобретения следует проводить до начала и после окончания курса лечения, а также при необходимости по ходу курса лечения. Повышение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 по ходу или по завершении курса лечения может свидетельствовать о восстановлении транскрипции генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, что может говорить о положительных сдвигах при лечении. Дальнейшее снижение уровней иРНК генов может указывать на отсутствие эффективности лечения.

Представленное выше подробное описание изобретения и его конкретных воплощений, приведенных в примерах со ссылкой на чертеж, предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Таблица 1
Клиническая характеристика образцов HMPЛ
Основные характеристики Больные
Пол Женщины/6 Мужчины/23
Возраст от 31 до 76 лет
средний - 60 лет
TNM/Клиническая стадия Гистологический тип опухоли
ПКРЛ АК
T1N0M0/IA 2 4
T2N0M0/IB 4 2
T3N0M0, T2N1M0/IIB 5* 1*
T1N2M0, Т2N2M0,T3N1M0,
T3N2M0/IIIA 7* 4*
Всего 18 11
Примечание: * - образцы НМРЛ от больных с метастазами в регионарные лимфатические узлы
Таблица 2
Изменение уровня мРНК (R) генов ITGА9, HYAL1 и HYAL2 при НМЛР (АК, ПКРЛ)
п/п TNM Классификация Клиническая стадия Интервал изменений уровня мРНК генов, R (разы)
ITGA9 HYAL1 HYAL2
АК
1 T1N0M0 IA ↓2-2,5 ↑6-11 сохранение
2 T1N0M0 IA ↓2-2,6 ↓5-8 ↓3-5
3 T1N0M0 IB ↓4-5 ↑3-4 ↓2,5-3
4 T2N0M0 IB ↓2-3 ↓8-10 ↓5-6
5 T1N0M0 IA сохранение ↓4-6 ↓7-10
6 T2N0M0 IB сохранение ↑2-3 ↓2,5-3
7 T2N1M0 IIB ↓6-8 ↓11-15 ↓8-10
8 T2N2M0 IIIA ↓9-12 ↓16-20 ↓9-13
9 T3N2M0 IIIA ↓32-41 ↓77-111 ↓17-24
10 T2N2M0 IIIA ↓9-11 ↓4-9 ↓3-5
11 T2N2M0 IIIA ↓3-4 сохранение ↓3-5
ПКРЛ
12 T2N0M0 IB ↓7-10 ↓15-20 ↓6-8
13 T1N0M0 IA ↓9-12 ↓12-14 ↓12-19
14 T2N0M0 IB ↓4-7 ↓5-7 ↓2-4
15 T2N0M0 IB ↓22-26 ↓2-3 ↓12-20
16 T1N0M0 IA 8-11 сохранение ↓2-4
17 T2N0M0 IB ↓32-42 ↓22-30 ↓46-62
18 T2N1M0 IIB ↓7-9 ↓12-16 ↓9-13
19 T2N1M0 IIB ↓8-11 ↓2-3 ↓4-6
20 T2N1M0 IIB ↓4-6 ↓6-13 ↓3-6
21 T2N1M0 IIB ↓9-11 ↓11-21 ↓10-12
22 T2N1M0 IIB ↓2-2,5 ↓4-5 ↓2-3
23 T3N1M0 IIIA ↓9-12 ↓2,5-3 ↓5-7
24 T3N2M0 IIIA ↓7-8 ↓3-6,5 ↓7-13
25 T2N2M0 IIIA ↓25-32 ↓13-22 ↓16-18
26 T3N2M0 IIIA ↓2-4 сохранение сохранение
27 T2N2M0 IIIA ↓14-26 сохранение ↓2-3
28 T1N2M0 IIIA ↓3-4 ↓6-10 ↓6-8
29 T2N2M0 IIIA ↓60-82 ↓67-87 ↓43-63
Таблица 3
Суммарные данные по частоте снижения уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в образцах НМРЛ (АК и ПКРЛ)
Группы ITGA9 HYAL1 HYAL2
АК ПКРЛ АК ПКРЛ АК ПКРЛ
Без метастазов (I стадия) FD 67 (4/6) 100 (6/6) 50 (3/6) 83 (5/6) 83 (5/6) 100 (6/6)
LDср 3(2-4) 13 (5-36) 7 (5-9) 10 (2-25) 4 (3-8) 9 (2-53)
Р <0.032 <0.032 >0.062 <0.062 <0.062 <0.032
С метастазами (II+III стадии) FD 100 (5/5) 100 (12/12) 80 (4/5) 83 (10/12) 100 (5/5) 92 (11/12)
LDcp 10 (3-36) 11 (3-70) 19 (6-93) 8 (3-77) 8 (4-20) 8 (2-25)
Р Р<0.062 Р<0.02 Р<0.062 Р<0.02 Р<0.062 Р<0.02
Всего FD 82 (9/11) 100 (18/18) 64 (7/11) 83 (15/18) 91 (10/11) 94 (17/18)
LDcp 6 (2-36) 11 (3-70) 12 (5-93) 9 (2-77) 6 (3-20) 8 (3-53)
Р Р<0.018 Р<0.02 Р>0.054 Р<0.02 Р<0.018 Р<0.02
Примечание: Значения FD приведены в %, цифры дроби в скобках - количество образцов со сниженным уровнем мРНК к общему количеству образцов, LDcp - в скобках указан интервал обнаруженных снижений LD (разы). Для расчета Р использовали непараметрический тест Уилкоксона.

Способ диагностики плоскоклеточнго рака легкого (ПКРЛ) и аденокарциномы легкого (АК), включающий следующие стадии:
а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей гистологически нормальной (условно-нормальной) ткани;
б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;
в) синтез одноцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;
г) проведение количественной реакции амплификации фрагментов генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы, и геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1, 2; 4, 5; 7, 8 и зондов с последовательностями SEQ ID NO: 3, 6, 9, отличающийся тем, что уменьшение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 по сравнению с контрольным в диапазоне от 2 до 100 раз служит диагностическим признаком рака легкого типа АК или ПКРЛ.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии. .

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторным методам исследования. .
Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для профилактики сепсиса у новорожденных
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и касается способа диагностики хронического эндометрита у женщин постменопаузального периода

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах
Изобретение относится к области медицины, а именно к области лабораторной диагностики, и позволяет на основе выявленной корреляции определить количество арахидоновой кислоты в периферической крови беременных при вспышке герпес-вирусной инфекции
Изобретение относится к области медицины и касается способа оценки содержания нитросоединений в плаценте у беременных при обострении герпес-вирусной инфекции
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике в педиатрии, и может быть использовано для прогноза течения ротавирусной инфекции у детей
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам, и касается способа диагностики вступления ядер синцитиотрофобласта ворсинок плаценты в апоптоз путем определения в гомогенате плаценты содержания антител IgG и IgM к фосфатидилсерину у беременных, перенесших в третьем триместре герпес-вирусную инфекцию
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования преждевременного излития околоплодных вод у беременных в сроке гестации 32-36 недель

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, неврологии, офтальмологии, используется для осуществления диагностики предрасположенности к ишемической нейрооптикопатии у лиц пожилого возраста, страдающих ишемической болезнью сердца (ИБС), артериальной гипертонией (АГ) и дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭП)
Наверх