Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида yersinia pestis


 


Владельцы патента RU 2404251:

Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Описан способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Ycrsinia pestis, включающий выделение ДНК из культуры клеток и проведение тестирования с использованием набора праймеров в реакции ПЦР, отличающийся тем, что тестирование проводят в два этапа: на первом для идентификации используют набор праймеров, состоящий из праймеров «3а», «vlm12for/ISrev216», «JS», «CDS39», которые взаимодействуют с ДНК пробы, при этом синтез специфических ДНК, направляемый праймерами «3а» и «vlm12for/ISrev216» подтверждает наличие в пробе ДНК штамма возбудителя чумы, а положительный результат с праймерами «CDS39» свидетельствует о наличии в пробе ДНК штамма Y.pestis одного из дополнительных подвидов, внутривидовую дифференциацию которых осуществляют вторым этапом, путем постановки ПЦР с праймерами «traA» и «YP02258», причем полученные с каждой парой праймеров результаты оценивают как положительные при наличии амплификатов известной длины, а именно: «3а» - 276 п.н., «JS» - 223 п.н., «vlm12for/ISrev216» - 390 п.н., «traA» - 472 п.н., «CDS39» - 418 п.н., «YP02258» - 130 п.н., при этом отрицательными считают результаты при отсутствии амплификатов или при их наличии, но с нехарактерным числом пар нуклеотидов. Изобретение может быть использовано при экспресс-диагностике возбудителя чумы, а именно при идентификации всех штаммов, принадлежащих к виду Y.pestis. 6 з.п. ф-лы, 11 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано при экспресс-диагностике возбудителя чумы, а именно при идентификации всех штаммов, принадлежащих к виду Y.pestis.

В настоящее время существует проблема ускоренной идентификации и быстрой внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы, выделенных от животных и из объектов внешней среды. Выделенные штаммы необходимо четко разграничивать на две группы: штаммы основного подвида - типичные (эпидемически опасные и вирулентные для людей) и штаммы дополнительных подвидов (caucasica, hissarica, ulegeica, altaica, talassica) - атипичные, со сниженной эпидемической опасностью и с избирательной вирулентностью. Ускоренная идентификация с одновременной внутривидовой дифференциацией необходимы для правильной оценки эпидемической ситуации, а также для проведения своевременного начала противоэпидемических мероприятий в необходимом объеме с целью предотвращения распространения инфекции.

Известен способ экспресс-диагностики чумы с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) на всех этапах этого исследования. Этот способ предусматривает использование зарегестрированных тест-систем, состоящих из набора праймеров, которые выявляют фрагменты генов cafl и рlа, расположенные на плазмидах чумного микроба, отвечающие за синтез фракции I и пестицина («Ген Пест» ТУ8895-005-0189).

Применяемые тест-системы предназначены исключительно для детекции типичных штаммов со специфическими плазмидами, и не способны выявлять атипичные штаммы возбудителя чумы, с атипичной структурой генома, что сужает диагностические возможности представленных тест-систем для возбудителя чумы плазмиды.

Известен способ идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica (Стенкова A.M., Исаеева М.П., Рассказов В.А. «Разработка многопраймерной ПЦР для идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов (Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica. // Мол генетика, микробиол и вирусол. 2008, №3, с.18-23), заключающийся в том, что для мульттилокусного анализа используют шесть праймеров, выявляющих последовательности генов ompF - поринов Yersinia, при этом видоспецифичность выбранных для тестирования последовательностей позволяет с помощью предложенных авторами праймеров выявлять среди штаммов рода Yersinia штаммы, принадлежащие к трем видам, патогенным для человека.

Однако в предложенном способе отсутствуют данные проверки набора праймеров на различных штаммах внутривидовых групп Y.pestis, в том числе атипичных. Кроме того, предложенные пары праймеров не позволяют отличить и локализовать по очагам разные таксономические внутривидовые группы штаммов возбудителя чумы с различной эпидемиологической опасностью. Эти обстоятельства сужают диагностические возможности известного способа.

За прототип выбран способ применения мультилокусной ПЦР для ускоренной идентификации Y.pestis (Куклев В.Е., Сухоносов И.Ю., Осина Н.А., с соавт. Применение мультилокусной ПЦР для ускоренной идентификации Y.pestis. // Сборник трудов, VI всероссийской науч.-практ. конф. с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней», Москва, - 2007. Т.1. С.376-377), заключающийся в том, что разработана тест-система на основании нуклеотидных последовательностей видоспецифичного хромосомного локуса «3а», а также генов irp2 островка высокой патогенности и lcrV плазмиды pCad, позволяющая одновременно с определением принадлежности возбудителя к виду Y.pestis дифференцировать авирулентные штаммы чумного микроба от вирулентных.

Однако предложенный набор праймеров имеет ряд недостатков:

- праймеры «3а» не выявляют все штаммы чумного микроба, так в некоторых очагах чумы в Африке от людей выделены штаммы, в хромосоме которых отсутствуют фрагменты ДНК, комплементарные этой паре праймеров, и отрицательный результат не гарантирует отсутствие возбудителя чумы в пробе;

- праймеры «IcrV» определяют репликацию ампликонов в присутствие плазмиды pCad, которая имеется не только у вирулентных, но и у авирулентных и вакцинных штаммов;

- праймеры «irp2», свидетельствуя о возможности проявления «общей» вирулентности штаммов для грызунов-носителей и людей, не позволяют, также как и праймеры «3а» и «IcrV», отличить и локализовать по очагам разные таксономические группы штаммов Y.pestis с «избирательной вирулентностью» и особым геномом, для одних из которых характерно отсутствие эпидемической опасности, а для других - полное отсутствие вирулентности для людей.

Таким образом, представленные праймеры ни поодиночке, ни в комплексе не дают возможность идентификацировать все, в том числе и с измененным генотипом штаммы Y.pestis, и не позволяют проводить внутривидовую дифференциацию, что снижает эффективность диагностических возможностей известного способа.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового эффективного способа, позволяющего проводить идентификацию и внутривидовую дифференциацию всех штаммов вида Yersinia pestis.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Yersinia pestis, включающем выделение ДНК из культуры клеток и проведение с использованием набора праймеров в реакции ПЦР тестирования, последнее проводят в два этапа, в первом для идентификации используют набор праймеров, состоящий из праймеров «3а», «vlm12for/ISrev216», «JS» и «CDS39», которые взаимодействуют с ДНК пробы, при этом синтез специфических ДНК, направляемый праймерами «3а» и «vlm12for/ISrev216», подтверждаем наличием в пробе ДНК штамма возбудителя чумы, а положительный результат с праймерами «CDS39» свидетельствует о наличии в пробе ДНК штамма Y.pestis одного из дополнительных подвидов, внутривидовую дифференциацию которых осуществляют вторым этапом, путем постановки ПЦР с праймерами «traA» и «YP02258», причем полученные с каждой парой праймеров результаты оценивают как положительные при наличии амплификатов известной длины, а именно: «3а» - 276 п.н., «JS» - 223 п.н., «vlm12for/ISrev216» - 390 п.н., «traA» - 472 п.н., «CDS39» - 418 п.н., «YP02258» - 130 п.н., при этом отрицательными считают результаты при отсутствии амплификатов или при их наличии, но с нехарактерным числом пар нуклеотидов.

Кроме того, праймеры «CDS39» конструируют, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и они имеют прямую и обратную нуклеотидную последовательности: «CDS39for» 5'-ТТА AAG GTC TGC GAA СТG GСТ С-3' и «CDS39rev» 5'-ТСТ GСА ТТG CGA AGG TAC TGA AC-3'.

При этом праймеры «traA» конструируют, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и они имеют прямую и обратную нуклеотидную последовательности: «traAfor» 5'-ТGТ СТА ТТА ТТА АСG СТG ТАС CCG С-3' и «traArev» 5'-CAG СТG GСА GТА ТGG ААА ТАС СТG-3'.

Сущность изобретения заключается также в том, что выявленную культуру оценивают, как возбудитель атипичной чумы, относящейся к одному из дополнительных подвидов (hissarica, ulegeica, altaica, talassica), если в результате ПЦР появляются амплификаты, свидетельствующие о положительной реакции с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «CDS39», «YP02258» и отрицательным результатом с праймерами «traA» и «JS».

Кроме того, выявленную культуру оценивают, как возбудитель атипичной чумы, относящейся к дополнительному подвиду caucasica, если в результате ПЦР появляются амплификаты, свидетельствующие о положительной реакции с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «CDS39», «traA» и «YP02258» и отрицательной с праймерами «JS».

Причем при внутривидовой дифференциации в случае отсутствия амплификации фрагмента ДНК в 130 п.н., направляемого праймерами «YP02258» с одновременным положительным результатом с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216» и «CDS39», выявленную культуру оценивают, как культуру возбудителя чумы, характерную для биовара «microtus».

При этом выявленную культуру оценивают, как возбудитель псевдотуберкулеза, если в результате ПЦР с помощью праймеров «JS» синтезируется амплификат длиной 223 п.н.

Способ осуществляют следующим образом.

Алгоритм постановки ПЦР с предлагаемым набором праймеров предполагает постановку реакции в два этапа.

На первом этапе постановку проводят с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «JS» и «CDS39». Если результаты реакции свидетельствуют о наличии в материале ДНК штаммов штаммов возбудителя чумы дополнительных подвидов (caucasica, hissarica, ulegeica, altaica, talassica), то проводят второй этап, а именно постановку с праймерами «traA» и «YP02258».

Пары праймеров, используемые в способе характеризуют как:

- «vlm12for/ISrev216» - праймеры, специфические для вида Y.pestis, направляющие синтез специфической последовательности длиной 390 пар нуклеотидов (п.н.);

- «3а» - праймеры, специфические для вида Y.pestis, направляющие синтез специфической последовательности длиной 276 п.н.;

- «JS» - праймеры, специфически реагирующие с ДНК Y. pseudotuber-culosis, направляющие синтез специфической последовательности длиной 223 п.н.;

- «CDS39» - праймеры, специфические для всех штаммов дополнительных подвидов чумного микроба. Праймеры были сконструированы, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и имеют последовательности: «CDS39for» 5'-ТТА AAG GTC TGC GAA CTG GCT С-3' и «CDS39rev» 5'-ТСТ GCA TTG CGA AGG TAC TGA АС-3'. Праймеры направляют синтез специфической последовательности длиной 418 п.н.;

- «traA» - праймеры, специфические для штаммов дополнительного подвида чумного микроба «caucasica». Были сконструированы, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и имеют последовательность: «traAfor» 5'-TGT СТА ТТА ТТА ACG CTG TAC CCG С-3' и «traArev» 5'-CAG CTG GCA GTA TGG AAA TAC CTG-3'. Праймеры направляют синтез специфической последовательности длиной 472 п.н.;

- «YP02258» - праймеры, способные дифференцировать штаммы чумного микроба, относящиеся к вновь предложенному биовару «microtus». Штаммы биовара «microtus» в отличие от штаммов основного подвида и других штаммов дополнительных подвидов несут в гене araC, отвечающем за регуляцию арабинозного оперона, делецию 122 п.н. Присутствие упомянутой делеции приводит к невозможности синтезировать продукт амплификации в ПЦР при использовании праймеров «YP02258» и в этом случае реакция является отрицательной. При положительном результате праймеры направляют синтез специфической последовательности длиной 130 п.н.

Во время проведения этапов специфической индикации с целью определения штаммов возбудителя чумы можно применять набор праймеров в различных вариантах.

а) При идентификации по виду и внутривидовым группам бактерий из отдельных колоний в посевах проб, подозрительных на зараженность возбудителем чумы в ПЦР, используют полный набор праймеров.

б) При внутривидовой идентификации штаммов, ранее идентифицированных по микробиологическим и иммунохимическим тестам как принадлежащие к виду Y.pestis, в ПЦР используют сокращенный набор праймеров, включающих только «CDS39», «traA» и «YP02258». Анализ результатов ПЦР-тестирования проводят руководствуясь таблицей 1.

Таблица 1
Группы штаммов Характер реакции с праймерами
JS vlm12for/ISrev216 CDS39 traA YP02258
Все классические штаммы основного подвида (опасные для человека) - + + - - +
Группа штаммов основного подвида из Центральной Африки (опасные для человека) - + - - - +
Штаммы дополнительного подвида из высокогорных очагов Кавказа (опасность для человека подвергается сомнению) - + + + + +
Штаммы дополнительных подвидов из высокогорных очагов Центральной Азии (опасность для человека подвергается сомнению) - + + + - +
Штаммы дополнительных подвидов из высокогорных очагов Центральной Азии (авирулентны для человека) - + + + - -
Штаммы Yersinia pseudotuberculosis + - -

Перед постановкой ПЦР проводят предварительную подготовку материала. Массу бактерий, сформировавших колонию или газон, в каждой из проб стерильной стеклянной палочкой перемещают в бактериологическую стеклянную пробирку, содержащую 200 мкл физиологического раствора, после чего выделяют ДНК согласно (Методические указания МУ 1.3.1794-03. «Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I и II группы патогенности». - М.: - 2003. - 38 с.). Полученную тотальную ДНК исследуют в ПЦР с помощью праймеров «JS», специфичных для возбудителя псевдотуберкулеза, и праймеров, специфических для вида и различных внутривидовых групп Y.pestis. Условия постановки ПЦР перечень праймеров соответствовали указанным в таблице 2.

Таблица 2
Праймеры Условия реакции
Температура (°С) Время реакции Количество циклов
3а, JS, vlm12for/ISrev216, traA, CDS39, «YP02258» 94 5 мин 1
94 15 с 30
65 15 с
72 30 с
72 5 мин 1

Учет результатов проводят по каждой паре праймеров. Все результаты с используемыми праймерами оцениваются как положительные при наличии в ПЦР амплификатов известной длины, а именно: «3а» - 276 п.н., «JS» - 223 п.н., «vlm12for/ISrev216» - 390 п.н., «traA» - 472 п.н., «CDS39» - 418 п.н., «YP02258» - 130 п.н. Отрицательными считают результаты при отсутствии амплификатов или при их наличии, но с не характерным числом пар нуклеотидов. Суммарную оценку результатов проводят руководствуясь с таблицей 1.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется примерами проведения идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Yersinia pestis.

Пример 1

Культуру микробных клеток (отобранную с агаровой пластины питательной среды на одном из этапов экспресс-диагностики возбудителя чумы в материале), полученную из блох полевки, обозначается как проба №1, обеззараживают и выделяют ДНК, как описано ранее.

На первом этапе способа производят постановку ПЦР с праймерами: «3а»; «vlm12for/ISrev216»; «JS»; «CDS39». Для каждой пары праймеров применяют отдельную пробирку. Реакция проходит в объеме 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 mM Трис НСl, рН 8,5, 25 mM KCl, 1,5 mМ MgCl2, по 200 mkM каждого дНТФ, 0,1% ТритонХ-100, 10 mM 2-меркаптоэтанол, 1 ЕД Taq-полимеразы и по 5 рмоль каждого праймера. Реакцию амплификации проводят в программируемом термостате "Терцик". Условия амплификации включали стадии денатурации, отжига и элонгации, как описано в таблице 2. Продукты амплификации анализируют в 2% агарозном геле. В качестве контролей используют: а) отрицательный контроль - в пробирки с реакционной смесью вносят по 5 мкл дистиллированой воды; б) положительный контроль в виде ДНК штамма возбудителя чумы дополнительного подвида Yersinia pestis 1213- в пробирки с реакционной смесью вносят по 5 мкл выделенной ДНК; в) положительный контроль для праймеров «узнающих» только последовательности возбудителя псевдотуберкулеза - «JS». В пробирки с реакционной смесью вносят по 5 мкл выделенной ДНК штамма Yersinia pseudotuberculosis I. Результаты идентификации представлены в таблице 3.

Таблица 3
Материал Праймеры
vlm12for/ISrev216 JS CDS39
Проба №1 + + - +
ДНК Y.pestis 1213 + + - +
ДНК Y.pseudotuberculosis - - + -
Отрицательный контроль - - - -

Таким образом, на первом этапе ПЦР показала, Проба №1 содержит ДНК, взаимодействующую с праймерами «3а»; «vlm12for/ISrev216», итогом чего стала амплификация специфических фрагментов, характерных для возбудителя чумы и наличие специфического продукта амплификации, синтез которого направлялся праймерами «CDS39». Это свидетельствовало о том (см. таблицу 1), что выявленная ДНК принадлежит штамму одного из дополнительных подвидов, что потребовало проведения второго этапа ПЦР-тестирования для внутривидовой дифференциации. Производили постановку ПЦР с праймерами «traA» и «YP02258». В качестве контроля ДНК штамма возбудителя псевдотуберкулеза заменяем на ДНК штамма дополнительного подвида caucasica. Получаем результаты, представленные в таблице 4.

Таблица 4
Материал Праймеры
traA YP02258
Проба №1 + +
ДНК Y.pestis 1213 - -
ДНК Y.pestis 1709 + +
Отрицательный контроль - -

В пробе выявлена последовательность гена «traA», а праймеры «сканирующие» структуру araC-гена не выявили в нем каких-либо делеций. Согласно таблице 1 это свидетельствует о наличии в пробе №1 ДНК штамма возбудителя чумы из высокогорных очагов Кавказа, относящегося к подвиду caucasica, эпидемическая значимость которого подвергается сомнению.

Пример 2

На исследование поступила культура возбудителя, полученная после высева из органов белой мышки, зараженной материалом, подозрительным на наличие возбудителя чумы (проба №2).

Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 5.

Таблица 5
Материал Праймеры
vlm12for/ISrev216 JS CDS39
Проба №2 + + - -
ДНК Y.pestis 1213 + + - +
ДНК Y.pseudotuberculosis - - + -
Отрицательный контроль - - - -

На этом этапе исследование останавливаем, так как полученные результаты, синтез специфических фрагментов ДНК, направляемый только праймерами «3а» и «vlm12for/ISrev216», свидетельствуют о том (см. таблицу 1), что в пробе №2 выявлена ДНК штамма возбудителя чумы основного подвида, представляющего опасность для человека.

Пример 3

На исследование поступила культура неизвестного возбудителя, выделенная из органов лесной мыши, труп которой обнаружен в одном из сельских районов (проба №3).

Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1, за исключением того, что материалом для исследования была Проба №3. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 6.

Таблица 6
Материал Праймеры
vlm12for/ISrev216 JS CDS39
Проба №3 - - + -
ДНК Y.pestis 1213 + + - +
ДНК Y.pseudotuberculosis - - + -
Отрицательный контроль - - - -

Полученные результаты показывают, что в Пробе №3 обнаружена ДНК, характерная для возбудителя псевдотуберкулеза. Это доказывается амплификацией специфического фрагмента, синтез которого направляли праймеры «JS» (см. таблицу 1). Дальнейшие исследования в ПЦР не проводим.

Пример 4

На исследование поступила культура возбудителя, полученная из музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института, идентифицированная ранее как возбудитель чумы, выделенный в одном из Африканских очагов (проба №4).

Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1, за исключением того, что материалом для исследования была Проба №4. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 7.

Таблица 7
Материал Праймеры
vlm12for/ISrev216 JS CDS39
Проба №4 - + - -
ДНК Y.pestis 1213 + + - +
ДНК Y.pseudotuberculosis - - + -
Отрицательный контроль - - - -

Из всех пар праймеров, используемых на первом этапе исследования с Пробой №4, только праймеры «vlm12for/ISrev216» дали положительный результат. Это свидетельствовало о наличии в пробе штамма возбудителя чумы основного подвида (см. таблицу 1), ДНК которого не реагирует с праймерами «3а». Наши исследования показывают, что только группа штаммов из Центральной Африки обладает подобными свойствами.

Пример 5

На исследование поступила полевка с признаками инфекционного заражения. Из полевки высеяна чистая культура неизвестного возбудителя, обозначенная как проба №5.

Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1, за исключением того, что материалом для исследования была Проба №5. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 8.

Таблица 8
Материал Праймеры
vlm12for/ISrev216 JS CDS39
Проба №5 + + - +
ДНК Y.pestis 1213 + + - +
ДНК Y.pseudotuberculosis - - + -
Отрицательный контроль - - - -

Аналогичные данные были получены в Примере 1. Проводим второй этап исследования с праймерами «traA» и «YP02258». На втором этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 9.

Таблица 9
Материал Праймеры
traA YP02258
Проба №5 - -
ДНК Y.pestis 1213 - -
ДНК Y.pestis 1709 + +
Отрицательный контроль - -

На втором этапе постановке ПЦР в Пробе №5 обнаружена ДНК с делецией в гене, отвечающем за синтез арабинозы (согласно таблицы 1). Полученные результаты свидетельствовали о наличии в исследуемом материале ДНК возбудителя чумы дополнительного подвида, характерной для штаммов, которые предложены относить к биовару «Microtus». Установлено, что эти штаммы авирулентны для человека и не представляют какой-либо эпидемической опасности.

Пример 6

На исследование поступила чистая культура неизвестного возбудителя, выделенного из трупа песчанки, найденного в одном из очагов Монголии (проба №6).

Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1, за исключением того, что материалом для исследования была Проба №6. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 10.

Таблица 10
Материал Праймеры
vlm12for/ISrev216 JS CDS39
Проба №6 + + - +
ДНК Y.pestis 1213 + + - +
ДНК Y.pseudotuberculosis - - + -
Отрицательный контроль - - - -

Такие же данные получены в Примере 1. Проводим второй этап исследования с праймерами «traA» и «YP02258». На втором этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 11.

Таблица 11
Материал Праймеры
traA YP02258
Проба №6 - +
ДНК Y.pestis 1213 - -
ДНК Y.pestis 1709 + +
Отрицательный контроль - -

В пробе №6 обнаружена ДНК, характеризующаяся тем, что на 1 и 2 этапах исследования давала положительный результат с праймерами:

«3а», «vlm12for/ISrev216» - это свидетельствовало о том, что ДНК принадлежит штамму возбудителя чумы (см. таблицу 1);

«CDS39» позволило отнести выделенную культуру к дополнительному подвиду (см. таблицу 1);

«YP02258» - выявленный полноценный ген, отвечающий за способность усваивать арабинозу (положительный результат) привело к пониманию того, что культура не может быть отнесена к биовару «microtus» (см. таблицу 1).

Отрицательный результат с праймерами «traA» исключил возможность определить культуру, как выделенную из из высокогорных очагов Кавказа и относящуюся к дополнительному подвиду caucasica.

В итоге в пробе №6 выявлена культура возбудителя чумы одного из 4 дополнительных подвидов hissarica, ulegeica, altaica, talassica, но не имеющая отношения к биовару «microtus».

Следовательно, путем идентификации и внутривидовой дифференциации предложенный способ дает возможность четко разграничивать все штаммы, принадлежащие к виду Y.pestis на две группы:

1. Штаммы основного подвида эпидемически опасные и вирулентные для людей (типичные).

2. Штаммы дополнительных подвидов со сниженной эпидемической опасностью и с избирательной вирулентностью (атипичные).

Использование нового эффективного способа идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Y.pestis за счет применения комплекса более специфических праймеров («3а», «JS», «vlm12for/ISrev216») в сочетании с праймерами, тестирующими ранее не использованные последовательности («CDS39», «traA», «YP02258»), позволяет:

- идентифицировать принадлежность штаммов к видам Y.pestis и Y.pseudotuberculosis;

- выявлять штаммы с необычным устройством генома из очагов Африки, Центральной Азии, Закавказья;

- правильно оценивать эпидемическую опасность штаммов и соответственно ситуацию в природных очагах чумы для принятия мер контроля над чумой;

- корректно осуществлять выбор модельных штаммов при выяснении механизмов вирулентности для людей и при разработке способов определения этого свойства без обращения к модели людей - добровольцев;

- получать важные данные для решения актуальных вопросов таксономии и эволюции Y.pestis.

1. Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Ycrsinia pestis, включающий выделение ДНК из культуры клеток и проведение тестирования с использованием набора праймеров в реакции ПЦР, отличающийся тем, что тестирование проводят в два этапа: на первом для идентификации используют набор праймеров, состоящий из праймеров «3а», «vlm12for/ISrev216», «JS», «CDS39», которые взаимодействуют с ДНК пробы, при этом синтез специфических ДНК, направляемый праймерами «3а» и «vlm12for/ISrev216» подтверждает наличие в пробе ДНК штамма возбудителя чумы, а положительный результат с праймерами «CDS39» свидетельствует о наличии в пробе ДНК штамма Y. pestis одного из дополнительных подвидов, внутривидовую дифференциацию которых осуществляют вторым этапом, путем постановки ПЦР с праймерами «traA» и «YP02258», причем полученные с каждой парой праймеров результаты оценивают как положительные при наличии амплификатов известной длины, а именно: «3а» 276 п.н., «JS» 223 п.н., «vlm12for/ISrev216» 390 п.н., «traA» 472 п.н., «CDS39» 418 п.н., «YP02258» 130 п.н., при этом отрицательными считают результаты при отсутствии амплификатов или при их наличии, но с нехарактерным числом пар нуклеотидов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймеры «CDS39» конструируют, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и они имеют прямую и обратную нуклеотидную последовательности: «CDS39for» 5'-TTA AAG GTC TGC GAA CTG GCT C-3' и «CDS39rev» 5'-TCT GCA TTG CGA AGG TAC TGA AC-3'.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймеры «traA» конструируют, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и они имеют прямую и обратную нуклеотидные последовательности: «traAfor» 5'-TGT СТА ТТА ТТА ACG CTG TAC CCG C-3' и «traArev» 5'-CAG CTG GCA GTA TGG AAA TAC CTG-3'.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявленную культуру оценивают как возбудитель атипичной чумы, относящейся к одному из дополнительных подвидов (hissarica, ulegeica, altaica, talassica), если в результате ПЦР появляются амплификаты, свидетельствующие о положительной реакции с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «CDS39», «YP02258» и отрицательным результатом с праймерами «traA» и «JS».

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявленную культуру оценивают как возбудитель атипичной чумы, относящейся к дополнительному подвиду caucasica, если в результате ПЦР появляются амплификаты, свидетельствующие о положительной реакции с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «CDS39», «traA» и «YP02258» и отрицательной с праймерами «JS».

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что при внутривидовой дифференциации в случае отсутствия амплификации фрагмента ДНК в 130 п.н., направляемого праймерами «YP02258» с одновременным положительным результатом с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216» и «CDS39», выявленную культуру оценивают как культуру возбудителя чумы, характерную для биовара «microtus».

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявленную культуру оценивают как возбудитель псевдотуберкулеза, если в результате ПЦР с помощью праймеров «JS» синтезируется амплификат длиной 223 п.н.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и касается способа измерения резистентности к доцетакселу. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу скрининга новорожденных на такие наследственные заболевания, как муковисцидоз, врожденный гипотиреоз, галактоземия, фенилкетонурия, и может быть использовано для обнаружения большого количества мутаций в ДНК обследуемого за один анализ крови.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к изучению инфекционных заболеваний, и может быть использовано для моделирования стадийности течения инфекции, прогнозирования клинического исхода и оценки схем лечения в эксперименте.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой мутантный фотопротеин для определения внутриклеточного кальция одновременно в разных органеллах клетки, обладающий светоизлучающей функцией и характеризующийся аминокислотной последовательностью кальций-регулируемого фотопротеина дикого типа, в которой природные остатки фенилаланина, относящиеся к консервативным областям названной последовательности и соответствующие остатку 119 фотопротеина обелина Obelia longissima, а также остатку 88 обелина Obelia longissima заменены другими остатками, отличными от фенилаланина, замены которых приводят к тому, что чувствительность кальций-регулируемого фотопротеина к ионам кальция уменьшается по сравнению с фотопротеином дикого типа и изменяется длина волны испускаемого света по сравнению с фотопротеином дикого типа.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для прогнозирования возможности эпидемий. .
Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для диагностики энтерококков. .

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к оптическим способам определения количества таких микробиологических объектов, как бактерийные клетки, грибы, дрожжи в процессе их культивирования, и может быть использовано для диагностических целей в медицине, а также контроле биотехнологических процессов.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается подбора высокоактивных антибактериальных средств для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается подбора высокоактивных антибактериальных средств для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями

Изобретение относится к области молекулярной генетики и может быть использовано в научно-исследовательской практике при изучении механизмов развития первичной врожденной глаукомы (ПВГ)
Изобретение относится к выявлению госпитальных штаммов микроорганизмов в лечебно-профилактических учреждениях и проведению соответствующих противоэпидемических мероприятий в них
Изобретение относится к выявлению госпитальных штаммов микроорганизмов в лечебно-профилактических учреждениях и проведению соответствующих противоэпидемических мероприятий в них
Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к набору для обнаружения диагностически значимых генов и генов вирулентности возбудителя холеры в материале от больных людей и из объектов окружающей среды и набору для определения экспрессии данных генов, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных службах санэпиднадзора

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к модуляторам пути передачи сигнала HGF/c-met
Наверх