Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов о1 и о139 серогрупп и оценки их вирулентности

Изобретение раскрывает набор, состоящий из комплексной гено- и иммунодиагностической тест-системы, позволяющий проводить идентификацию природных штаммов холерного вибриона О1 и О139 серогрупп и определять их вирулентность на основе тестирования присутствия диагностически значимых генов и генов вирулентности и их экспрессии. Генодиагностическая тест-система включает специфические праймеры wbeW1 - wbeW2, wbfR1 - wbfR2, ctxA1 - ctxA2, tcpAc-lassica1-tcpAclassica2 и tcpAeltor1-tcpAeltor2 к участкам диагностически значимых генов и генов вирулентности. Иммуноферментная тест-система на основе дот-иммуноанализа (ДИА) содержит пять нитроцеллюлозных мембран с нанесенными контрольными образцами: О1 антиген серовара Инаба, О1 антиген серовара Огава, О139-антиген, токсин-корегулируемые пили адгезии, холерный токсин и пять поликлональных сывороток, содержащих антитела к данным антигенам. Иммуноферментная тест-система позволяет определять экспрессию выявляемых генов. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет проводить многофакторный анализ природных штаммов холерного вибриона, выявляя диагностически значимые гены и гены вирулентности, а также оценивать эффективность их экспрессии. 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к набору для обнаружения диагностически значимых генов и генов вирулентности возбудителя холеры в материале от больных людей и из объектов окружающей среды и набору для определения экспрессии данных генов, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных службах санэпиднадзора.

Из известных 206 серогрупп V. cholerae только холерные вибрионы O1 и O139 серогрупп способны вызывать развитие холерной инфекции. В свою очередь, вибрионы O1 серогруппы относятся к двум биоварам - классическому и эльтор, отличающимся по биохимическим свойствам и структуре генома. В настоящее время холерные вибрионы классического биовара, которые вызвали, видимо, первые шесть пандемий азиатской холеры (1817-1923 гг.), сохранились только на эндемичной по холере территории (Бангладеш, Индия), образуя природный резервуар генов вирулентности. Возбудителем текущей седьмой пандемии холеры являются вирулентные штаммы V. cholerae биовара эльтор, способные к существованию как в организме больного, так и во внешней среде. Кроме того, начиная с 1992 г., регистрируются вспышки холеры, вызванные V. cholerae O139 серогруппы. Между тем наряду с вирулентными штаммами в различных объектах окружающей среды широко распространены авирулентные штаммы V. cholerae O1 серогруппы биовара эльтор и O139 серогруппы, лишенные генов вирулентности и не представляющие эпидемической опасности [1]. Принято считать, что основным критерием эпидемически опасных штаммов является присутствие в их геноме генов ctxA, кодирующих продукцию холерного токсина (XT), вызывающего профузную диарею - основной клинический синдром холеры, и генов tcpA, ответственных за синтез токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА) - основного фактора колонизации кишечника человека. Гены wbe- и wbf, кодирующие поверхностные 01 (сероваров Инаба или Огава)- и O139 - антигены, позволяют идентифицировать штаммы холерного вибриона и соответственно определяют принадлежность к O1 или O139 серогруппам [1]. При проведении мониторинговых исследований необходимы сведения не только о присутствии генов вирулентности в выделенных изолятах, но и об эффективности их экспрессии. Именно синтез клеткой факторов вирулентности определяет развитие инфекционного процесса и обуславливает возможность эпидемического распространения холеры. Следует также учитывать, что выявление специфических генов холерных вибрионов в объектах окружающей среды не означает наличия в указанной пробе жизнеспособных вибрионов. Специфическая ДНК может находиться либо в составе погибших клеток, либо в виде некультивируемых форм возбудителя. Один из подходов решения этой задачи состоит в создании комплексной гено- и иммунодиагностической тест-системы, позволяющей провести многофакторный анализ природных штаммов, определяя наличие диагностически значимых генов и генов вирулентности, а также их экспрессию. Такая тест-система обеспечит проведение более эффективного мониторинга внешней среды с целью обнаружения в ней эпидемически опасных штаммов V. cholerae разных серогрупп.

В настоящее время разработаны и внедрены в практику различные ПЦР тест-системы на основе использования одного-двух генов - «ГенХол» (производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г.Саратов), позволяющие детектировать ген ctxA, «Тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции» (НИИ микробиологии Минобороны России и Ростовский НИПЧИ) [2]. Известно комплексное ПЦР-тестирование штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров, выделенных из объектов внешней среды, от больных и носителей на наличие в их геноме видоспецифического гена hapA и трех генов вирулентности (ctxA, tcpA, toxR) [3]. Созданы комплексные тест-системы «Мульто-Cholerae» и «АмплиСенс V. cholerae» (производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, г.Москва и ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г.Саратов), позволяющие выявлять ДНК холерных вибрионов в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Последние два препарата позволяют провести идентификацию возбудителя, тестируя ген hlyA, определить серогруппу по наличию амплификатов фрагментов генов wbeT (O1 серогруппа) или wbeF (O139 серогруппа) и проводить идентификацию вирулентных клонов по наличию генов ctxA и tcpA [4]. Однако данные генодиагностические тест-системы позволяют определять только присутствие диагностически значимых генов и генов вирулентности, но не оценивать их экспрессию.

Для изучения экспрессии O-антигена и холерного токсина разработаны иммуно-ферментные тест-системы на основе моноклональных антител [5]. Известна иммуносерологическая коагглютинирующая тест-система на основе препарата рекомбинантной В-субъединицы холерного токсина для выявления токсина в клиническом материале [6]. Данные тест-системы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, но их недостатком является только идентификация и выявление синтеза одного фактора вирулентности холерного вибриона.

Для изучения присутствия O-антигенов, ТКПА, холерного токсина и В-субъединицы холерного токсина в вакцинных препаратах и экспрессии генов, кодирующих данные антигены, авторами предложена иммуноферментная тест-система на основе поликлональных антител [7]. Тест-система состоит из набора, содержащего очищенные O1 антигены сероваров Инаба и Огава, O139 антиген, ТКПА, холерный токсин, В-субъединицу холерного токсина и поликлональные сыворотки к ним. Однако с помощью данной тест-системы возможно только изучение экспрессии генов, но она не предназначена для тестирования присутствия диагностически значимых генов и генов вирулентности, поэтому не возможно установить причину отсутствия синтеза конкретного антигена - с отсутствием гена или с отсутствием экспрессии данного гена.

Известен способ обнаружения некультивируемых форм Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп и прогнозирования их потенциальной способности к реверсии методом иммуноферментного анализа, в котором используют набор специфических моноклональных антител, полученных к различным эпитопам O-антигена липополисахарида штаммов холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп [8]. Однако с помощью данного способа возможно лишь обнаружение холерных вибрионов без оценки их вирулентности.

Известен набор для идентификации энтерогеморрагических штаммов Escherihia coli [9], состоящий из иммуномагнитной разделительной тест-системы и тест-системы для постановки мультиплексной ПЦР. Иммуномагнитная разделительная тест-система содержит носитель - магнитные латексные частицы и сенситин - белок А, ковалентно связанный со специфическими иммуноглобулинами кролика к полисахаридным фракциям липополисахарида O157, O26, O55, O111, O113, O117, серотипам и белковым жгутиковым антигенам Н7, Н11, Н8, Н21, Н14. Тест-система для постановки ПЦР содержит буфер со специфическими праймерами для идентификации генов stx1, stx 2, rfb, fliC энтерогеморрагических E.coli и контрольные суспензии бактерий. Однако данный набор позволяет идентифицировать и определять патогенность только штаммов кишечной палочки, а не холерного вибриона.

В настоящее время в научно-технической и патентной литературе данных о тест-системах, позволяющих проводить идентификацию штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп и определять их вирулентность на основе одновременного проведения гено- и иммунодиагностики, не обнаружено.

Задача изобретения - создать комплексную тест-систему, позволяющую одновременно проводить идентификацию штаммов O1 и O139 серогрупп и определять их вирулентность на основе тестирования присутствия в геноме диагностически значимых генов и генов вирулентности и оценки их экспрессии.

Поставленная задача достигается созданием комплексной гено- и иммунодиагностической тест-системы, состоящей из ПЦР тест-системы, включающей специфические праймеры wbeW1- wbeW2, wbfR1- wbfR2, ctxA1-ctxA2, tcpAclassica1-tcpAclassica2, tcpAeltor1-tcpAeltor2 к участкам диагностически значимых генов и генов вирулентности, и иммуноферментной тест-системы на основе дот-иммуноанализа, содержащей нитроцеллюлезные мембраны на каждую из которых, в качестве положительного контрольного образца, нанесены соответственно O1 антиген серовара Инаба, O1 антиген серовара Огава, O139-антиген, токсин-корегулируемые пили адгезии, холерный токсин, отрицательный контроль, а также поликлональные антисыворотки, специфичные к соответствующим антигенам, коньюгат, растворы для блокировки свободных сайтов связывания, отмывки НЦМ, разведения коньюгата, проявитель. Олигонуклеотидные праймеры на гены wbeW, wbfR, ctxA, tcpAclassica, tcpAeltor приведены в таблице 1 и имеют следующие последовательности:

к участку гена wbeW, входящего в кластер генов, кодирующих биосинтез O1 антигена:

wbeW1 5' - gcg ttt gta gtg ctc gtc att - 3',

wbeW2 5' - ttt acg tga atg caa agt ggc - 3'

обеспечивают образование фрагмента, размером 614 п.н.;

к участку гена wbfR, входящего в кластер генов, кодирующих биосинтез O139 антигена:

wbfR1 5' - atg tgc ggt gta gcg ggt ttt a - 3'

wbfR2 5' - cga tcc cga atc aag atc aac tgt - 3'

обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента, размером 428 п.н.;

к участку гена ctxA, кодирующего А субъединицу холерного токсина, ответственную за токсическую активность:

ctxA1 5' - cgg gca gat tct aga cct cct g - 3'

ctxA2 5' - cga tga tct tgg agc att ccc ас - 3'

обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК, размером 564 п.н.;

к участку гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии холерных вибрионов эльтор биовара:

tcpAeltor1 5' - gaa gaa gtt tgt aaa aga aga аса с - 3'

tcpAeltor2 5' - gaa agg acc ttc ttt cac gtt g - 3'

обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента, размером 471 п.н.;

к участку гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии холерных вибрионов классического биовара:

tcpAclassica1 5' - cac gat aag aaa acc ggt caa gag - 3'

tcpAclassica2 5' - acc aaa tgc aac gcc gaa tgg agc - 3'

обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента, размером 617 п.н.

Олигонуклеотидные праймеры wbeW1- wbeW2, wbfR1- wbfR2, используемые для амплификации диагностически значимых генов wbeW, wbfR, высокоспецифичны и рассчитаны авторами на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у штамма V. cholerae N16961, представленных в базе данных GenBank.

К моменту разработки заявляемой ПЦР тест-системы праймеры ctxA1-ctxA2, tcpAclassica1-tcpAclassica2, tcpAeltor1-tcpAeltor2 на гены вирулентности ctxA, tcpAclassica, tcpAeltor описаны в литературе [10, 11]. Указанные праймеры выявляют фрагмент гена ctxA, кодирующего продукцию холерного токсина, а также фрагмент гена tcpA, кодирующего продукцию токсин-корегулируемых пилей адгезии, являющегося не только геном вирулентности, но и обладающего биовароспецифичностью, что позволяет дифференцировать биовар изучаемых штаммов холерного вибриона.

Подобранный набор праймеров wbeW1- wbeW2, wbfR-1- wbfR2, ctxA1-ctxA2, tcpAclassica1-tcpAclassica2, tcpAeltor1-tcpAeltor2 ПЦР тест-системы позволяет идентифицировать штаммы холерного вибриона O1 и O139 серогрупп с одновременным определением их вирулентности.

Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система содержит также иммуноферментную тест-систему, предназначенную для оценки экспрессии диагностически значимых генов и ключевых генов вирулентности в штаммах холерного вибриона.

В состав тест-системы входят:

1. Полоски нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ) с размером пор 0,45 мкм с очерченными квадратами для нанесения исследуемых образцов в количестве 5 штук из расчета на одно исследование. Ширина и длина мембраны позволяет одновременно наносить 10 исследуемых образцов. В первый и последний квадраты мембраны нанесены аликвотами по 2 мкл положительный и отрицательный контрольные образцы. В качестве положительного контрольного образца на одну из мембран нанесен антиген Инаба, на другую мембрану - антиген Огава, на следующие соответственно - O139 антиген, холерный токсин и белок ТКПА. В качестве отрицательного контроля на всех пяти мембранах используют любой белковый препарат, например 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) или нормальную кроличью сыворотку.

2. Поликлональные сыворотки, содержащие соответственно антитела к O1 антигену Инаба, O1 антигену Огава, O139 антигену, холерному токсину в разведении 1:200 и к токсин-корегулируемым пилям адгезии в разведении 1:3000;

3. Раствор для блокировки свободных сайтов связывания;

4. Раствор для отмывки НЦМ;

5. Коньюгат. В качестве коньюгата возможно использование любого коммерческого препарата, содержащего антитела диагностические против IgG кролика, меченные пероксидазой;

6. Раствор для разведения коньюгата;

7. Проявитель для выявления пероксидазы. Субстратами для проявления пероксидазы могут быть 0,01 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,2-7,4 (ФСБ), 0,025% раствор перекиси водорода, 0,0125% раствор диаминобензидина или коммерческий препарат «Peroxidase substrate Kit DAB» (Cat.SK-4100) производства «Vector Lab. Inc.», Burlingem, CA, США.

Очищенные антигены холерного вибриона: O1 антиген Инаба, O1 антиген Огава, O139 антиген, холерный токсин, белок ТКПА и сыворотки, содержащие антитела к данным антигенам, получены по ранее описанным методикам [7, 12].

Заявляемая комплексная тест-система, включающая ПЦР тест-систему и иммуно-диагностическую, работает следующим образом.

Схема идентификации холерных вибрионов О1 и O139 серогрупп и определения их вирулентности с использованием ПЦР тест-системы включает следующие этапы:

Приготовление образцов.

Для получения образцов проводят выращивание штаммов V. cholerae на чашках Петри с твердой питательной средой, используемой для культивирования холерных вибрионов (LB агар, рН 7,6; щелочной агар, рН 8,0; агар Хоттингера, рН 7,6, агар из настоя сердечной мышцы, рН 7,6), которые инкубируют при 37°C в течение 18 ч.

Клетки холерных вибрионов ресуспендируют в 0,85% растворе натрия хлорида до концентрации 109 микробных клеток в 1 мл согласно инструкции по применению отраслевого стандартного образца (ОСО 42-28-59-86П) для визуального определения мутности бактериальных взвесей и делают ряд разведений в деионизованной воде до конечной концентрации 107 микробных клеток в 1 мл. Затем суспензию инактивируют посредством кипячения в течение 30 мин при 100°C, центрифугируют при 12000 g в течение 5 мин. Для проведения ПЦР используют супернатант в объеме 10 мкл.

Постановка ПЦР.

Общую реакционную смесь готовят, исходя из того, что на одну пробу необходимо: H2O - 9,1 мкл, 2,5 мкл 10-кратного буфера, содержащего 70 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 20 мМ (NH4)2SO4, 0,1% Твин-20, 200 мкг/мл БСА, 2,5 мкл дНТФ (водный раствор дезокси-рибонуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ - концентрация каждого 2 мМ), 1,2 мкл 50 mM MgCl2, по 0,3 мкл прямого и обратного праймеров и 0,3 мкл ДНК-полимеразы. Смесь тщательно перемешивают на вортексе и переносят в пробирки по 15 мкл. Наслаивают на поверхность по 25-30 мкл минерального масла. Одноразовыми наконечниками с аэрозольным барьером во все пробирки, кроме контрольных, вносят под масло по 10 мкл образцов. В пробирку для положительного контроля вносят 10 мкл лизата клеток контрольных штаммов. Например, для контроля по гену ctxA и tcpAclassica1,2 можно использовать штамм V. cholerae 569B O1 серогруппы классического биовара, для праймеров на tcpAeltor1,2 и wbeW - V. cholerae 34 Филипп O1 серогруппы эльтор биовара, для wbfR - V. cholerae P16064 O139 серогруппы или другие проверенные штаммы соответствующей серогруппы и биовара. В пробирку для отрицательного контроля вносят 10 мкл деионизованной воды.

Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов:

1. Для генов wbeW и wbfR (праймеры wbeW1,2 и wbfR1,2): 94°C - 2 мин - 1 цикл; 95°C, 57°C, 72°C по 45 сек - 35 циклов; 57°C - 45 сек, 72°C - 3 мин · 5 циклов;

2. Для гена ctxA (праймер ctxA1,2): 95°C - 5 мин - 1 цикл; 95°C, 60°C, 72°C по 30 сек - 35 циклов; 72°C - 7 мин - 1 цикл;

3. Для гена tcpA (праймеры tcpAeltor1,2 и tcpAclassica1,2): 95°C - 5 мин - 1 цикл; 95°C -1 мин, 56°C - 1 мин, 72°C - 1 мин - 35 циклов; 72°C - 7 мин - 1 цикл.

По окончании ПЦР реакционную смесь (продукты реакции) хранят при температуре 4°C. Продукты ПЦР анализируют методом горизонтального гель-электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле («Промега», США). Оценку результатов проводят при сравнении полученных полос с положительными контролями. У холерных вибрионов, содержащих ген wbeW, выявляется полоса в 614 п.н., wbfR - 428 п.н., ctxA - 564 п.н; tcpA эльтор типа - 471 п.н, tcpA классического типа - 617 п.н.

Схема оценки экспрессии диагностически значимых генов и генов вирулентности штаммов V. cholerae с использованием иммунодиагностической тест-системы методом дот-иммуноанализа включает следующие этапы:

Приготовление образцов.

Для получения образцов исследуемые штаммы культивируют в условиях, оптимальных для продукции основных факторов вирулентности холерными вибрионами разных серогрупп и биоваров - в LB-бульоне (рН 7,2) при 30°C с аэрацией (круговая качалка) в течение 18 ч (O1 серогруппа классического биовара) и AKI бульоне (рН 7,4) при 37°C, сначала стационарно в течение 4-х часов, затем 16 часов при 37°C на шейкере (O1 серогруппа эльтор биовара и O139 серогруппа). Для определения присутствия О антигенов используют образцы, полученные при любом методе выращивания, так как О антиген синтезируется как в LB, так и в AKI бульонах. В тоже время при определении синтеза XT и ТКПА необходимо использовать два образца, полученных при выращивании культуры и в LB, и в AKI бульонах. Полученную культуру обеззараживают путем добавления в бульон 37% р-ра формальдегида до конечной концентрации 0,6%. Смесь перемешивают в течение 15 мин и выдерживают не менее 14 ч. Биомассу отделяют от бульона центрифугированием при 8-10000 g и получают две фракции - осадок и надосадок. Осадок разводят физиологическим раствором до концентрации 3,0×106 м.кл./мл и используют для определения ТКПА. В надосадке определяют содержание O-антигена и холерного токсина. Чувствительность тест-системы в ДИА при выявлении секретируемого холерного токсина составляет 0,3 мкг/мл.

Постановка дот-иммуноанализа.

ДИА выполняют по общей схеме: нанесение образцов в определенные точки на подложке, инкубация подложек в блокирующем растворе, в промывочном растворе, в рабочем разведении соответствующих антител, в растворе коньюгата, в отмывочном растворе, в субстрате для проявления метки, в дистиллированной воде.

Для определения синтеза O1 антигена Инаба, O1 антигена Огава или O139 антигена на нитроцеллюлозные мембраны, на каждую из которых нанесен один из положительных контрольных образцов - антиген Инаба, Огава, O139 антиген, наносят 2 мкл надосадка исследуемых культур, выращенных в любой из двух жидких сред.

Для определения экспрессии холерного токсина на нитроцеллюлозную мембрану с положительным контрольным образцом - холерным токсином наносят по 2 мкл надосадка образцов, выращенных в LB и AKI бульонах.

Для определения присутствия ТКПА на нитроцеллюлозную мембрану с положительным контрольным образцом - белок ТКПА наносят по 2 мкл осадка культур, выращенных в LB и AKI бульонах.

Затем все мембраны с нанесенными образцами высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 30 мин. Для блокирования неспецифических сайтов связывания мембрану с контрольным образцом - белком ТКПА помещают в раствор коммерческого препарата сыворотки диагностической холерной О адсорбированной производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г.Саратов) в рабочем разведении 1:200 в ФСБ. Остальные мембраны погружают в блокирующий раствор, содержащий 0,01 М натрий-фосфатный буфер (рН 7,2-7,4), 0,1% твин-20, 1% БСА или 0,1% раствор высокомолекулярного полимера ПЭГ-20М, и оставляют на 60 мин при температуре 37°C. Затем мембраны отмывают три раза по 5 мин в растворе 0,01 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,2-7,4) с 0,1% твин-20 или деионизованной воде.

После отмывки мембраны погружают в соответствующий контрольному образцу рабочий раствор поликлональных сывороток, содержащих соответственно антитела к O1 антигену Инаба, O1 антигену Огава, O139 антигену, холерному токсину и токсин-корегулируемым пилям адгезии. Затем их в течение 60-90 мин инкубируют при 37°C, отмывают и помещают в рабочий раствор конъюгата на 60 минут при 37°C, вновь трижды отмывают и помещают в проявитель на 3-5 минут для выявления пероксидазы. Затем мембраны промывают в деионизованной воде и высушивают на воздухе.

Учет результатов.

Наличие на мембране коричневого окрашенного пятна одновременно в контрольном и исследуемом образце указывает на положительный результат.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Апробация комплексной тест-системы на лабораторных штаммах V. cholerae.

В качестве примера, подтверждающего диагностическую значимость разработанной тест-системы, были использованы шесть хорошо изученных в лабораторных условиях и на модельных животных штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп:

- вирулентные штаммы O1 серогруппы классического биовара - V. cholerae 569B, серовара Инаба и V. cholerae Дакка 35 серовара Огава, синтезирующие соответственно 9,0 и 13,0 мкг/мл XT, а также ТКПА, определяемые методом иммуноблоттинга;

- штаммы O1 серогруппы эльтор биовара: вирулентный - V. cholerae 34 Филип серовара Огава, экспрессирующий 0,45 мкг/мл XT, и ТКПА, выявляемые методом иммуноблоттинга, и авирулентный - V. cholerae 1420 серовара Инаба, не синтезирующий указанные факторы вирулентности.

- штаммы O139 серогруппы: вирулентный - V. cholerae P16064, синтезирующий in vitro только XT; авирулентный - V. cholerae 230, не экспрессирующий XT и ТКПА.

Комплексная тест-система в штаммах V. cholerae 569B и Дакка 35 выявляла фрагменты генов wbeW, ctxA, tcpAclassica, а также наличие холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, соответственно O1 антигена серовара Инаба и O1 антигена серовара Огава. У штамма V. cholerae 34 Филип были обнаружены фрагменты генов wbeW, ctxA, tcpAeltor и синтез O1 антигена серовара Огава, XT и ТКПА. У штамма V. cholerae 1420 выявлен ген wbeW и синтез O1 антигена серовара Инаба. У штамма V. cholerae P16064 были выявлены фрагменты генов wbfR, ctxA, tcpAeltor и продукция O139 антигена и XT (ТКПА данный штамм синтезирует только in vivo). У штамма V. cholerae 230 обнаружен только фрагмент гена wbfR и экспрессия O139 антигена.

Полученные результаты приведены в таблице 2.

Пример 2. Апробация комплексной тест-системы на коллекционных штаммах.

Для анализа были взяты тридцать шесть штаммов, хранившихся в лиофилизированном состоянии в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (г.Саратов).

Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система не выявляла штаммы близкородственных видов - V. mimicus, V. parahaemolyticus, V. anguillarum, а также энтеробактерий - Salmonella, E.coli, Shigella, что подтверждает ее специфичность.

Выявление фрагментов генов wbeW или wbfR с помощью ПЦР тест-системы позволяет проводить идентификацию холерных вибрионов, определяя принадлежность к O1 или O139 серогруппе. Наличие O1 антигена серовара Инаба/Огава или O139 антигена, выявленных с помощью иммунодиагностической тест-системы, указывает на экспрессию указанных генов и дает возможность определять серовар штаммов O1 серогруппы.

Выявление фрагментов генов tcpAclassica или tcpAeltor с помощью генодиагностической тест-системы указывает на присутствие в геноме V. cholerae гена вирулентности и позволяет определить биовар (классический или эльтор). Наличие положительной пробы при определении ТКПА с помощью иммунодиагностической тест-системы указывает на продукцию штаммом токсин-корегулируемых пилей адгезии.

Выявление фрагмента гена ctxA с помощью генодиагностической тест-системы указывает на присутствие в геноме анализируемого штамма гена вирулентности. Наличие положительной пробы при определении XT с помощью иммунодиагностической тест-системы указывает на экспрессию штаммом холерного токсина.

Штаммы холерного вибриона, содержащие гены ctxA, topA и синтезирующие XT и ТКПА, являются вирулентными.

Штаммы V. cholerae, не содержащие фрагментов генов ctxA, tcpA и не синтезирующие XT и ТКПА, являются авирулентными.

Штаммы V. cholerae, содержащие фрагменты гена(ов) ctxA и/или tcpA, но не экспрессирующие XT и/или ТКПА, а также штаммы V. cholerae, содержащие один из генов вирулентности или продуцирующие один из факторов вирулентности, относятся к штаммам, требующим дополнительной проверки, так как штаммы, не содержащие ген ctxA и не синтезирующие XT, но имеющие ген tcpA и синтезирующие ТКПА, являются потенциально вирулентными. В результате горизонтального переноса такие штаммы способны приобрести гены холерного токсина и стать вирулентными, поскольку ТКПА являются рецептором для фага СТХφ, содержащего гены ctxAB. Штаммы V. cholerae, не содержащие фрагментов генов ctxA и tcpA, но дающие положительную реакцию при определении продукции ТКПА, возможно, синтезируют новый тип пилей, подобных ТКПА [13], поэтому могут колонизировать кишечник. Полученные данные указывает на возможность использования тест-системы для анализа атипичных штаммов и возможность обнаружения дополнительных факторов патогенности холерного вибриона.

Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таким образом, изобретение осуществимо практически и позволяет выявлять диагностически значимые гены и гены вирулентности, а также оценивать эффективность их экспрессии, что способствует проведению многофакторного анализа природных штаммов холерного вибриона и своевременному обнаружению вирулентных клонов V. cholerae во внешней среде.

Таблица 1
Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и оценки их вирулентности
Ген Нуклеотидная последовательность праймера (5'-3') Размер ампликона (п.н.)
к участкам диагностически значимых генов
wbeW1 gcg ttt gta gtg ctc gtc att 614
wbeW2 ttt acg tga atg caa agt ggc
wbfR1 atg tgc ggt gta gcg ggt ttt a 428
wbfR2 cga tcc cga atc aag atc aac tgt
к участкам генов вирулентности
ctxA1 cgg gca gat tct aga cct cct g 564
ctxA2 cga tga tct tgg agc att ccc ac
tcpAeltor1 gaa gaa gtt tgt aaa aga aga аса с 471
tcpAeltor2 gaa agg acc ttc ttt cac gtt g
tcpAclassica1 cac gat aag aaa acc ggt caa gag 617
tcpAclassica2 acc aaa tgc aac gcc gaa tgg agc
Таблица 2
Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и оценки их вирулентности
Штамм V. cholerae Наличие генов Синтез поверхностных антигенов Синтез XT
wbeW wbfR ctxA tcpA classica tcpA eltor O1 антиген Инаба O1 антиген Огава O139 антиген ТКПА
569В (O1 серогруппа классического бирвара серовара Инаба, вирулентный) + - + + - + - - + +
Дакка 35 (O1 серогруппа классического биовара серовара Огава, вирулентный) + - + + - - + - + +
34 Филип (O1 серогруппа эльтор биовара серовара Огава, вирулентный) + - + - + - + - + +
Р16064 (O139 серогруппа, вирулентный) - + + - + - - + - +
M1420 (O1 серогруппа эльтор биовара серовара Инаба, авирулентный) + - - - - + - - - -
230 (O139 серогруппа, авирулентный) - + - - - - - + - -
Примечание: «-» - отрицательный, «+» - положительный результаты
Таблица 3
Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп и оценки их вирулентности
Исследуемые штаммы Тестируемые гены Синтез антигенов
wbeW wbfR ctxA tcpAclassica tcpAeltor O1 антиген Инаба O1 антиген Огава O139 антиген ТКПА Холерный токсин
1 V. cholerae M16 + - + + - - + - + +
2 V. cholerae M29 + - + + - - + - + +
3 V. cholerae M9 + - + + - - + - - +
4 V. cholerae P3644 + - + - + + - - + +
5 V. cholerae P18796 + - - - + - + - + -
6 V. cholerae P18797 + - - - + - + - + -
7 V. cholerae M1260 + - + - + - + - + +
8 V. cholerae M964 + - + - + + - - + -
9 V. cholerae M999 + - - - - - + - + -
10 V. cholerae M1085 + - + - + + - - - +
11 V. cholerae M1430 + - + - + - + - + -
12 V. cholerae M998 + - - - - - + - + -
13 V. cholerae 1132 + - - - - - + - - -
14 V. cholerae P18751 + - - - - - + - - -
15 V. cholerae M1425 + - - - - - + - + -
16 V. cholerae MO45 - + + - + - - + + -
17 V. cholerae KM115 - + - - - - - + - -
18 V. cholerae 1396 + - + - + - + - + -
19 V. cholerae ATCC14033 + +
20 V. cholerae M1324 + - - - - - + - - -
21 V. cholerae 203 + - - - + - + - - -
22 V. cholerae 76/9 + - - - - + - - - -
23 V. cholerae M1167 + - + - + - + - + +
24 V. cholerae M1326 + - + - + - + - + +
25 V. cholerae M22 + - + + - - + - + +
26 V. cholerae 5/65 + - + - + - + - - -
27 V. cholerae CW-6 + - + - - - + - - -
28 V. cholerae 128/64 + - - - + - + - - -
29 V. cholerae 5/66 + - + - - + - - - -
30 V. cholerae 34 Каюм + - - - + - + - - -
31 V. mimicus ATCC33653 - - - - - - - - - -
32 V. parahaemolyticus 964 - - - - - - - - - -
33 V. anguillarum ATCC19264 - - - - - - - - - -
34 E.coli 1702 - - - - - - - - - -
35 Salmonella typhy abdominalis 25 - - - - - - - - - -
36 Shigella dys. sonnei 59117 - - - - - - - - - -
Примечание: «-» - отрицательный, «+» - положительный результаты

Источники информации

1. Kaper J. В., Morris J.G., Levin M.M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8:48-89.

2. Лабораторная диагностика холеры. Методические указания МУК 4.2.2218-07. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. - М: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2007, 87 с.

3. Челдышова Н.Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae O1 c различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA. Автореферат дис.… канд. мед. наук. Саратов, 2002, 24 с.

4. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. М., 2008.

5. Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Мазрухо Б.Л. И др. Моноклональные антитела к липополисахариду Vibrio cholerae O139. Биотехнология. 2002; 2:79-84.

6. Шеклакова Л.А., Рубцов И.В., Белая Ю.А., Петрухин В.Г., Белый Ю.Ф. Получение рекомбинантной В-субъединицы холерного энтеротоксина и разработка иммуносерологической тест-системы для его определения. Клин. Лаборат. Диагностика. 2005; 9: 40 с.

7. Захарова Т.Л., Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Крепостнова И.М., Киреев М.Н. Смирнова Н.И. Создание многокомпонентной диагностической иммуноферментной тест-системы для оценки экспрессии основных генов вирулентности у холерных вибрионов. Биотехнология. 2008; 1:88-96.

8. Патент RU №2287824 C2. «Способ обнаружения некультивируемых форм Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп и прогнозирования их потенциальной способности к реверсии», 2006.

9. Патент RU №2270253 C2. «Набор для идентификации энтерогеморрагических Escherichia coli», 2006.

10. Fields P.I., Popovic Т., Wachsmuth К., Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic. J. Clin. Microbiol. 1992; 30:2118-2121.

11. Keasler S.P., Hall R.N. Detecting and biotyping V. cholerae O1 with multiplex polimerase chain reaction. Lancet. 1993; 341:1661.

12. Заднова С.П., Топорков А.В., Новикова О.В., Смирнова Н.И. Получение и использование антител на токсин-корегулируемые пили адгезии холерного вибриона. Биотехнология. 2003; 1:79-84.

13. Fullner K.J., Mekalanos J.J. Genetic characterization of a new type IV-a pilus gene cluster found in both classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 1999; 67(3):1393-1404.

1. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов и определения их вирулентности, характеризующаяся тем, что содержит ПЦР тест-систему, включающую набор специфических праймеров wbeW1 - 5' - gcg ttt gta gtg ctc gtc att - 3', wbeW2 - 5' - ttt acg tga atg caa agt ggc - 3', wbfR1 - 5' - atg tgc ggt gta gcg ggt ttt a - 3', wbfR2 - 5' - cga tcc cga atc aag atc aac tgt - 3' к участкам диагностически значимых генов и ctxA1 - 5' - cgg gca gat tct aga cct cct g - 3', ctxA2 - 5' - cga tga tct tgg agc att ccc ac - 3', tcpAclassica1 - 5' - cac gat aag aaa acc ggt caa gag - 3', tcpAclassica2 - 5' - асе aaa tgc aac gcc gaa tgg agc - 3', tcpAeltor1 - 5' - gaa gaa gtt tgt aaa aga aga аса с - 3', tcpAeltor2 - 5' - gaa agg асc ttc ttt cac gtt g - 3' к участкам генов вирулентности, и иммуноферментную тест-систему, предназначенную для оценки экспрессии диагностически значимых генов и генов вирулентности, на основе дот-иммуноанализа, содержащую нитроцеллюлезные мембраны, на каждую из которых в качестве положительного контрольного образца нанесены соответственно О1 антиген серовара Инаба, О1 антиген серовара Огава, О139-антиген, токсин-корегулируемые пили адгезии, холерный токсин, отрицательный контроль, а также поликлональные антисыворотки, специфичные к соответствующим антигенам, конъюгат, растворы для блокировки свободных сайтов связывания, отмывки НЦМ, разведения конъюгата, проявитель.

2. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве отрицательного контроля используют белковый препарат: 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина или нормальную кроличью сыворотку.

3. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве раствора для блокировки свободных сайтов связывания используют раствор коммерческого препарата сыворотки диагностической холерной О адсорбированной, а также 0,01 М натрий-фосфатный буфер (рН 7,2-7,4), 0,1% твин-20, 1% БСА или 0,1%-ный раствор высокомолекулярного полимера ПЭГ-20М.

4. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве коньюгата используют любой коммерческий препарат, содержащий антитела диагностические против IgG кролика, меченные пероксидазой.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к выявлению госпитальных штаммов микроорганизмов в лечебно-профилактических учреждениях и проведению соответствующих противоэпидемических мероприятий в них.

Изобретение относится к области молекулярной генетики и может быть использовано в научно-исследовательской практике при изучении механизмов развития первичной врожденной глаукомы (ПВГ).

Изобретение относится к области медицины и касается способа измерения резистентности к доцетакселу. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу скрининга новорожденных на такие наследственные заболевания, как муковисцидоз, врожденный гипотиреоз, галактоземия, фенилкетонурия, и может быть использовано для обнаружения большого количества мутаций в ДНК обследуемого за один анализ крови.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к олигонуклеотиду с двойной специфичностью, способу его получения и способам, в которых он используется.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции сои. .

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования профилактического и/или терапевтического эффекта агониста RAR- у онкологических больных

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и урологии, и может быть использовано для ранней ДНК-диагностики рака предстательной железы
Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям

Изобретение относится к термоциклерами и может быть использовано для амплификации нуклеиновой кислоты

Изобретение относится к медицине, а именно фтизиатрии, и может быть использовано для прогноза развития заболевания туберкулезом органов дыхания

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору из двух праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты вируса гепатита А, к способу обнаружения вируса гепатита А в биологическом образце, а также к набору для обнаружения вируса гепатита А в биологическом образце
Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способам контроля инфицированности сельскохозяйственной птицы бактериальными инфекциями

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к набору для обнаружения диагностически значимых генов и генов вирулентности возбудителя холеры в материале от больных людей и из объектов окружающей среды и набору для определения экспрессии данных генов, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных службах санэпиднадзора

Наверх