Способ диагностики атрофии влагалища у женщин репродуктивного возраста в состоянии постовариоэктомии
Владельцы патента RU 2404430:
Евтушенко Ирина Дмитриевна (RU)
Покуль Лилиана Викторовна (RU)
Чухрай Ольга Юрьевна (RU)
Иванова Татьяна Васильевна (RU)
Изобретение относится к медицине, конкретно к гинекологии. Предложен способ диагностики атрофического процесса во влагалище у женщин после радикальных операций на органах малого таза. Проводят иммуногистохимическое исследование биоптатов влагалища с подсчетом в них количества и диаметра сосудов, для чего осуществляют биопсию влагалища в средней его трети с забором биоптата размером 0,5×0,5×0,3 см, далее, биоптат фиксируют в нейтральном 10% формалине в течение 18 часов с последующей проводкой в изопропаноле и заливкой в парафин, после этого проводят окраску депарафинизированных срезов гематоксилином и эозином по классической методике с предварительной демаскировкой антигена в цитратном буфере для CD34, результат реакции идентифицируют по ядерному окрашиванию клеток, количеству и размеру сосудов, визуализируемых при помощи CD34, и при наличии сосудов среднего и крупного диаметра с площадью, равной 3-10 мм2, определяют норму, а при наличии сосудов с площадью 2 мм2 и менее, диагностируют атрофию влагалища. 5 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к онкогинекологии, и касается диагностики атрофии влагалища у женщин репродуктивного возраста в состоянии постовариоэктомического синдрома (ПОЭС) и медикаментозной супрессии яичников.
За последние десятилетия наглядно проявляется тенденция к возникновению рака тела и шейки матки в более раннем возрасте женщины. В связи с чем отмечается рост оперативных вмешательств, объем которых обуславливает удаление тела матки с шейкой и придатками, а также, проведение сочетанных лучевых методов лечения, конечным итогом которых являются постлучевые изменения во влагалище женщины. Хирургическое выключение яичников и их медикаментозная супрессия в репродуктивном возрасте у 75-80% пациенток сопровождается развитием синдрома постовариоэктомии, характеризующегося развитием вегетативных, афферентных, личностных, обменно-эндокринных и урогенитальных нарушений, в основе которых лежит дефицит половых стероидов, в частности эстрадиола (5, 8, 13).
По данным ряда авторов после проведения тотальной овариогистерэктомии афферентные и урогенитальные расстройства у 25% женщин носят затяжное течение, практически не подвергаются обратному развитию и с течением времени приобретают хронический характер (7).
Все клинические проявления постовариоэктомического синдрома (ПОЭС) снижают качество жизни женщины и требуют поиска адекватных профилактических и прогностических мер диагностики, на основе которых возможно создание модели качественного и полноценного лечения (2).
Известны способы выявления тяжести атрофических процессов во влагалище с применением кольпоцитологических методов исследования: определение зрелости влагалищного эпителия, подсчета индекса вагинального здоровья (10). Минусами этих способов являются влияние экзогенных (инфекция урогенитального тракта) и эндогенных (снижение иммунитета) факторов на результат исследования, что приводит к получению неадекватных результатов исследования. Кроме того, описанные методики не учитывают уровень периферических стероидов в крови.
Таким образом, до настоящего времени не предложены оптимальные методы диагностики и прогнозирования атрофии влагалища у женщин в состоянии постовариоэктомии хирургического и медикаментозного генеза по поводу рака тела и/или шейки матки.
Наиболее близким к предлагаемому является способ диагностики атрофии влагалища путем кольпоскопии - первый эндоскопический метод, нашедший широкое применение в гинекологической практике (3). Кольпоскопия заключается в проведении детального визуального осмотра слизистой оболочки влагалища, вульвы и влагалищной части шейки матки. Недостатком известного метода является недостаточная точность и информативность, обусловленная тем, что при его применении не учитываются показатели состояния местной гемодинамики. Кроме того, при расширенной кольпоскопии слизистая оболочка обрабатывается 3% раствором уксусной кислоты, которая вызывает спазм сосудов и как следствие уменьшение кровообращения, что снижает точность способа при учете этих показателей.
Необходимым условием эффективного диагностического поиска влагалищных атрофий постовариоэктомического генеза является комплексное и углубленное изучение влагалища женщины. Все приведенные известные методы обследования и диагностики дают оценку только состоянию эпителиальной выстилки влагалища, не изучая при этом базальный, парабазальный, промежуточный и стромальные слои влагалищной стенки, что также снижает точность и информативность диагностики. Учитывая, что рецепторы к стероидам и сосудистая сеть располагаются в основном в базальном, парабазальном и стромальном слоях влагалищной стенки (11, 12), логично предположить, что изучение глубоких слоев позволит произвести качественную оценку состояния влагалища у женщин репродуктивного возраста в состоянии постовариоэктомии.
Новая техническая задача - повышение точности и информативности способа.
Для решения поставленной задачи в способе диагностики атрофии влагалища у женщин репродуктивного возраста в состоянии постовариоэктомии, заключающемся в исследовании тканей влагалища, проводят иммуногистохимическое исследование биоптатов влагалища с подсчетом количества диаметра сосудов, для чего осуществляют биопсию влагалища в средней его трети с забором биоптата размером 0,5×0,5×0,3 см, далее, биоптат фиксируют в нейтральном 10% формалине в течение 18 часов с последующей проводкой в изопропаноле и заливкой в парафин, после этого проводят окраску депарафинизированных срезов гематоксилином и эозином по классической методике с предварительной демаскировкой антигена в цитратном буфере для CD34, результат реакции идентифицируют по ядерному окрашиванию клеток, количеству и размеру сосудов, визуализируемых при помощи CD34, и при наличии сосудов среднего и крупного диаметра с площадью, равной 3-10 мм2, определяют норму, а при наличии сосудов с площадью 2 мм2 и менее, диагностируют атрофию влагалища.
Иммуногистохимическое исследование по данным литературы (4) используется для диагностики различных заболеваний и, главным образом, в дифференциальной диагностике опухолей. При этом метод также широко используется для определения метастатических поражений органов, оценки гормонального статуса опухоли, иммунофенотипирования опухолей, определения факторов прогноза опухолевого прогресса, идентификации различных микроорганизмов, определения гормонов и их рецепторов и т.д. (7, 10). Однако возможность применения иммуногистохимического исследования с целью диагностики атрофии влагалища не очевидна для специалиста.
Данные отличительные признаки не известны в научно-медицинской и патентной литературе. Таким образом, предложенный способ соответствует критерию изобретения «новизна». Совокупность отличительных признаков не вытекает явным образом для специалиста из уровня техники. Способ апробирован в клинике. Предлагаемый способ соответствует критериям «изобретательский уровень», «промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом. У пациентки на гинекологическим кресле после предварительной асептической обработки наружных половых органов раствором спирта 70% обнажают влагалище в зеркалах. Влагалище обрабатывают 1% водным раствором хлоргексидина. Следующий этап - при помощи аппликационной анестезии местными анестетиками обезболивают участок 2×2 см. В средней трети влагалища при помощи биопсийных щипцов производят забор биоптата размером 0,5×0,5×0,3 см.
Иммуногистохимическое исследование биоптатов при помощи CD34 проводят на парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной демаскировкой антигена в нитратном буфере (для CD34). Проявление реакции оценивают с помощью системы визуализации DakoCytomation En Vision + System-HRP (DAB).
Для морфологического и иммуногистохимического исследования, биоптаты влагалища фиксируют в нейтральном 10% растворе формалина в течение 18-24 часов с последующей проводкой в абсолютизированном изопропаноле с минеральным маслом по следующей схеме (Табл.1):
1 - И: М - смесь изопропанола и минерального масла в соотношении 5:1 и 2:1.
2 - Под понятием минеральное масло подразумевается: вазелиновое масло, парафиновое масло, минеральное моторное масло, самой низшей марки.
Затем проводят заливку в парафин.
Далее выполняется стандартная окраска срезов гематоксилином и эозином по методике (Табл.2):
На следующем этапе проводят классическую окраску депарафинизированных срезов гематоксилином и эозином, иммуногистохимическое определение количества и размеров сосудов стромы моноклональным антителом против CD34, с дальнейшим подсчетом количества сосудов на единицу площади среза по протоколу (Табл.3).
Все используемые реактивы, буферы и среды для разведения производства Dako.
Результат реакции идентифицируют по ядерному окрашиванию клеток. Полученные результаты оценивают: количество и размер визуализируемых при помощи CD34 сосудов, подсчитывают в единицах на поле зрения микроскопа при увеличении микроскопа 10×, окуляр 10× по системе Автандилова Г.Г. И при наличии сосудов среднего и крупного диаметра с площадью, равной 3-10 мм2, определяют норму, а при наличии сосудов с площадью 2 мм2 и менее, диагностируют атрофии влагалища.
Проведенные клинические испытания способа диагностики атрофии влагалища у женщин репродуктивного возраста в состоянии постовариоэктомии и медикаментозной супрессии яичников, отягощенных раком тела и шейки матки, доказывают, что иммуногистохимическое исследование биоптатов влагалища может быть успешно использовано в клинической гинекологии, как способ достоверной диагностики патологического процесса влагалища, позволяющий онкогинекологу вовремя поставить диагноз и начать соответствующую терапию, а пациентке улучшить качество жизни. Иммуногистохимическое исследование более универсально, чем рассматриваемый прототип, так как может применяться при большем количестве случаев. Противопоказаний к использованию этого метода исследования не найдено, в отличие от кольпоскопии. Таким образом, предложенный способ соответствует критерию изобретения «промышленно применимо».
Конкретные примеры, подтверждающие эффективность использования иммуногистохимического исследования при оценке микроциркуляции в рамках диагностики атрофии влагалища.
Клинический пример 1
Больная Л., 1975 года рождения. История болезни №20242. Диагноз; Cr colli uteri T1бN1M0 III ст. Состояние после комбинированного лечения (2007 г.). Клиническая группа 3. Проведено лечение: 30.05.07. Лапаротомия, расширенная экстирпация матки с придатками по Вертгейму. 10.06.07. - проведен курс сочетанной дистанционной и внутриполостной гамма-терапии в сопровождении МХТ+6 курсов ПХТ. Гистологическое исследование №56982-88: В шейке матки низко дифференцированный эпидермоидный Cr без ороговения с инвазией на всю глубину до адвентиции. МТС в лимфоузлах с обеих сторон. Тело матки и придатки без опухолевого поражения. Постовариоэктомический синдром - тяжелая форма.
Дополнительно проведены исследования согласно предлагаемому способу.
12.12.08. произведена биопсия влагалища.
Гормональный профиль: ФСГ - 31,31 ммЕ/мл; ЛГ - 22,43 ммЕ/мл; эстрадиол 10,0 пг/мл
Результат CD34 - крупные сосуды - 0; средние - 0; мелкие - 5.
Проведенное исследование биоптатов влагалищной стенки обнаружило тяжелое нарушение кровообращения влагалища, что обусловливало проявление урогенитальных нарушений в виде сухости влагалища, диспареуний. Диагностический поиск позволил назначить этиоторопную терапию, корригирующую данные нарушения.
Клинический пример 2
Больная Е., 1976 года рождения. История №13530. Диагноз: Cr colli uteri T3бNxM0. Состояние после сочетанной лучевой лучевой терапии. Клиническая группа 3 (2006 год). Постовариоэктомический синдром средней степени тяжести.
20.09.06. (биопсия шейки матки). Гистологическое исследование №15816: Эпидермоидный cr без ороговения
26.09.06. Проведен курс сочетанной внутриполостной и дистанционной терапии
16.12.08. произведена биопсия влагалища
Гормональный профиль: ФСГ 147,69 ммЕ/мл, ЛГ 66 ммЕ/мл, эстрадиол 108 пг/мл Результат CD34 - крупные сосуды - 0; средние - 0; мелкие - 9.
Полученные результаты констатировали нарушение микроциркуляции влагалища тяжелой степени тяжести. Однако сохранялся кровоток сосудами мелкого калибра на удовлетворительном уровне. Данный факт обуславливался сохраненным стероидогенезом в яичниках. Анализ показателей позволил провести корригирующую терапию.
Предпосылками разработки предлагаемого способа явились клинические исследования. Для доказательства эффективности предложенного нами способа диагностики было проведено обследование 4 групп женщин. Общее количество обследованных составило 354 женщины в состоянии постовариоэктомии после проведенных хирургических, комбинированных и комплексных методов лечения онкозаболеваний.
В основную группу I (n=85) вошли пациентки, после проведенного хирургического лечения (простая, расширенная экстирпация матки с придатками по Вертгейму, Бохману).
В основную II группу (n=131) вошли женщины, пролеченные комбинированными методиками (оперативное лечение в сочетании с лучевой (СЧЛ) и полихимиотерапией (ПХТ).
Основная группа III (n=70) включала пациенток, находившихся в медикаментозной менопаузе после сочетанной лучевой терапии.
В группу IV (группа сравнения; n=68) вошли женщины с доброкачественными заболеваниями внутренних гениталий, получившие хирургическое лечение в объеме простой экстирпации матки с придатками.
При изучении прогностической значимости экспрессии CD34 выявлено, что у пациенток во всех исследуемых группах и в группе сравнения сохраняется на удовлетворительном уровне состояние кровообращения сосудами мелкого калибра. При этом отмечен достоверно менее выраженный средний показатель в группах с проведенным комбинированным лечением - группа II (8,01±0,45) и в группе III с сочетанным лучевым лечением женщин с проведенными лучевыми методами лечения в анамнезе, что, очевидно, связано с агрессивным воздействием внутриполостной гамма-терапии, способствующей склерозированию и разрушению эндотелиальной выстилки кровеносных сосудов. Также в I, II и в IV-й группах наличие удовлетворительного кровоснабжения влагалищной стенки артериями мелкого калибра обусловлено развитием множества мелких коллатералей после проведенного хирургического лечения. При этом в группе I только у 5 чел (5.8%) не фиксировались в биоптате сосуды мелкого калибра; в группе II число аналогичных пациентов было 9 (6,8%), в III группе - 3 (4,3%) и в группе сравнения - подобное явление отмечено только у 2 чел. (2,9%).
В Таблице 4 приведены показатели уровня экспрессии CD34 в обследованных группах (M±m). (Примечание: ∗в сравнениях группы IV и групп II и III t=2,01 и 1,96 соответственно р<0,05, ∗∗в сравнениях группы IV и групп II и III t=10,2 и 15,8 соответственно р<0,001, ∗∗∗в сравнениях группы IV и групп II и III t=7,6 и 8,1 соответственно р<0,01).
Изучение уровня экспрессии CD34, маркирующего капиллярную сеть влагалища сосудами среднего калибра, обнаружило уменьшение показателя в группе II: М=2,02±0,24 (σ=2,754). В группе III с сочетанными лучевыми методами лечения в анамнезе их среднее количество составило 0,79±0,205 (σ=1,719).
Установлено, что наиболее выражено кровоснабжение стенок влагалища сосудами крупного калибра у женщин I и IV-й групп (М=6,09 и 4,09 соответственно). У пациенток второй и третьей групп количество крупных сосудов значительно меньше: в сравнении с IV группой при t=10,2 и 15,8 соответственно р<0,001.
При сравнении показателей по группам пациенток второй и третьей групп с группой I также отмечаются различия высокого уровня достоверности (t=16,9 и 18,6 соответственно, т.е. р<0,001).
В группах II и III средние показатели количества сосудов крупного калибра находились в пределах 1,02±0,18 (σ=2,017) и 0,14±0,05 (σ=0,427). В основной группе II только у 31 чел (24%) обнаружены артерии и вены крупного калибра. В основной группе III число таких пациенток было 8 (11,4%). На высокодостоверном уровне (р<0,001) имелись различия в количестве артериоло-венозных сплетений сосудов среднего калибра у женщин I и III групп в сравнении с группой IV (t=7,6 и 8,1 соответственно). Вместе с этим, сравнение показателей CD34 между I и IV группами обнаружили отсутствие достоверно значимых отличий (t=1,2; р>0,05). Ухудшение кровотока в данных подгруппах обуславливалось двумя факторами: нарушением анатомических взаимоотношений сосудистого русла ввиду хирургических пособий и патологическим влиянием лучевых методов.
В Таблице 5 приведены показатели эстрадиола в исследуемых группах. Примечание: ∗в сравнениях группы IV и III t=3,07. т.е. р<0,01.
Полученные результаты дают основание говорить о наличии достоверно значимых различий в продуцировании эстрадиола у пациенток III и IV-й групп. В группах I и II уровень эстрадиола также превышал значения показателей группы IV, однако статистически достоверных различий между ними выявлено не было (t=0,02 и t=0,2, т.е. р>0,05). Превышение концентраций эстрадиола в группах 1, II связано с наличием в данных выборках около половины женщин с ожирением: индекс массы тела выходил за границы 30 у 45,0% и 47,0% женщин соответственно, что обусловливало усиление ароматазной активности стероидгенеза. Кроме того, уровень содержания эстрадиола в группах I и II, превышающий показатели группы IV, был связан с присутствием в выборках пациенток с диагнозом рака тела матки 1-го патогенетического гормонозависимого варианта.
В группе I таких женщин 40,0% (31 чел.) и в группе II - 29,8% (39 чел.). Как известно, 1-й патогенетический вариант рака тела матки основывается на многообразном проявлении гиперэстрогении и сопутствующему ей ожирению, что согласуется с показателями эстрадиола крови у пациенток I и II групп.
Таким образом, применение разработанного способа с использованием диагностики уровня локального кровотока влагалища, характеризующего одно из звеньев атрофии влагалища посредством клона CD34, позволило своевременно разработать пациенткам план коррекции и терапии урогенитальных расстройств.
Полученные результаты наблюдений биоптатов влагалищной стенки у женщин II и III групп, свидетельствующие о катастрофически сниженном количестве артериоло-венозных сплетений из сосудов крупного и среднего калибра согласно экспрессии
CD34, объясняются агрессивным локальным воздействием лучевой терапии на влагалищную стенку. Изменение кровоснабжения влагалища в группах с проведенным хирургическим этапом лечения связано с нарушением анатомического взаиморасположения органов и с компенсаторным ростом «новых» артериоло-венозных анастомозов сосудов мелкого калибра.
Эстрогены воздействуют на имеющиеся в сосудистой стенке специфические клетки сосудов, подавляя секрецию коллагена этими клетками. Эстрогенам также присущи эндотелий-зависимый и эндотелий-независимый сосудорасширяющие эффекты, улучшение функции эндотелия и торможение тока кальция через кальциевые каналы. Не менее важным фактором среди положительных эффектов эстрогенов является их способность улучшать рост эндотелия, а также тормозить апоптоз и пролиферацию гладкомышечных клеток в ответ на повреждение сосудов (7).
В проведенном исследовании результаты показателей эстрадиола группы III свидетельствовали о достоверно значимых различиях в сравнении с группой IV. В группе III наличия показателей эстрадиола, превышающих показатели групп I, II и IV, может свидетельствовать о продолжающемся на невысоком уровне синтезе эстрогенов и андрогенов тека-тканью яичников.
В результате проведенных исследований было впервые показано, что использование иммуногистохимического исследования для оценки микроциркуляции с целью диагностики атрофии влагалища в значительной степени способствует повышению эффективности хирургического вмешательства, позволяет улучшить качество жизни онкологических пациенток, снизить количество осложнений в отдаленном послеоперационном периоде. Применение иммуногистохимического исследования у женщин репродуктивного возраста в состоянии постовариоэктомии характеризуется хорошим диагностическим результатом: отсутствуют ложно-положительные результаты, диагностика возможна на ранних стадиях развития атрофии влагалища. Также доказано отсутствие побочных эффектов при заборе материала для биопсии и проведении в дальнейшем корригирующей терапии.
Таким образом, использование предлагаемого способа в клинической практике позволяет эффективно, высокотехнологично на современном инновационном уровне проводить диагностику сосудистых нарушений во влагалище у женщин в ПОЭС, вовремя оценить степень урогенитальных нарушений и повысить эффективность лечения. Предлагаемые критерии иммуногистохимического исследования биоптатов влагалища могут быть успешно использованы в клинической гинекологии, как способ достоверной диагностики патологического процесса влагалища, позволяющий онкогинекологу вовремя поставить диагноз и начать соответствующую терапию, а пациентке улучшить качество жизни. Иммуногистохимическое исследование более универсально, может применяться при большем количестве случаев. Противопоказаний к использованию этого метода в отличие от кольпоскопии исследования не найдено.
Источники информации
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М. - 1990 - 384 с.
2. Балан В.Е. Урогенитальные расстройства в климактерии (клиника, диагностика, заместительная гормонотерапия) / Дисс… д.м.н. // 1998. 295 с.
3. Бодяжина В.И., Сметник В.Л., Тумилович Л.Г. «Неоперативная гинекология», Москва, Медицина, 1990. - С.25-32.
4. Криволапов Ю.А., Леенман Е.Е. Морфологическая диагностика лимфом. СПб. «КОСТА», 2006, 208 с.
5. Кулаков В.И., Сметник В.П. Руководство по климактерию. М., 2001. С.404-495.
6. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Издание 3-е. - Казань. - 2004. - 456 с.
7. Сметник В.П. Медицина климактерия. М., 2006, 848 с.
8. Юренева С.В. Синдром постовариоэктомии // Materia Medica. 1999 №2(22). С.3-10.
9. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистохимия (Практические рекомендации). - Санкт-Петербург. - 2002. - с.35.
10. Bachman G. Urogenital ageing: an old problem newly recognized // Maturitas. 1995. №22. Suppl. P.1-5.
11. Forsberg J.G. A morphologist approach to the vagine-age-related changesand estrogen sen-sitivity // Maturitas. 1995. №22 / suppl. P.7-15.
12. McLean A.B., Nicol L.A., Hodgins M.B. Immunohystochenical localization of estrogen receptors in the vulva and vagina // J. Reprod. Med. 1990. Vol.35. P.1015-1016.
13. Payer L: The menopause in various cultures. In: A portrait of the menopause. Expert reports on medical and therapeutic strategies for the 1990s. Ed. Burger H & Boulet M. Parthenon Publishing, Park Ridge, NJ, USA, 1991, p.3-22.
| Таблица 1 | |||
| Этап | Реагент | Ручная проводка | |
| Время (часы) | Температура | ||
| 1 | Изопропанол | 1 | комнатная |
| 2 | Изопропанол | 1 | комнатная |
| 3 | Изопропанол | 1 | комнатная |
| 4 | Изопропанол | 1 | комнатная |
| 5 | Изопропанол | 1 | комнатная |
| 6 | И: М1-2 (5:1) | 1,5 | 50°С |
| 7 | И:М (2:1) | 1,5 | 50°С |
| 8 | Минеральное масло | 1,5 | 50°С |
| 9 | Парафин | 1 | 60°С |
| 10 | Парафин | 1 | 60°С |
| 11 | Парафин | 1 | 60°С |
| 12 | Парафин | 1 | 60°С |
| Таблица 2 | ||
| Этап | Реагент | Время в минутах |
| 1 | Ксилол | 5 |
| 2 | Ксилол | 5 |
| 3 | Спирт | 5 |
| 4 | Спирт | 5 |
| 5 | Вода дистиллированная 56° | 5 |
| 6 | Гематоксилин (Карацци) | 4-5 |
| 7 | Вода дистиллированная 56° | Промыть 2 раза |
| 8 | Эозин | 0,5-1 |
| 9 | Спирт | 5 |
| 10 | Спирт | 5 |
| 11 | Ксилол | с |
| 12 | Ксилол | 5 |
| 13 | Заключение в канадский бальзам |
| Таблица 3 | |||
| Этап | Реагент | Время в минутах | Примечание |
| 1 | Поместить срезы в термостат | 40 | 56°С |
| 2 | Ксилол | 5 | |
| 3 | Ксилол | 5 | |
| 4 | Спирт | 5 | |
| 5 | Спирт | 5 | |
| 6 | Спирт | 5 | |
| 7 | Вода дистиллированная | 2-3 | 3 смены |
| 8 | Демаскировка антигенов в цитратном буфере (рН 6,0) | 30 | при температуре 94-98°С на водяной бане |
| 9 | Остывание при комнатной температуре | 20 | |
| 10 | Вода дистиллированная | 2 смены промывка | |
| 11 | Вода дистиллированная | 5 | 2 смены |
| 12 | Обводка гидрофобным (восковым) карандашом | DakoPen | |
| 13 | Блокировка эндогенной пероксидазы (3% р-р перикиси водорода, Peroxidase Block) | 15-20 | во влажной камере |
| 14 | Вода дистиллированная | 2-3 | 3 смены |
| 15 | Инкубация с первыми антителами | 30 | во влажной камере |
| 16 | Промывочный буфер (рабочий р-р TrisHCl 1×10) | промыть | |
| 17 | Промывочный буфер (рабочий р-р TrisHCl) | 5 | 2 смены |
| 18 | Инкубация с системой визуализации En Vision+ | -30 | во влажной камере |
| 19 | Промывочный буфер (рабочий р-р TrisHCl 1×10) | промыть | |
| 20 | Промывочный буфер (рабочий р-р TrisHCl) | 5 | 2 смены |
| 21 | DAB+ | 2-3 | |
| 22 | Вода дистиллированная | 2 | 3 смены |
| 23 | Докраска гематоксилином Карацци | 25-27 секунд | |
| 24 | Проточная водопроводная вода | 1 -2 | 2 смены промыть |
| 25 | Теплая водопроводная вода | 5 | 56°С |
| 26 | Обезвоживание в спиртах: | 5 | 2 смены |
| 27 | Карбол-Ксилол: | 5 | 2 смены |
| 28 | Ксилол: | 5 минут | 2 смены |
| 29 | Заключение под покровное стекло в канадский бальзам |
| Таблица 4 | |||
| Показатели уровня экспрессии Cd34 в обследованных группах (M±m) | |||
| Группы | Частота встречаемости маркера | ||
| Сосуды крупного калибра | Сосуды среднего калибра | Сосуды мелкого калибра | |
| I (n=85) | 6,09±0,33 | 4,54±0,2 | 8,34±0,46 |
| II (n=131) | 1,02±0,18∗∗ | 2,02±0,24∗∗∗ | 8,01±0,45∗ |
| III (n=70) | 0,14±0,05∗∗ | 0,79±0,205∗∗∗ | 7,94±0,509∗ |
| IV (n=68) | 4,09±0,252∗∗ | 4,03±0,345∗∗∗ | 9,10±0,304∗ |
| Таблица 5 | ||||
| Группы | ||||
| I | II | III | IV | |
| Эстрадиол | 32,27±3,31 | 32,05±2,37 | 47,24+4,6* | 31,28±2,44∗ |
Способ диагностики атрофии влагалища у женщин репродуктивного возраста в состоянии постовариоэктомии, заключающийся в исследовании тканей влагалища, отличающийся тем, что проводят иммуногистохимическое исследование биоптатов влагалища с подсчетом количества диаметра сосудов, для чего осуществляют биопсию влагалища в средней его трети с забором биоптата размером 0,5×0,5×0,3 см, далее, биоптат фиксируют в нейтральном 10% формалине в течение 18 ч с последующей проводкой в изопропаноле и заливкой в парафин, после этого проводят окраску депарафинизированных срезов гематоксилином и эозином по классической методике с предварительной демаскировкой антигена в цитратном буфере для CD34, результат реакции идентифицируют по ядерному окрашиванию клеток, количеству и размеру сосудов, визуализируемых при помощи CD34, и при наличии сосудов среднего и крупного диаметра с площадью, равной 3-10 мм2,определяют норму, а при наличии сосудов с площадью 2 мм2 и менее диагностируют атрофию влагалища.
