Способ оценки влияния ингибитора деацетилирования белков на индукцию ростового морфогенеза растений



Способ оценки влияния ингибитора деацетилирования белков на индукцию ростового морфогенеза растений
Способ оценки влияния ингибитора деацетилирования белков на индукцию ростового морфогенеза растений
Способ оценки влияния ингибитора деацетилирования белков на индукцию ростового морфогенеза растений
Способ оценки влияния ингибитора деацетилирования белков на индукцию ростового морфогенеза растений

 


Владельцы патента RU 2404585:

Учреждение Российский академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН (ИБ УНЦ РАН) (RU)

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений. Первоначально проращивают семена пшеницы в 0,004 мМ растворе бутирата натрия, в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом и определяют в вышеперечисленных ядерных фракциях протеолитическую и ингибиторную активности. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 1 табл., 4 ил.

 

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и может быть применено к анализу механизмов ростового морфогенеза растений, а именно при исследовании процессов, происходящих на уровне супраструктур интерфазного клеточного ядра, которые иногда называют «молекулярными морфогенезами», физико-химическая природа которых мало исследована, что необходимо для получения дополнительной информации в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления.

Известен способ оценки влияния гиббереловой кислоты и кинетина на белки клеточных ядер [1], в котором был описан способ оценки влияния физиологически активных веществ на белки клеточных ядер проростков растений. Недостаток этого метода заключается в том, что с его помощью невозможно оценить влияние физиологически активных веществ на индукцию ростового морфогенеза растений.

Вышеуказанный способ оценки влияния гиббереловой кислоты и кинетина на белки клеточных ядер [1] был принят за основу, в котором первоначально осуществляют обработку семян в процессе набухания физиологически активными веществами, инкубацией в среде с 2-14С-ацетатом и Na2H32PO4, с последующей изоляцией клеточных ядер по методам Ро, Чипчейза и Кюля [см. 1], получением ядерных экстрактов растворами солей: 0,14 М, 2 М хлористого натрия, определением турбидиметрически содержание белка в пробах, фракционный состав белков определяли с помощью электрофореза. Недостаток этого метода заключается в том, что в анализ берется только один временной период роста растения, а именно 2 суток, что не позволяет оценить морфогенетические изменения в растении в процессе индукции ростовых процессов, происходящие под влиянием физиологически активных веществ, клеточные ядра выделяются методами Ро, Чипчейза и Кюля [см. 1], что ведет к низкому выходу нативных ядер, фракционирование клеточных ядер ограничивается получением только 2-х фракций, содержание белка в которых определяется турбидиметрически, т.е. методом с низким порогом чувствительности (до 3-5 мкг белка в 0,1 мл раствора).

Цель изобретения - предлагается использование Арг-Х протеолиза, как одного из молекулярно-генетических механизмов крупномасштабной пространственной организации хроматина в условиях гиперацетилированного состояния протеома клеточных ядер при индукции ростового морфогенеза растений.

Указанная цель достигается тем, что в способе оценки влияния ингибитора деацетилирования белков на индукцию ростового морфогенеза растений первоначально проращивают семена пшеницы в 0,004 мМ растворе бутирата натрия, в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом и определяют в вышеперечисленных ядерных фракциях протеолитическую и ингибиторную активности.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Опыты проводили на элитных семенах пшеницы (Thticum aestivum L.) сортов Мироновская 808 (озимая) и Мироновская яровая (любезно присланные нам из коллекции Мироновского научно-исследовательского института селекции и семеноводства пшеницы им. В.Н. Ремесло). Проращивание зародышей осуществляли в темноте при 22±1°С. Соответственно, в одном варианте опыта (контроль) использовали дистиллированную воду, в другом варианте - 0,004 мМ NaВ(бутират натрия), растворенный в дистиллированной воде. Бутират натрия использовали для ингибирования in vivo процессов деацетилирования гистонов (возможно и других негистоновых белков). То есть для поддержания удлиненной (пролонгированной) стадии повышенного уровня ацетилирования гистонов (возможно и других ядерных белков), необходимого для стимуляции транскрипции, NaB был синтезирован на базе Института органической химии УНЦ РАН. Элементный анализ бутирата натрия находился в пределах: С - 43,5; Н - 6,3; Na - 21. Оптимальную концентрацию NaB подбирали по увеличению всхожести семян пшеницы Мироновской яровой через 21 ч после индукции ростовых процессов (таблица). В определённые интервалы времени - 0 ч (воздушно-сухое семя) и от начала замачивания семян: 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводили отделение зародышей от эндосперма. Клеточные ядра выделяли по методу [2]. Надмолекулярные структуры: нуклеоплазму (Нп), хроматин непрочно- (Хр-I) и прочно- (Хр-II) связанный с ядерным матриксом (ЯМ), а также ЯМ выделяли из очищенных клеточных ядер соответственно при повышении ионной силы раствора: 0,14М NaCl, 0,35М NaCl, 2М NaCl в 0,01М трис-HCl буфере, рН 6.8. ЯМ извлекали 6М гуанидингидрохлоридом (Gu·HCI) с 0,004%-ным β-меркаптоэтанолом в том же буфере. Количество белка в ядрах и ядерных фракциях определяли методом Бредфорда в нашей модификации [3]. Арг-Х (триптазную) активность оценивали по расщеплению Арг-Х связей в аргининбогатом белке - протамине- Salmine-A-I («Merk») (молекула которого состоит из 33 аминокислот: 22-х молекул Apг; 4-х молекул Сер; 3-х молекул Про; по 2 молекулы Глу и Вал) во всех вышеперечисленных фракциях ядер [3]. Удельную активность триптаз выражали в нмоль аргинина·с-1·мг·белка.

Анализ таблицы показал, что максимальная всхожесть семян на 21 ч прорастания соответствует концентрации бутирата натрия 0,004 мМ.

На фиг.1 представлена всхожесть семян пшениц Мироновская яровая (А) и Мироновская озимая (Б), контроли (1), обработанные бутиратом натрия (2). I - не проклюнулись, II - проклюнулись: общий размер проростка 0,3-0,5 см, III - активный рост главного корня (более 0,1 см). На оси ординат показан процент всхожести семян.

На фиг.2 представлена динамика внутриядерного протеома G1 фазы клеточных ядер зрелых зародышей Мироновской яровой (А) и Мироновской 808 (озимой) (Б) пшениц в нормальных условиях (1) и в присутствии ингибитора деацетилирования белков (2). На оси абсцисс показано время прорастания зародышей пшеницы. На оси ординат - масса 1 зародыша, мг.

На фиг.3 представлен выход белковых компонентов во фракциях клеточных ядер зрелых зародышей Мироновской яровой (А) и Мироновской 808 (озимой) (Б) пшениц в нормальных условиях (1) и в присутствии ингибитора деацетилирования белков (2). Использованы следующие обозначения: Нп-нуклеоплазма, Хр-I - хроматин непрочносвязанный с ядерным матриксом, Хр-II - прочносвязанный с ядерным матриксом, ЯМ - ядерный матрикс. На оси абсцисс показан возраст зародышей пшеницы, по оси ординат - процент выхода белковых компонентов.

На фиг.4 представлена Арг-Х протеолитическая активность во фракциях клеточных ядер зрелых зародышей Мироновской яровой (А) и Мироновской 808 (озимой) (Б) пшениц в нормальных условиях (1) и в присутствии ингибитора деацетилирования белков (2). Использованы следующие обозначения: Нп - нуклеоплазма, Хр-I - хроматин непрочносвязанный с ядерным матриксом, Хр-II - прочносвязанный с ядерным матриксом, ЯМ - ядерный матрикс. На оси абсцисс указан возраст зародышей пшеницы, по оси ординат - единицы протеолитической активности нмоль аргинина·с-1·мг·белка.

Анализ фиг.4 показал, что протеазочувствительность супраструктур клеточного ядра в присутствии ингибитора деацетилирования ядерных белков резко влияет на экспонированность определенных участков ядерного матрикса (9 ч), нуклеоплазмы (15 ч) при сохраненности Арг-Х протеолиза на уровне ядерного матрикса в контрольном варианте опыта (18 ч). 18-ч фаза клеточного цикла у пшеницы интересна тем, что в этот временной период наблюдается репликация и переход к синтезу ДНК, т.е. клетка осуществляет процессы, необходимые для их сохранения в митозе.

Данное изобретение рекомендуется для молекулярно-генетического анализа механизмов ростового морфогенеза растений, а именно при исследовании процессов, происходящих на уровне супраструктур интерфазного клеточного ядра.

Влияние NaB на всхожесть семян пшеницы сорта Мироновская яровая
Концентрация бутирата Na (мМ) Всхожесть семян на 21 ч, %
0 80
0,004 92
0,01 88
0,015 76
0,5 70
1 72
2 52
4 32

Способ оценки влияния ингибитора деацетилирования белков на индукцию ростового морфогенеза растений, включающий проращивание семян пшеницы в 0,004 мМ растворе бутирата натрия, отделение зародышей от эндосперма в определенные интервалы времени от начала замачивания: 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч, консервацию зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, с последующим выделением клеточных ядер, экстракцией ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом, определением в вышеперечисленных ядерных фракциях протеолитической и ингибиторной активности.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в парфюмерно-косметической промышленности, кожевенном производстве, меховом производстве, химико-фармацевтической промышленности.
Изобретение относится к технологии получения ферментов. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции организмов, например растений. .

Изобретение относится к борьбе с насекомыми-вредителями, в частности с нематодами. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для разработки анти-НСУ терапевтических агентов. .

Изобретение относится к медицине и касается получения очищенных экзопротеаз возбудителя мелиоидоза и может быть использовано для изучения факторов патогенности данного микроорганизма, а также приготовления диагностических препаратов для их обнаружения.

Изобретение относится к областям: элементоорганической химии, в частности к комплексному соединению цинка с 18-краун-6. .

Изобретение относится к области элементоорганической химии, в частности к комплексному соединению молибдена с 18-краун-6. .

Изобретение относится к сельскому хозяйству. .

Изобретение относится к антибактериальному средству, состоящему из серебросодержащих частиц гидроксида сульфата алюминия, представленных следующими формулами (X-I) или (Y-I): (Ag aBb-a)bAlcAx (SO4)y(OH)z·pH2 O (X-I), где а, b, с, х, у, z и р удовлетворяют неравенствам 0,00001 а<0,5 0,7 b 1,35; 2,7<с<3,3; 0,001 х 0,5; 1,7<у<2,5; 4<z<7 и 0 р 5 соответственно, В представляет собой по меньшей мере один одновалентный катион, выбранный из группы, состоящей из Na+,NH4 +, K+ и Н3О+ , суммарная величина (1b+3с), полученная путем умножения валентностей на число молей катионов, удовлетворяет неравенству 8<(1b+3с)<12, и А представляет собой анион органической кислоты; [Aga Bb-a]b[M3-cAlc](SO 4)y(OH)z·pH2O (Y-I), где а, b, с, у, z и р удовлетворяют неравенствам 0,00001 а<0,5; 0,8 b 1,35; 2,5 с 3; 1,7<у<2,5; 4<z<7 и 0 р 5 соответственно, В представляет собой по меньшей мере один одновалентный катион, выбранный из группы, состоящей из Na+, NH4 +, К+ и Н3О+ , и М представляет собой Ti или Zn.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к химическим средствам защиты растений от вредителей и болезней, например от крестоцветных блошек и фузариоза, и может быть использовано для обработки семян озимого и ярового рапса, горчицы сарептской перед их посевом.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к химическим средствам защиты растений от вредителей и болезней, например от крестоцветных блошек и фузариоза, и может быть использовано для обработки семян озимого и ярового рапса, горчицы сарептской перед их посевом.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к химическим средствам защиты растений от вредителей и болезней, например от крестоцветных блошек и фузариоза, и может быть использовано для обработки семян озимого и ярового рапса, горчицы сарептской перед их посевом.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при выращивании сахарной свеклы. .
Наверх