Способ получения мутантного белка trail человека



Способ получения мутантного белка trail человека
Способ получения мутантного белка trail человека
Способ получения мутантного белка trail человека
Способ получения мутантного белка trail человека
Способ получения мутантного белка trail человека
Способ получения мутантного белка trail человека

 

C12N15 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2405038:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно, к получению рекомбинантного мутантного TRAIL человека и может быть использовано для исследования TRAIL опосредованных механизмов апоптоза, а также в качестве терапевтического средства для лечения DR5-зависимых опухолей. В ген TRAIL человека, находящийся в составе плазмидной ДНК рЕТ32а, вводят мутации Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q/D269H или Y189N/R191K7Q193R/H264R/I266L/D269H с последующей трансформацией штамма Escherichia coli BL21(DE3) полученной рекомбинантной плазмидной ДНК, экспрессией и выделением целевого белка. Изобретение позволяет получить рекомбинантный мутантный TRAIL человека с высокой противоопухолевой активностью. 3 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к области клеточной биологии, молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно, к получению мутантного белка TRAIL человека, который может быть использован в качестве терапевтического средства для эффективного лечения ОК5-зависимых опухолей, а также в качестве инструмента для научных исследований механизмов TRAIL опосредованно апоптоза.

Белок TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) является одним из членов семейства цитокинов типа TNF (tumor necrosis factor, фактор некроза опухолей). Природный TRAIL играет важную роль в иммунной защите организма от опухолевой трансформации и вирусной инфекции, а также участвует в подавлении аутоиммунных воспалительных реакций, определяющих патогенез ревматоидного артрита, рассеянного склероза и других заболеваний. Экспрессия TRAIL усиливается под действием интерферонов и в значительной степени определяет эффективность этой важнейшей защитной системы организма.

Основной интерес к белку TRAIL связан с его свойством избирательного индуцирования апоптоза в опухолевых клетках, не затрагивая нормальные клетки. Рекомбинантный растворимый белок TRAIL способен вызывать апоптоз в культурах клеток из широкого спектра человеческих опухолей. В связи с этим белок TRAIL рассматривается в качестве многообещающего потенциального терапевтического средства при лечении аутоиммунных и раковых заболеваний. Молекула TRAIL содержит 281 аминокислотных остатков и представляет собой трансмембранный белок II типа с C-концевым экстраклеточным доменом. Показано, что рекомбинантный белок TRAIL 114-281 способен индуцировать апоптоз в концентрациях от 2 до 100 нг/мл на различных раковых клеточных линиях.

TRAIL имеет 5 типов рецепторов: DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG. Эти рецепторы отличаются способностью индуцировать апоптоз при взаимодействии с лигандом. Причем только рецепторы DR4 и DR5 способны проводить сигнал апоптоза и носят название «рецепторов смерти». Рецепторы DcR1 и DcR2 (так называемые рецепторы ловушки) соревнуются с DR4 and DR5 для связывания с TRAIL и противоборствуют TRAIL опосредованному апоптозу. Остеопротегерин (OPG) является растворимой TRAIL взаимодействующей молекулой, которая, скорее, играет роль в развитии костных и миелоидных клеток, но не в регуляции TRAIL опосредованного апоптоза.

В большинстве видов опухолей рецептор DR5/TRAIL-R2 играет основную роль в проведении сигнала апоптоза при связывании с лигандом. Кроме того, зачастую происходит индукция рецептора DR5 в опухолевых клетках при воздействии различных химиотерапевтических средств. В связи с этим наибольший интерес представляет увеличение специфичности TRAIL по отношению к рецептору DR5.

Известен способ получения DR5 селективного мутантного варианта TRAIL DR5-8 и DR4-8 (Kelley FR., Totpal K., Lindstrom SH., Mathieu M., Billeci K., De Forge L. et al. Receptor-selective mutants of Apo2L/TRAIL reveal a greater contribution of DR5 than DR4 to apoptosis signaling // J.Biol.Chem. 2005. Vol.280, p.2205-2212). Эти мутантные варианты получают с помощью метода фагового дисплея. С помощью рекомбинантных DR4 и DR-5 рецепторов отобрают клоны, в которых мутантные варианты TRAIL хуже связываются к одному или другому рецептору. Гены отобранных мутантных вариантов TRAIL с добавочным метионином на N-конце клонируют в плазмиду pS1346, экспрессируют в штамме Escherichia coli W3110 под контролем промотора trp. После разрушения клеток белок осаждают в буфере 40% аммония сульфата и очищают хроматографическим методом сначала на гидроксиапатите, а затем на Ni-NTA агарозе. Мутантный вариант TRAIL DR5-8 содержит 6 замен аминокислотных остатков (Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q) и обладает повышенной специфичностью к DR5 рецептору за счет снижения эффективности связывания с другими рецепторами DR4, DcR1 и OPG. Однако этот мутантный вариант в 2 раза хуже связывается с рецептором DR5, в результате чего менее эффективно вызывает апоптоз.

Мутантный вариант TRAIL DR4-8 содержит 6 замен аминокислотных остатков (Y189A/Q193S/N199V/K201R/Y213W/S215D) и обладает повышенной специфичностью к DR4 рецептору за счет снижения эффективности связывания с рецептором DR5. Однако этот мутантный вариант обладает пониженной биологической активностью по сравнению с диким типом и высокой аффинностью к рецепторам DcR1 и DcR2.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения DR5 селективного мутантного варианта TRAIL D269H (Van der Sloot AM., Tur V., Szegezdi ТЕ., Mullally MM., Cool RH., Samali A. et al. (2006). Designed tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand variants initiating apoptosis exclusively via the DR5 receptor // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2006. V.103, p.8634-8639). D269H мутантный вариант получают с помощью алгоритма автоматического дизайна FOLD-X. ДНК TRAIL клонируют в вектор рЕТ15В и точечную мутацию D269H вводят с помощью метода сайт-направленного мутагенеза. Белок экспрессируют в штамме Escherichia coli BL21 (DE3). После разрушения клеток белок очищают сначала на IMAC сефарозе, заряженной никелем, потом дочищают хроматографическим методом на гидроксиапатите, а затем на Ni-NTA агарозе.

Мутантный вариант TRAIL/ D269H в несколько раз эффективнее связывается с рецептором DR5 и значительно хуже связывается с рецепторами DR4 и DcR1. Недостатком этого мутантного варианта является его невысокая селективность к DR5 рецептору, так как он связывается с DcR2 и OPG рецепторами так же эффективно, как и дикий тип.

Изобретение решает задачу получения препарата с высокой противоопухолевой активностью на основе рекомбинантного белка TRAIL.

Поставленная задача решается за счет способа получения рекомбинантного мутантного белка TRAIL человека с высокой противоопухолевой активностью, включающего введение мутаций Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q/D269H или Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H в ген TRAIL человека, находящийся в составе плазмидной ДНК рЕТ-32а, с последующей трансформацией штамма Escherichia coli BL21(DE3) полученной рекомбинантной плазмидной ДНК, экспрессию и выделение целевого белка.

Предлагаемым способом путем комбинации мутаций получают мутантные варианты DR5-A и DR5-B, содержащие мутации Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q/D269H и Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H соответственно.

Плазмидная ДНК pET-32a/DR5-A, кодирующая мутантный вариант TRAIL DR5-A, содержит мутантный ген белка DR5-A/Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q/D269H (SEQ ID NO 9), и плазмидная ДНК pET-32a/DR5-B, кодирующая мутантный вариант TRAIL-DR5-B, содержит мутантный ген TRAIL DR5-B Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H (SEQ ID NO 10).

Плазмидную ДНК pET-32a/DR5-A или pET-32a/DR5-B трансформируют в компетентные бактериальные клетки штамма Escherichia coli BL21(DE3). Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET-32a/DR5-A или Escherichia coli BL21(DE3)/pET-32a/DR5-B обеспечивает конститутивный синтез белка теоредоксин/DR5-А или теоредоксин/DR5-В соответственно; уровень экспрессии составляет не менее 1.5 г из 1 литра клеточной культуры. Выделение и очистку целевого белка проводят с помощью хроматографических методов (аффинной хроматографии на никелевой агарозе) после расцепления слитных белков тиоредоксин/DR5-А и тиоредоксин/DR5-В с помощью рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы.

Исследуют тримеризации мутантных вариантов TRAIL с помощью аналитического ультрацентрифугирования (Фиг.1).

Определяют константы связывания мутантных вариантов TRAIL DR5-A и DR5-B с рецепторами DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG методом поверхностного плазменного резонанса (Фиг.2, Табл.2). Мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B не связываются с рецепторами DcR1 и DR4. Кроме того, вариант DR5-B в 280 раз и в 223 раза хуже связывается с DcR2 и OPG рецепторами соответственно по сравнению с диким типом. Введение мутации D269H в аминокислотную последовательность мутантного белка DR5-8, содержащую мутации Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q (мутантный белок DR5-A), приводит к увеличению сродства к рецептору DR5 в 3.6 раза, не затрагивая при этом его избирательные свойства к другим рецепторам. Данные поверхностного плазменного резонанса свидетельствуют, что мутантный вариант DR5-B отличается наибольшей избирательностью к DR5 рецептору (Табл.2).

Для сравнительного анализа противоопухолевой активности всех мутантных вариантов TRAIL исследуют биологическую активность этих белков (Фиг.3, Табл.3) на линиях раковых клеток с различными уровнями экспрессии рецепторов: клетки карциномы человека Hela (экспрессирующие DR4 и DR5 в равных количествах); клетки Т лейкемии человека Jurkat (в основном экспрессирующие DR5 рецептор); клетки лейкемии монобластов U937 (экспрессирующие в основном DR5 и DcR2 рецепторы) и клетки лейкемии миелоида К562 (экспрессирующие все 4 рецептора). В клетках HeLa мутантные варианты DR5-A и DR5-B индуцируют апоптоз несколько раз эффективнее по сравнению с диким типом, тогда как DR5-8 вариант уступает дикому типу. В клетках Jurkat DR5-A и DR5-B варианты индуцируют апоптоз более эффективно по сравнению с диким типом и DR4-8, DR5-8 или D269H вариантов. Наоборот, в DR4 ответственных клетках К562 DR4-8 вариант был также эффективен как дикий тип, тогда как DR5-8, DR5-A и DR5-B варианты демонстрируют сниженную активность. В этих клетках D269H вариант так же эффективен, как дикий тип, что указывает на его более низкую селективность по сравнению с DR5-A и DR5-B вариантами. Наконец, в клетках U937 цитотоксичная активность DR5-8, DR5-A и DR5-B вариантов значительно выше, чем у дикого типа, а эффективная доза (ЭД50) индукции апоптоза этими вариантами была уменьшена в 1.8, 3.0 и 3.4 раза соответственно. Данные таблицы 3 наглядно показывают, что противоопухолевая активность в полученных заявленным способом рекомбинантных препаратах в 2-3 раза выше, чем аналогичные свойства у известных ранее препаратов.

Таким образом, техническим результатом заявленного изобретения является получение нового препарата на основе рекомбинантного мутантного белка TRAIL DR5-A и DR5-B с высокой противоопухолевой активностью, значительно превышающей активность известных препаратов. Полученные соединения обладают повышенным сродством связывания с рецептором DR5, сильно пониженной эффективностью связывания с рецепторами DcR2 и OPG и практически не связываются с рецепторами DR4 и DcR1. Кроме того, в DR5 зависимых раковых клеточных линиях варианты TRAIL DR5-А и DR5-B несколько раз эффективнее вызывают апоптоз по сравнению как с диким типом, так и с уже известными DR5 избирательными мутантными вариантами DR5-8 и D269H. Получаемые препараты DR5-A и DR5-B с повышенной избирательностью к DR5 рецептору и высокой противоопухолевой активностью могут быть использованы для лечения DR5-зависимых опухолей, а также в качестве инструмента для исследования TRAIL опосредованных механизмов апоптоза. Получаемые вещества позволяют снизить дозу вводимых препаратов при лечении раковых заболеваний, что приводит к снижению стоимости лечения и негативных последствий для пациентов. Кроме того, благодаря высокой специфичности к рецептору смерти DR5 полученные препараты могут быть применены для лечения таких видов опухолей, которые резистентны к препарату дикого типа.

Изобретение иллюстрируется чертежами:

Фиг.1. Анализ аналитического ультрацентрифугирования мутантных вариантов DR5-A и DR5-B.

Препараты центрифугируют при 60000 rpm в стандартных 0.4 мл ячейках. Профили белков зарегистрированы после 1, 10, 20, 45, 54, 60, 74 и 86 мин при поглощении 280 нм. Посчитанные коэффициенты седиментации s20, w=3.69±0.04 утверждают содержание исключительно глобулярных тримерных молекул в препаратах.

Фиг.2. Сенсограммы связывания мутантных вариантов TRAIL с пятью рецепторами, полученные методом поверхностного плазменного резонанса (SPR). Пять лигандов (дикий тип TRAIL и DR5-8, D269H, DR5-A, DR5-B варианты) при концентрации 250 нМ одновременно наносят через 5 параллельных каналов 6×6 детекторного чипа иммобилизированных с DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG рецепторами.

Фиг.3. Биологическая активность дикого типа и мутантных вариантов TRAIL на клеточных линиях HeLa, Jurkat, K562 и U937.

Выживаемость клеток определена после 24 часов инкубации с вариантами TRAIL. Для увеличения чувствительности клеток к TRAIL опосредованному апоптозу в культуральную среду для клеток Hela и U937 добавляют эметин 0.05 и 0.25 мкг/мл соответственно.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Конструирование мутантного гена белка TRAIL DR5-A

Для введения мутаций Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q/D269H в ген белка TRAIL дикого типа в составе плазмидного вектора рЕТ-32а используют метод сайт-направленного мутагенеза, основанный на полимеразной цепной реакции. Введение мутаций осуществляют в 3 этапа.

На первом этапе вводят мутации Y189N/R191K/Q193R в ген белка TRAIL дикого типа, находящийся в составе плазмидного вектора рЕТ-32а. Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции содержит буфер с MgSO4 для Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва), Pfu ДНК-полимеразу (Fermentas, Литва), смесь из 4-х дезоксинуклеотидтрифосфатов, плазмидную ДНК pET-32a/TRAIL, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2) олигонуклеотидные праймеры. Поверх реакционной смеси наслаивают минеральное масло. Проводят 25 циклов амплификации при следующих условиях: 1 минута при 95°C, 30 секунд при 95°C, 1 минута при 55°C, 14.5 минут при 68°C. Образование мутантной ДНК проверяют с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле. Для расщепления исходной метилированной плазмидной ДНК реакционную смесь обрабатывают рестриктазой Dpn I в течение 1 часа при 37°C. Для наработки мутантной ДНК проводят трансформацию бактериального штамма Escherichia coli XL-1 Blue реакционной смесью. Выращивают клетки в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°C и интенсивном перемешивании 250 об/мин в течение 18 часов, после чего выделяют плазмидную ДНК из клеточной биомассы. Наличие мутаций подтверждают определением нуклеотидной последовательности мутантной ДНК.

На втором этапе вводят мутации H264R/I266L/D267Q в ген TRAIL, содержащий мутации Y189N/R191K/Q193R, по вышеописанной схеме. Используют олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4. После второго этапа получают последовательность ДНК кодирующий мутантный вариант TRAIL DR5-8.

На третьем этапе вводят мутацию D269H в ген мутантного варианта DR5-8, содержащий мутации Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q, по вышеописанной схеме. Используют олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO 5 и SEQ ID NO 6.

Результатом проделанной работы является рекомбинантная плазмидная ДНК рЕТ-32а, содержащая ген мутантного белка DR5-A с мутациями Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q/D269H (SEQ ID NO 9), кодирующая мутантный белок DR5-A (SEQ ID NO 9).

Пример 2.

Конструирование мутантного гена TRAIL DR5-B

Для конструирования мутантного гена белка DR5-B используют метод сайт-направленного мутагенеза, основанный на полимеразной цепной реакции.

Вводят мутации Q267D/D269H в ген мутантного варианта TRAIL DR5-8, содержащий мутации Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q, находящийся в составе плазмидного вектора рЕТ-32а. Используют олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO 7 и SEQ ID NO 8. Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции содержит буфер с MgSO4 для Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва), Pfu ДНК-полимеразу (Fermentas, Литва), смесь из 4-х дезоксинуклеотидтрифосфатов, плазмидную ДНК, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2) олигонуклеотидные праймеры. Поверх реакционной смеси наслаивают минеральное масло. Проводят 25 циклов амплификации при следующих условиях: 1 минута при 95°C, 30 секунд при 95°C, 1 минута при 55°C, 14.5 минут при 68°C. Образование мутантной ДНК проверяют с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле. Для расщепления исходной метилированной плазмидной ДНК реакционную смесь обрабатывают рестриктазой Dpn I в течение 1 часа при 37°C. Для наработки мутантной ДНК проводят трансформацию бактериального штамма Escherichia coli XL-1 Blue реакционной смесью. Выращивают клетки в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°C и интенсивном перемешивании 250 об/мин в течение 18 часов, после чего выделяют плазмидную ДНК из клеточной биомассы. Наличие мутаций подтверждают определением нуклеотидной последовательности мутантной ДНК.

Результатом проделанной работы является рекомбинантная плазмидная ДНК рЕТ-32а, содержащая ген мутантного белка DR5-B с мутациями Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H (SEQ ID NO 10), кодирующая мутантный белок DR5-B (SEQ ID NO 10). Все известные рецептор-избирательные мутантные варианты представлены в Таблице 1.

Таблица 1
Аминокислотные замены мутантных вариантов TRAIL.
Варианты TRAIL Аминокислотные замены Ссылки
DR4-8 Y189A - Q193S N199V K201R Y213W S215D *
DR5-8 Y189N R191K Q193R H264R I266L D267Q - *
D269H - - - - - - D269H **
DR5-A Y189N R191K Q193R H264R I266L D267Q D269H Заявка
DR5-B Y189N R191K Q193R H264R I266L - D269H Заявка
* Kelley FR., Totpal К., Lindstrom SH., Mathieu M., Billeci К., De Forge L. et al. Receptor-selective mutants of Apo2L/TRAIL reveal a greater contribution of DR5 than DR4 to apoptosis signaling // J.Biol.Chem. 2005. Vol.280, p.2205-2212.
** Van der Sloot AM., Tur V., Szegezdi ТЕ., Mullally MM., Cool RH., Samali A. et al. (2006) Designed tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand variants initiating apoptosis exclusively via the DR5 receptor//Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2006. V.103, p.8634-8639.

Пример 3.

Экспрессия и очистка мутантных белков DR5-A и DR5-B

Экспрессия мутантных вариантов TRAIL DR5-A или DR5-B, находящегося в составе рекомбинантного плазмидного вектора рЕТ-32а, проводится в бактериальном штамме Escherichia coli BL21(DE3). Клетки трансформируют плазмидной ДНК, содержащей мутантный ген, выращивают в жидкой питательной среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°C и интенсивном перемешивании (230 об/мин) в течение 18 часов. После этого клетки инокулируют в жидкую среду ТВ с ампициллином (100 мкг/мл) и индуцируют экспрессию добавлением 0.02 мМ IPTG (изопропил_β-D-1-тиогалактопиранозид). Культуру клеток выращивают при 27°C в течение 21 часа. После этого клетки осаждают центрифугированием при 4000 g и 4°C в течение 15 минут, промывают в буфере, содержащем 500 мМ NaCl и 25 мМ NaH2PO4 (pH 7.4), снова осаждают и замораживают при -80°C для хранения.

Разрушение клеток проводят в буфере, содержащем 25 мМ имидазола, 500 мМ NaCl и 25 мМ NaH2PO4 (pH 7.4), продавливанием под давлением на установке «French press» (Spectronic Instruments, Inc., США). Разрушенную клеточную массу осаждают центрифугированием при 28000 об/мин в течение 40 мин. Растворимую фракцию наносят на хроматографическую колонку Ni-NTA High Performance. Слитные белки Trx-DR5-A или Trx-DR5-B элюируют в буфере, содержащем 25 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазола (pH 7.4). Очищенные препараты диализуют против буфера, содержащего 50 мМ Tris/HCl (pH 8.0), 80 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ при 4°C в течение 18 часов. После диализа белки Trx-DR5-A или Trx-DR5-B расщепляют рекомбинантной легкой цепью человеческой энтеропептидазы в течение 18 часов при комнатной температуре. После расщепления остаточную активность энтеропептидазы удаляют на колонке с STI (soybean trypsin inhibitor, соевый ингибитор трипсина)-агарозой. Мутантные белки DR5-A или DR5-В отделяют от тиоредоксина на колонке с никелевой агарозой. На последней стадии препараты диализуют против буфера, содержащего 50 мМ фосфата натрия (pH 7.5) и 150 мМ NaCl, после чего стерилизуют через фильтр и хранят при 4°C для дальнейшего использования. На всех этапах очистки белок анализируют спектрофотометрически и с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.

В результате получают очищенные рекомбинантные мутантные варианты TRAIL DR5-A (SEQ ID NO 9) или DR5-B (SEQ ID NO 10).

Пример 4.

Определение связывания мутантных вариантов TRAIL DR5-A или DR5-B с рецепторами DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG методом поверхностного плазменного резонанса

Константы диссоциации (KD) для прямого связывания мутантных белков DR5-A или DR5-B с иммобилизованными рецепторами определяют методом поверхностного плазменного резонанса на установке ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System (BioRad). Пять рецепторов DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG одновременно связывают с поверхностью сенсорного 6×6-канального чипа в количестве 6000-8000 резонансных единиц. Чип активируют в течение 120 сек при помощи смеси гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (0.13 М) и N-гидроксилсульфосукцинимида (0.03 М). По 2 мкг каждого рецептора в 10 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5.0) наносят на активированные каналы. Реакцию иммобилизации завершают 1 М этаноламином (рН 8.5). В качестве контроля остающийся канал не связывают с белком. Сенсограммы записывают одновременно для 5 концентраций высокоочищенного тримерного белка DR5-A или DR5-B от 15 до 250 нМ. 300 мкл белка DR5-A или DR5-B наносят со скоростью 100 мкл/мин при 25°C, используя фосфатный буфер (рН 7.4) с добавлением 0.005% Tween-20. Связывание лиганда с рецепторами наблюдают в реальном времени. В промежутках между нанесением вариантов TRAIL поверхность рецептора регенерируют с помощью 3 М ацетата натрия (рН 5.2). Для определения значений КD применяют различные концентрации вариантов TRAIL в зависимости от их сродства к различным рецепторам. Сенсограммы анализируют с помощью нелинейного регрессивного анализа согласно модели связывания 1:1 программного обеспечения ProteOn Manager Version 2.0.1 (BioRad) для определения скоростей диссоциации. Константы диссоциации KD вычисляют из скоростей диссоциации KD=koff/kon при пяти различных концентрациях. Для связывания мутантного варианта TRAIL DR5-B с рецепторами DcR2 и OPG значения KD вычисляют согласно 1:1 изотерме связывания Ленгмюра и анализируют в виде нелинейной кривой с помощью того же программного обеспечения.

Анализ сенсограмм показал, что мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B не связываются с рецепторами DR4 и DcR1. Константа диссоциации белка DR5-A с рецептором DR5 в 3.5 раза ниже, чем мутантного варианта DR5-8, содержащего мутации Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q. Аффинность мутантного белка DR5-B с рецепторами DcR2 и OPG снижено в 280 и 223 раза соответственно по сравнению с TRAIL дикого типа (Таблица 2).

Таблица 2
Константы диссоциации вариантов TRAIL к пяти рецепторам определенные методом поверхностного плазменного резонанса (SPR)
TRAIL варианты KD, 10-9 M
DR5 DR4 DcR1 DcR2 OPG
Дикий тип 0.51±0.028 0.46±0.014 1.09±0.069 0.36±0.009 0.99±0.017
D269H 0.13±0.003 8.47±0.335 8.69±0.628 0.73±0.014 5.26±0.980
DR5-8 1.18±0.017 HC HC 3.32±0.048 10.9±0.448
DR5-A 0.33±0.005 HC HC 4.18±0.082 12.2±0.138
DR5-B 0.71±0.013 HC HC 101±7.0 221±19*
143±13*
DR4-8 NB 3.26±0.010 2.49±0.950 2.10±0.075 21.0±0.140
HC - нет связывания. *KD определенный из равновесных кривых.

Пример 5.

Исследование действия мутантных вариантов TRAIL DR5-A и DR5-B на линиях раковых клеток HeLa, Jurkat, K562 и U937

Раковые линии клеток Hela, Jurkat, U937 и K562 культивируют в жидкой питательной среде RPMI 1640, содержащей 10% (по объему) бычьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 ед./мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина при 37°C и 5% СО2. Разведения мутантных белков DR5-A и DR5-B производят в культуральной среде. Для определения количества живых клеток клетки рассаживают на 96-луночные планшеты (1×105 клеток/лунку) и инкубируют с серийными разведениями мутантных белков DR5-A или DR5-B в течение 24 часов при 37°C и 5% СО2. После этого добавляют реагент МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2]-2,5-дифенил тетразолиумбромид) в окончательной концентрации 0.5 мг/мл. Количество живых клеток определяют спустя 3 часа инкубации путем измерения поглощения при 570 нм на установке Multiscan. Линии клеток цервикальной карциномы HeLa и HeLa Bcl-2 культивируют в жидкой питательной среде DMEM, содержащей 10% (по объему) бычьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 ед./мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина при 37°C и 5% СО2. В некоторых экспериментах вместе с мутантными белками DR5-A или DR5-B добавляют ингибитор синтеза белка эметин (0.3 мкг/мл), ингибитор активновых микрофиламентов цитохалазин Д (1 мкг/мл) или ингибитор роста микротрубочек таксол (10 мкМ). Процент апоптоза определяют по количеству клеток с фрагментированными ядрами в препаратах, обработанных красителем Хехст в концентрации 1 мкг/мл в течение 30 минут.

Таблица 3
Величины эффективных доз (ЭД50) индукции апоптоза мутантных вариантов TRAIL на различных клеточных линиях
Варианты TRAIL HeLa К562 Jurkat U937
+0.5 мкг/мл еметин +0.25 мкг/мл еметин
ЭД50
нг/мл
Гибель клеток % ЭД50
нг/мл
Гибель клеток % ЭД50
нг/мл
Гибель клеток % ЭД50
нг/мл
Гибель клеток %
Дикий тип 6.2±0.5 93±6 0.22±0.02 60±4 0.28±0.03 37±3 0.27±0.03 22±2
D269H 2.1±0.2 91±6 0.23±0.03 85±7 0.17±0.02 43±3 0.27±0.03 25±2
DR5-8 6.0±0.6 45±3 0.27±0.02 27±3 0.15±0.02 48±4 0.15±0.02 43±3
DR5-A 2.2±0.2 86±7 0.73±0.06 34±3 0.07±0.01 56±5 0.09±0.01 43±4
DR5-B 1.5±0.1 78±6 1.11±0.07 35±3 0.07±0.01 53±5 0.08±0.01 50±3
DR4-8 1.6±0.2 25±3 0.23±0.02 62±7 0.71±0.06 26±3 0.26±0.02 14±3

Подсчет конденсированных и фрагментированных ядер (около 500 клеток на 1 образец) осуществляют под флуоресцентным микроскопом. Результаты исследования представлены на Фис.3 и в Таблице 3.

Способ получения рекомбинантного мутантного белка TRAIL человека с высокой противоопухолевой активностью, включающий введение мутаций Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D267Q/D269H или Y189N/R191K/Q193R/H264RA266L/D269H в ген TRAIL человека, находящийся в составе плазмидной ДНК рЕТ-32а, с последующей трансформацией штамма Escherichia coli BL21(DE3) полученной рекомбинантной плазмидной ДНК, экспрессию и выделение целевого белка.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к рекомбинантной экспрессии дефенсинов насекомых в клетке мицелиальных грибов рода Aspergillus. .

Изобретение относится к рекомбинантной экспрессии дефенсинов насекомых в клетке мицелиальных грибов рода Aspergillus. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению водорастворимого домена белка Линкс1 человека, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению водорастворимого домена белка Линкс1 человека, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии и решает задачу поиска новых лекарственных средств, направленных против боли. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделению физиологически активных соединений, и может быть использовано в медицине. .
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выявления РНК вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, и может быть использовано в ветеринарии

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к rac-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]пиридиний бромиду, обладающему способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих: Технический результат: описанное соединение, обладает низкой токсичностью и способно в виде спиртового раствора доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинантную термостабильную ДНК-лигазу Thermococcus sp 1519, проявляющую лигазную активность в присутствии ионов магния, в широком диапазоне значений рН (7,0-10,7) и концентраций натрия хлорида (25-150 мМ)

Изобретение относится к биотехнологии, для изготовления лекарственных препаратов для иммунокоррекции или использования как компонент тест-системы для определения интерферонового статуса человека в норме и патологии

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой липолитический фермента, который получен из одного из Streptomyces

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенные моноклональные антитела, в частности моноклональные антитела человека, которые специфически связываются с PD-1 с высокой аффинностью

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору из двух праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты вируса гепатита А, к способу обнаружения вируса гепатита А в биологическом образце, а также к набору для обнаружения вируса гепатита А в биологическом образце
Наверх