Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца



Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца
Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца

 


Владельцы патента RU 2405158:

МТМ ЛАБОРАТОРИЕС АГ (DE)

Изобретение относится к медицине и касается способа обнаружения неопластических заболеваний исходя из оценки солюбилизированного физиологического образца. Изобретение обеспечивает надежный метод диагностики неопластических поражений на ранней стадии. 5 н. и 25 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл.

 

Настоящее изобретение относится к способу ранней диагностики неопластических заболеваний, таких как рак и предшествующие ему стадии, в частности рак дыхательных путей, рак мочевыделительной системы, рак репродуктивной системы, рак, ассоциированный с HPV-инфекцией, или рак аногенитального тракта, исходя из солюбилизированного физиологического образца.

Предшествующий уровень техники

Уже в середине пятидесятых годов были предложены программы по предупреждению рака различных типов. Во многих развитых странах существуют программы для широкого обследования населения в целях выявления рака шейки матки. Однако аналогичные программы обследования применимы и для других типов рака и предраковых состояний, таких как, например, рак мочевыделительной системы, рак дыхательных путей и т.п. В нижеследующем описании настоящего изобретения рак шейки матки служит лишь примером, на котором будут показаны недостатки современных профилактических мер. Однако после соответствующих изменений (mutandis mutatis) эти меры могут быть применены и для других программ по профилактике любых раковых заболеваний.

Что касается внутриэпителиальной неоплазии шейки матки и поражений гландулярного эпителия шейки матки, то программы по их профилактике основаны, главным образом, на морфологическом и цитологическом исследовании цитологических мазков шейки матки, которое называется Рар-тестом и которое проводят путем рутинного гинекологического обследования женщин, начиная с 20-летнего возраста, через определенные интервалы времени. В соответствии с морфологией клеток эти мазки подразделяют на различные степени интенсивности диспластических клеточных изменений. В соответствии с методом Рар I-V эти степени интенсивности клеточных изменений разделяются на следующие категории: нормальные клетки, легкая дисплазия, умеренная дисплазия, тяжелая дисплазия и инвазивная карцинома соответственно. Если Рар-тест дает неожиданный результат, то проводят биопсию с получением небольшого образца, который подвергают гистопатологическому анализу для определения типа и степени дисплазии, которая может быть классифицирована как внутриэпителиальная неоплазия шейки матки (CIN1-3).

Несмотря на профилактические программы, рак шейки матки, который ежегодно диагностируется у 400000 человек, является вторым по частоте встречаемости опухолевых заболеваний у женщин. Это, inter alia, обусловлено тем фактом, что примерно до 30% из всех результатов индивидуальных Рар-тестов являются ложноотрицательными.

В стандартном скрининг-анализе на внутриэпителиальную дисплазию шейки матки, проводимом для выявления неопластических поражений шейки матки, используются мазки. В этой скрининг-процедуре идентифицируются поражения различного происхождения. Причинами, вызывающими такие поражения, могут быть, например, воспаления (вызванные инфекционными агентами, либо физическими или химическими повреждениями) или неопластические изменения. При морфологическом анализе поражения различного характера трудно поддаются дифференциации. Так, например, для анализа цервикальных мазков и других мазков цитологи и патологи должны пройти особую подготовку, и даже опытные специалисты-диагносты при проведении диагностических анализов цитологических образцов получают результаты, которые в высокой степени отличаются как от наблюдений других сотрудников, так и от их собственных наблюдений. В основном, результат такого исследования основан на субъективной интерпретации диагностических критериев патологом/цитологом, проводящим исследование. В итоге, число ложноположительных и ложноотрицательных результатов в таких скрининг-анализах является недопустимо высоким.

Воспроизводимость результатов таких исследований может быть увеличена путем применения подтверждающих молекулярных методов. Однако проблема, связанная с хранением и получением образцов, не может быть решена лишь дополнительным использованием молекулярных маркеров. Еще одной проблемой, с которой сталкиваются цитологи или гистологи при проведении скрининга, в частности, при осуществлении методов детектирования молекулярных маркеров, является необходимость соблюдать строгие меры предосторожности при хранении образцов для предотвращения образования артефактов или получения ложных результатов.

Это обусловлено, отчасти, ненадежностью информации о морфологии клеток и, отчасти, нестабильностью молекулярных маркеров, детектируемых во время проведения тестов. Если приготовление, транспортировка или хранение образцов не соблюдается надлежащим образом, то информация о клетках или даже молекулярная информация может быть вообще утрачена или искажена. Поэтому в данном случае диагноз не может быть установлен, либо он может быть искажен артефактами. Так, например, интерпретация биоптата или цитологических препаратов часто значительно затруднена или вообще невозможна из-за повреждения клеток (физического или биохимического). Кроме того, что касается образцов ткани или биоптатов, то сохранение молекулярной структуры образцов, которые подвергаются быстрому метаболизму, представляется довольно трудной задачей, поскольку до помещения всего образца в соответствующие консерванты проходит много времени.

Хотя программы по профилактике неопластических поражений были рассмотрены выше на примере рака шейки матки, однако, в основном, такие программы могут быть также направлены и на лечение других раковых заболеваний, поскольку в их течении наблюдаются почти те же самые ситуации. Диагностические методы, подтверждаемые морфологическими анализами и осуществляемые в соответствии со стандартными процедурами, имеют два главных недостатка. Во-первых, эти методы в высокой степени зависят от субъективной оценки исследователя. Во-вторых, информация, полученная в морфологических исследованиях, является достаточно чувствительной к процессам разрушения клеток, и поэтому она может приводить к возникновению артефактов после получения образцов. Оба этих аспекта являются причиной плохой воспроизводимости результатов.

Поэтому целью настоящего изобретения является разработка метода, с помощью которого могут быть надежно и на ранней стадии диагностированы неопластические поражения, такие как рак и предшествующие ему стадии. Кроме того, этот метод позволяет дифференцировать доброкачественные воспалительные состояния или метапластические изменения от неопластических поражений, таких как дисплазии и предрак. Более того, настоящее изобретение относится к способам выявления рака на биохимическом уровне исходя из солюбилизированных образцов. Такими образцами могут быть любые образцы, включая клетки в консервирующем растворе, используемом в методах цитологического анализа в растворе (LBC).

В другом аспекте настоящего изобретения авторы настоящего изобретения рассматривают использование LBC-образцов в качестве источников исследуемого материала в целях разработки диагностических тест-наборов для неклеточного биохимического анализа для диагностики клинически релевантных состояний. Рассматриваемые LBC-образцы используются для разработки анализов клеточного формата. Однако лизис образцов в описанном здесь способе дает авторам настоящего изобретения базу для разработки наборов для биохимического анализа образцов материала, которые являются подходящими для получения информации о статусе заболевания пациента, диагностированного в результате проведения других диагностических процедур, исходя из того же самого материала образца.

Способ детектирования нуклеиновой кислоты HPV в образцах LBC описан Digene Corp. В этом способе в качестве базы для проведения анализа используются LBC-образцы. Детектирование нуклеиновой кислоты HPV осуществляют после лизиса клеток, содержащихся в LBC-образцах. В этом методе количество LBC-образца, используемого в биохимическом неклеточном детектировании нуклеиновой кислоты HPV, не нормализуют в отношении информации, полученной исходя из цитологического образца, взятого из того же самого LBC-образца. Поэтому способ, описанный Digene, ограничен лишь качественными измерениями. Любой количественный или даже полуколичественный метод, основанный на неклеточном биохимическом анализе, требует наличия информации относительно состава образцов, получаемой либо с помощью биохимических маркеров, либо из анализов образца с помощью микроскопа или проточной цитометрии. В настоящем изобретении использование LBC-образцов в целях установления диагноза или разработки наборов и in vitro диагностических устройств позволяет проводить точный и сравнительный анализ с получением цитологической информации, которая может быть использована в биохимических неклеточных тестах. В этих случаях не требуется биохимической нормализации по отношению к маркерам, которые являются индикаторами присутствия или отсутствия клеток или типов клеток. Преимущество использования LBC-образцов заключается в том, что цитологическая информация поступает непосредственно из гомогенного LBC-образца, что позволяет получить надежные и точные данные, которые могут быть использованы для оценки результатов биохимических неклеточных тестов.

С другой стороны, способ детектирования молекулярных маркеров на уровне белков или нуклеиновых кислот в солюбилизированных образцах описан в различных публикациях. Однако в этих публикациях не приводится каких-либо упоминаний, связанных с использованием LBC-образцов в качестве источника для взятия препаратов проб. В общих чертах, LBC-методы используются специалистами для более точной морфологической оценки цитологических препаратов. Поэтому область применения LBC-образцов предусматривает их применение лишь в цитологии. Исходя из описаний предшествующих работ, можно отметить, что в этих работах не рассматривается использование LBC-образца для последующей его солюбилизации в целях проведения биохимического анализа. Кроме того, в этих работах в любом из методов, который не основан на проведении клеточной морфологической оценки образцов, описаны преимущества LBC-процедур, и ничего не сказано о применении LBC-образцов. В соответствии с данными, полученными авторами настоящего изобретения, использование LBC-образцов в качестве источников для биохимических неклеточных анализов на определение уровней белка в солюбилизированных образцах, дает то преимущество, что полученные результаты могут непосредственно сравниваться с результатами цитологического анализа образца. В этой связи биохимический анализ белка может служить в качестве предварительного теста или для получения дополнительной информации, или даже для подтверждения цитологически неоднозначного результата. В других вариантах осуществления изобретения информация, полученная из биохимических неклеточных тестов, может быть использована для разработки процедур цитологического анализа.

Поэтому разработка описанного здесь способа имеет важное значение для достижения эффективных и надежных наборов и устройств для диагностики in vitro. Способ для разработки описанных здесь наборов и устройств для диагностики in vitro позволяет осуществлять сравнение результатов, полученных в биохимических неклеточных анализах, с результатами цитологических анализов посредством нормализации. Такую нормализацию образца для его применения в формате биохимического теста осуществляют по отношению к данным LBC-образца, полученным из его цитологического анализа. Такая информация включает, например, объем клеточного содержимого в LBC-образце, объем LBC-образца, массу образца или параметры, которые могут быть определены только путем приготовления тонкослойного препарата из LBC-образца. В соответствии с этим авторами настоящего изобретения заявлены способы, которые являются надежными способами для получения наборов и устройств для диагностики in vitro с использованием LBC-образцов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу диагностики неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного образца, взятого у пациента. Этот способ включает стадии (а) взятия физиологического образца у индивидуума, (b) солюбилизации указанного физиологического образца в среде для лизиса и (с) определения сверхэкспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы в солюбилизированном образце путем сравнения уровня указанного ингибитора циклин-зависимой киназы в указанном солюбилизированном образце с уровнем указанного ингибитора, присутствующего в солюбилизированном образце здорового человека. Образцами, используемыми в способе настоящего изобретения, могут быть любые образцы, включая клетки в растворе для консервации клеток, используемом в цитологических методах, осуществляемых в растворе.

Настоящее изобретение также относится к тест-набору для определения уровня ингибиторов циклин-зависимой киназы, включающему зонды, специфичные для указанного ингибитора циклин-зависимой киназы, и среду для лизиса, используемую для солюбилизации физиологического образца. Указанный тест-набор может представлять собой устройство для диагностики in vitro.

В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к набору, используемому в качестве устройства для диагностики in vitro. Кроме того, настоящее изобретение также относится к устройству для диагностики in vitro, содержащему зонды, направленные против ингибитора циклин-зависимой киназы и фиксированные на твердых носителях, где указанное устройство предназначено для измерения уровня ингибитора циклин-зависимой киназы в солюбилизированном образце.

Настоящее изобретение также относится к способу получения наборов и устройств для диагностики in vitro в целях установления диагноза клинически релевантных состояний с использованием солюбилизированных физиологических образцов, где указанный способ осуществляют с использованием физиологических образцов, приготовленных в среде для консервации клеток, и где указанные консервированные клетки предназначаются и приготавливаются для их использования в способах цитологического анализа, таких как способы цитологического анализа в растворе. Образцы, применяемые в способах цитологического анализа в растворе (далее называемые LBC-образцами), солюбилизируют в соответствующей среде для лизиса и используют в целях разработки эффективных наборов и устройств для диагностики in vitro клинически релевантных состояний путем проведения биохимических неклеточных анализов солюбилизированных образцов.

Настоящее изобретение также относится к способу установления диагноза клинически релевантных состояний путем проведения биохимического неклеточного анализа на присутствие или отсутствие или на уровень маркерной молекулы в солюбилизированных физиологических образцах, где указанным физиологическим образцом является LBC-образец, и где детектирование маркерных молекул осуществляют путем определения наличия или отсутствия белков, пептидов, нуклеиновых кислот или их фрагментов в указанных солюбилизированных образцах и/или определения их уровней. Маркерные молекулы, которые могут быть использованы в этом способе, описаны выше как “маркерные молекулы, ассоциированные с клинически релевантными состояниями”. Этот способ может быть применен для диагностики любого клинически релевантного состояния.

Краткое описание графического материала

На фигуре 1 представлены значения OD, полученные в ELISA-тесте на детектирование уровней p16INK4a в солюбилизированных цервикальных образцах; подробное описание эксперимента см. в примере 1.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на предположении авторов изобретения о том, что при многих неопластических заболеваниях, таких как рак, например, рак дыхательных путей, рак мочевыделительной системы, рак репродуктивной системы, рак, ассоциированный с HPV-инфекцией, или рак аногенитального тракта, в частности рак шейки матки, и предшествующие стадии вышеуказанных раковых заболеваний, соответственно, происходит сверхэкспрессия продуктов гена ингибиторов циклин-зависимой киназы. Примерами ингибиторов циклин-зависимой киназы являются белки р14, p15INK4b, p16INK4a, p18INK4c, p19INK4d, p21WAF1/CIP1 и p27KIP1. В контексте настоящего изобретения термин “ингибитор циклин-зависимой киназы” также включает белок-регулятор клеточного цикла p14ARF, который по своей функции не является ингибитором циклин-зависимой киназы.

Заявителем было также обнаружено, что степень сверхэкспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы, определяемая в цитологических образцах, коррелирует со степенью дисплазии, определяемой в соответствующих гистологических образцах.

В соответствии с настоящим изобретением заявителями был предложен способ ранней диагностики неопластических заболеваний, таких как раковые заболевания и предшествующие им стадии, где указанный способ предусматривает установление сверхэкспрессии ингибиторов циклин-зависимой киназы в физиологическом образце.

В соответствии с настоящим изобретением процедуры цитологического и/или гистологического анализа подтверждаются с помощью молекулярных маркеров. Такие маркеры могут быть, например, использованы в реакциях иммуноцитохимического окрашивания, или в реакциях гибридизации in situ. Комбинирование морфологических исследований и реакций иммуноцитохимического окрашивания, проводимых с использованием маркерных молекул, характерных для неопластических заболеваний, таких как рак, например рак шейки матки, рак мочевого пузыря или легких, может давать лучшие результаты. Морфологическое исследование, даже при его комбинировании с молекулярными методами, которые дают более надежный результат, пока еще остается трудоемким и дорогостоящим методом, требующим много времени. Кроме того, диагноз, поставленный на основе данных клеточно-морфологического анализа, даже при его подтверждении молекулярными параметрами, зависит от субъективной оценки морфологии отдельными специалистами. Таким образом, диагноз зависит от специалиста, проводящего исследование.

Авторами настоящего изобретения, кроме того, было показано, что в определенных случаях молекулярные маркеры могут быть использованы в качестве диагностических средств, не требующих дополнительного подтверждения путем проведения морфологического исследования клеток. Методы диагностики неопластических заболеваний, таких как рак, осуществляемые лишь на молекулярном уровне и не подтвержденные информацией о морфологии клеток, ограничены лишь теми случаями, где используются маркеры или уровни маркеров, которые являются строго специфическими для диагностируемого состояния. Особенно это относится к тем случаям, когда маркерами являются вещества, не происходящие от организма человека. Так, например, обнаружение вирусных инфекций может быть осуществлено в растворах образцов, поскольку маркеры, указывающие на присутствие вирусов в тканях, не обнаруживаются в нормальных тканях человека.

Однако авторами настоящего изобретения было обнаружено, что некоторые ингибиторы циклин-зависимой киназы человека могут служить в качестве маркера ракового заболевания в процедурах детектирования с использованием биохимических маркеров, хотя в любой нормальной пролиферирующей человеческой клетке, в определенных фазах клеточного цикла, этот белок регуляции клеточного цикла экспрессируется на низком уровне.

Ингибиторами циклин-зависимой киназы, используемыми в настоящем изобретении, являются р14, p15INK4b, p16INK4a, p18INK4c, p19INK4d, p21WAF1/CIP1 и p27KIP1. В описанном здесь способе, помимо ингибиторов циклин-зависимой киназы, может быть также использован белок регуляции клеточного цикла p14ARF, кодируемый альтернативной рамкой считывания гена p16INK4a. Для удобства в контексте настоящего изобретения термин “ингибитор циклин-зависимой киназы” также включает белок-регулятор клеточного цикла p14ARF, который по своей функции не является ингибитором циклин-зависимой киназы.

Используемые здесь термины “р16” или “ингибитор циклин-зависимой киназы p16INK4a” означают ингибитор циклин-зависимой киназы p16INK4a (также обозначаемый CDKN2 или MTS1), ген которого локализован в области хромосомы 9р21. p16INK4a впервые был описан Serrano M., et al., Nature, 1993, Dec 16; 366(6456):704-7. Термины “p16INK4a” или “ингибитор циклин-зависимой киназы p16INK4a”, используемые в контексте настоящего изобретения во всех грамматических формах, означают нуклеиновую кислоту, а также полипептидные молекулы. Термины “p16INK4a ” или “ингибитор циклин-зависимой киназы p16INK4a” также включают, например, РНК (мРНК, чРНК и т.п.), ДНК (кДНК, геномную ДНК и т.п.), белки, полипептиды, протеогликаны, гликопротеины и соответствующие фрагменты этих молекул.

Используемый здесь термин “уровень” ингибиторов циклин-зависимой киназы или других маркерных молекул означает полуколичественную, а также количественную величину, относящуюся к количеству соответствующего маркера (ингибиторов циклин-зависимой киназы или других маркерных молекул), присутствующего в образце. Количественная величина может быть, например, определена как концентрация. Полуколичественная величина может быть выражена в виде шкалы уровней, например, неопределяемых уровней, низких уровней, промежуточных уровней, высоких уровней, или любым другим подходящим способом. Уровень маркера, такого как p16INK4a, может быть также представлен как зависимый параметр, такой как интенсивность сигнала, генерируемого в формате анализа в ответ на присутствие, например, ингибитора циклин-зависимой киназы. В некоторых вариантах осуществления изобретения термин “уровень” может также означать качественную величину, определяющую присутствие маркерной молекулы.

Вследствие экспрессии ингибиторов циклин-зависимой киназы (например, p16INK4a) в некоторых доброкачественных клетках, присутствующих в физиологическом образце (например, в цервикальных образцах, в образцах, взятых из полости рта, в моче, мокроте и т.п.), установление диагноза неопластического заболевания, исходя только из уровня ингибиторов циклин-зависимой киназы, но без дополнительной информации о морфологии клеток, представляет определенные трудности или вовсе невозможно. Специалистам известно, что в определенном количестве цервикальных образцов, составляющем до 30%, лишь некоторые из многих метапластических клеток могут оказаться иммунореактивными по отношению к ингибитору циклин-зависимой киназы p16INK4a на умеренном или на высоком уровне. Кроме того, клетки эндометрия, которые в некоторых случаях могут присутствовать в цервикальных мазках, могут оказаться позитивными по p16INK4a. В цитологических или гистологических тест-процедурах этот факт не влияет на установление диагноза, поскольку клетки этого типа могут быть легко идентифицированы от диспластических клеток по их клеточной морфологии.

Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что определение пороговой величины ингибиторов циклин-зависимой киназы (например, p16INK4a) позволяет выявлять или диагностировать дисплазию даже без какой-либо информации о клеточной морфологии.

Термин “неопластические заболевания”, используемый в контексте настоящего изобретения во всех его грамматических формах, означает рак любого вида и происхождения и его предшествующие стадии соответственно. В соответствии с этим термин “неопластическое заболевание” включает рассматриваемое здесь поражение, называемое “неоплазией”, “неоплазмой”, “раком”, “предраком” или “опухолью”. Кроме того, в объем используемого здесь термина “неопластическое заболевание” входит также цитологический аналог, идентифицируемый в гистологической патологии как “диспластическое поражение” или “дисплазия”.

Неопластические заболевания, для диагностики которых применяются способы настоящего изобретения, включают, например, неопластические поражения дыхательных путей, рак мочевыделительной системы, рак желудочно-кишечного тракта, рак аногенитального тракта, а также неопластические заболевания, ассоциированные с HPV-инфекцией и др. Такими заболеваниями могут быть рак дыхательных путей, мочевыделительной системы, репродуктивной системы или рак аногенитального тракта, рак, ассоциированный с HPV-инфекцией, и, в частности, рак шейки матки. Что касается последнего заболевания, то в этой связи могут быть упомянуты его предшествующие стадии, например, внутриэпителиальная неоплазия шейки матки (CINI-III), карцинома in situ (CIS) и т.п. Термин “предшествующие стадии”, используемый здесь во всех его грамматических формах, включает все предшествующие стадии рака и предрак или любые другие злокачественные заболевания. Используемый здесь термин “предрак шейки матки” или его “предшествующие стадии” может, например, означать стадии внутриэпителиальной неоплазии шейки матки, идентифицированные в соответствии с такими системами классификации, как, например, классификация CIN (CIN I-CIN III), классификация РАР (РАР I-РАР V) или классификация Bethesda (NILM, LSIL, HSIL).

Термин “рак дыхательных путей” может означать любое злокачественное заболевание дыхательных путей, такое как, например, рак легких, рак альвеол, рак бронхиол, рак бронхиального дерева и рак бронхов, рак носоглотки, рак ротовой полости, рак гортани, рак носовой полости и околоносовой пазухи. К раку легких относится мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточная карцинома легких, мелкоклеточная карцинома легких, аденокарцинома легких, крупноклеточная карцинома легких, плоскоклеточная аденокарцинома легких, карциноидная опухоль легких, опухоль бронхиальных желез или (злокачественная) мезотелиома. Общее описание опухолей дыхательных путей можно найти в работе Colby T.V. et al.: Tumors of the Lower Respiratory Tract, Atlas of Tumor Pathology, Third Series, Fascicle 13, AFIP: Washington 1995”, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Опухоли мочевыделительной системы могут включать рак мочевого пузыря, рак почек, рак почечной лоханки, рак мочеточника, рак уретры и т.п. Опухоли репродуктивной системы могут включать рак и предрак яичника, матки, яичек, предстательной железы, эпидидимиса и т.п.

В некоторых вариантах осуществления изобретения термин “неопластическое заболевание”, в общих чертах, относится к HPV-ассоциированным неопластическим заболеваниям. В соответствии с этим настоящее изобретение применяется к HPV-ассоциированным неопластическим заболеваниям, и особенно у индивидуумов с высоким риском HPV-инфицирования и у индивидуумов с HPV слизистой. HPV-инфекция высокого риска может включать подтипы HPV, такие как HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 и 58. Маркеры HPV-инфекции могут включать продукты экспрессии генов HPV, таких как L1, L2, Е2, Е4, Е5, Е6 или Е7.

Термин “физиологический образец” включает любые физиологические образцы любого типа и природы. Примерами таких физиологических образцов являются секреты, тампонированные мазки, лаважи, физиологические жидкости, сперма, образцы клеток и тканей, кровь, мазки, мокрота, моча, кал, цереброспинальные жидкости, желчь, желудочно-кишечные секреты, лимфа, костный мозг, аспираты и биоптаты органов, такие как биоптаты, взятые иглой или щипцами, и аспираты, взятые тонкой иглой. В частности, взятие цитологических мазков, тампонированных мазков и биопсии показаны в том случае, когда речь идет о выявлении аногенитального рака, например рака шейки матки. Термин “биопсия”, используемый в описании изобретения, включает все виды биопсии, известные специалистам. Таким образом, термин “биопсия”, используемый в контексте настоящего изобретения, может включать, например, образцы, полученные при резекции опухолей, образцы тканей, полученные эндоскопическими методами, или биоптаты органов, полученные с помощью щипцов или иглы. Термин “биопсия” включает образцы, полученные несколькими различными методами, такими как биопсия с помощью замораживающего микротома, LEEP-биопсия (процедура биопсии с помощью электрокатетера-петли) и т.п.

Термин “физиологические образцы”, используемый в контексте настоящего изобретения, может включать образцы фиксированных или консервированных клеток или тканей. Образцы клеток или тканей могут, например, храниться в стандартной коллекции образцов, в средах для консервации или в средах для транспортировки, известных специалистам, таких как, например, коммерчески доступная среда для консервации (раствор формалина, Cytyc “PreservCyt” или “CytoLyt”, Digene “Universal Collection Medium”, Tripath Imaging “Cytorich” и т.п.). В одном из вариантов осуществления изобретения образцами клеток или тканей, приготовленными в стандартной среде для сбора образцов, являются цитологические образцы в растворе (LBC-образцы), которые получают методами, применяемыми для приготовления цитологических LBC-образцов, или аналогичными методами, известными специалистам. Подходящая среда для консервации клеток может содержать смесь одного или нескольких веществ, выбранных из группы, включающей спирты, альдегиды, кетоны, кислоты, ионы металлов или сублиматы, а также простые эфиры и т.п., используемые для консервации клеточных компонентов. Спирты включают метанол, этанол, н- или изопропанол, н-, изо- или трет-бутанол или высшие разветвленные или неразветвленные спирты. Альдегиды включают формальдегид, ацетальдегид, глутаральдегид и т.п. Могут быть также использованы кетоны, такие как ацетон. Кислоты, используемые в стандартной среде для образцов, включают органические кислоты (уксусную кислоту, трихлоруксусную кислоту, салициловую кислоту, пикриновую кислоту) или неорганические кислоты, такие как, например, хромовая кислота. Стандартные растворы образцов могут содержать металлы, такие как серебро, медь, хром, ртуть, осмий и уран. Компонентами среды для консервации могут быть растворы солей, такие как уранилацетат, бихромат калия, сульфат аммония и т.п.

Клетки, консервированные в подходящей среде (спирте и т.п.), или образцы фиксированных тканей могут быть использованы в качестве исходных образцов в способах настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения физиологический образец может, например, содержать образец мокроты, цервикальный мазок, мазок, взятый из полости рта, мазок, взятый из уретры, или т.п., которые могут быть перенесены в среду для консервации, содержащую спирт.

Кроме того, в описанных здесь способах могут быть использованы физиологические образцы, которые были подвергнуты клеточному лизису сразу после их получения. Авторами настоящего изобретения был разработан ряд надежных, быстрых и простых способов сохранения молекулярных свойств образцов для предотвращения потери морфологической информации, которую содержат данные образцы. Такие образцы могут быть, например, получены в воспроизводимой и удобной для хранения и транспортировки форме путем солюбилизации клеточных компонентов исходного образца в подходящей среде для лизиса сразу после получения этого образца или даже во время его получения. Физиологические жидкости могут быть непосредственно взяты из организма индивидуума и перенесены в среду, содержащую подходящие детергенты и консерванты. Кроме того, образцы тканей могут быть непосредственно перенесены в условия денатурирующего лизиса (фактически поддерживаемые физическими силами), и, таким образом, они могут быть сохранены. Молекулярные компоненты исходного образца могут быть сохранены с использованием соответствующих ингредиентов в среде для лизиса, и поэтому они не могут подвергаться деградации. Деградация ферментативных активностей может быть, например, минимизирована с использованием ингибиторов ферментов. Таким образом, раствор тест-образцов в указанной среде для лизиса может легко сохранять молекулярные свойства тест-образца в процессе солюбилизации.

В соответствии с настоящим изобретением физиологические образцы могут быть солюбилизированы в любой подходящей среде для лизиса. Такой средой для лизиса могут быть, например, водные растворы хаотропных агентов, таких как мочевина, GuaSCN, формамид, водные растворы детергентов, таких как анионогенные детергенты (например, ДСН, N-лаурилсаркозин, дезоксихолат натрия, алкиларилсульфонаты, сульфаты длинноцепочечных (жирных) спиртов, сульфаты и сульфонаты олефинов, сульфаты и сульфонаты альфа-олефинов, сульфированные моноглицериды, сульфированные эфиры, сульфосукцинаты, алкансульфонаты, сложные эфиры фосфорной кислоты, алкилизетионаты, сложные эфиры сахарозы), катионогенные детергенты (например, хлорид цетилтриметиламмония), неионогенные детергенты (например, Твин-20, Nonidet P-40, Тритон Х-100, NP-40, Igepal CA-630, N-октилглюкозид) или амфотерные детергенты (например, CHAPS, 3-додецилдиметиламмонийпропан-1-сульфонат, оксид лаурилдиметиламина) и/или водные растворы гидроксидов щелочных металлов, таких как, например, NaOH или КОН. В основном, в качестве растворителя в среде для лизиса настоящего изобретения может быть использована любая подходящая жидкость. Такой жидкостью может быть органическая или неорганическая жидкость, чистая жидкость, смесь жидкостей или раствора веществ в этой жидкости, и такая жидкость может содержать добавки, улучшающие свойства растворителя. В некоторых вариантах настоящего изобретения, если лизис клеток может быть достигнут без использования детергентов, то в качестве растворителя могут быть использованы гипер- или гипотонические растворы или буферы, или просто вода или органическая жидкость. Любая жидкость, подходящая для полной или частичной солюбилизации клеточных компонентов физиологических образцов, может рассматриваться в описании настоящего изобретения как среда для лизиса. Таким образом, используемая здесь среда для лизиса необязательно должна содержать буферные вещества или обладать буферной емкостью. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения среда для лизиса может обладать буферной емкостью и может содержать буферные вещества.

В одном из вариантов осуществления изобретения среду для лизиса получают так, чтобы клетки, клеточный дебрис, нуклеиновые кислоты, полипептиды, липиды и другие биомолекулы, которые, возможно, присутствуют в исходном образце, были солюбилизированы. В других вариантах изобретения растворитель может быть выбран так, чтобы он обеспечивал дифференциальную солюбилизацию конкретных компонентов физиологического образца, но при этом другие компоненты оставались бы несолюбилизированными.

Среда для лизиса, предназначенная для солюбилизации физиологического образца, в соответствии с настоящим изобретением, может, кроме того, содержать один или несколько агентов, предотвращающих деградацию компонентов в данных исходных образцах. Такими компонентами могут быть, например, ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы протеиназы, ингибиторы РНКазы, ингибиторы ДНКазы и т.п. В одном из вариантов настоящего изобретения образец подвергают лизису непосредственно в той форме, в которой он был взят у индивидуумов, подвергаемых обследованию. Ингибиторы протеиназы могут, например, включать ингибиторы сериновых протеиназ, ингибиторы цистеиновых протеиназ, ингибиторы аспарагиновых протеиназ, ингибиторы металлопротеиназ, ингибиторы кислотных протеиназ, ингибиторы щелочных протеиназ или ингибиторы нейтральных протеиназ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ингибирование ферментов может быть достигнуто химическими методами, такими как денатурация ферментов посредством концентрированной соли, рН, хаотропных агентов или т.п.

В другом варианте осуществления изобретения данный физиологический образец может быть, кроме того, очищен, а затем подвергнут лизису. Такие процедуры очистки могут, например, включать удаление (путем промывки) примесей, таких как слизь или т.п., выделение или концентрирование клеточных компонентов, сохранение и транспортировку клеток. В одном из вариантов изобретения указанные клетки могут быть разделены с помощью проточной цитометрии или других подходящих методов клеточного сортинга, известных специалистам. Так, например, клеточные компоненты исходных образцов могут быть включены в один раствор образца.

Получение образца для его использования в описанном здесь способе может также включать несколько дополнительных стадий приготовления образца, таких как разделение нерастворимых компонентов, выделение полипептидов или нуклеиновых кислот, получение фиксированных на твердой фазе пептидов или нуклеиновых кислот или получение сфер, мембран или предметных стекол, с которыми могут быть ковалентно или нековалентно связаны определяемые молекулы.

Термин “установление сверхэкспрессии белков-ингибиторов циклин-зависимой киназы” включает любые методы, которые являются подходящими для детектирования экспрессии белков-ингибиторов циклин-зависимой киназы или кодирующих эти белки мРНК, и амплификации соответствующих генов. Для установления сверхэкспрессии анализируемый физиологический образец может быть подвергнут сравнению с соответствующим физиологическим образцом, взятым у здорового человека или из непораженного участка соответствующего органа. Такой образец может присутствовать в стандартизированной форме.

Сравнение с физиологическими образцами, взятыми у здорового человека, может быть осуществлено различными методами. В одном из вариантов осуществления изобретения такое сравнение может быть осуществлено непосредственно путем проведения контрольной реакции с образцом непораженных тканей или клеток. Образцы непораженных тканей или клеток могут быть взяты у здорового человека или из непораженных участков обследуемого человека, или из клеточных культур, о которых известно, что они обладают свойствами, такими как экспрессия ингибитора циклин-зависимой киназы, характерная для непораженных клеток. В другом варианте изобретения такое сравнение может быть осуществлено опосредованно, то есть путем сравнения уровня ингибитора циклин-зависимой киназы в исследуемом образце с уровнем указанного ингибитора циклин-зависимой киназы, который, как известно, присутствует в образцах здорового человека. Информация об уровне такого ингибитора в образцах ткани или клеток здорового человека может быть получена после проведения репрезентативного числа тестов или из научных публикаций, дающих информацию об уровне экспрессии указанного ингибитора циклин-зависимой киназы в клетках здорового человека. Такое сравнение может быть осуществлено исходя из величины концентрации белка ингибитора циклин-зависимой киназы или его нуклеиновой кислоты; либо исходя из какой-либо другой характерной величины, зависящей от концентрации белка или нуклеиновой кислоты, такой как оптическая плотность в определенных реакционных условиях. В других случаях известная величина может быть представлена контролем-суррогатом, таким как пептид или рекомбинантный белок. Таким образом, уровень p16INK4a, присутствующего в образцах здорового человека, может быть представлен в тест-процедуре контрольным образцом рекомбинантного белка или пептида.

В общих чертах, может быть проведено сравнение уровня указанного ингибитора в исследуемом образце с величиной, определенной в каждой отдельной тест-процедуре или с предварительно определенной величиной. Такая предварительно определенная величина может быть определена глобально в течение всей тест-процедуры. Так или иначе, указанная величина может быть достоверной только для определенной партии тест-реагентов. Так, например, контрольная величина может быть достоверной только для определенного периода калибровки и может быть определена после калибровки в процессе тестирования.

Например, уровень ингибитора циклин-зависимой киназы в цервикальном образце здорового человека может быть определен из стандартизированного раствора образца. Стандартизированный раствор образца может содержать раствор образцов солюбилизированного пула нормальных клеток или тканей. Такой пул образцов может, например, представлять собой пул цитологических образцов с диагнозом, предварительно установленным стандартным способом после обследования населения, или пул нормальных клеток, полученных из гистологических образцов. Кроме того, пул нормальных клеток может быть получен из тканевых культур нормальных цервикальных эпителиальных клеток. Раствор образца может быть, например, стандартизирован в отношении количества клеток на 1 мл раствора образца. Для стандартизации могут быть также использованы любые другие параметры. Раствор образца может быть, например, получен в стандартизированной форме для гарантии стабильности и воспроизводимости результатов теста. В некоторых вариантах осуществления изобретения такой раствор может быть получен как компонент набора для сравнения или калибровки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия сравнения уровня ингибиторов циклин-зависимой киназы, присутствующих в образце пациента, с уровнем, который, как известно, присутствует в физиологическом образце, взятом от здорового индивидуума, предусматривает использование величины отсечки или пороговой величины для концентрации соответствующего ингибитора циклин-зависимой киназы. В этом контексте термин “отсечка” означает величину (например, концентрацию белка p16INK4a, выраженную, например, в мг/мл, или оптическую плотность, измеренную в определенных условиях в ELISA-тесте), которая может быть использована для дифференциации нормальных образцов, взятых у здорового индивидуума, от патологических образцов. Например, все образцы, дающие величину, превышающую величину отсечки, рассматриваются как образцы с дисплазией, а образцы, дающие величину ниже величины отсечки, рассматриваются как образцы здорового индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пороговая величина или величина отсечки может быть установлена для дифференциации высокозлокачественных (низкодифференцированных) неопластических заболеваний (HSIL или неопластических заболеваний, соответствующих, например, инвазивной карциноме, низкодифференцированной дисплазии или гистологически установленным поражениям CIN 3) из всех менее тяжелых стадий неопластических заболеваний (например, LSIL). В других вариантах осуществления изобретения величина отсечки может быть определена в целях дифференциации образцов здорового индивидуума (NILM) от неопластических заболеваний, включая предшествующие им стадии (LSIL и HSIL). Таким образом, можно спроектировать испытания в специальном формате, адаптированном для различных задач, таких как раннее выявление поражений, и даже предшествующих стадий таких поражений, или выявление поражений, которые требуют немедленного лечения.

(Сверх)экспрессия ингибиторов циклин-зависимой киназы может быть детектирована на уровне нуклеиновых кислот и на уровне белков соответственно. Что касается детектирования на уровне белков, то можно использовать, например, антитела, которые направлены против ингибиторов циклин-зависимой киназы. Эти антитела могут быть использованы в большинстве методов, таких как Вестерн-блот-анализ, ELISA или иммунопреципитация. Может оказаться желательным, чтобы антитела были фиксированы на твердых носителях, таких как ELISA-планшеты, реакционные сосуды, гранулы, сферы, мембраны, коллоидные вещества, такие как металлы в коллоидном состоянии (например, золото), пористые мембраны, поверхности капилляров (например, в тесте, проводимом проточным методом), тест-полоски или латексные частицы. Что касается детектирования на уровне нуклеиновых кислот, то могут быть использованы такие методы, как амплификация нуклеиновых кислот или гибридизация. Методы амплификации нуклеиновых кислот предусматривают проведение одностадийных или многостадийных реакций всех видов, таких как цепные реакции. Цепные реакции включают, но не ограничиваются ими, ПЦР, NASBA, ОТ-ПЦР, ЛЦР и т.п. Реакции гибридизации включают любые реакции гибридизации с репортерной системой любого типа. Реакции иммобилизации гибрида с последующим детектированием гибридных нуклеиновых кислот осуществляют с помощью антител, направленных против указанных гибридов. Например, реакции гибридизации, такие как, например, реакции гибридизации РНК in situ, применяются для детектирования экспрессии на уровне РНК-транскриптов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения детектирование маркерных молекул осуществляют в растворе солюбилизированных физиологических образцов. Поэтому такое детектирование может быть проведено в растворе или с использованием реагентов, фиксированных на твердой фазе.

“Твердой фазой”, используемой в контексте настоящего изобретения, могут быть твердые вещества различных типов, такие как плоские поверхности и частицы (включая микро- и наночастицы или даже более мелкие частицы). В некоторых вариантах осуществления изобретения такими частицами могут быть сферы, гранулы, коллоиды или т.п.

Фиксация реагентов на твердой фазе в тест-наборе или в устройстве для диагностики in vitro может быть осуществлена путем прямой или непрямой иммобилизации. Прямая фиксация может быть осуществлена путем ковалентного связывания, нековалентного связывания, ассоциации или адсорбции на поверхностях. Непрямая фиксация может быть осуществлена путем связывания антител с агентами, которые сами являются непосредственно фиксированными на твердых фазах. Связывающие агенты включают, например, авидин, стрептавидин, биотин, дигоксигенин, антитела или т.п.

Детектирование одного или нескольких молекулярных маркеров может быть осуществлено в одной реакционной смеси, либо в двух или в нескольких отдельных реакционных смесях. Реакции детектирования нескольких маркерных молекул могут быть, например, осуществлены одновременно в многолуночных реакционных сосудах. Реакция детектирования маркерных молекул может включать одну или несколько дополнительных реакций с детектирующими агентами, которые либо распознают исходные маркерные молекулы, либо, предпочтительно, распознают молекулы-предшественники (например, “первые” антитела), используемые для распознавания исходных маркеров. Реакция детектирования, кроме того, может включать “репортерную” реакцию, указывающую на уровень маркеров, являющихся признаком клеточно-пролиферативных расстройств, или маркеров нормализации.

Реакция детектирования уровня ингибиторов циклин-зависимой киназы в солюбилизированных образцах может быть осуществлена в растворе или с реагентами, фиксированными на твердых фазах. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакция детектирования может быть осуществлена в растворе; причем такие процедуры могут включать любые методы, подходящие для определения молекулярных взаимодействий (связывание антитела или аналогичного связывающего агента с антигеном) в растворе. Методы определения молекулярного взаимодействия (изменения проводимости, массового обмена, изменения интенсивности светового излучения, УФ-излучения, ИК-излучения, спектрометрические изменения в магнитом резонансе, в плазмонном резонансе и т.п.) известны специалистам. В некоторых вариантах изобретения детектирование может быть осуществлено методом, при котором комплекс реагента для детектирования, связанного с антигеном, адсорбируют на твердой фазе в целях его обнаружения. Таким образом, в способе настоящего изобретения может быть использовано нековалентное связывание аналитов с твердыми фазами в процессе реакции детектирования или даже до проведения реакции детектирования.

Зондом для детектирования маркерных молекул может быть любая молекула, специфически связывающаяся с указанными маркерными молекулами. Таким зондом может быть, например, антигенсвязывающий агент, такой как антитела (моноклональные или поликлональные антитела), фрагменты антител или искусственные молекулы, содержащие антигенсвязывающие эпитопы, ДНК- или РНК-связывающие молекулы, такие как белки или нуклеиновые кислоты. Нуклеиновыми кислотами, связывающимися с другими нуклеиновыми кислотами, могут быть, например, олигонуклеотиды, используемые для детектирования, или праймеры. В некоторых вариантах осуществления изобретения для реакций гибридизации могут быть использованы даже более крупные нуклеотидные молекулы. Считается, что молекула распознает другую молекулу в том случае, если она специфически взаимодействует с этой молекулой. Специфическим взаимодействием может быть, например, специфическое связывание с другой молекулой. Термин “антитело”, используемый в контексте настоящего изобретения во всех его грамматических формах, обычно означает антигенсвязывающие молекулы, включая, но не ограничиваясь ими, моноклональные и поликлональные антитела, фрагменты антител, антигенные детерминанты, миниантитела, пептидомиметики с антигенсвязывающими свойствами, антикалины и диантитела.

“Репортерной” реакцией может быть, например, реакция, продуцирующая сигнал в ответ на присутствие маркера или в ответ на связывание специфического зонда с маркером. Так, например, в качестве “репортерной” реакции может служить реакция, продуцирующая окрашенное соединение, флуоресцентное соединение, светоизлучающее соединение, радиоактивное соединение или определяемую концентрацию одного или нескольких соединений в предварительно определенном участке тест-устройства.

Форматами, применяемыми для реакции детектирования по настоящему изобретению, могут быть методы блоттинга, такие как Вестерн-блот-анализ, Саузерн-блот-анализ и Нозерн-блот-анализ. Методы блоттинга известны специалистам и могут быть осуществлены, например, в формате электроблоттинга, “полусухого” блоттинга, “вакуум”-блоттинга или дот-блоттинга. Кроме того, для детектирования молекул могут быть использованы иммунологические методы, такие как, например, иммунопреципитация или иммунологические анализы, такие как ИФА, ELISA, РИА, ФИА (флуоресцентный иммуноанализ), анализ методом боковых потоков (с использованием пористых мембран или капилляров), анализ на иммунохроматографических пластинах, анализы методом проточной цитометрии, анализы посредством агглютинации латексных частиц и т.п. Иммуноанализы, используемые в настоящем изобретении, могут включать как конкурентные, так и неконкурентные иммуноанализы, такие как “сэндвич”-анализы.

В методах, разработанных на основе нуклеиновых кислот, может применяться гибридизация или амплификация. Методы гибридизации могут, например, включать любую гибридизацию, известную специалистам. В некоторых вариантах осуществления изобретения гибридизация может быть осуществлена с помощью анализа, предусматривающего иммобилизацию гибрида с использованием антител, направленных против гибридных молекул ДНК-РНК в целях их детектирования. Могут быть также использованы реакции амплификации, такие как ПЦР, NASBA, ОТ-ПЦР, ЛЦР или другие подходящие цепные реакции. Альтернативно, для амплификации нуклеиновой кислоты могут быть использованы даже одностадийные или последовательные реакции, не являющиеся цепными реакциями.

В некоторых вариантах осуществления изобретения тестирование, проводимое иммунохимическими методами или методами с использованием нуклеиновых кислот, может быть осуществлено с помощью тест-устройства для клинических лабораторий. Таким тест-устройством могут быть любые устройства, подходящие для тестирования, проводимого иммунохимическими методами или методами любого формата с использованием нуклеиновых кислот, например, такие устройства, как точные контрольно-измерительные приборы для испытаний, а также настольные или лабораторные устройства. Эти устройства могут быть также снабжены открытыми или закрытыми системами типа платформ. Эти системы могут быть разработаны на основе любой подходящей методики, такой как, например, использование микротитрационных планшетов, многолуночных планшетов, систем сквозных или боковых потоков, микрочипов или матричных систем, либо систем с использованием сфер или мембран. Используемыми методами определения могут быть любые методы, известные специалистам, которые обычно применяются для осуществления иммунохимических реакций детектирования или реакций детектирования на уровне нуклеиновых кислот. Такими системами детектирования могут быть, например, люминесцентные системы (электролюминесцентные, биолюминесцентные, фотолюминесцентные, радиолюминесцентные, хемилюминесцентные, электрохемилюминесцентные), системы, основанные на флуоресценции; системы детектирования, основанные на проводимости; системы, основанные на облучении (видимым светом, УФ-излучением, рентгеновским излучением, гамма-излучением и т.п.), системы, основанные на плазмонном резонансе (например, поверхностном плазмонном резонансе, ППР), или системы, основанные на применении любого другого известного метода.

Используемый здесь термин “пористая мембрана”, в основном, относится к любым трехмерным структурам пористых веществ. Такие пористые мембраны могут, например, содержать, соединения, используемые в качестве мембран, сфер или т.п.

В соответствии с настоящим изобретением можно также диагностировать предрак, то есть рак в его предшествующей стадии.

Другим объектом настоящего изобретения является набор, используемый для осуществления способа по настоящему изобретению. Такой набор включает, например:

а) реагент для детектирования экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы, например зонда, направленного против белка ингибитора циклин-зависимой киназы или его нуклеиновой кислоты, или ее частей соответственно,

b) среду для лизиса, используемую для солюбилизации физиологического образца,

с) стандартные добавки, такие как буферы, носители, маркеры и т.п., и необязательно

d) агент для проведения контрольных реакций, например, на присутствие белка-ингибитора циклин-зависимой киназы или его нуклеиновой кислоты и ее частей, соответственно, или клеточный препарат.

В данном наборе, кроме того, могут присутствовать один или несколько отдельных компонентов. Так, например, могут присутствовать реагент для детектирования или другие реагенты, фиксированные на твердой фазе. В одном из вариантов настоящего изобретения набор включает реагенты для детектирования p16INK4a, фиксированные на твердой фазе и недетектирующие реагенты, обладающие другой специфичностью и фиксированные на твердой фазе.

В некоторых вариантах изобретения наборы для детектирования ингибиторов циклин-зависимой киназы поставляются в виде устройств для диагностики in vitro.

В основном, средой для лизиса, включенной в набор по настоящему изобретению, может быть любой подходящий растворитель, известный специалистам. Средой для лизиса, используемой в данном наборе, могут быть, например, органические или водные растворы хаотропных агентов, таких как мочевина, GuaSCN, формамид, детергенты, такие как анионогенные детергенты (например, ДСН, N-лаурилсаркозин, дезоксихолат натрия, алкиларилсульфонаты, сульфаты длинноцепочечных (жирных) спиртов, сульфаты и сульфонаты олефинов, сульфаты и сульфонаты альфа-олефинов, сульфированные моноглицериды, сульфированные эфиры, сульфосукцинаты, алкансульфонаты, сложные эфиры фосфорной кислоты, алкилизетионаты, сложные эфиры сахарозы), катионогенные детергенты (например, хлорид цетилтриметиламмония), неионогенные детергенты (например, Твин-20, Nonidet P-40, Тритон Х-100, NP-40, Igepal CA-630, N-октилглюкозид) или амфотерные детергенты (например, CHAPS, 3-додецилдиметиламмонийпропан-1-сульфонат, оксид лаурилдиметиламина) и/или гидроксиды щелочных металлов, такие как, например, NaOH или КОН. В некоторых вариантах изобретения, где лизис клеток может быть достигнут без использования детергентов, в качестве растворителя могут быть использованы гипер- или гипотонические растворы или буферы, либо просто вода или органическая жидкость. При этом в качестве описанной здесь среды для лизиса может быть использована любая жидкость, подходящая для солюбилизации клеточных компонентов физиологических образцов, в целом или их частей. Таким образом, используемые здесь среды для лизиса необязательно должны содержать буферные вещества или обладать буферной емкостью.

В некоторых вариантах изобретения, для получения оптимальных результатов анализа, рН среды для лизиса, которая может быть непосредственно введена в аналитическую систему, должен быть примерно нейтральным. В других вариантах изобретения рН среды для лизиса составляет в пределах от 4 до 10. В некоторых других вариантах изобретения рН среды для лизиса составляет в пределах от 5 до 9. В предпочтительном варианте изобретения рН среды для лизиса составляет в пределах от 6 до 8. В более предпочтительном варианте изобретения рН среды для лизиса составляет в пределах от 6,5 до 7,5.

Среды для лизиса могут быть, например, выбраны из композиций, представленных в таблице 1.

Таблица 1
Среда для лизиса Солюбилизация p16INK4a в Вестерн-блот-анализе Совместимость с ELISA
Детергенты:
0,1-1% ДСН + +/-
0,2-3% ДСН + <0,5%
0,2-3% DOC ++ +/-
0,1-1% н-октилгликозид + да
0,1-3% тритон Х-100% + да
0,1-1% Chaps + н.о.
Смеси детергентов
RIPA (1% NP40, 0,5% DOC, 0,1% ДСН, PBS) 40-100% ++ да
SOX (0,5% DOC, 0,5% н-октилгликозид) 40-100% + да
Среда для лизиса mtm (3% тритон X-100, 0,4% ДСН, PBS) ++ да
Коммерчески доступные среды для лизиса
Dynal (Dynal, Oslo, Norway) ++ да
M-PER/B-PER (Pierce, Rockford, IL) ++ да
Другие среды
0,5-8М мочевины в PBS +++ совместимый<2М
Буфер для образца Леммли +++ нет
10-80% ДМСО +++ нет
10-80% формамид н.о. нет
50-70% муравьиной кислоты ++ нет
PBS +/- да
Цитратный буфер, рН 6,0 +/- да
500 мМ NaCl в фосфатном буфере +/- да
н.о. - не определяли; +/-: плохая; +: хорошая; ++: очень хорошая; +++: превосходная.

В некоторых случаях ингибитор циклин-зависимой киназы p16INK4a может разлагаться в солюбилизированных образцах, и поэтому он не может быть детектирован. Это особенно относится к тем случаям, когда образцы непосредственно переносят в среду для лизиса и хранят в этой среде в течение определенного периода времени. Для предупреждения деградации среда для лизиса может, кроме того, содержать один или несколько агентов, предотвращающих деградацию компонентов в исходных образцах. Такими компонентами могут быть, например, ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы протеиназы, ингибиторы РНКазы, ингибиторы ДНКазы и т.п. Такими ингибиторами могут быть, например, ингибиторы протеиназы, выбранные из композиций, представленных в таблице 2.

Таблица 2
Ингибитор Класс ингибируемой протеиназы Концентрация Раствори-мость в воде Стабильность в воде Стабилизация p16INK4a в среде для лизиса mtm
Апротинин Сериновая 0,6-2 мкг/мл очень хорошая хорошая нет
Бензамидин Сериновая 0,5-4 мМ хорошая хорошая нет
Бестатин Аминопептидаза 1-10 мкМ хорошая хорошая нет
Калпептин Цистеиновая 0,3-1 мкМ хорошая хорошая нет
Цистатин Цистеиновая 1 мкМ хорошая хорошая нет
Е-64 Цистеиновая 1-10 мкМ хорошая хорошая нет
EDTA Металлопротеиназа 0,5-5 мМ хорошая хорошая нет
Эластатинал Сериновая 0,5-2 мкг/мл слабая хорошая нет
EST Цистеиновая 20-50 мкг/мл плохая слабая нет
Телячья фетальная сыворотка Все классы 10% хорошая хорошая да
Лейпептин Сериновая/цистеи-новая 10-100 мкМ хорошая хорошая нет
а2-Макро-глобулин Все классы 1 мкМ хорошая хорошая нет
NCO-700 Цистеиновая 0,5-100 мМ слабая слабая нет
Pefabloc=
AEBSF
Сериновая 0,2-10 мкМ хорошая очень слабая да
Пепстатин А Аспарагиновая 1 мкМ плохая слабая нет
PMSF Сериновая 0,2-10 мкМ плохая очень слабая да
о-Фенантролин Металлопротеиназа 1-10 мМ плохая слабая нет

Ингибиторы ДНКазы и РНКазы известны специалистам и могут быть использованы в условиях, подходящих для применения среды для лизиса в соответствии с настоящим изобретением.

В целях стабилизации среда для лизиса может также содержать объемный белок (например, альбумин, такой как альбумин бычьей сыворотки, или альбумин телячьей сыворотки, или другие объемные белки) для предотвращения разложения белками образца. Объемные белки могут, например, присутствовать в комбинации с ингибиторами протеиназы, либо они могут быть добавлены вместо ингибиторов протеиназы. В одном из вариантов изобретения растворитель может быть выбран так, чтобы он был совместим с условиями проведения данного анализа (например, ELISA), и чтобы солюбилизированные образцы можно было непосредственно использовать в данном анализе. В некоторых вариантах настоящего изобретения среда для лизиса может быть специально приготовлена так, чтобы можно было установить заданную величину отсечки.

В некоторых вариантах изобретения указанный набор может поставляться в виде устройства для диагностики in vitro. Устройство для диагностики in vitro представляет собой набор, определенный выше, то есть набор, предназначенный для установления диагноза клинически релевантного состояния на физиологических образцах человека или животного. В некоторых вариантах изобретения указанное устройство для диагностики in vitro может представлять собой любое устройство, входящее в объем определения термина “медицинское устройство для диагностики in vitro”, данного в директиве 98/79 ЕС, Статья 1 (b):

“Термин “медицинское устройство для диагностики in vitro” означает любое медицинское устройство, которое представляет собой продукт реагента, калибратор, контрольный материал, набор, инструмент, аппарат, оборудование или систему, независимо от того, используются ли они отдельно или в комбинации, и которое изготавливается производителем в целях его применения для in vitro-анализа образцов, включая взятие крови и ткани из организма человека, исключительно, или, главным образом, в целях получения информации, касающейся физиологического или патологического состояния или касающейся врожденной патологии, либо в целях оценки безопасности и совместимости с организмом потенциальных реципиентов, или в целях мониторинга терапевтических мер.

Устройство для диагностики in vitro также относится к U.S. классу I IVD и, по существу, к устройствам для диагностики in vitro, которые не заявлены в тех пунктах формулы изобретения, которые относятся к их диагностической эффективности. Поэтому под используемым здесь термином “устройство для диагностики in vitro” будет также подразумеваться ASR любого типа. В одном из вариантов настоящего изобретения указанное устройство для диагностики in vitro отличается использованием фиксированных на твердой фазе реагентов для детектирования, специфичных к ингибитору циклин-зависимой киназы. В одном из вариантов изобретения реагентами для детектирования являются реагенты, специфичные к ингибитору циклин-зависимой киназы p16INK4a.

Специалистам известны некоторые устройства для диагностики in vitro, в которых используются реагенты для детектирования ингибитора циклин-зависимой киназы p16INK4a в гистологических или цитологических образцах. Такими устройствами для диагностики in vitro являются устройства для клеточного детектирования, которые позволяют детектировать антиген p16INK4a в клетках или тканях, но не в солюбилизированных образцах.

Ингибиторы циклин-зависимой киназы, такие как p16INK4a, представляющие собой внутриклеточные антигены, могут быть доступными для детектирующих реагентов только в растворе после пермеабилизации клеток. Так, например, применение реагентов в диагностике in vitro для детектирования ингибитора циклин-зависимой киназы p16INK4a, известного специалистам, исключает фиксацию детектирующих реагентов на твердой фазе. В литературе ничего не упоминается о получении тест-наборов или in vitro-диагностических устройств, содержащих реагенты для детектирования p16INK4a, фиксированные на твердой фазе. Очевидно, что способ установления диагноза исходя из солюбилизированных образцов ранее не рассматривался специалистами, и даже не было высказано каких-либо предположений на этот счет.

Таким образом, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к устройству для диагностики in vitro, содержащему зонды, направленные против ингибиторов циклин-зависимой киназы, фиксированные на твердой фазе, и позволяющему установить диагноз карциномы и предшествующих ей поражений в солюбилизированном образце. В некоторых вариантах настоящего изобретения указанные зонды могут содержать, например, нуклеиновые кислоты, антитела или их фрагменты, направленные против белка p14ARF или p16INK4a. Преимущество устройств для диагностики in vitro настоящего изобретения заключается в том, что они позволяют легко и без значительных экономических затрат установить диагноз рака и предраковых поражений. Этот тест может быть использован для скрининга и диагностики, а также для установления предварительного диагноза и наблюдения за развитием заболевания. В некоторых вариантах настоящего изобретения устройства для диагностики in vitro могут быть использованы в клинических лабораториях в качестве контрольно-измерительных приборов для испытаний или даже для самотестирования.

Устройства для диагностики in vitro, содержащие фиксированные на твердой фазе реагенты для детектирования ингибиторов циклин-зависимой киназы, могут быть использованы для выявления различных раковых заболеваний и соответствующих им предраковых поражений. Устройства для диагностики in vitro могут применяться для анализа лизированных физиологических образцов любого типа.

Зонды могут быть иммобилизованы на твердой фазе путем прямой или непрямой фиксации. Прямая фиксация может быть осуществлена путем ковалентного или нековалентного связывания или ассоциации с поверхностями. Непрямая фиксация может быть осуществлена путем связывания антител с агентами, которые сами являются непосредственно фиксированными на твердых фазах. Такими агентами могут быть антитела или другие связывающие агенты, такие как авидин, стрептавидин, биотин, дигоксигенин или т.п.

Устройства для диагностики in vitro, рассматриваемые в настоящем изобретении, выбраны из группы, состоящей из:

а. ELISA-устройства, включающего антитела, направленные против ингибитора циклин-зависимой киназы и фиксированные на ELISA-планшетах, ELISA-полосках или ELISA-лунках;

b. устройства для анализа методом боковых потоков, включающие антитела, направленные против ингибитора циклин-зависимой киназы и фиксированные на тест-полосках, коллоидных золотых частицах или латексных частицах;

с. устройства для анализа проточным методом, включающие антитела, направленные против ингибитора циклин-зависимой киназы и фиксированные на пористой мембране или на поверхности капилляров;

d. устройства для анализа методом латекс-агглютинации, включающие антитела, направленные против ингибитора циклин-зависимой киназы и фиксированные на латексных частицах;

е. устройства для иммуноанализа, включающие антитела, направленные против ингибитора циклин-зависимой киназы и фиксированные на сферах, мембранах или микросферах.

ELISA-устройствами могут быть устройства любого типа, известные специалистам. Такими устройствами являются устройства формата “сэндвич”-ELISA, формата конкурентного анализа ELISA и любого другого формата ELISA.

В одном из вариантов настоящего изобретения устройство для диагностики in vitro включает среду для лизиса, используемую для солюбилизации образца. В другом варианте осуществления изобретения устройство для диагностики in vitro включает реагенты, детектирующие один специфический ингибитор циклин-зависимой киназы, фиксированный на твердых фазах, и реагенты, не детектирующие какие-либо другие специфические ингибиторы, фиксированные на твердых фазах.

Устройствами для анализа методом боковых потоков, используемыми в качестве устройства для диагностики in vitro в соответствии с настоящим изобретением, являются любые устройства для анализа методом боковых потоков, в которых используется, по крайней мере, один реагент, связывающийся с ингибиторами циклин-зависимой киназы, фиксированными на твердой фазе. В таких устройствах могут использоваться различные механизмы визуализации результатов теста. В некоторых вариантах изобретения в указанных тестах могут быть использованы “вторые” детектирующие реагенты, направленные против ингибиторов циклин-зависимой киназы, или другие компоненты, участвующие в данном тесте и связанные с детектируемыми молекулами. Такими детектируемыми молекулами могут быть коллоидное золото, (окрашенные) латексные частицы и другие молекулы.

Используемыми в настоящем изобретении устройствами для проточного анализа могут быть устройства, основанные на использовании капиллярных или пористых мембран (таких как мембраны, сферы или другие трехмерные структуры пористых веществ). В зависимости от варианта осуществления настоящего изобретения, размер пор или капилляров должен быть скорректирован для обеспечения оптимальных условий проточного анализа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к использованию твердой фазы, на которой фиксированы или иммобилизованы реагенты для детектирования, или зондов, направленных против ингибиторов циклин-зависимой киназы, в целях изготовления тест-набора или устройства для диагностики in vitro, либо в целях изготовления набора в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах настоящего изобретения указанными зондами являются антитела или их фрагменты. В других вариантах изобретения указанными зондами являются олигонуклеотиды.

Твердыми фазами, которые могут быть использованы для изготовления тест-набора или устройства для диагностики in vitro, являются твердые фазы, описанные выше, и такими фазами могут быть любые подходящие твердые фазы. В некоторых вариантах настоящего изобретения указанными твердыми фазами являются мембраны, пористые мембраны, плоские поверхности, многолуночные планшеты (с плоской или неплоской поверхностью), коллоидные растворы, частицы и т.п. Все твердые фазы, на которых могут быть фиксированы зонды для детектирования ингибиторов циклин-зависимой киназы, могут быть использованы для изготовления наборов и устройств для диагностики in vitro в соответствии с настоящим изобретением. Изготовление такого набора в соответствии с настоящим изобретением может предусматривать проведение любой процедуры, в результате которой может быть получено готовое устройство для диагностики in vitro. Такие процедуры могут включать все технологические процессы, а также повторную упаковку, сборку отдельных компонентов, повторное мечение и т.п.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу разработки наборов и устройств для диагностики in vitro, в целях установления диагноза клинически релевантных состояний в солюбилизированных физиологических образцах, где указанную разработку осуществляют с использованием физиологических образцов в виде “консервированных” клеток в среде для консервации клеток, и где указанные консервированные клетки предназначены и приготовлены для использования в процедурах цитологического анализа, таких как цитологические анализы в растворе. Образцы, используемые для проведения цитологических анализов в растворе (далее называемые LBC-образцами), солюбилизируют в соответствующей среде для лизиса и используют в целях разработки in vitro диагностических наборов и устройств для выявления клинически релевантных состояний в солюбилизированных физиологических образцах с помощью биохимического неклеточного анализа.

В соответствии с настоящим изобретением использование LBC-образцов для установления диагноза или для разработки in vitro диагностических наборов и устройств может, например, предусматривать проведение точного и сравнительного анализа в целях получения цитологических данных, используемых для проведения биохимического неклеточного теста. Это может быть достигнуто путем нормализации образца по отношению к данным, полученным исходя из цитологического препарата, приготовленного из того же самого LBC-образца. В этих методах не требуется биохимической нормализации с использованием маркеров, которые являются индикаторами присутствия или отсутствия определенных клеток или типов клеток. Преимущество использования LBC-образцов заключается в том, что цитологическая информация может быть получена непосредственно из гомогенного LBC-образца, и поэтому она является ценной и точной информацией для оценки результатов биохимических неклеточных тестов.

В области, к которой относится поданная заявка, применение LBC-образцов позволяет уточнить морфологическую оценку цитологических образцов. Поэтому область применения LBC-образцов классически ограничивается лишь их использованием в цитологии. В соответствии с настоящим изобретением использование LBC-образцов в качестве источников для определения уровней белков с помощью биохимического неклеточного анализа в солюбилизированных образцах дает возможность непосредственно сравнивать результаты биохимического неклеточного анализа с результатами цитологического анализа образцов. В этой связи биохимический анализ на уровни белков может служить, например, предварительным тестом или тестом для получения дополнительной информации или даже для подтверждения цитологически неоднозначного результата. В других вариантах осуществления изобретения информация, полученная из биохимических неклеточных тестов, может быть использована для разработки цитологических процедур.

Преимущество такого способа получения результатов заключается в том, что тот же самый образец, который используется для установления диагноза у индивидуума, может быть применен для оценки результата биохимического анализа. Такое сравнение с результатом биохимического анализа гарантирует надежность установления диагноза.

LBC-образцами, используемыми в контексте настоящего изобретения, являются любые клеточные образцы, которые хранят в стандартной коллекции образцов, в консервирующих средах или в средах для транспортировки, известных специалистам, таких как, например, коммерчески доступная консервирующая среда (раствор формалина, Cytyc “PreservCyt” или “CytoLyt”, Digene “Universal Collection Medium”, Tripath Imaging “Cytorich” и т.п.). LBC-образцами, соответственно, являются клеточные образцы в любой подходящей среде для консервации клеток, которая может содержать смесь одного или нескольких веществ, выбранных из группы, включающей спирты, альдегиды, кетоны, кислоты, ионы металлов или сублиматы, простые эфиры и т.п., используемые для сохранения клеточных компонентов. Спирты включают метанол, этанол, н- или изопропанол, н-, изо- или трет-бутанол или высшие разветвленные или неразветвленные спирты. Альдегиды включают формальдегид, ацетальдегид, глутаральдегид и т.п. Могут быть также использованы кетоны, такие как ацетон. Кислоты, используемые в стандартной среде для образцов, включают органические кислоты (уксусную кислоту, трихлоруксусную кислоту, салициловую кислоту, пикриновую кислоту) или неорганические кислоты, такие как, например, хромовая кислота. Стандартные растворы образцов могут содержать металлы, такие как серебро, медь, хром, ртуть, осмий и уран. Компонентами консервирующих сред могут быть растворы солей, таких как уранилацетат, бихромат калия, сульфат аммония и т.п.

LBC-образцами могут быть образцы клеток любого типа, взятые для проведения различных диагностических анализов. В настоящее время LBC-образцы, используемые для диагностики при обследовании здоровых людей, получают из любых участков организма человека в тех случаях, когда необходимо или целесообразно проведение процедур цитологических и/или микробиологических тестов. Очевидно, что использование LBC-образцов различных цитологических препаратов является средством, которое позволяет минимизировать потерю клеток и детальной морфологической информации. Поэтому LBC-образцы по настоящему изобретению включают образцы, полученные в виде аспиратов, взятых тонкой иглой. Аспираты, взятые тонкой иглой, могут включать пробы из различных источников, например из молочной железы, щитовидной железы (например, из узелков), почек, поджелудочной железы, предстательной железы, легких, лимфоузлов, плевры, шейных утолщений, яичников, синовий, опухолевой массы и т.п. Кроме того, LBC-образцы могут быть получены с использованием физиологических жидкостей. Подходящими физиологическими жидкостями являются жидкости широкого ряда, взятые из организма человека или животного, включая, но не ограничиваясь ими, асциты, цереброспинальные жидкости, гной или выпоты. Выпоты, независимо от участка тела, из которого они взяты, могут быть подвергнуты LBC-анализу. Некоторыми примерами выпотов являются перикардиальные, плевральные, синовиальные и абдоминальные выпоты. Физиологические жидкости, которые могут быть проанализированы LBC-методами, кроме того, включают жидкости, присутствующие в некоторых опухолях или в кистах, таких как, например, кисты молочной железы, кисты яичника или другие кисты. Образцы, получаемые в жидкой форме из организма, кроме того, включают пробы слизистой, например мокроту. LBC-методы широко применяются для исследования эксфолиативных цитологических проб любого типа. Такие эксфолиативные цитологические пробы могут быть получены любыми методами, такими как, например, путем взятия мазков с помощью тампона, щеточной биопсии, соскоба, цитологических мазков и т.п. Термин “эксфолиативные цитологические пробы” также включает промывки, лаважи и т.п., происходящие из любых участков организма. Промывки и лаважи могут быть получены из широкого ряда участков организма, включая, без ограничений, эпителий слизистой, кожу, эпителий любого внутреннего или наружного органа или т.п. Эпителием слизистой может быть, например, эпителий желудочно-кишечного тракта, мочевыделительной системы, аногенитального тракта, дыхательных путей, прямой кишки, уретры, шейки матки, влагалища, вульвы, ротовой полости, эндометриальной полости и т.п. LBC-методы могут быть применены для анализа эксфолиативных цитологических проб всего указанного ряда.

Наборы, используемые в контексте настоящего изобретения, представляют собой композиции компонентов, предназначенные для проведения процедур аналитического теста. Этот набор может включать все или некоторые реагенты и материалы, необходимые для правильного осуществления теста. Кроме того, в некоторых вариантах настоящего изобретения такой набор может содержать инструкции по правильному применению его компонентов, включая, например, иллюстративный протокол проведения теста, предупреждение и дополнительную вспомогательную информацию для потребителя данного набора.

Устройство для диагностики in vitro представляет собой набор, определенный выше, то есть набор, предназначенный для установления диагноза клинически релевантного состояния на физиологических образцах человека или животного. В некоторых вариантах изобретения указанное устройство для диагностики in vitro может представлять собой любое устройство, входящее в объем определения термина “медицинское устройство для диагностики in vitro”, данного в директиве 98/79 ЕС, Статья 1 (b):

“Термин “медицинское устройство для диагностики in vitro” означает любое медицинское устройство, которое представляет собой продукт реагента, калибратор, контрольный материал, набор, инструмент, аппарат, оборудование или систему, независимо от того, используются ли они отдельно или в комбинации, и которое изготавливается производителем в целях его применения для in vitro-анализа образцов, включая взятие крови и ткани из организма человека, исключительно, или, главным образом, в целях получения информации о физиологическом или патологическом состоянии или о врожденной патологии, либо в целях оценки безопасности и совместимости с организмом потенциальных реципиентов, или в целях мониторинга терапевтических мер.

Устройство для диагностики in vitro также относится к US классу I IVD и, по существу, к устройствам для диагностики in vitro, которые не заявлены в тех пунктах формулы изобретения, которые относятся к их диагностической эффективности. Поэтому под используемым здесь термином “устройство для диагностики in vitro” будет также подразумеваться ASR любого типа. В некоторых вариантах настоящего изобретения указанными тест-наборами и устройствами для диагностики in vitro, которые применяются для разработки описанных здесь способов, являются тест-наборы и устройства для диагностики in vitro, предназначенные для детектирования молекулярных маркеров с использованием белков или пептидов.

Тест-процедуры настоящего изобретения, для которых разрабатываются указанные наборы и устройства для диагностики in vitro, предусматривают определение уровней маркерных молекул, являющихся признаками клинически релевантных состояний, в тест-образце в биохимическом неклеточном анализе. Маркеры, подходящие для проведения этих тест-процедур в соответствии с настоящим изобретением, могут иметь различное происхождение. Характер экспрессии маркера, подходящего для выявления рассматриваемых клинически релевантных состояний, может зависеть от пролиферативного статуса клеток, от статуса дифференцировки клеток, от типа клеток или от вида организма. Примеры подходящих маркеров описаны ниже.

Используемый здесь термин “диагностика”, по существу, означает любой анализ с применением рассматриваемых здесь наборов и устройств для диагностики in vitro на наличие или отсутствие клинически релевантного состояния. Так, например, термин “диагностика” включает такие процедуры, как скрининг на предрасположенность к данному клинически релевантному состоянию, скрининг на предшествующую стадию клинически релевантного состояния, скрининг для выявления клинически релевантного состояния и установления клинического или морфологического диагноза клинически релевантного состояния и т.п. Используемый здесь термин “диагностика или установление диагноза” может также включать оценку прогноза или получение информации о различных фазах лечения пациента, осуществляемые с помощью биохимического неклеточного теста. Используемый здесь термин “диагностика клинически релевантного состояния” может включать анализ любого состояния, выявляемого на цитологическом, гистологическом, биохимическом или молекулярно-биологическом уровне, который может быть использован для оценки состояния здоровья и/или организма человека. Такие исследования могут включать, например, анализы, проводимые методами клинической диагностики, и научные биологические исследования. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный метод используется для диагностики клинически релевантных состояний, таких как, например, заболевания. Такими заболеваниями могут быть, например, расстройства, характеризующиеся пролиферацией клеток или тканей дикого типа.

В одном из вариантов осуществления изобретения термин “диагностика” относится к диагностике неопластических заболеваний и предшествующих им состояний, к мониторингу течения неопластического заболевания, к прогностической оценке неопластического заболевания и к обнаружению диссеминированных опухолевых клеток, например, в процессе установления диагноза минимального резидуального заболевания. Способ по настоящему изобретению может быть, например, применен в клинической или патологической диагностике рака и предшествующих ему стадий или в рутинных скрининг-тестах, осуществляемых для выявления конкретного ракового заболевания, таких как, например, анализы мазков, например, в скрининг-тестах на поражения шейки матки; анализы бронхиальных лаважей на рак легких; или анализы кала на поражение желудочно-кишечного тракта, например, на поражение прямой и толстой кишки.

Способ разработки наборов и устройств для диагностики in vitro в соответствии с настоящим изобретением может быть применен для создания in vitro диагностических наборов и устройств для обнаружения и диагностики всех видов клинически релевантных состояний.

Термин “клинически релевантные состояния”, используемый в настоящем изобретении, может, например, относиться к составу тканей, физиологических жидкостей, секретов, промывок или мазков. Термин “состояния” может, например, означать клеточный состав физиологических жидкостей, такой как состав крови, состав цереброспинальной жидкости или состав спермы. В этом контексте термин “состав” будет означать, например, присутствие или отсутствие клеток конкретных типов (например, патогенов, таких как вирусы и т.п.; пренеопластических, неопластических и/или диспластических клеток и т.п.), наличие или отсутствие определенного характера дифференцировки клеток конкретного типа, общее число клеток конкретного типа (например, эритроцитов, лейкоцитов, клеток спермы и т.п.), общее число всех клеток любого типа или фракции клеток с другими свойствами, присутствующих или отсутствующих в данном образце.

Кроме того, термин “клинически релевантные состояния” может также включать нарушения, относящиеся к клеткам или тканям. Термин “диагностируемые состояния” может включать параметры, относящиеся к клеткам в цитологических или гистологических образцах тканей. Термин “состояния” может включать определенный характер дифференцировки клеток в образцах тканей, таких как образцы хирургических срезов, биоптаты, мазки, лаважи и т.п. Такими состояниями могут быть, например, врожденные расстройства, воспалительные заболевания, механические нарушения, травмы, сосудистые заболевания, дегенеративные расстройства, нарушения роста, доброкачественные опухоли и злокачественные опухоли. В другом аспекте настоящего изобретения такими состояниями могут быть состояния, характеризующиеся наличием или отсутствием пролиферативных признаков. Состояниями, характеризующимися наличием или отсутствием пролиферативных признаков, могут быть, например, клеточные пролиферативные расстройства.

Клеточные пролиферативные расстройства по настоящему изобретению включают заболевания, характеризующиеся способностью клеток или тканей к аномальному росту по сравнению с ростом нормальных контрольных клеток или тканей. Рост таких клеток или тканей может быть, например, аномально ускоренным, пониженным, либо он может подвергаться аномальной регуляции. Используемый здесь термин “аномальная регуляция” может означать любую форму присутствия или отсутствия клеточного или тканевого ответа не-дикого типа на природные процессы, влияющие на регуляцию роста. Термин “аномалии роста клеток или тканей” может означать, например, неоплазию или гиперплазию.

В одном из вариантов осуществления изобретения клеточными пролиферативными расстройствами являются неопластические заболевания, такие как опухоли. Термин “опухоли” может включать опухоли головы и шеи, опухоли дыхательных путей, опухоли аногенитального тракта, опухоли желудочно-кишечного тракта, опухоли мочевыделительной системы, опухоли репродуктивной системы, опухоли эндокринной системы, опухоли центральной и периферической нервной системы, опухоли кожи и придатков кожи, опухоли мягких тканей и костей, опухоли лимфопоэтической и гемопоэтической системы и т.п. Термин “опухоли” может включать, например, неоплазмы, такие как доброкачественные и злокачественные опухоли, карциномы, саркомы, лейкозы, лимфомы или дисплазии. В конкретном варианте осуществления изобретения такими опухолями являются, например, рак головы и шеи, рак дыхательных путей, рак аногенитального тракта, рак желудочно-кишечного тракта, рак кожи и придатков кожи, рак центральной и периферической нервной системы, рак мочевыделительной системы, рак репродуктивной системы, рак эндокринной системы, рак мягких тканей и костей и рак гемопоэтической и лимфопоэтической системы.

Опухоли аногенитального тракта могут включать рак промежности, рак кожи промежностно-мошоночной области, рак шейки матки, рак вульвы, рак влагалища, рак пениса, рак заднего прохода и т.п. Рак шейки матки может включать сквамозные поражения, железистые поражения или другие эпителиальные опухоли. Сквамозные поражения включают, например, внутриэпителиальные неоплазии шейки матки (слабую, умеренную и значительную дисплазию), карциному in situ, плоскоклеточную карциному (например, кератинизирующие, некератинизирующие, сосочковые, онкопластические, папиллярные и лимфаэпителиомоподобные карциномы). Железистые поражения могут включать атипичные гиперплазии, аденокарциному in situ, аденокарциному (такую как муцинозную, эндометриоидную и светлоклеточную аденокарциному, злокачественную аденому, папиллярную, серозную или мезонефрическую аденокарциному). Другие эпителиальные опухоли могут включать аденосквамозную карциному, стекловидно-клеточную карциному, аденокистозную карциному, аденобазальноклеточную карциному, карциноидную опухоль, мелкоклеточную карциному и недифференцированную карциному. Для более подробной информации можно обратиться к работе “Kurman R., Norris H., et al., Tumors of the Cervix, Vagina, and Vulva, Atlas of Tumor Pathology, 1992, AFIP”, содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Опухоли желудочно-кишечного тракта могут включать рак ободочной кишки, рак восходящей ободочной кишки, нисходящей ободочной кишки, поперечной ободочной кишки, сигмовидной ободочной кишки, рак прямой кишки, рак тонкой кишки, рак тощей кишки, рак двенадцатиперстной кишки, рак желудка, рак пищевода, рак печени, рак желчных путей, рак билиарной системы, рак поджелудочной железы и т.п. Исчерпывающее описание поражений желудочно-кишечного тракта приводится в работе “Hamilton Sr., Aaltonen LA (Eds.): World Health Organization Classification of Tumors, Pathology and Genetics of Tumors of the Digestive Systems, IARC Press: Lyon 2000”, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

“Опухоли дыхательных путей” могут включать любое злокачественное заболевание дыхательных путей, такое как, например, рак легких, альвеол, бронхиол, бронхиального дерева и бронхов, рак носоглотки, рак ротовой полости, рак гортани, рак носовой полости и околоносовой пазухи. К раку легких относится мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточная карцинома легких, мелкоклеточная карцинома легких, аденокарцинома легких, крупноклеточная карцинома легких, плоскоклеточная аденокарцинома легких, карциноидная опухоль легких, опухоль бронхиальных желез или (злокачественная) мезотелиома. Общее описание опухолей дыхательных путей можно найти в работе Colby T.V. et al.: Tumors of the Lower Respiratory Tract, Atlas of Tumor Pathology, Third Series, Fascicle 13, AFIP: Washington 1995”, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Опухоли мочевыделительной системы могут включать рак мочевого пузыря, рак почек, рак почечной лоханки, рак мочеточника, рак уретры и т.п. Опухоли репродуктивной системы могут включать рак и предрак яичника, матки, яичек, предстательной железы, эпидидимиса и т.п.

Во всех случаях способы, для которых разработаны наборы и устройства для диагностики in vitro в соответствии с настоящим изобретением, могут также применяться для лечения предопухолевых поражений, опухолей или рака.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ настоящего изобретения предусматривает выявление диссеминированных опухолевых клеток или метастазов.

В одном из вариантов осуществления изобретения раковым заболеванием является, например, рак шейки матки, рак ободочной кишки, рак желудка, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак легких, рак ротовой полости и т.п.

Термин “разработка”, используемый в контексте настоящего изобретения, относится ко всем видам деятельности, связанной с конструированием и разработкой и осуществляемой производителем в целях контролируемого изготовления готового набора или устройства для диагностики in vitro, предназначенного для его сбыта или продажи. Термин “разработка наборов и устройств для диагностики in vitro”, используемый в контексте настоящего изобретения, относится ко всем видам деятельности, связанной с конструированием и разработкой, проверкой соблюдения проектных и конструкторских задач, проверкой достоверности проектных и экспериментальных данных, оценкой эксплуатационных данных и анализом на безопасность и эффективность наборов и устройств для диагностики in vitro. В одном из вариантов изобретения термин “разработка” относится к тестированию результатов научного проекта и разработки наборов и устройств для диагностики in vitro на их пригодность для применения в желаемых целях. При этом следует отметить, что используемый здесь термин “цели применения” относится к целям детектирования или диагностики, для осуществления которых могут применяться такие наборы или устройства для диагностики in vitro.

Наборы и устройства для диагностики in vitro, разработанные в соответствии с описанным здесь способом, отличаются тем, что они предназначены для детектирования маркерных молекул, характерных для клинически релевантных состояний, с помощью биохимического неклеточного анализа. Термин “биохимический неклеточный анализ”, используемый в контексте настоящего изобретения, относится ко всем способам, в которых аналит или маркерная молекула детектируется в растворе, где отсутствует информация о клеточной морфологии или об архитектуре ткани, необходимая для установления диагноза. (Остатки клеток и тканей необязательно должны быть удалены из указанного раствора). Указанный биохимический неклеточный анализ был разработан на основе информации, полученной в результате определения присутствия или отсутствия одной или нескольких маркерных молекул в исследуемом растворе или в результате определения уровней одной или нескольких маркерных молекул в исследуемом растворе. В некоторых вариантах настоящего изобретения указанные наборы и устройства для диагностики in vitro конструируют так, чтобы можно было детектировать только одну маркерную молекулу. В других вариантах настоящего изобретения указанные наборы и устройства для диагностики in vitro конструируют так, чтобы можно было детектировать серию маркерных молекул. В общих чертах, описанный здесь способ разработки может быть применим для создания наборов и устройств для диагностики in vitro нескольких типов. Описание различных вариантов наборов и устройств для диагностики in vitro приводится выше.

Детектирование указанных маркерных молекул в процессе биохимического неклеточного анализа может быть осуществлено в растворе или с использованием реагентов, фиксированных на твердой фазе. В некоторых вариантах настоящего изобретения детектирование маркерных молекул осуществляют в растворе растворенных в нем физиологических образцов. Поэтому детектирование может быть проведено в растворе или с использованием реагентов, фиксированных на твердой фазе. Твердой фазой, используемой в контексте настоящего изобретения, могут быть твердые вещества различных типов, такие как плоские поверхности и частицы (включая микро- и наночастицы, или даже более мелкие частицы). В некоторых вариантах осуществления изобретения такими частицами могут быть сферы, коллоиды или т.п. Фиксация реагентов на твердой фазе в тест-наборе или в устройстве для диагностики in vitro может быть осуществлена путем прямой или непрямой фиксации. Прямая фиксация может быть, например, осуществлена путем ковалентного или нековалентного связывания или ассоциации с поверхностями. Непрямая фиксация может быть осуществлена путем связывания реагентов (например, антител, зондов и т.п.) с агентами, которые сами непосредственно фиксированы на твердых фазах. Такими агентами могут быть антитела или другие связывающие агенты, такие как стрептавидин, биотин или т.п. Детектирование одного или нескольких молекулярных маркеров может быть осуществлено либо в одной реакционной смеси, либо в двух или в нескольких отдельных реакционных смесях. Реакции детектирования нескольких маркерных молекул могут быть, например, осуществлены одновременно в многолуночных реакционных сосудах, либо, как в данном случае, они могут быть осуществлены на одной, двух или более отдельных тест-полосках. Маркеры, характерные для клеточных пролиферативных расстройств, могут быть детектированы с использованием реагентов, которые специфически распознают эти молекулы. В том случае, когда проводится детектирование более чем одного детектируемого маркера, оно может включать одну или несколько дополнительных реакций с детектирующими агентами, которые распознают либо исходные маркерные молекулы, либо, предпочтительно, молекулы-предшественники (например, “первые” антитела), используемые для распознавания исходных маркеров. Реакция детектирования, кроме того, может включать “репортерную” реакцию, указывающую на уровень маркеров, являющийся признаком клеточно-пролиферативных расстройств.

Термин “маркерные молекулы”, используемый в контексте настоящего изобретения, во всех случаях означает маркерные молекулы, характерные для данного клинически релевантного состояния. Термины “маркерная молекула” или “маркерная молекула, характерная для данного клинически релевантного состояния”, используемые в контексте настоящего изобретения во всех грамматических формах, относятся к нуклеиновой кислоте, а также к полипептидным молекулам. Таким образом, такие маркерные молекулы включают, например, РНК (мРНК, чРНК и т.п.), ДНК (кДНК, геномную ДНК и т.п.), белки, полипептиды, протеогликаны, гликопротеины и соответствующие фрагменты этих молекул.

Используемый здесь термин “уровень маркерной молекулы” означает полуколичественную, а также количественную величину, относящуюся к количеству соответствующего маркера, присутствующего в образце. Количественная величина может быть, например, определена как концентрация. Полуколичественная величина может быть выражена в виде шкалы уровней, например неопределяемых уровней, низких уровней, промежуточных уровней, высоких уровней, или любым другим подходящим способом. Уровень маркера может быть также представлен как зависимый параметр, такой как интенсивность сигнала, генерируемого в формате анализа в ответ на присутствие маркерной молекулы.

Зондом для детектирования маркерных молекул, используемым в настоящем изобретении, может быть любая молекула, специфически связывающаяся с указанными маркерными молекулами. Таким зондом может быть, например, антигенсвязывающий агент, такой как антитела (моноклональные или поликлональные), фрагменты антител или искусственные молекулы, содержащие антигенсвязывающие эпитопы, ДНК- или РНК-связывающие молекулы, такие как белки или нуклеиновые кислоты. Нуклеиновыми кислотами, связывающимися с другими нуклеиновыми кислотами, могут быть, например, связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (PNA), олигонуклеотиды (РНК, ДНК, PNA, искусственные нуклеиновые кислоты и т.п.), используемые для детектирования, или праймеры.

Считается, что молекула распознает другую молекулу, если она специфически взаимодействует с этой молекулой. Таким специфическим взаимодействием может быть, например, специфическое связывание этой молекулы с другой молекулой.

“Репортерной” реакцией может быть, например, реакция, продуцирующая окрашенное соединение. В одном из вариантов изобретения репортерные вещества, ассоциированные с конкретными маркерами, продуцируют различные цветовые реакции. В другом варианте осуществления изобретения “репортером”, специфичным к маркеру нормализации, может быть молекула, гасящая сигнал, продуцированный репортерной молекулой, специфичной к данному маркеру, характерному для данного клинически релевантного состояния, в зависимости от уровня маркера нормализации, присутствующего в образце. В еще одном варианте настоящего изобретения “репортерные” реакции могут продуцировать флуоресцентные красители, излучающие на различных длинах волн. В еще одном варианте настоящего изобретения такая репортерная реакция может включать излучение света на различных длинах волн, характерных для данных репортерных веществ, специфичных к любому определяемому маркеру. В другом варианте изобретения такая репортерная реакция может включать радиоактивное излучение и другие методы, обеспечивающие визуализацию или количественную оценку данного излучения. В одном из вариантов осуществления изобретения различные маркерные молекулы могут распознаваться агентами, несущими радионуклиды, излучающие на различных энергетических уровнях, в результате чего могут распознаваться сигналы, выявляющие маркерные молекулы.

Форматами, применяемыми для реакций детектирования в наборах и в устройствах для диагностики in vitro в соответствии с настоящим изобретением, могут быть методы блоттинга, такие как Вестерн-блот-анализ, Саузерн-блот-анализ и Нозерн-блот-анализ. Такие методы блоттинга известны специалистам и могут быть осуществлены, например, в формате электроблоттинга, “полусухого” блоттинга, “вакуум”-блоттинга или дот-блоттинга. Кроме того, для детектирования молекул могут быть использованы иммунологические методы, такие как, например, иммунопреципитация или иммунологические анализы, такие как ИФА, ELISA, РИА, анализы методом боковых потоков, анализы методом проточной цитометрии, анализы на иммунохроматографических пластинах и т.п. Иммуноанализы, используемые в настоящем изобретении, могут включать как конкурентные, так и неконкурентные иммуноанализы.

В некоторых вариантах наборов и устройств для диагностики in vitro, разработанных в соответствии со способом настоящего изобретения, иммунохимическое тестирование или тестирование на основе нуклеиновых кислот может быть осуществлено с использованием тест-устройства для клинических лабораторий. Таким тест-устройством может быть любое устройство, подходящее для тестирования, проводимого иммунохимическими методами или методами любого формата с использованием нуклеиновых кислот, например, такое устройство, как точные контрольно-измерительные приборы для испытаний, а также настольные или лабораторные устройства. Эти устройства могут быть также снабжены открытыми или закрытыми системами типа платформ. Эти системы могут быть разработаны на основе любой подходящей методики, такой как, например, использование микротитрационных планшетов, многолуночных планшетов, систем сквозных или боковых потоков, микрочипов или матричных систем, либо систем с использованием сфер или мембран. Используемыми методами детектирования могут быть любые методы, известные специалистам, которые обычно применяются для осуществления иммунохимических реакций детектирования или реакций детектирования на уровне нуклеиновых кислот. Такими системами детектирования могут быть, например, люминесцентные системы (электролюминесцентные, биолюминесцентные, фотолюминесцентные, радиолюминесцентные, хемилюминесцентные, электрохемилюминесцентные), системы, основанные на флуоресценции; системы детектирования, основанные на проводимости; системы, основанные на облучении (видимым светом, УФ-излучением, рентгеновским излучением, гамма-излучением и т.п.), или системы, основанные на применении любого другого известного метода.

В одном из вариантов осуществления изобретения методом определения уровня маркерных молекул, для которого были сконструированы и разработаны наборы и устройства для диагностики in vitro настоящего изобретения, является любой метод, подходящий для определения даже очень небольшого количества специфических молекул в биологических образцах. Кроме того, может быть использован любой метод детектирования маркерных молекул, независимо от его чувствительности. Реакция детектирования по настоящему изобретению может включать, например, реакции детектирования на уровне нуклеиновых кислот и/или реакции детектирования на уровне полипептидов. В одном из вариантов осуществления изобретения детектирование маркерных молекул может включать детектирование конкретных вариантов сплайсинга. В другом варианте осуществления изобретения указанный способ детектирования может предусматривать детектирование модификаций маркерных молекул, таких как фосфорилирование, гликозилирование или т.п. полипептидов, или метилирование молекул нуклеиновой кислоты в образцах.

В некоторых вариантах настоящего изобретения может быть осуществлено определение уровня метилирования нуклеиновых кислот таких генов, как гены p16INK4a, p14ARF, TSLC1, клаудина, pRB, Her-2/Neu, р53, p21CIP1/WAF1, p27KIP1 или т.п. Присутствие или отсутствие гиперметилирования или детектирование LOH-статуса исходя из уровня метилирования, могут служить показателями наличия или отсутствия клинически релевантного состояния.

В одном из вариантов осуществления изобретения наборы и устройства для диагностики in vitro конструируют так, чтобы определение уровня маркерных молекул можно было осуществлять путем определения уровня нуклеиновых кислот, кодирующих маркерные молекулы или их фрагменты, присутствующие в образце. Методы детектирования молекул нуклеиновых кислот известны специалистам. Процедура детектирования нуклеиновых кислот может быть осуществлена, например, посредством реакции связывания детектируемой молекулы с комплементарными нуклеиновокислотными зондами, с белками, обладающими специфичностью связывания с нуклеиновыми кислотами, или с любыми другими молекулами, специфически распознающими указанные нуклеиновые кислоты и связывающимися с ними. Такой способ может быть осуществлен in vitro, а также непосредственно in situ, например, в процессе детектирования, проводимого посредством реакции окрашивания. Другим методом детектирования маркерных молекул в образце на уровне нуклеиновых кислот, осуществляемым в способе по настоящему изобретению, является реакция амплификации нуклеиновых кислот, которая может быть осуществлена количественно, например полимеразная цепная реакция. В одном из вариантов осуществления изобретения количественная оценка уровня маркерной РНК в образцах для диагностики клеточно-пролиферативных расстройств может быть проведена, например, с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.

В другом варианте осуществления изобретения наборы и устройства для диагностики in vitro конструируют так, чтобы определение уровня маркерных молекул можно было осуществлять путем определения уровня экспрессии белка. Детектирование маркерных молекул на уровне белка может быть осуществлено, например, в реакционной смеси, содержащей связывающий агент, специфичный для детектирования маркерных молекул. Такими связывающими агентами могут быть, например, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, бифункциональные гибридные антитела, пептидомиметики, содержащие минимальное количество антигенсвязывающих эпитопов, и т.п. Связывающие агенты могут быть использованы во многих различных методах детектирования, таких как, например, вестерн-блоттинг, ELISA, РИА, ИФА, проточная цитометрия, анализ методом боковых потоков, метод латекс-агглютинации, метод иммунохроматографических полос или иммунопреципитация. Обычно, детектирование с применением связывающих агентов может быть осуществлено in vitro, а также непосредственно in situ, например, в процессе реакции иммуноцитохимического окрашивания. В соответствии с настоящим изобретением может быть использован любой способ, подходящий для определения количества конкретных полипептидов в растворах биологических образцов.

Методы детектирования модифицированных молекул нуклеиновой кислоты и/или полипептидов известны специалистам.

Методы детектирования метилирования нуклеиновых кислот известны специалистам, и такими методами могут быть, например, методы с применением предварительной химической обработки нуклеиновых кислот, например, бисульфитом и перманганатом натрия или гидразином, с последующим детектированием модификации с помощью специфических рестриктирующих эндонуклеаз или специфических зондов, например, в процессе реакции амплификации. Детектирование метилирования может быть также осуществлено с использованием рестриктирующих эндонуклеаз, ответственных за метилирование. Методы детектирования метилирования нуклеиновых кислот описаны, например, в патентной заявке ЕР02010272.9, US5856094, WO0031294, US6331393 и т.п. Цитируемые документы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Детектирование модификаций в полипептидах может быть, например, осуществлено с использованием связывающих агентов, специфически распознающих модифицированные или немодифицированные формы полипептидов. Альтернативно, для удаления модификаций в молекулах могут быть использованы ферменты, такие как фосфатазы или гликозилазы. Таким образом, присутствие или отсутствие модификаций может быть детектировано путем определения массы или заряда молекул с помощью электрофореза, хроматографии, масс-спектрометрии и т.п., до и после инкубирования с соответствующим ферментом.

В еще одном варианте настоящего изобретения наборы и устройства для диагностики in vitro конструируют так, чтобы детектирование серии маркерных молекул можно было осуществлять на полипептидном уровне и одновременно можно было осуществлять детектирование другой серии маркерных молекул и/или всех или некоторых из этих маркерных молекул на уровне нуклеиновых кислот.

Маркерными молекулами, ассоциированными с клинически релевантными клеточными состояниями, могут быть, например, молекулы, которые влияют на характер пролиферации и/или дифференцировки клеток и/или тканей и/или отражают такой характер. Такие молекулы могут включать, например, белки регуляции клеточного цикла; белки, ассоциированные с репликацией ДНК; трансмембранные белки, рецепторные белки; белки-трансдукторы сигнала; кальций-связывающие белки; белки, содержащие ДНК-связывающие домены; металлопротеиназы; киназы; ингибиторы киназ; шапероны; белки эмбриогенеза; белки теплового шока или ферменты, обеспечивающие посттрансляционную модификацию других белков, и тем самым, регулирующие их активность; или нуклеиновые кислоты, кодирующие названные белки. Маркерными молекулами, используемыми в настоящем изобретении, могут быть также мРНК, кодирующие указанные белки. В одном из вариантов осуществления изобретения маркер, ассоциированный с клеточно-пролиферативным расстройством, может, например, уникально экспрессироваться в клетках с такой патологией, но может и не экспрессироваться в указанных клетках или сверхэкспрессироваться в этих клетках.

Наборы и устройства для диагностики in vitro, разработанные описанным здесь способом, включают одну или несколько маркерных молекул (белков, а также нуклеиновых кислот), выбранных из белков регуляции клеточного цикла или нуклеиновых кислот, кодирующих эти белки (например, р53, pRb, p14ARF), циклинов (например, циклина А, циклина В, циклина Е), ингибиторов циклин-зависимой киназы (таких как р13.5, р14, p15INK4b, p16INK4a, p18INK4c, p19INK4d, p21WAF1/CIP1 и p27KIP1), опухолеассоциированных антигенов (например, MDM-2, МСМ2, МСМ5, МСМ6, CDC2, CDC6, Id1, остеопонтина, GRP, клаудина, почечной дипептидазы CD46, her2/neu, TGFβII-рецептора), генов-супрессоров опухоли, HPV-ассоциированных маркеров (например, происходящих от HPV-генов L1, L2, Е1, Е2, Е4, Е5, Е6 или Е7 и т.п.), антигенов клеточной поверхности (например, цитокератинов, катенинов или т.п.) или т.п. В некоторых вариантах настоящего изобретения маркерные молекулы, детектируемые с помощью наборов и устройств для диагностики in vitro, разработанных в соответствии с описанным здесь способом, могут включать гены, участвующие в репликации ДНК, такие как гены белков или нуклеиновые кислоты пре-инициирующего комплекса или репликативной вилки. Такими молекулами могут быть, например, маркеры пролиферации (белки, а также нуклеиновые кислоты), например, геликазы (такие как эукариотическая геликаза или белки МСМ [МСМ2, МСМ3, МСМ4, МСМ5, МСМ6, МСМ7], белок ТР, описанный в WO0050451 и WO0217947 [также обозначаемый HELAD1, Pomfil2, Unc-53], киназы или фосфатазы, участвующие в процессе репликации, такие как, например, CDC6, протеинкиназа CDC7, Dbf4, протеинфосфатаза CDC14, CDC45 и МСМ10; белки, участвующие в процессивной репликативной вилке (такие как, например, PCNA или ДНК-полимераза дельта, белок репликации А (RPA), фактор репликации С (RFC), FEN1), молекулы, необходимые для поддержания клеточной пролиферации (такие как Ki67, Ki-S5 или Ki-S2) и т.п. В основном, описанный здесь способ разработки наборов и устройств для диагностики in vitro является подходящим для разработки наборов и устройств для диагностики in vitro на основе различных маркерных молекул, характерных для клинически релевантных состояний. В одном из вариантов настоящего изобретения маркерными молекулами, характерными для клинически релевантного состояния, могут быть маркеры, ассоциированные с опухолями (опухолевые маркеры). Маркерными молекулами, ассоциированными с опухолями, могут быть, например, белки, которые экспрессируются в опухоли по механизму не-дикого типа, в отличие от нормальной контрольной ткани. Используемый здесь термин “экспрессия не-дикого типа” может означать повышенные или пониженные уровни экспрессии, отсутствие экспрессии или экспрессию соответствующих молекул в формах не-дикого типа. Экспрессия белка не-дикого типа может включать экспрессию мутированных форм белков, имеющих мутации, вызванные инсерцией, делецией, заменой или сдвигом рамки, или какие-либо другие мутации известных типов, присутствующие в белках или нуклеиновых кислотах. Во всех случаях экспрессии белков не-дикого типа или уровней белков не-дикого типа, белки, полипептиды или их фрагменты, или нуклеиновые кислоты, кодирующие эти белки, либо полипептиды или фрагменты этих нуклеиновых кислот могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров, ассоциированных с опухолями, и поэтому они могут подпадать под понятие “опухолевый маркер”, используемое в контексте настоящего изобретения. Белки, которые обнаруживают экспрессию не-дикого типа, ассоциированную с опухолями, описаны, например, в документах WO9904265A2, WO0149716A2, WO0055633A2 и WO0142792A2, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

В одном из вариантов осуществления изобретения маркер, характерный для данного клинически релевантного состояния, может представлять собой белок регуляции клеточного цикла, такой как, например, циклин, циклин-зависимая киназа или ингибитор циклин-зависимой киназы. В другом варианте осуществления изобретения маркером, характерным для данного клинически релевантного состояния, может быть маркер, ассоциированный с временной или персистентной вирусной инфекцией. Такой вирусной инфекцией может быть инфекция, вызванная вирусом папилломы человека (HPV), таким как HPV высокого или низкого риска. HPV высокого риска может включать такие подтипы HPV, как, например, HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 и 58. Маркерами для HPV-инфекции могут быть, например, продукты экспрессии генов HPV, таких как L1, L2, Е2, Е4, Е5, Е6 или Е7. В третьем варианте осуществления изобретения маркер, характерный для вирусной инфекции, может быть использован в комбинации с любым другим маркером, характерным для данного клинически релевантного состояния, например, в комбинации с белком регуляции клеточного цикла. Комбинации маркерных молекул, которые могут представлять особый интерес с точки зрения их ассоциации с HPV, описаны, например, в документе WO0208764, который вводится в настоящее описание посредством ссылки.

В одном из вариантов осуществления изобретения белки регуляции клеточного цикла, используемые в комбинации с маркерами HPV, могут быть выбраны, например, из группы, включающей pRb, р53, p14ARF и ингибиторы циклин-зависимой киназы. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения, например, p16INK4a может быть использован в комбинации с маркерами, ассоциированными с HPV-инфекцией (например, L1, L2, Е2, Е4, Е5, Е6 или Е7).

В некоторых вариантах настоящего изобретения осуществляют детектирование генов HPV на уровне транскриптов или белков. В этой связи определенное преимущество может давать нормализация образца, используемого в биохимическом неклеточном анализе, по отношению к данным цитологического анализа того же самого LBC-образца. В одном из вариантов изобретения осуществляют нормализацию образца, используемого в биохимическом неклеточном анализе, по отношению к объему LBC-образца, необходимого для приготовления препарата ThinPrep™, с использованием процессора Cytyc™ ThinPrep™. В результате этого могут быть получены количества нуклеиновых кислот HPV, сравнимые с количеством клеток, присутствующих в образце. При отсутствии нормализации не может быть установлена зависимость HPV-инфекции от содержания клеток.

В описанном здесь методе детектирования клинически релевантных состояний для обнаружения некоторых клинически релевантных состояний могут быть использованы, в принципе, любые маркерные молекулы. Однако известно, что некоторые маркерные молекулы ассоциированы с конкретными клинически релевантными состояниями. Каждому специалисту известно, какие маркерные молекулы могут быть подходящими для их использования в способе настоящего изобретения, предназначенном для выявления клинически релевантного состояния в солюбилизированном физиологическом образце. В нижеследующей таблице 3 приводятся примеры клинически релевантных состояний и маркерных молекул, к которым может быть применен способ настоящего изобретения. Для иллюстрации описанного здесь способа приводится нижеследующая информация, которая не ограничивает объема настоящего изобретения и, как указано выше, по существу, относится к молекулам, которые, как известно специалистам, ассоциируются с конкретными клинически релевантными состояниями.

Таблица 3
Клинически релевантное состояние Примеры подходящих маркерных молекул для осуществления описанного здесь способа
Уровень белка Уровень нуклеиновых кислот
Карцинома шейки матки p16INK4a, p14ARF, клаудин, p19INK4d Ki67, циклин Е, циклин D, МСМ-5, МСМ-2, HPV E7, HPV E2, HPV E4, HPV L1, СК18, CD-46, NMP-173, Brn-3, Mn-антиген; p16INK4a, p14ARF, клаудин, p19INK4d, Ki67, циклин Е, циклин D, МСМ-5, МСМ-2, HPV E7, HPV E6, HPV E2, HPV E4, HPV L1 (любая последовательность нуклеиновой кислоты HPV, в частности, hrHPV), NMP-173, Brn-3, Mn-антиген, TSLC-1, PTEN
Рак мочевого пузыря сурвивин, МСМ-5, МСМ-2, CDC-6, Her-2/Neu, MMP-2, циклин-Е, KIAA1096, p21WAF1/CIP1, pRB, MDM2, NMP-22 NY-ESO1, МСМ-5, МСМ-2, CDC-6, р53, Her-2/Neu, MMP-2, циклин-Е, KIAA1096, p21WAF1/CIP1, pRB, MDM2, NMP-22
Рак прямой и толстой кишки клаудин, ДНКаза Х, МСМ-5, МСМ-2, кавеолин-1, катепсин-В, циклин D1, циклин Е, c-myc, TGF-бета, Her-2/Neu клаудин, ДНКаза Х, МСМ-5, МСМ-2, кавеолин-1, катепсин-В, циклин D1, циклин Е, с-myc, TGF-бета, Her-2/Neu
Мелкоклеточный рак легких p16INK4a, GRP, Her-2/Neu, циклооксигеназа-2, NSE, СА 15-3 p16INK4a, GRP, Her-2/Neu, циклооксигеназа-2, NSE, СА 15-3
Немелкоклеточный рак легких NSE, GRP, циклин D1, Her-2/Neu, SCC, СЕА,
СА 19-9
NSE, GRP, циклин D1, Her-2/Neu, SCC, СЕА,
СА 19-9
Рак молочной железы циклин D3, Her-2/Neu, е-кадгерин, сурвивин, катепсин D BRCA2, циклин D3, Her-2/Neu, е-кадгерин, сурвивин, катепсин D
Различные цитологические образцы из области воспаления лейкоцит-специфические белки, гранулоцит-специфические белки лейкоцит-специфические нуклеиновые кислоты, гранулоцит-специфические нуклеиновые кислоты

В соответствии с настоящим изобретением маркерные молекулы для клинически релевантных состояний могут быть индикаторами наличия или отсутствия клинически релевантного состояния. В одном из вариантов настоящего изобретения маркерные молекулы могут служить индикаторами конкретных параметров клинически релевантных состояний. Такими параметрами могут быть прогрессирование таких состояний, прогноз и поведенческие эффекты, соответствующие определенному терапевтическому лечению указанного клинически релевантного состояния. Поэтому маркерные молекулы, характерные для данных клинически релевантных состояний, могут представлять собой маркерные молекулы, которые могут быть использованы для оценки прогноза у индивидуумов, страдающих клинически релевантными состояниями, или для назначения курса терапии индивидуума, страдающего данным клинически релевантным состоянием. В некоторых вариантах настоящего изобретения такое применение может быть направлено на определение наличия или отсутствия экспрессии определенных маркерных молекул, которые являются показателями позитивного или негативного прогноза конкретных клинически релевантных состояний (например, уровня экспрессии р16, Her-2/Neu, Brca-2, клаудина или т.п. при раке молочной железы и т.п.). Примеры маркерных молекул, которые позволяют сделать прогноз для индивидуумов, страдающих конкретными клинически релевантными состояниями, известны специалистам. В способе настоящего изобретения могут быть использованы любые такие маркеры, определенные исходя из цитологических или гистологических анализов. Оценка прогноза может быть осуществлена, например, во время или после установления основного диагноза клинически релевантного состояния, во время или после (хирургического) лечения клинически релевантного состояния или во время любой другой стадии, предшествующей соответствующему клинически релевантному состоянию. В других вариантах изобретения способ настоящего изобретения может быть использован для назначения лечения индивидуумов, страдающих клинически релевантными состояниями. Такое лечение может, например, включать выбор определенных терапевтических соединений в терагностических процедурах (используемых, например, для отбора пациентов в целях проведения терапии герцептином или т.п.), отбор пациентов для проведения химиотерапии, лучевой терапии, либо для назначения дополнительного терапевтического лечения, либо, в общих чертах, для принятия решения о проведении консервативного лечения индивидуумов, например, соответствующего мониторинга или т.п.

В некоторых вариантах настоящего изобретения маркерными молекулами, характерными для данных клинически релевантных состояний, могут быть маркеры, указывающие на прогрессирование такого клинически релевантного состояния. В некоторых других вариантах настоящего изобретения маркерные молекулы, указывающие на прогрессирование клинически релевантных состояний, могут быть использованы в комбинации с маркерными молекулами, указывающими просто на наличие такого клинически релевантного состояния.

Разработку в соответствии с настоящим изобретением осуществляют с использованием LBC-образцов в качестве исходного материала. В одном из вариантов изобретения наборы и устройства для диагностики in vitro, разработанные в соответствии с описанными здесь способами, предусматривают использование солюбилизированного физиологического образца любого типа. В другом варианте осуществления изобретения наборы и устройства для диагностики in vitro, разработанные в соответствии с описанным здесь способом, предусматривают использование только LBC-образцов. В этом случае набор и устройство для диагностики in vitro разрабатывают и изготавливают для анализа солюбилизированных LBC-образцов, используемых в качестве тест-образцов для проведения адъюнктивного и конъюнктивного цитологического анализа или в качестве тест-образцов для проведения автономного теста.

Метод разработки наборов и устройств для диагностики in vitro в соответствии с настоящим изобретением направлен на изготовление in vitro диагностических наборов и устройств для проведения тестов в формате биохимического анализа. В тестах этого формата анализ на присутствие или отсутствие маркерных молекул и/или их уровней осуществляют в солюбилизированных физиологических образцах. Солюбилизацию физиологических образцов проводят с использованием подходящей среды для лизиса, подробно описанной выше. Разработку наборов или устройств для диагностики in vitro в соответствии с настоящим изобретением осуществляют с использованием LBC-образцов для конструирования и разработки, проверки соблюдения проектных и конструкторских задач и проверки достоверности проектных и экспериментальных данных. Кроме того, способ разработки наборов и устройств для диагностики in vitro с использованием описанных здесь LBC-образцов представляет собой любой способ, который предусматривает использование LBC-образцов для получения технической документации и/или свидетельства о безопасности и эффективности соответствующих наборов и устройств для диагностики in vitro в целях их предоставления Регулирующим органам, а затем Федеральным ведомствам и регулирующим (контролирующим) организациям, если это необходимо, для урегулирования конфликтов или получения разрешения на их применение. В описанном здесь способе разработки наборов и устройств для диагностики in vitro, LBC-образцы могут быть использованы на всех этапах конструирования, разработки, верификации, проверки достоверности, передачи данных Регулирующим органам на рассмотрение и разрешение/одобрение, либо LBC-образцы могут быть использованы только в одной или в нескольких из вышеназванных стадий конструирования и разработки наборов и устройств для диагностики in vitro. В одном из вариантов настоящего изобретения способом разработки наборов или устройств для диагностики in vitro в соответствии с настоящим изобретением является способ конструирования и разработки указанных наборов или устройств для диагностики in vitro, где LBC-образцы используются для верификации и/или проверки достоверности данных конструирования и разработки. В другом варианте осуществления изобретения указанным способом разработки наборов и устройств для диагностики in vitro является способ получения документации о наборах и устройствах для диагностики in vitro в целях их предоставления Регулирующим органам, а затем местным или региональным директивным ведомствам и/или местным или региональным регулирующим (контролирующим) организациям на рассмотрение таких данных, а также разрешения/одобрения указанных наборов и устройств для диагностики in vitro, где LBC-образцы используются для сбора технических данных, эксплуатационных данных или данных о безопасности и эффективности указанных наборов или устройств для диагностики in vitro. В другом варианте изобретения способом разработки наборов и устройств для диагностики in vitro является способ, в котором объединены последние из вышеупомянутых методов.

Подробно описанный здесь способ разработки наборов и устройств для диагностики in vitro предусматривает использование LBC-образцов в соответствии с любой процедурой, подходящей для сбора данных об эксплуатационных характеристиках разрабатываемого набора или устройства. В общих чертах, LBC-образцы используются в качестве источника физиологических образцов, применяемых в процессе разработки наборов или устройств для диагностики in vitro. В одном из вариантов настоящего изобретения LBC-образец поставляется как резервный образец, где цитологическую пробу берут из LBC-образца до, во время и после использования части LBC-образца в методе разработки настоящего изобретения. В другом варианте настоящего изобретения LBC-образец получают только в целях его использования в способе разработки настоящего изобретения. В этом случае второй, а может быть и третий LBC-образец или даже образец, приготовленный стандартными методами с использованием нетонкослойных образцов для цитологического анализа, могут быть получены до или после взятия соответствующего LBC-образца, используемого в способе разработки настоящего изобретения.

Что касается LBC-образцов, то в способе настоящего изобретения с использованием этих образцов, информация о процедурах цитологического анализа может либо присутствовать, либо отсутствовать. Такая информация включает, например, объем LBC-образца, необходимый для получения подходящего тонкослойного препарата; данные о содержании клеток в LBC-образце, данные об адекватности LBC-образца или о проводимой на их основе процедуре взятия образца, диагностическую информацию, оцененную исходя из цитологического анализа образца, и информацию о заболевании и диагнозе пациента и т.п.

В способе настоящего изобретения полученный LBC-образец используется либо полностью, либо частично. В некоторых вариантах настоящего изобретения общий объем LBC-образца используется в целях разработки. В другом варианте изобретения для такой разработки используются данные об общем количестве клеток, содержащихся в образце. В еще одном варианте изобретения для такой разработки используется только одна фракция от общего объема или от общего числа клеток, содержащихся в исходном LBC-образце.

В способе настоящего изобретения может быть проведена нормализация LBC-образца. В некоторых вариантах настоящего изобретения нормализация LBC-образца может быть проведена для гарантии наличия сравнимого количества клеток в процессах разработки, осуществляемых с использованием LBC-образца. Это может быть достигнуто путем нормализации объема LBC-образца по объему указанного образца, необходимого для приготовления соответствующего тонкослойного образца. Приготовление тонкослойного образца может быть осуществлено любым подходящим методом, таким как, например, использование процессора ThinPrep™ или т.п. В этом случае объем фракции LBC-образца, используемый в способе разработки настоящего изобретения, можно не учитывать. В некоторых других вариантах изобретения нормализацию LBC-образца осуществляют по объему образца, используемого в тест-процедуре. В этом случае количество клеток, присутствующих во фракции LBC-образца, используемого в способе разработки настоящего изобретения, можно не учитывать. Примеры проведения описанной здесь нормализации приводятся в примерах 4ff.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу установления диагноза клинически релевантных состояний путем проведения биохимического неклеточного анализа на присутствие или отсутствие и/или на уровень маркерной молекулы в солюбилизированных физиологических образцах, где указанным физиологическим образцом является LBC-образец. В некоторых вариантах настоящего изобретения способ установления диагноза предусматривает нормализацию количества образца, используемого для проведения биохимического неклеточного анализа, в соответствии с информацией, которая может быть доступна исходя из цитологического (например, тонкослойного) препарата, полученного из LBC-образца. Такой информацией может быть, например, информация о содержании клеток в данном образце. В этой связи под термином “содержание клеток” подразумевается содержание клеток, присутствующих в одном миллилитре данной среды. Термин “содержание клеток” может означать общее количество клеток любого типа и происхождения. В других вариантах осуществления изобретения термин “содержание клеток” может означать содержание клеток определенного типа в LBC-образце. Такими клетками могут быть, например, клетки, определенные исходя из источника или места их локализации (например, эндоцервикальные клетки, эктоцервикальные клетки, эндометриальные клетки, цервикальные клетки, вагинальные клетки), клетки, определенные по их статусу пролиферации и/или дифференцировки (например, метапластические клетки, диспластические клетки, HPV-инфицированные клетки и т.п.) или клетки любого другого определенного типа.

В этой связи описанный здесь способ детектирования относится к детектированию таких маркерных молекул, как нуклеиновые кислоты, белки или пептиды и их соответствующие фрагменты. В некоторых вариантах настоящего изобретения детектирование маркерных молекул осуществляют путем анализа на присутствие или отсутствие и/или на уровень белков, пептидов или их фрагментов в указанных солюбилизированных образцах. Маркерные молекулы, которые могут быть использованы в этом способе, описаны выше в определении термина “маркерные молекулы, характерные для клинически релевантных состояний”. Такой способ может быть применим для оценки любого клинически релевантного состояния, определенного выше. В других вариантах настоящего изобретения осуществляют детектирование нуклеиновых кислот маркерных молекул, характерных для данных клинически релевантных состояний. Используемый здесь термин “нуклеиновые кислоты” определен выше в описании настоящего изобретения.

Используемый здесь термин “детектирование маркерных молекул” в указанных способах означает любые подходящие способы детектирования, определенные выше. В некоторых вариантах настоящего изобретения детектирование белков и пептидов осуществляют иммунохимическим методом.

В соответствии с настоящим изобретением могут быть диагностированы неопластические заболевания, такие как рак и ранние предшествующие ему стадии. В частности, предраковые состояния могут быть выявлены на ранней стадии. Следует также подчеркнуть, что может быть проведена дифференциация доброкачественного воспалительного процесса или метапластических изменений от неопластических поражений. Другим характерным признаком является то, что результаты, полученные способом по настоящему изобретению, не основаны на субъективной оценке, что снижает или исключает возможность получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов Рар-теста или гистологического анализа препаратов. Кроме того, само настоящее изобретение отличается быстрым и простым способом его осуществления, и поэтому оно может быть положено в основу программы массового обследования населения, особенно в странах третьего мира. Таким образом, настоящее изобретение вносит важный вклад в современную диагностику раковых заболеваний.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано нижеследующими примерами, однако существо или объем изобретения не ограничивается конкретными процедурами, описанными в этих примерах.

Примеры

Пример 1: Выявление внутриэпителиальной неоплазии шейки матки в ELISA-тесте

33 цервикальных мазка, помещенных в буфер для лизиса, подвергали ELISA-детектированию на сверхэкспрессию ингибитора циклин-зависимой киназы p16INK4a в растворах, полученных из клеток, содержащихся в указанных мазках. ELISA-тест проводили, как описано ниже.

(А) Лизис клеток

Щетки с цервикальными мазками помещали в 15-мл сосуды, содержащие 2 мл буфера для лизиса mtm (2% Тритона Х-100, 0,4% ДСН, 0,6 мМ PMSF в PBS). Цервикальные клетки, присутствующие на щетке, подвергали лизису, по крайней мере, в течение 20 ч. Затем лизаты образцов цервикальных мазков переносили в 2-мл пробирки и центрифугировали при 4°C (15 минут при 28000 × g (16600 об/мин, в высокоскоростной центрифуге JEC Multi RF)). Супернатант переносили в чистую пробирку. Этот супернатант может храниться при -20°C.

(В) Осуществление ELISA

Сенсибилизация ELISA-планшетов

Маточный раствор p16INK4a-специфического антитела клон mtm Е6Н4 разводили в PBS с получением готового раствора для сенсибилизации.

50 мкл раствора для сенсибилизации добавляли в каждую лунку ELISA-планшетов.

Для сенсибилизации планшеты инкубировали в течение ночи при 4°C.

Раствор для сенсибилизации удаляли из ELISA-планшетов, и эти планшеты промывали с помощью автоматического устройства для мойки ELISA-планшетов с использованием:

• 7 × 250 мкл промывочного буфера (0,1% твина 20 (об/об) в PBS),

после удаления остатков промывочного буфера в каждую лунку добавляли 300 мкл блокирующего буфера (2% BSA в PBS). Планшеты инкубировали в течение 1 часа на качалке при комнатной температуре.

Инкубирование с образцами

После удаления блокирующего буфера в каждую лунку добавляли 100 мкл образца клеток, подвергнутых лизису. Лизаты клеток HeLa использовали в качестве позитивного контроля.

В целях калибровки в данном тесте были использованы различные концентрации рекомбинантного белка p16INK4a (0 пг/мл, 50 пг/мл, 100 пг/мл, 200 пг/мл, 400 пг/мл, 800 пг/мл).

Образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

Затем проводили промывку в автоматическом устройстве для мойки ELISA-планшетов с использованием:

• 7 × 250 мкл промывочного буфера. Остаточный буфер удаляли.

Инкубирование с детектирующим антителом

Рабочий раствор биотинилированного “второго” антитела клон mtm D7D7, специфичного к белку p16INK4a, получали путем разведения маточного раствора.

Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл рабочего раствора. После инкубирования в течение 1 часа при комнатной температуре раствор антитела удаляли и ELISA-планшеты промывали в автоматическом устройстве для мойки ELISA-планшетов с использованием

• 7 × 250 мкл промывочного буфера.

Детектирование

Полимеры “стрептавидин-ПХ” (1 мг/мл) предварительно разводили 1:10 (4 мкл + 36 мкл буфера для инкубирования). Конечный раствор для инкубирования получали путем разведения 1:300 в буфере для инкубирования (0,1% BSA в PBS) до конечной концентрации 0,33 мкг/мл.

В каждую лунку добавляли 100 мкл полученного раствора и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

Затем буфер удаляли и планшеты 5 раз вручную промывали 200 мкл промывочного буфера на лунку.

Инкубирование субстрата

ТМВ-субстрат уравновешивали до 25°C в темноте в течение 1 часа.

В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата.

ELISA-планшеты инкубировали при 25°C в темноте в течение ровно 15 минут. Затем реакцию прекращали добавлением 80 мкл 2,5М H2SO4.

Через 5 минут после прекращения реакции определяли OD 450 нм. После оценки результатов снова определяли значение OD для каждого образца.

Результаты этого эксперимента приводятся в таблице 4. Результаты ELISA-анализа сравнивали с диагностическими результатами, полученными с помощью теста Папаниколау (Papanicolaou) (РАР-тест, цервикальная цитология) для тех же самых пациентов. Цервикальный цитологический тест проводили в соответствии с Мюнхенской классификацией II (1990). Рар II охватывает доброкачественные клетки, клетки области цервицита и метаплазии, Рар IV охватывает значительную дисплазию и карциному in situ. При этом оказалось, что образцы, дававшие OD более чем 0,9 в анализе ELISA, соответствовали образцам, которые в соответствии со стандартным цитологическим РАР-тестом были классифицированы как диспластические.

Принимая OD=0,9 за пороговое значение при оценке образцов в ELISA, были получены следующие результаты:

Таблица 4
Диагноз/Результаты ELISA Положительные результаты ELISA Отрицательные результаты ELISA
Рар II 0 30
Рар IV 3 0

ELISA-тест был положительным для всех образцов (100%), взятых у женщин со значительной дисплазией, и отрицательным для всех 30 образцов (100%), взятых у женщин, не имеющих дисплазии.

Используя пороговое значение, определенное в этих экспериментах, цитологические образцы, взятые у 300 пациентов, тестировали в представленном здесь ELISA-формате. В этих экспериментах образцы, идентифицированные в цитологическом анализе как диспластические, могут быть также идентифицированы как диспластические в анализе формата ELISA.

Эти результаты показали, что количественная оценка белка p16INK4a в солюбилизированных образцах, взятых у пациента, позволяет выявлять дисплазию в этих образцах. В данном примере диагноз устанавливают исходя из сравнения уровня p16INK4a, определенного в конкретном образце, взятом у пациента, с известным уровнем, присутствующим в образцах человека, не имеющего дисплазии. Такое сравнение проводят в тест-формате с использованием порогового значения для OD, определенного в вышеописанном ELISA-анализе, где указанный конкретный образец классифицируется как положительный.

Пример 2: Выявление внутриэпителиальной неоплазии шейки матки в тесте, проводимом методом боковых потоков

Девять цервикальных мазков, поставляемых в растворе PreservCyt (Cytyc Corporation, Boxborough, MA), подвергали стандартному РАР-испытанию и одновременно анализу методом боковых потоков на сверхэкспрессию ингибитора циклин-зависимой киназы p16INK4a в растворах, полученных из клеточных суспензией указанных мазков. Анализ методом боковых потоков проводили следующим образом:

(А) Клеточный лизис

10 мл клеточных суспензий из образцов мазков шейки матки индивидуума, поставляемых в виде готовых препаратов PreservCyt™, переносили в реакционный 15-мл сосуд. Образцы центрифугировали в течение 15 минут при комнатной температуре при 1500 × g (3000 об/мин, Heraeus Varifuge, rotor 8074), затем супернатант отбрасывали и остаточный метанол выпаривали (в течение 15 минут при комнатной температуре), после чего осадок солюбилизировали в 500 мкл буфера для лизиса и переносили в реакционный 1,5-мл сосуд. Раствор центрифугировали при 4°C (в течение 15 минут при 28000 × g (16600 об/мин, Microcentrifuge Biofuge fresco) и супернатант переносили в свежую пробирку. Такой супернатант может храниться при -20°C.

(В) Проведение анализа методом боковых потоков

Использование антитела, иммобилизованного на мембране

Маточный раствор p16INK4a-специфического антитела клон 6H4 разводили в TBS (содержащем 1% альбумин бычьей сыворотки) и получали готовый раствор для нанесения пятен с конечной концентрацией 1 мг антитела/мл. Готовый раствор наносили пятнами на нитроцеллюлозную мембрану при 30 мкл/30 см. К одному концу нитроцеллюлозной мембраны присоединяли фитили Whatman, и щупы для измерения уровня сушили в течение 1 часа при 37°C. Затем эти щупы оставляли для уравновешивания при комнатной температуре, и щупы разрезали на части шириной 4 мм.

Получение раствора конъюгата

Маточный раствор p16INK4a-специфического антитела клон mtm D7D7, конъюгированного с коллоидным золотом (с размером частиц 40 нм), разводили в TBS (содержащем 1% альбумин бычьей сыворотки) и получали готовый раствор детектирующего антитела с конечной концентрацией 1,0 OD при 520 нм.

Инкубирование с образцами

Затем 20 мкл образцов лизированных клеток добавляли к 20 мкл готового раствора детектирующего антитела в лунке микротитрационного планшета и смешивали. Затем в лунку вводили щуп для измерения уровня, сенсибилизированный антителом для захвата, клон Е6Н4, после чего образец погружали в раствор и оставляли для завершения реакции. Сигнал считывали в то время, пока щуп для измерения уровня оставался влажным.

Результаты

В формате анализа настоящего изобретения 2 образца (образцы 1 и 2), классифицированные как PAP IVa по РАР-окрашиванию и, следовательно, содержащие диспластические клетки, давали явно различимые пурпурные полосы на участке нанесенного пятна антитела для захвата. В противоположность этому, такая полоса не выявлялась для других 7 образцов (образцы 3-9), классифицированных как РАР II-III по РАР-окрашиванию, и, следовательно, они не содержали диспластических клеток.

ELISA проводили в соответствии с протоколами, описанными в примере 1. Результаты приводятся в таблице 5.

Таблица 5
Образец Диагноз ELISA OD
1 Pap IVa 2,209
2 PAP IVa 0,536
3 PAP III 0,067
4 PAP II 0,113
5 PAP II 0,095
6 PAP II 0,284
7 PAP II 0,192
8 PAP II 0,138
9 PAP II 0,07

Настоящее изобретение, а также способ его осуществления и применения описаны в данной заявке в исчерпывающих, ясных, четких и точных терминах, что дает возможность каждому специалисту в этой области осуществить и применить эти способы на практике. Для каждого специалиста очевидно, что в приведенном выше описании изобретения рассматриваются предпочтительные варианты его осуществления, и что в настоящее изобретение могут быть внесены модификации, не выходящие за рамки объема настоящего изобретения, сформулированного в прилагаемой формуле изобретения. Для конкретного описания и точного определения притязания по рассматриваемому здесь предмету изобретения в конце настоящего изобретения представлена формула изобретения.

Пример 3: Детектирование транскриптов p16INK4a и p14ARF с помощью ОТ-ПЦР

В этом анализе использовали образцы шейки матки, взятые у 50 индивидуумов. От каждого индивидуума брали два образца, один - в универсальной среде для сбора (Universal Collection Medium), а один - в растворе PreservCyt™. Оба образца получали в процессе проведения одного и того же сеанса анализа. Для каждого из индивидуумов может быть поставлен диагноз исходя из анализа тонкослойного цервикального образца, приготовленного в растворе PreservCyt™. Из всех образцов, включенных в исследование настоящего изобретения, было выбрано 20 образцов, диагностированных как NILM, 20 образцов, диагностированных как LSIL, и 10 образов, диагностированных как HSIL. Для всех этих образцов уровень транскриптов p16INK4a и p14ARF определяли по уровню мРНК с помощью ОТ-ПЦР в соответствии с нижеследующим протоколом. Для проведения анализа клетки осаждали из растворов UCM и PreservCyt™ путем центрифугирования. Полученный осадок непосредственно использовали для получения РНК-препаратов. Этот осадок разводили и ресуспендировали в готовом буфере RLT. После добавления 70% этанола к гомогенизованному лизату суспензию смешивали путем пипетирования. Очистку и выделение РНК проводили на вращающихся колонках QIAamp-Spin в соответствии с инструкциями производителя.

Концентрацию РНК определяли фотометрически при 260 нм. Для реакции обратной транскрипции использовали от 100 нг до 500 нг РНК. ДНК подвергали деградации путем проведения нижеследующей реакции с ДНКазой:

17,0 мкл РНК (6-30 нг/мкл)

1,0 мкл ДНКазы I Amp Grade (1 единица/мкл)(Invitrogen)

2,0 мкл буфера для реакции с ДНКазой (10×)(Invitrogen)

Общий объем 20,0 мкл

Инкубирование осуществляли в течение 15 минут при 25°C и реакцию прекращали путем добавления 2 мкл 25 мМ EDTA, после чего реакционную смесь инкубировали в течение 10 минут при 65°C.

Синтез кДНК проводили с использованием полного объема гидролизата ДНКазы посредством реакции обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы Omniscript в присутствии РНКзина.

Эту реакцию осуществляли в течение 2 часов при 37°C, а затем в течение 5 минут при 93°C. После этого смесь хранили при 4°C. В результате получали раствор кДНК, готовый для применения в ПЦР TaqMan (соответствовал концентрации кДНК примерно 7-36 нг/5 мкл).

Для использования в ОТ-ПЦР 40 мкл реакционной кДНК-смеси разводили 30 мкл воды, не содержащей РНКазы, до объема 70 мкл. В этой реакции были использованы праймеры:

Прямой праймер для p16INK4a 5'-CGA ATA GTT ACG GTC GGA GG-3'
Обратный праймер для p16INK4a 5'-ACC AGC GTG TCC AGG AAG-3'
Прямой праймер для p14ARF 5'-CCG CCG CGA GTG AGG GTT-3'
Обратный праймер для p14ARF 5'-TGC CCA TCA TCA TGA CCT GGT CT-3'

В качестве контроля в ПЦР-реакциях для β-актина и GAPDH использовали следующие праймеры:

Прямой праймер (63) для β-актина 5'-CCT AAA AGC CAC CCC ACT TCT C-3'
Обратный праймер (64) для β-актина 5'-ATG CTA TCA CCT CCC CTG TGT G-3'
Прямой праймер для GAPDH 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'
Обратный праймер для GAPDH 5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'

Каждый праймер использовали в концентрации 300 нмоль. Реакционная смесь для ОТ-ПЦР содержала следующие компоненты:

12,5 мкл SYBR-Umix

0,25 мкл смеси праймеров

7,25 мкл воды, используемой в молекулярной биологии

5,0 мкл раствора кДНК

общий объем 25,0 мкл.

2-Стадийную ПЦР проводили в режиме реального времени при следующих условиях:

1-я стадия: 50°C, 2 мин; 95°C, 10 мин;

2-я стадия: 95°C, 15 сек; 60°C, 1 мин; 10 сек, 40 циклов.

Анализ результатов ОТ-ПЦР проводили путем оценки степени сверхэкспрессии транскриптов p16INK4a исходя из уровня транскриптов, обнаруженных в препаратах образцов, по сравнению с уровнем транскриптов, присутствующих в образцах нормальной ткани или клеток. Перед проведением анализа на сверхэкспрессию уровни p14ARF нормализовали по отношению к уровню генов “домашнего хозяйства”, определенному в каждом образце. Сверхэкспрессия, которая в 0-24 раза превышала экспрессию в нормальной ткани, рассматривалась как незначимая. И лишь в том случае, если уровни сверхэкспрессии p16INK4a и p14ARF были в 24 раза выше, то они рассматривались как значимо повышенные уровни транскриптов в данных образцах. При этом необходимо отметить, что эта схема оценки является лишь одним из нескольких в равной степени подходящих методов оценки. Каждому специалисту известно, каким образом результаты ОТ-ПЦР могут быть использованы для оценки уровней транскриптов и каким образом они коррелируют с клиническими параметрами образцов. Пороговое значение, упоминаемое в этом примере, приводится лишь в целях иллюстрации и может варьироваться в зависимости от условий. Величины, полученные из UCM-препарата одного образца и соответствующей пробы PreservCyt™, дали аналогичные результаты. Сравнение определенных уровней транскриптов с уровнями, соответствующими диагнозу, установленному путем проведения цитологического анализа, обнаруживало хорошую корреляцию между повышенными уровнями транскрипта и наличием цервикальных поражений, диагностированных исходя из цитологического анализа тонкослойных образцов. Эта корреляция отражена в нижеследующей таблице:

Таблица 6
Цитологический диагноз
Ген NILM LSIL HSIL
Уровень транскриптов p16INK4a, детектированный в ОТ-ПЦР [выраженный как степень увеличения уровня по сравнению с уровнями, обнаруживаемыми в нормальных образцах]
Увеличение в 0-24 раза p16INK4a 19 0 -
p14ARF 16 3 -
Увеличение в 24 раза p16INK4a 1 20 10
p14ARF 4 17 10

Данный эксперимент показал, что способ определения уровня транскриптов p16INK4a и p14ARF в лизированных цервикальных образцах может быть применен для установления диагноза цервикальных поражений и стадий, предшествующих этим поражениям. Протестированные растворы для консервации клеток также оказались подходящими для осуществления описанного способа. Уровни транскриптов обоих тестируемых генов могут быть использованы для более точного установления диагноза внутриэпителиальной неоплазии шейки матки, где p16INK4a давал несколько лучшие результаты, чем p14ARF.

Пример 4: Анализ на уровни транскрипта p16INK4a и p14ARF методом иммобилизации гибрида в образцах для цитологического анализа в растворе (LBC), полученных из мазков, взятых из ротовой полости и из мокроты, а также из цервикальных мазков

Каждый из 10 LBC-образцов в растворе PreservCyt™ или CytoLyt™, соответственно, полученных из цервикальных мазков, взятых у индивидуумов с диагностированным поражением HSIL, из образцов мокроты, взятых у индивидуумов с мелкоклеточным раком легких, и мазков, взятых из ротовой полости индивидуумов с раком ротовой полости, был использован для каждой из маркерных молекул, описанных в данном примере (всего 20 образцов для каждого ракового заболевания). Цервикальные образцы и образцы, взятые из ротовой полости, анализировали методом иммобилизации гибрида на присутствие hrHPV различных типов и транскриптов p16INK4a и p14ARF. Анализ на присутствие hrHPV различных типов проводили методом иммобилизации гибридов с использованием теста HybridCaptrue hc2, разработанного Digene Corp. Анализ методом иммобилизации гибрида на присутствие транскриптов указанных ингибиторов циклин-зависимой киназы проводили способом, описанным ниже.

(А) Лизис клеток

В настоящем примере количество LBC-образца зависело от содержания клеток в LBC-образце. Тонкослойный образец, взятый из каждой пробы, получали с использованием процессора CytycThinPrep™. Массу LKBC-образца определяли до и после получения тонкослойного образца. Поскольку процессор ThinPrep™ после прохождения каждого цикла обработки может обрабатывать только то количество образца, которое необходимо для достижения специфической клеточной плотности на фильтре, то потребляемый объем рассматривается как показатель относительной концентрации клеток в LBC-образце. В настоящем примере для проведения анализа методом иммобилизации гибрида использовали каждый из LBC-образцов, масса которого в 2 раза превышала массу, расходуемую процессором ThinPrep™ на приготовление тонкослойного образца. (LBC-образцы, содержание клеток в которых является слишком низким, исключали).

Для проведения анализа клетки осаждали из растворов CytoLyt™ и PreservCyt™ путем центрифугирования. Полученный осадок непосредственно использовали для получения РНК-препарата. Этот осадок разводили и ресуспендировали в готовом буфере RLT. После добавления 70% этанола к гомогенизованному лизату суспензию смешивали путем пипетирования. Очистку и выделение РНК проводили на вращающихся колонках QIAamp-Spin в соответствии с инструкциями производителя.

Для детектирования мРНК p16INK4a использовали смесь 40-мерных олигонуклеотидных ДНК-зондов, специфичных к p16INK4a и p14ARF. Наиболее подходящие зонды в данной смеси имели следующие последовательности p14ARF:

Для гарантии того, чтобы данные зонды распознавали только p14ARF-специфическую мРНК, предпочтительно, чтобы эти зонды располагались на стыке между экзоном 1β и экзоном 2 мРНК (для конкретных ПЦР-условий данная ситуация аналогична для p16INK4a и p14ARF соответственно; при этом пары праймеров должны быть выбраны так, чтобы они покрывали стык экзонов в амплификате). Аналогичным образом могут быть использованы любые другие зонды, специфически распознающие мРНК p14ARF. Зонды, описанные в настоящем примере, используются лишь в иллюстративных целях и не ограничивают объема настоящего изобретения. Аналогично, в описанном здесь способе может быть использована последовательность зондов, содержащая вышеуказанные последовательности или их фрагменты.

Подходящими последовательностями зондов для p16INK4a являются:

Аналогично ситуации с использованием зондов для p14ARF, зонды для p16INK4a, предпочтительно, должны быть расположены так, чтобы они перекрывались со стыком “экзон 1α-экзон 2”. Такое расположение дает гарантию того, что будет распознаваться только p16INK4a, а не какая-либо другая мРНК, транскрибированная из локуса INK4. Кроме того, следует отметить, что в данном случае комментарии, представленные для p14ARF-зондов, должны применяться с учетом соответствующих изменений (mutandis mutatis).

Смесь меченых зондов добавляли ко всему клеточному РНК-экстракту. Для осуществления гибридизации смесь инкубировали при 65°C в течение 30 минут.

(В) Осуществление ELISA

Для детектирования гибридов РНК-ДНК использовали микротитрационные планшеты, сенсибилизированные антителами против гибрида РНК/ДНК, поставляемыми Digene Corp. Раствор для гибридизации добавляли непосредственно в микротитрационные планшеты и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали в соответствии с инструкциями производителя. Детектирование проводили с использованием “второго” антитела против гибрида РНК/ДНК и детектирующих реагентов, поставляемых Digene Corp.

Анализ всех цервикальных образцов методом иммобилизации гибрида дал положительные результаты для p16INK4a. Этот результат соответствовал результату, полученному для всех цервикальных образцов, которые были положительными на hrHPV в анализе методом иммобилизации гибрида. Примерно половина всех раковых образцов, взятых из полости рта, была протестирована на сверхэкспрессию p16INK4a. Все образцы, положительные на p16INK4a, были протестированы на hrHPV с помощью hc2. При этом наблюдалась значимая корреляция между позитивным HPV-результатом и сверхэкспрессией p16INK4a в раковой опухоли полости рта. Для мелкоклеточного рака легких, р16 может быть детектирован как позитивный в 8 из 10 анализируемых случаев. Все результаты для p16INK4a, полученные в тесте методом иммобилизации гибрида, могут быть подтверждены с помощью иммуноцитохимического анализа тонкослойных образцов.

Для p14ARF результаты, полученные из цервикальных образцов, были сравнимы с результатами для p16INK4a. Для мелкоклеточного рака легких, только в двух из 10 анализируемых случаев был получен положительный результат на p14ARF в анализе, проводимом методом иммобилизации гибрида. Этот результат может быть подтвержден с помощью иммуноцитохимического анализа. В LBC-образцах, взятых из ротовой полости, p14ARF мог быть детектирован в 7 из 10 случаев, что соответствовало результатам иммуноцитохимического анализа.

Эти результаты показали, что данные детектирования ингибиторов циклин-зависимой киназы в анализе LBC-образцов, проводимом методом иммобилизации гибрида, могут быть использованы для установления диагноза некоторых раковых заболеваний. Эти результаты дают основание предположить, что указанный биохимический тест может быть использован как адъюнктивный или конъюнктивный тест для проведения цитологического анализа.

Пример 5: Иммунологический анализ на уровни белков p16INK4a , Her-2/Neu и p14ARF в цитологических образцах в растворе (LBC), взятых из мочи, мокроты, аспиратов, извлеченных тонкой иглой из молочной железы, и цервикальных мазков

Все 10 цервикальных мазков, цитологически классифицированных как HSIL, 10 образцов мокроты с цитологически диагностированным мелкоклеточным раком легких, 10 образцов мочи, взятых у индивидуумов с диагностированными опухолями мочевого пузыря, и 10 аспиратов, извлеченных тонкой иглой у индивидуумов с диагностированным DCIS, поставляемые в среде PreservCyt™, подвергали центрифугированию для выделения клеток, а затем эти клетки солюбилизировали в среде для лизиса. Затем их подвергали ELISA-детектированию на уровень экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы p16INK4a, p14ARF и Her-2/Neu в растворах, полученных из клеток, содержащихся в указанных мазках. ELISA-тест проводили, как описано ниже.

(А) Лизис клеток

Каждые 10 мл LBC-образцов центрифугировали для осаждения клеток. Клеточный осадок [TIME] разводили в 700 мкл буфера для лизиса mtm (2% Тритона Х-100, 0,4% ДСН, 0,6 мМ PMSF в PBS) путем смешивания и инкубирования в течение 10 минут при 80°C. Лизаты LBC-образцов центрифугировали при 4°C (15 минут при 28000 × g (16600 об/мин, в высокоскоростной центрифуге JEC Multi RF)). Супернатант переносили в чистую пробирку. Такой супернатант может храниться при -20°C.

(В) Осуществление ELISA

Сенсибилизация ELISA-планшетов

Для каждого белка приготавливали отдельные ELISA-планшеты, как описано ниже. Маточные растворы “первых” антител против p16INK4a, p14ARF и Her-2/Neu разводили в PBS с получением готового раствора для сенсибилизации.

В целях сенсибилизации ELISA-планшетов для клона p16INK4a использовали mtm Е6Н4. Для p14ARF использовали поликлональное антитело против p14ARF, поставляемое Calbiochem. Для Her-2/Neu использовали сенсибилизирующее поликлональное антитело, поставляемое DakoCytomation.

50 мкл раствора для сенсибилизации добавляли в каждую лунку ELISA-планшетов.

Для сенсибилизации планшеты инкубировали в течение ночи при 4°C.

Растворы для сенсибилизации удаляли из ELISA-планшетов, и эти планшеты промывали с помощью автоматического устройства для мойки ELISA-планшетов с использованием:

• 7 × 250 мкл промывочного буфера (0,1% твина 20 (об/об) в PBS),

после удаления остатков промывочного буфера в каждую лунку добавляли 300 мкл блокирующего буфера (2% BSA в PBS). Планшеты инкубировали в течение 1 часа на качалке при комнатной температуре.

Инкубирование с образцами

После удаления блокирующего буфера в каждую лунку добавляли 100 мкл образца клеток, подвергнутых лизису.

В целях калибровки в данном тесте были использованы различные концентрации рекомбинантных белков (0 пг/мл, 50 пг/мл, 100 пг/мл, 200 пг/мл, 400 пг/мл, 800 пг/мл).

Образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

Затем проводили промывку в автоматическом устройстве для мойки ELISA-планшетов с использованием:

• 7 × 250 мкл промывочного буфера. Остаточный буфер удаляли.

Инкубирование с детектирующим антителом

Рабочий раствор биотинилированных “вторых” антител против соответствующих белков получали путем разведения маточного раствора. Для p16INK4a использовали клон mtm D7D7, для p14ARF использовали моноклональное антитело, поставляемое Calbiochem, а для Her-2/Neu использовали моноклональное антитело, поставляемое DakoCytomation. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл рабочего раствора. После инкубирования в течение 1 часа при комнатной температуре раствор антитела удаляли и ELISA-планшеты промывали с помощью автоматического устройства для мойки ELISA-планшетов с использованием

• 7 × 250 мкл промывочного буфера.

Детектирование

Полимеры “стрептавидин-ПХ” (1 мг/мл) предварительно разводили 1:10 (4 мкл + 36 мкл буфера для инкубирования). Конечный раствор для инкубирования получали путем разведения 1:300 в буфере для инкубирования (0,1% BSA в PBS) до конечной концентрации 0,33 мкг/мл.

В каждую лунку добавляли 100 мкл полученного раствора и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

Затем буфер удаляли и планшеты 5 раз вручную промывали 200 мкл промывочного буфера на лунку.

Инкубирование субстрата

ТМВ-субстрат уравновешивали до 25°C в темноте в течение 1 часа.

В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата.

ELISA-планшеты инкубировали при 25°C в темноте в течение ровно 15 минут. Затем реакцию прекращали добавлением 80 мкл 2,5М H2SO4.

Через 5 минут после прекращения реакции определяли OD 450 нм. После оценки результатов снова определяли значение OD для каждого образца. Для каждого антитела определяли пороговое значение OD с учетом базальной величины.

Результаты ELISA-анализа сравнивали с диагностическими данными, полученными в цитологическом анализе образцов, взятых от тех же самых индивидуумов. Результаты этого эксперимента приводятся в таблице 7:

Таблица 7
Цервикальные образцы
Цитологический диагноз: 10 HSIL
Иммуноцитологическая оценка
p16INK4a пол. 10
отр. 0
p14ARF пол. 8
отр. 2
Her-2/Neu пол. 2
отр. 8
ELISA-оценка
p16INK4a пол. 10
отр. 0
p14ARF пол. 9
отр. 1
Her-2/Neu пол. 3
отр. 7
Образцы, взятые из мочевого пузыря
Цитологический диагноз: 10 карцином
Иммуноцитологическая оценка
p16INK4a пол. 0
отр. 10
p14ARF пол. 1
отр. 9
Her-2/Neu пол. 6
отр. 4
ELISA-оценка
p16INK4a пол. 0
отр. 10
p14ARF пол. 0
отр. 10
Her-2/Neu пол. 5
отр. 5
DCIS-образцы
Цитологический диагноз: 10 DCIS
Иммуноцитологическая оценка
p16INK4a пол. 0
отр. 10
p14ARF пол. 0
отр. 10
Her-2/Neu пол. 6
отр. 4
ELISA-оценка
p16INK4a пол. 0
отр. 10
p14ARF пол. 1
отр. 9
Her-2/Neu пол. 7
отр. 3

Было обнаружено, что для p16INK4a в 100% протестированных образцов наблюдалась хорошая корреляция между цитологически оцененной картиной окрашивания p16INK4a и p16INK4a-положительными результатами, полученными в анализе ELISA-формата с использованием солюбилизированных образцов PreservCyt™. Для p14ARF эта корреляция составляла 93%. Для Her-2/Neu корреляция между результатами иммуноцитохимического детектирования сверхэкспрессии и положительными результатами, полученными в анализе ELISA-формата, может составлять более чем 90%.

Результаты, представленные в вышеописанных примерах, показали, что биохимический анализ, осуществляемый с использованием солюбилизированных LBC-образцов, может быть проведен на тех же самых образцах, на которых проводился иммуноцитохимический анализ. Поскольку для биохимического анализа требуется только одна фракция LBC-образца, то он может быть проведен как дополнение к иммуноцитохимическому анализу.

Наблюдалась также хорошая корреляция между результатами иммуноцитохимических анализов и результатами ELISA-анализов. Это указывает на то, что способ настоящего изобретения может быть использован для современной диагностики различных клинически релевантных состояний, в которой цитологические анализы в растворе могут проводиться в качестве адъюнктивных или конъюнктивных тестов, либо, в некоторых случаях, они могут проводиться в качестве автономного диагностического теста.

Пример 6: Иммунохимический и ОТ-ПЦР-анализ на МСМ-5 и МСМ-2 на уровне мРНК/белка, проводимый на пробах мочи методом цитологического исследования в растворе

В настоящем примере использовали 20 LBC-образцов клеток мочи в CytoLyt™. ОТ-ПЦР проводили, как описано в примере 3. Анализ белков осуществляли в тесте методом детектирования полос, как описано в примере 2, и параллельно в тесте формата ELISA, как описано в примере 1. Экспериментальные процедуры осуществляли, как описано в указанных примерах.

Было показано, что МСМ-5 может быть легко детектирован в лизатах LBC-образцов мочи. Результаты, полученные с помощью биохимического неклеточного анализа на уровне белка, а также нуклеиновой кислоты, очень хорошо соответствуют результатам цитологического анализа. В цитологическом анализе иммуноцитологическое окрашивание для выявления белка МСМ-5 использовалось для более точного установления диагноза.

1. Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из оценки солюбилизированного физиологического образца, взятого у человека, где указанный способ включает стадии:
(a) взятия физиологического образца у человека,
(b) солюбилизацию указанного физиологического образца, взятого у человека, в среде для лизиса, и
(c) определение сверхэкспрессии маркерной молекулы для обнаружения неопластических заболеваний, причем указанную молекулу выбирают из:
i) ингибитора циклин-зависимой киназы p16INK4a;
ii) белка регуляции клеточного цикла р14ARF;
в солюбилизированном физиологическом образце путем сравнения уровня указанного ингибитора циклин-зависимой киназы p16INK4a или указанного белка регуляции клеточного цикла р14ARF в указанном солюбилизированном физиологическом образце, взятом у человека, с уровнем указанного ингибитора или белка, присутствующего в солюбилизированном физиологическом образце, взятом у здорового человека.

2. Способ по п.1, где указанные неопластические заболевания выбраны из группы, включающей (i) рак шейки матки или предшествующие ему поражения, (ii) рак дыхательных путей или предшествующие ему поражения.

3. Способ по п.1, где указанным физиологическим образцом, взятым у человека являются мазок, взятый тампоном, лаваж, цитологический мазок, аспират, биоптат, консервированный цитологический образец, LBC-образец, гистологический образец, фиксированный клеточный препарат, фиксированный тканевый препарат, физиологическая жидкость, секрет, желудочно-кишечный секрет, кровь, мокрота, моча, кал, цереброспинальная жидкость, желчь, лимфа или костный мозг.

4. Способ по любому из пп.1-3, где указанный физиологический образец, взятый у человека, солюбилизируют:
a. сразу после получения образца,
b. после хранения и/или переноса в буфер для хранения, или
с. после внесения в буфер для переноса.

5. Способ по п.1, где определяют уровень двух маркерных молекул, включающих:
i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INK4a;
ii) белок регуляции клеточного цикла p14AKF.

6. Способ по п.5, где детектирование маркерных молекул осуществляют с использованием, по крайней мере, одного зонда, специфичного к детектируемым молекулам.

7. Способ по п.6, где указанный зонд является детектируемо меченым.

8. Способ по п.7, где указанная метка выбрана из группы, состоящей из радиоизотопа, биолюминесцентного соединения, хемилюминесцентного соединения, электрохемилюминесцентного соединения, флуоресцентного соединения, хелатного металлокомплекса, фермента или биологически соответствующей связывающей структуры.

9. Способ по п.6, где указанным зондом является белок и/или нуклеиновая кислота.

10. Способ по п.9, где, по крайней мере, одним зондом является антитело, фрагмент антитела, миниантитело или пептидомиметик, содержащий антигенсвязывающий эпитоп.

11. Способ по п.9, где, по крайней мере, одним зондом является нуклеиновая кислота, специфически гибридизующаяся с маркерной молекулой, выбранной из:
i) ингибитора циклин-зависимой киназы p16INH4a и
ii) белка регуляции клеточного цикла p14ARF.

12. Способ по п.11, который предусматривает проведение реакции, выбранной из группы, включающей реакцию гибридизации in situ и реакцию амплификации нуклеиновой кислоты.

13. Способ по п.12, где указанной реакцией амплификации нуклеиновой кислоты является ПЦР, NASBA или ЛЦР.

14. Способ по п.1, где уровень маркерных молекул, выбранных из группы, включающей: i) ингибитор циклин-зависимой киназы, p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF в физиологическом образце, взятом из шейки матки здоровой женщины, получают как предварительно определенную величину, которая задает пороговое значение для проведения процедуры детектирования.

15. Способ по п.14, где уровень маркерных молекул, выбранных из группы, включающей: i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF в образце, взятом из шейки матки здоровой женщины, определяют из стандартизированного раствора образца или из репрезентативного числа образцов, взятых из шейки матки здоровой женщины.

16. Способ по п.14, где определение маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей: i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INK4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF в образце, взятом из шейки матки здоровой женщины, осуществляют:
а. во время проведения процедуры детектирования;
b. в процессе калибровки системы детектирования;
с. один раз для каждой партии детектирующих реагентов, или
d. исходя из стандартной величины, используемой в способе детектирования.

17. Устройство для осуществления способа по любому из пп.1-16, включающее только зонды одной специфичности, фиксированные на твердой фазе, где указанные зонды одной специфичности являются специфичными к маркерной молекуле, выбранной из группы, включающей
i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, и предназначенное для детектирования указанной маркерной молекулы в солюбилизированном образце.

18. Устройство для диагностики in vitro по п.17, где указанным зондом является антитело, фрагмент антитела, миниантитело или пептидомиметик, содержащий антигенсвязывающий эпитоп, или нуклеиновая кислота.

19. Устройство для диагностики in vitro по п.17 или 18, которое выбрано из группы, состоящей из:
а. ELISA-устройства, включающего антитела, их фрагменты или антигенсвязывающие агенты, направленные против маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INK4a а и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, фиксированные на ELISA-планшетах, ELISA-полосах или ELISA-лунках;
b. устройства для тестирования методом боковых потоков, включающего антитела, их фрагменты или антигенсвязывающие агенты, направленные против маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, фиксированные на тест-полосах, коллоидных золотых частицах или латексных частицах;
с. устройства для анализа проточным методом, включающего антитела, их фрагменты или антигенсвязывающие агенты, направленные против маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, фиксированные на пористой мембране или на поверхности капилляров;
d. устройства для анализа методом латекс-агглютинации, включающего антитела, их фрагменты или антигенсвязывающие агенты, направленные против маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INK4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, фиксированные на латексных частицах;
е. устройства для иммуноанализа, включающего антитела, их фрагменты или антигенсвязывающие агенты, направленные против маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, фиксированные на сферах или мембранах;
f. устройства для иммуноанализа, включающего антитела, их фрагменты или антигенсвязывающие агенты, направленные против маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, фиксированные на микросферах; и
g. устройства для детектирования нуклеиновых кислот, включающего зонды, специфически гибридизующиеся с генным продуктом маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, фиксированные на твердой фазе.

20. Устройство для осуществления способа по любому из пп.1-16, предназначенное для определения уровня маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, и содержащее зонд, выбранный из группы, включающей антитело, фрагмент антитела, миниантитело или пептидомиметик, содержащий антигенсвязывающий эпитоп и нуклеиновую кислоту, специфичную к маркерной молекуле, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF,а также содержащее среду для лизиса, предназначенную для солюбилизации физиологического образца.

21. Устройство для диагностики in vitro по п.20, где указанная среда для лизиса содержит, по крайней мере, одну композицию, выбранную из группы, состоящей из хаотропных агентов, анионогенных детергентов, катионогенных детергентов, неионогенных детергентов и амфотерных детергентов, и щелочные композиции.

22. Устройство для диагностики in vitro no п.20 или 21, где указанная среда для лизиса содержит, по крайней мере, одну композицию, выбранную из группы, состоящей из ингибитора протеиназы, ингибитора ДНКазы и ингибитора РНКазы.

23. Устройство для диагностики in vitro по п.22, где указанный ингибитор протеиназы выбран из группы, состоящей из ингибиторов сериновых протеиназ, ингибиторов цистеиновых протеиназ, ингибиторов аспарагиновых протеиназ, ингибиторов металлопротеиназ, ингибиторов кислотных протеиназ, ингибиторов нейтральных протеиназ и ингибиторов щелочных протеиназ.

24. Устройство для диагностики in vitro no п.20, где указанная среда для лизиса содержит, по крайней мере, один неионогенный детергент и, по крайней мере, один ингибитор протеиназы.

25. Устройство для диагностики in vitro по п.24, где указанная среда для лизиса содержит тритон Х-100 и, по крайней мере, один ингибитор сериновых протеиназ.

26. Устройство для диагностики in vitro no п.20, которое дополнительно включает, по крайней мере, одну маркерную молекулу для осуществления позитивной контрольной реакции, а также реагенты и буферы, обычно используемые для проведения реакции детектирования.

27. Устройство для диагностики in vitro по п.26, которое дополнительно включает рекомбинантный белок, выбранный из группы, включающей i) белок-ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, его фрагменты или пептиды, происходящие от указанного белка, в качестве маркерных молекул для осуществления позитивной контрольной реакции.

28. Устройство для анализа методом иммобилизации гибрида, представляющее собой устройство для осуществления способа по любому из пп.1-16, где указанное устройство включает нуклеиновые кислоты, комплементарные или обратно комплементарные одной или нескольким нуклеиновым кислотам ингибитора циклин-зависимой киназы, где указанный ингибитор циклин-зависимой киназы выбран из группы, состоящей из p16INH4a и р14ARF, и предназначено для детектирования сверхэкспрессии указанного одного или нескольких ингибиторов циклин-зависимой киназы в солюбилизированном физиологическом образце.

29. Применение твердой фазы, на которой фиксированы или к которой присоединены антитела, их фрагменты или антигенсвязывающие агенты, направленные против маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF, в целях изготовления устройства для осуществления способа по любому из пп.1-16, предназначенного для определения уровней маркерной молекулы, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF в солюбилизированном образце, взятом у человека, где указанное устройство для диагностики in vitro включает только зонды одной специфичности, фиксированные на твердой фазе, где указанные зонды одной специфичности являются специфичными к маркерной молекуле, выбранной из группы, включающей i) ингибитор циклин-зависимой киназы p16INH4a и ii) белок регуляции клеточного цикла р14ARF.

30. Применение по п.29, где указанная твердая фаза выбрана из группы, включающей пористые мембраны, капилляры, мембраны, гранулы, плоские поверхности, сферы, микросферы, наносферы, коллоидные золотые частицы, латексные частицы и коллоиды.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии. .
Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования развития тяжелого геморрагического синдрома у больных с впервые выявленным острым промиелоцитарным лейкозом.

Изобретение относится к медицине, точнее к диагностике, а именно к способам исследования биологического материала. .

Изобретение относится к области медицины и касается белков, относящихся к семейству Bcl-2, их фрагментов, а также к их применению для пациентов со злокачественной опухолью.

Изобретение относится к диагностике гепатоцеллюлярной карциномы. .

Изобретение относится к области медицины и касается композиций и способов для лечения и диагностики рака, в особенности, рака легких. .

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкоурологии, и может быть использовано при диагностике и лечении пациентов, страдающих поверхностным раком мочевого пузыря.

Изобретение относится к области медицины, а именно к патоморфологии и дерматоонкологии. .

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики in vitro заболевания печени

Изобретение относится к области медицины, а именно к маммологии, и касается способа выявления группы риска генетических мутаций и пролиферации у пациенток с доброкачественными узловыми образованиями молочной железы, в которой может развиться рак

Изобретение относится к биотехнологии

Изобретение относится к области медицины и касается улучшенных способов иммуноанализа для выявления болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию у млекопитающего

Изобретение относится к медицине и касается способа определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, путем определения в биологическом образце сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и онкоэндокринологии, и касается способа оценки эстрогенозависимости высокодифференцированного рака щитовидной железы

Изобретение относится к медицине и касается способа определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования

Изобретение относится к области иммунологической диагностики

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения хронического гломерулонефрита на протяжении всей жизни человека
Наверх