Способ определения биологической (антимикробной) активности дефенсинов и их производных

Настоящее изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен способ определения антимикробной активности дефенсинов и их производных. В качестве тест штамма в данном способе используется штамм Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9»). Изобретение позволяет расширить спектр штаммов микроорганизмов для определения биологической (антимикробной) активности дефенсинов и их производных. 2 ил.

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается применения штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») в качестве тест-штамма для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов и их производных).

Известно использование различных штаммов микроорганизмов для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов) (Lehrer R.I., Rosenman M., Harwig S.S., Jackson R., Eisenhauer P. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides. J Immunol Methods. 1991 Mar 21; 137 (2): 167-173). Недостатком данного метода является длительность исследования.

Известно использование люминесцирующих бактерий Pseudomonas aeruginosa H1001 (fliC:luxCDABE) для тестирования активности антимикробных катионных пептидов (Hilpert К, Hancock RE. Use of luminescent bacteria for rapid screening and characterization of short cationic antimicrobial peptides synthesized on cellulose using peptide array technology. Nat Protoc. 2007; 2 (7): 1652-1660).

Известно использование штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») для определения биотоксичности питьевых минеральных вод (заявка на изобретение RU 2007129999, опубликовано 27.02.2009), бактерицидной активности сыворотки крови (RU 2247987, 10.03.2005), токсичности воды («Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста «Эколюм». Методические рекомендации. МР 11-1/133-09. Утверждены Минздравом РФ 08.06.2000).

Новым в заявляемом изобретении является применение штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») в качестве тест-штамма для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов и их производных).

Техническим результатом изобретения является расширение спектра люминесцирующих тест-штаммов бактерий для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов и их производных).

Пример осуществления изобретения.

Для проведения исследования использовали тромбодефенсины, полученные известным способом (Dankert, J. (1988). Role of platelets in early pathogenesis of viridans group streptococcal endocarditis: a study on thrombodefensins. PhD thesis, University of Groningen, Groningen, The Netherlands). Реакционную систему формировали путем внесения 0,1 мл суспензии люминесцирующих бактерий в 0,9 мл раствора тромбодефенсинов; в качестве контроля использовали те же количества бактерий, вносимые в аналогичный объем растворителя. Полученные опытную и контрольную смеси инкубировали в течение 10 минут при 30°С в термостатируемой измерительной ячейке двухканального биохемилюминометра 8802М2К (СКТБ «Наука», Красноярск). Регистрацию интенсивности свечения осуществляли в непрерывном режиме, осуществляя расчет эффектов тромбодефенсинов на интенсивность бактериальной биолюминесценции по формуле: , где - сумма импульсов, испускаемых в контроле на n-й секунде эксперимента, - сумма импульсов, испускаемых в опыте на n-й секунде эксперимента.

Для оценки бактерицидного эффекта тромбодефенсинов в отношении используемых клеток-мишеней из опытных и контрольных проб по истечении 10 минут контакта отбирали аликвоты по 10 мкл, которые высевали на чашки с ВСР-агаром (Bio-Merieux, Франция) с добавлением ампициллина в конечной концентрации 200 мкг/мл (селективный маркер для использованного штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9»)). Учет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) проводили после дополнительной 18-24 часовой инкубации при 37°С. Расчет величин IC50 и LD50 осуществлен с использованием специализированной программы «LD50 (ver. 0.2)» (НПП «Наука Плюс»). Установлен дозозависимый отклик биолюминесценции рекомбинантного штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») на воздействие тромбодефенсинов (фиг.1).

Расчет величин IC50, соответствующих пятидесятипроцентной ингибиции интенсивности биолюминесценции от исходного уровня (фиг.2) позволил констатировать высокую чувствительность рекомбинантного штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») к воздействию тромбодефенсинов.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет расширить спектр штаммов микроорганизмов для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов и их производных).

Способ определения биологической (антимикробной) активности дефенсинов и их производных, включающий внесение в реакционную смесь суспензии люминесцирующих бактерий и раствора дефенсинов, инкубацию полученной смеси и регистрацию интенсивности свечения реакционной смеси по сравнению с контрольной смесью, не содержащей дефенсинов, отличающийся тем, что в качестве тест штамма используют штамм Escherichia coli К 12 TG1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для разложения токсичных органических соединений, а именно для разложения фенола. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза. .
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу 11 -гидроксилирования 4-3-кетостероидов с помощью биомассы мицелия штамма Curvularia lunata ВКПМ F-988. .
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к культивированию продуцента липазы. .
Изобретение относится к микробиологии и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты. .

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается штамма бактерий, продуцирующего новую сайт-специфическую эндонуклеазу KroI. .
Изобретение относится к выявлению госпитальных штаммов микроорганизмов в лечебно-профилактических учреждениях и проведению соответствующих противоэпидемических мероприятий в них.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается подбора высокоактивных антибактериальных средств для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к изучению инфекционных заболеваний, и может быть использовано для моделирования стадийности течения инфекции, прогнозирования клинического исхода и оценки схем лечения в эксперименте.
Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для диагностики энтерококков. .

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к оптическим способам определения количества таких микробиологических объектов, как бактерийные клетки, грибы, дрожжи в процессе их культивирования, и может быть использовано для диагностических целей в медицине, а также контроле биотехнологических процессов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательской и практической работе для бактериологической диагностики ряда условно патогенных микроорганизмов.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ детекции живых клеток микроорганизма путем дифференцирования живых клеток от мертвых клеток или поврежденных клеток в тестируемом образце.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской микробиологии. .

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается применения штамма Escherichia coli К12 TG 1 с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 в качестве тест-штамма для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов

Наверх