Стереоселективный способ получения гамма-лактонов
Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает селекцию подходящего микроорганизма, выбранного из микроорганизмов, позволяющих осуществить гидроксилирование субстрата в положении С4; культивирование указанного микроорганизма в подходящей питательной среде, не содержащей пептонов, причем получаемая культура клеток образует «зернистый» мицелий, состоящий из септированных гифов без конидиоспор и содержащий вздутия, заполненные включениями; причем указанному культивированию необязательно предшествует стадия предварительного культивирования указанного микроорганизма; добавление субстрата, способного к конверсии в гамма-лактон формулы (I); превращение субстрата в гамма-лактон формулы (I), выделение образовавшегося гамма-лактона. Изобретение позволяет повысить эффективность получения гамма-лактона формулы (I). 6 з.п. ф-лы.
Объектом настоящего изобретения является способ стереоселективного синтеза гамма-лактонов, в частности природных гамма-лактонов.
Потребительское общество все больше стремится потреблять «природные» продукты, поэтому производители, использующие пахучие соединения или одоранты, сосредоточивают свои усилия на разработке «природных» ароматизирующих веществ и препаратов. К их числу могут быть отнесены только вещества, идентифицированные в природе; поэтому их получают либо из растений, либо из микроорганизмов; последние находят все большее применение, и в настоящее время биотехнологические способы позволяют синтезировать природные молекулы при небольших затратах. Такими молекулами являются гамма-лактоны.
Гамма-лактоны являются ароматическими молекулами, обеспечивающими запах и вкус многочисленных природных продуктов. Например, гамма-гептолактон известен своим запахом и вкусом лесного ореха или карамели. Гамма-ноналактон имеет консистентный аромат сливок или кокосового ореха; гамма-декалактон и гамма-ундекалактон имеют запах и вкус персика или абрикоса.
Гамма-лактоны существуют в естественном состоянии в двух энантиоморфных формах (R) и (S), причем энантиомер (R) является доминирующим.
Гамма-лактоны могут быть получены синтетическим путем или путем биосинтеза при помощи микроорганизмов. Так, в документе ЕР 371568 описан способ получения гамма-лактонов при помощи микроорганизма, разрешенного для производства пищевых продуктов, такого как Saccharomyces cerevisiae, Debaromyces hansenii или Candida boidinii.
В US 5112903 указано, что гамма-лактон и, в частности, его оптические изомеры (R) и (S) можно использовать для создания запахов и вкуса сливочного масла, и описан способ для повышения потребительского аромата или вкуса вещества путем добавления существенных количеств оптически активных гамма-окталактонов и смеси различных соединений, которые являются субпродуктами описанного способа. Согласно способу, описанному в US 5112803, на основе каприловой кислоты путем биосинтеза при помощи штаммов бактерий рода Syncephalastratum sp. или Mortierella sp. можно получать оба изомера (R) и (S) гамма-окталактона; однако этот способ не является энантиоселективным.
В пищевой промышленности и в парфюмерной промышленности гамма-лактоны играют важную роль, и получение продуктов, обладающих разными органолептическими свойствами, стало важной задачей в промышленном масштабе.
Известно, что хиральность летучих молекул может быть причиной разных восприятий на уровне обоняния и что не все оптические изомеры гамма-лактонов обладают одними и теми же органолептическими свойствами; вследствие этого возрастает значение получения отдельного оптического изомера гамма-лактона, в частности, если это получение осуществляют согласно способу, по меньшей мере, в такой же мере эффективному и даже более эффективному, чем известные способы, и при конкурентных материальных затратах.
Насколько известно заявителю, в настоящее время не существует стереоселективного способа, позволяющего получать напрямую энантиомер природных гамма-лактонов. Известные способы позволяют получать смеси энантиомеров, при этом выделение необходимого энантиомера, как правило, осуществляют при помощи хроматографии замещенного циклодекстрина в газообразной фазе на капиллярной колонке или после дериватизации.
В связи с этим задачей настоящего изобретения является создание эффективного, экономичного и стереослективного способа синтеза гамма-лактонов биологическим путем.
Изобретение относится как к синтезу (R)-гамма-лактона, так и к синтезу (S)-гамма-лактона. В рамках настоящего изобретения (R) и (S) обозначают асимметричную конфигурацию углерода в позиции №4 гамма-лактона.
Предпочтительными гамма-лактонами для получения синтезом при помощи способа в соответствии с настоящим изобретением являются гамма-лактоны С5-С20 согласно изобретению, отвечающие формуле (I):
в которой лактоновое кольцо может нести непредельную связь между углеродом №2 и углеродом №3 и в которой R1 является С1-16-алкенильной группой, С1-16-алкинильной группой или C1-16-алкильной группой, которые могут иметь один или несколько замещенных атомов углерода за пределами позиции №5. Под замещенным алкенилом или алкинилом или алкилом следует понимать алкенил или алкинил или алкил, по меньшей мере, один атом которого несет, по меньшей мере, одну замещающую группу. Под замещающей группой следует понимать, в частности, гидроксильную группу, кетогруппу, тиогруппу, алкильную группу или алкенильную группу.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ стереоселективного получения гамма-лактона, отличающийся тем, что при помощи микроорганизмов осуществляют биосинтез гамма-лактона, в частности гамма-лактона вышеуказанной общей формулы (I), в которой лактоновое кольцо может нести непредельную связь между углеродом №2 и углеродом №3 и предпочтительно является насыщенным, и в которой R1 является С1-16-алкенильной группой, С1-16-алкинильной группой или C1-16-алкильной группой, возможно замещенной, при этом указанный биосинтез осуществляют на основе, по меньшей мере, одного субстрата, предпочтительно жирной кислоты при помощи культуры микроорганизмов штамма, выбранного из штаммов, обеспечивающих стереоселективное С4-гидроксилирование субстрата.
Объектом настоящего изобретения является получение гамма-лактонов биологическим путем и, в частности, стереоселективный биосинтез каждого из оптических изомеров (R) или (S) гамма-лактонов на основе, по меньшей мере, одного субстрата при помощи культуры микроорганизмов соответствующего штамма.
Это получение содержит следующие этапы:
a) селекция соответствующего штамма,
b) культивирование указанного штамма в соответствующей питательной среде, при этом перед указанным культивированием, в случае необходимости, осуществляют этап предварительного культивирования штамма,
c) добавление субстрата, который может быть трансформирован в гамма-лактон,
d) биоконверсия субстрата в гамма-лактон,
e) выделение полученного гамма-лактона.
Соответствующими штаммами микроорганизмов, отбираемыми на этапе а) для биосинтеза гамма-лактона в соответствии с настоящим изобретением, являются штаммы, обеспечивающие специфическое гидроксилирование субстрата. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения соответствующими штаммами микроорганизмов, отбираемыми на этапе а) для биосинтеза гамма-лактона в соответствии с настоящим изобретением, являются штаммы, обеспечивающие специфическое стереоселективное С4-гидроксилирование субстрата. Таким образом, согласно изобретению получают гамма-лактоны, в которых углерод С4 имеет конфигурацию (R) или конфигурацию (S).
Если получаемый в результате биосинтеза продукт предназначен для пищевой промышленности, предпочтительными, естественно, являются штаммы пищевого назначения. Среди штаммов, обеспечивающих стереоселективное гидроксилирование, можно указать, в частности, штаммы рода Aspergillus sp., Penicilinnum sp., Mucor sp. Поскольку все эти штаммы принадлежат к классу 1 микроорганизмов и некоторые из них являются пищевыми, их применение не создает особых проблем как при промышленном производстве лактонов, так и для их возможного применения в индустрии питания. Согласно частному варианту осуществления настоящего изобретения используемым штаммом является штамм рода Aspergillus sp., предпочтительно Aspergillus oryzae, из которых можно упомянуть следующие коллекционные штаммы:
Aspergillus oryzae DSMZ 1861, Aspergillus oryzae DSMZ 1864, Aspergillus oryzae DSMZ 1147, Aspergillus oryzae DSMZ 633303, Aspergillus oryzae CBS 570.65, Aspergillus oryzae CBS 819.72, Aspergillus oryzae CBS 110.27, Aspergillus oryzae VMF 88093.
Среди них предпочтительными являются Aspergillus oryzae DSMZ 1861 и Aspergillus oryzae CBS 110.27.
Согласно другому частному варианту осуществления используемым штаммом является штамм рода Mortierella sp., для которого можно упомянуть следующие коллекционные виды:
Mortierella isabellina DSMZ 1414, Mortierella isabellina CBS 100559, Mortierella isabellina CBS 221.29, Mortierella isabellina CBS 194.28, Mortierella isabellina CBS 208.32, Mortierella isabellina CBS 224.35, Mortierella isabellina CBS 560.63, Mortierella isabellina CBS 167.80, Mortierella isabellina CBS 493.83. Mortierella isabellina CBS 309.93, Mortierella isabellina CBS 250.95, Mortierella isabellina CBS 109075, Mortierella ramanniana CBS 112.08, Mortierella ramanniana CBS 219.47, Mortierella ramanniana CBS 243.58, Mortierella ramanniana CBS 478.63, Mortierella ramanniana CBS 852.72, Mortierella ramanniana CBS 366.95, Mortierella ramanniana CBS 101226.
Действительно, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что применение штамма рода Aspergillus sp. приводит к селективному получению (R)-гамма-лактона и что применение штамма рода Mortierella sp. приводит к селективному получению (S)-гаммa-лактона.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения исключаются из изобретения штаммы Yarrowia lipolytica, так как они не способны вызвать гидроксилирования по С4. Предпочтительно все штаммы, которые не могут специфично и стереоселективно производить С4-гидроксилирование, исключаются из настоящего изобретения.
Не связывая себя какой-либо теорией, можно предусмотреть, чтобы условия культивирования штаммов могли играть роль в указанной стереоселективности, а также в количественном аспекте биоконверсии.
Культивирование, осуществляемое на этапе b) способа в соответствии с настоящим изобретением содержит получение культуры, предпочтительно полуконцентрированной культуры штаммов, например, путем клеточной амплификации, в соответствующей питательной среде. Этому культивированию может предшествовать предварительное культивирование штаммов в первой питательной среде, более адаптированной для первых этапов размножения штамма.
Условия культивирования, применяемые в стереоселективном способе в соответствии с настоящим изобретением должны быть такими, чтобы они могли привести к получению мицелия, который содержит вздутия, заполненные включениями (в частности, пероксисомами). Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, полученная клеточная культура содержит мицелий в виде «компота», состоящий из содержащих перегородки нитей без конидиоспор и содержащий набухшие структуры, заполненные этими включениями (в частности, пероксисомами). Действительно, условия культивирования должны быть специально адаптированными, чтобы избежать спорообразования в мицелии. Кроме того, авторы изобретения смогли убедиться, что физиологическое состояние мицелия, полученного, в частности, за счет применений условий культивирования, описанных в настоящей заявке (мицелий с перегородками, содержащий вздутия и утолщения, заполненные включениями, в частности пероксисомами), может иметь большое влияние на производительность реакции и может позволить получить больший выход по сравнению с известными аналогами. Физиологическое состояние мицелия может также влиять на стереоселективность реакции.
Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, этап b) способа в соответствии с настоящим изобретением является этапом культивирования штамма в соответствующей питательной среде, позволяющей получить мицелий с перегородками, содержащий вздутия и утолщения, заполненные включениями, в частности пероксисомами. Предпочтительно питательная среда, используемая в соответствии с изобретением, не содержит пептона. Предпочтительно питательная среда в соответствии с настоящим изобретением содержит солод и/или дрожжевой экстракт. Согласно предпочтительному варианту осуществления, мицелий, используемый на этапе с), является концентрированным. Предпочтительно концентрация мицелия, используемого для этапа с), находится в пределах от 5 до 15 г/л, предпочтительно от 6 до 12 г/л и еще предпочтительнее - от 7 до 10 г/л.
Было также особо отмечено, что получению (S)-гамма-лактона при помощи штамма Mortierella во многом благоприятствует, как в плане стереоселективности, так и в плане выхода, применение описанного выше набухшего мицелия, заполненного включениями; действительно, применение такого мицелия может обеспечить получение продукта реакции, имеющего большую вращательную способность по абсолютной величине, чем известные аналоги; с другой стороны, выход, достигаемый способом в соответствии с настоящим изобретением и, в частности, путем применения описанного выше набухшего мицелия, заполненного включениями, позволяет достигать более высокой производительности по сравнению с известными решениями.
Этап с) способа состоит в добавлении субстрата к клеточной культуре. Согласно изобретению биологический синтез гамма-лактона позволяет использовать любой соответствующий субстрат.
Под соответствующим субстратом в рамках настоящего изобретения следует понимать ненасыщенные или насыщенные линейные жирные кислоты, содержащие, по меньшей мере, 5 атомов углерода, предпочтительно от 5 до 20 атомов углерода, в случае необходимости - разветвленные или замещенные за пределами позиции №5, и сложные эфиры указанных жирных кислот; предпочтительными являются метиловые или этиловые эфиры.
Среди предпочтительных субстратов можно указать: валериановую кислоту, которая является кислотой с С5, позволяющую получить гамма-валеролактон; капроновую кислоту, которая является кислотой с С6, позволяющую получить гамма-гексалактон; энантовую кислоту, являющуюся кислотой с С7 и позволяющую получить гамма-гепталактон; каприловую кислоту, которая является кислотой с C8 и позволяет получить гамма-окаталактон; пеларгоновую кислоту, которая является кислотой с С9 и позволяет получить гамма-ноналактон; каприновую кислоту, которая является кислотой с С10 и позволяет получить гамма-декалактон; ундекановую кислоту, которая является кислотой с С11 и позволяет получить гамма-ундекалактон; ундециленовую кислоту, которая является кислотой с С11 и позволяет получить ундеценолактон; лауриновую кислоту, которая является кислотой с С12 и позволяет получить гамма-додекалактон; миристиновую кислоту, которая является кислотой с С14 и позволяет получить гамма-тетрадекалактон; пальмитиновую кислоту, которая является кислотой с C16 и позволяет получить гамма-гексадекалактон; пальмитолеиновую кислоту, которая является кислотой с C16 и позволяет получить гамма-гексадеценолактон; стеариновую кислоту, которая является ненасыщенной кислотой с С18 и позволяет получить гамма-октадекалактон; олеиновую кислоту, которая является кислотой с C18 и позволяет получить гамма-октадеценолактон; линолевую кислоту, которая является кислотой с С18 и позволяет получить гамма-октадекадиенолактон; линоленовую кислоту, которая является кислотой с C18 и позволяет получить гамма-октадекатриенолактон; эйкозановую кислоту, которая является кислотой с C20 и позволяет получить гамма-эйкозанолактон, и их сложные эфиры, предпочтительно их этиловые или метиловые эфиры.
Жирные кислоты с C13, C15, C17, и C19 и их этиловые или метиловые эфиры, хотя и реже, также могут подвергаться окислению и приводить к получению соответственно гамма-лактонов с C13, C15, С17, и C19.
Само собой разумеется, что субстратом может быть любой соответствующий субстрат или смесь разных соответствующих субстратов, в частности смесь определенной кислоты и одного или нескольких ее сложных эфиров.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения субстрат добавляют к мицелию методом дозировки или дозированной подачи. Согласно предпочтительному варианту осуществления субстрат добавляют в смеси с вспомогательным веществом, например маслом, в частности любым классическим пищевым маслом, таким как соевое, кукурузное, подсолнечное или другое масло, или синтетические триглицериды жирных кислот с короткими цепочками, такие как миглиоль, предпочтительно подсолнечное масло, гидрогенированное или обогащенное олеиновой кислотой перед введением в контакт с мицелием. Присутствие вспомогательного вещества позволяет, в частности, значительно снизить коррозийное или токсическое действие субстрата. Согласно варианту осуществления изобретения синтез в соответствии с настоящим изобретением с применением штамма Mortierela isabellina осуществляют в среде, не содержащей минерального масла. Предпочтительно субстрат добавляют в концентрациях от 0,3 до 2,5 г/л/ч. Предпочтительно количество масла, предпочтительно растительного масла, смешиваемого с субстратом, составляет от 100 до 500 г/л, предпочтительно от 150 до 300 г/л.
В среду одновременно с субстратом добавляют также источник сахара, предпочтительно источник глюкозы, чтобы обеспечить энергетические ресурсы клеток. Предпочтительно концентрация добавляемой глюкозы находится в пределах от 0,3 до 0,4 г/л/ч.
В зависимости от потребностей во время добавления субстрата и в течение всего последующего цикла биоконверсии можно производить регулирование рН путем добавления любого соответствующего основания. Предпочтительно рН находится в пределах от 4,5 до 8,5, предпочтительно от 5,5 до 8 и еще предпочтительнее - от 6 до 7,5.
Предпочтительно в ходе биоконверсии температуру поддерживают в пределах от 27 до 30°С. Продолжительность биоконверсии может составлять от 30 до 120 часов, предпочтительно от 48 до 72 часов.
Биоконверсия субстрата в гамма-лактон, осуществляемая на этапе d) способа в соответствии с настоящим изобретением, является этапом лактонизации, которому предшествует реакция С4-гидроксилирования субстрата, производимая штаммом. Для осуществления этого гидроксилирования требуется наличие источника кислорода. Этим источником кислорода предпочтительно является газ, содержащий кислород, предпочтительно воздух или газ. Газ растворяется в относительно большом количестве в реакционной среде.
Согласно предпочтительному варианту осуществления и, как известно из предшествующего уровня техники для контроля за образованием пены во время биоконверсии используют противовспенивающие средства, в частности силиконовые масла или полимеры полиэтиленгликоля, этерифицированные жирными кислотами.
После осуществления биоконверсии, то есть специфического и стереоселективного гидроксилирования по С4 следует этап с) способа, который состоит в выделении гамма-лактона путем экстрагирования, при этом экстрагирование гамма-лактона осуществляют при помощи любого соответствующего средства. Предпочтительно экстрагирование гама-лактона осуществляют путем гидродистилляции с возможной последующей этерификацией, предназначенной для последующего удаления не прореагировавшего субстрата.
В альтернативном варианте экстрагирование гамма-лактона осуществляют путем экстрагирования в растворителе после отверждения среды.
Согласно варианту изобретения этап е) способа не осуществляют и вместо него осуществляют этап е'), во время которого способ продолжают до конца этапа d) путем восстановления in situ полученного гамма-лактона перед экстрагированием. Этап е') позволяет получить более насыщенный (R)- или (S)-гамма-лактон в зависимости от стереохимии гамма-лактона, полученного на этапе d).
Согласно первому варианту осуществления восстановление можно осуществлять до получения насыщенного лактона. Согласно второму варианту осуществления восстановление можно остановить для получения гамма-лактона, боковая цепочка которого несет меньше непредельности, чем цепочка, полученная в результате биоконверсии на этапе d). Согласно этому второму варианту осуществления способ в соответствии с настоящим изобретением продолжают по завершении этапа d), останавливая регулирование рН ферментера и добавляя в реактор активные сухие дрожжи, которыми могут быть пекарские дрожжи, винные дрожжи или пивные дрожжи, и источник сахара, в частности глюкозы. Когда рН достигает значения 5,5, его поддерживают на уровне 5,5 при помощи соответствующего основания, например, при помощи соды NaOH. Инкубацию осуществляют предпочтительно в течение 12-24 часов, затем выделяют гамма-лактон. Согласно другому варианту полученный после этапа d) гамма-лактон можно восстанавливать при помощи свежей культуры восстановительного микроорганизма или микроорганизма, по крайней мере, помещенного в условия восстановления, например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia etchelsii, или Pichia pastoria, или Hansenula polymorpha, или Bacillus subtilis, или Lactobacillus brevis.
Восстановление на этапе е') приводит к получению гамма-лактонов, более насыщенных чем гамма-лактоны, полученные на этапе d). Эти более насыщенные гамма-лактоны, полученные согласно данному частному варианту осуществления, содержат в позиции 4 асимметричный углерод той же конфигурации, что и углерод менее насыщенного, производного от него гамма-лактона, при этом реакция восстановления не приводит к изменению стереоизомерии молекулы.
Гамма-лактоны, полученные согласно способу в соответствии с настоящим изобретением, обладают такими свойствами запаха и вкуса, которые позволяют их использовать во всех областях производства парфюмерии или ароматических пищевых добавок, в частности при производстве духов, отдушек, косметических композиций или пищевых композиций, или в качестве пищевых добавок.
В рамках настоящего изобретения слово «парфюмерия» обозначает не только парфюмерию в обычно смысле этого термина, но также и другие области, в которых запах продуктов играет важную роль. Речь может идти о парфюмерных композициях в обычном смысле термина, таких как пахучие основы и концентраты, одеколон, туалетная вода, духи и аналогичные продукты; топические, в частности косметические, композиции, такие как кремы для лица и тела, тальк в порошке, масла для волос, шампуни, капиллярные лосьоны, соли и масла для ванн, гели для душа и для ванн, туалетное мыло, средства против пота и дезодоранты для тела, лосьоны и кремы для бритья, мыла, кремы, зубные пасты, полоскания для рта, помады и аналогичные продукты; и бытовые средства, такие как размягчающие средства, моющие средства, отбеливатели, освежители воздуха и аналогичные продукты.
Термин «одорант» используют для обозначения соединения, выделяющего запах.
Под пищевой ароматизацией следует понимать любое применение соединений в соответствии с настоящим изобретением для ароматизации любого пищевого жидкого или твердого пищевого продукта, используемого в качестве питания для человека или корма для животных, в частности напитков, молочных продуктов, мороженого.
(R)- или (S)-гамма-лактоны или смесь (R)- или (S)-гамма-лактонов можно использовать в парфюмерных композициях для придания им экзотических, цветочных или фруктовых запахов. В зависимости от назначения (S)-энантиомер или (R)-энантиомер или смесь обоих энантиомеров используют в количествах, определяемых специалистом.
Предпочтительно гамма-лактоны, полученные при помощи способа в соответствии с настоящим изобретением, используют в количествах, находящихся в пределах от 0,0025 мас.% до 10 мас.% по отношению к общей массе композиции, в которой они присутствуют. Они могут входить в композицию в твердом виде или в жидком виде, в частности в композицию гелей, кремов, помад и/или аэрозолей.
Гамма-лактоны, полученные при помощи способа в соответствии с настоящим изобретением, можно также использовать в композиции, которая сама является пахучей, или в композиции, в которой пахучее вещество используют для маскирования или нейтрализации некоторых запахов.
Другие преимущества и отличительные признаки настоящего изобретения будут более очевидны из приведенных ниже примеров, которые предназначены иллюстрировать изобретение, не ограничивая его объема.
Пример 1. Этап а: - селекция штаммов
Сначала производят посев всех коллекционных штаммов на агаровой среде MGY и осуществляют их инкубацию в течение 72 часов при температуре 27°С; затем производят посев этих штаммов в колбах Эрленмейера емкостью 1 л, содержащих 100 мл солодовой среды 1х и осуществляют инкубацию в течение 24 часов при 27°С. Затем в питательную среду добавляют субстрат в виде ундециленовой кислоты (5 г/л в 10 дозах) и культуру выдерживают еще в течение 48-120 часов при 27°С.
После оценки пахучести и анализов концентрации гамма-ундеценолактона в средах отбирают наиболее подходящие штаммы; в данном случае такими штаммами оказались Mortierella isabelina CBS 100559, Mortierella isabelina CBS 221.29, Aspergillus oryzae DSMZ 1861 и Aspergillus oryzae CBS 110.27, которые впоследствии использовали для тестов оптимизации в ферментерах.
Пример 1. Этап b: - Получение клеточных культур
Производят посев штамма Mortierella isabeline CBS 100559 или Mortierella isabeline CBS 221.29 или Aspergillus oryzae DSMZ 1861 или Aspergillus oryzae CBS 110.27 (исходный материал=пробирка, замороженная до -80°С) на агаровой среде MGY и осуществляют инкубацию при температуре 27°С в течение 30 часов.
Указанную предварительную культуру помещают в 5 л солодовой среды 1х в ферментере емкостью 6 л:
| Экстракт солода | 165 г |
| Экстракт дрожжей | 25 г |
| Н2О в достаточном количестве | 5 л |
| рН | 6,5 |
Mortierella isabelina
Инкубацию производят при 27°С, 500 об/мин, объемный коэффициент в мин. воздуха 0,05, рН свободный, в течение 30 часов.
Aspergillus oryzae
Инкубацию производят при 20°С, 500 об/мин, объемный коэффициент воздуха в минутах 0,05, рН свободный, в течение 30 часов, затем при 25°С, 500 об/мин, объемный коэффициент в минутах воздуха 0,05, рН свободный, в течение 24 часов. В обоих случаях должны получить мицелий, содержащий множество больших вздутий, заполненных включениями (в частности, пероксисомами).
После этого готовят 125 л солодовой среды 1,5х в ферментере емкостью 300 л:
| Экстракт солода | 6,188 г |
| Экстракт дрожжей | 0,939 г |
| Н2О в достаточном количестве | 125 л |
Среду стерилизуют в течение 40 минут при температуре 121°С. Ферментер и его принадлежности являются стерильными и находятся под давлением. Температура является стабильной и поддерживается в значении 27°С.Сбрасывают давление и поддерживают расход воздуха в значении 3,5 л/л/ч, то есть примерно равным 0,6 м3/ч. В стерильных условиях соединяют основание (NaOH 10 N), кислоту (Н3РO4 85%) и пеногаситель и 5-литровый ферментер, который служит в качестве инокулюма. Скорость перемешивания устанавливают на 325 об/мин, активируют пеногаситель, затем производят посев в инокулюме (5 л), рН свободный. Скорость перемешивания поддерживают на 325 об/мин, и насыщение воздухом доводят до 2,2 м3/ч (объемный коэффициент в минутах 0,3). Выращивание продолжают в течение 24 часов таким образом, чтобы получить 10 г/л сухого веса мицелия: этот мицелий должен быть в виде «компота» и состоять из нитей, содержащих множество вздутий и утолщений без спор.
Пример 2. Этапы end: Конверсия лауриновой кислоты при помощи штаммов Mortierella sp.
Сразу после достижения необходимого количества и качества мицелия производят подачу субстрата (лауриновая кислота) в миглиоль. Параллельно непрерывно подают глюкозу при расходе 0,35 г/л/ч в течение 55 часов. Во время всего периода ферментации рН поддерживают на уровне 7 при помощи NaOH 5 N. Скорость повышают до 900 об/мин и производят аэрацию с расходом 1 объемный коэффициент в минутах, то есть 12 м3/ч. Конверсию продолжают в течение 55 часов. Получают выход (S)-гамма-додекалактона, равный 12 г/л. Для сравнения гамма-додекалактоны получают в соответствии с патентом US 5457036 (Наn) с применением штаммов Mortierella, описанных в патенте US 5457036.
При применении способа по патенту (Наn), достигнутый выход составляет от 4 до 6,5 г/л; для сравнения, если применяют способ в соответствии с настоящим изобретением с применением компотообразного мицелия, содержащего включения, выход составляет порядка 12-15 г/л.
Пример 3. Этапы c и d: Конверсия каприловой кислоты при помощи штаммов Mortierella sp.
Сразу после достижения необходимого количества и качества мицелия производят подачу субстрата при расходе 0,75 г/л/ч в течение 6 часов. Параллельно непрерывно подают глюкозу при расходе 0,36 г/л/ч. Во время всего периода ферментации рН поддерживают на уровне 6,5 при помощи NaOH 5 N. Скорость повышают до 600 об/мин и производят аэрацию с расходом 3,5 м3/ч. Конверсию продолжают в течение 48-72 часов. Получают выход (S)-гамма-додекалактона, равный от 15 до 25 г/л, как правило примерно равный 19 г/л.
Для сравнения гамма-додекалактоны готовили в соответствии с патентом ЕР 519481 (Farbood) с применением штаммов Mortierella sp., описанных в патенте ЕР 519481; вращательная способность продукта, полученного по способу Farbood, составляет -28°, что означает, что продукт является смесью (R) и (S) с небольшим превышением (S); вращательная способность, полученная согласно способу в соответствии с настоящим изобретением, составляет -42°, что показывает селективность реакции при производстве (S)-гамма-лактона.
Если применяют способ по Farbood, достигнутый выход составляет от 7,5 до 10 г/л; для сравнения, если применяют способ в соответствии с настоящим изобретением с применением компотообразного мицелия, содержащего включения, выход составляет порядка 15-25 г/л.
Пример 4. Этапы c и d: Конверсия капроновой кислоты при помощи штаммов Mortierella sp.
Сразу после достижения необходимого количества и качества мицелия производят подачу субстрата при расходе 0,3 г/л/ч в течение 6 часов. Параллельно непрерывно подают глюкозу при расходе 0,36 г/л/ч. Во время всего периода ферментации рН поддерживают на уровне 6,5 при помощи NaOH 5 N. Скорость повышают до 600 об/мин и производят аэрацию с расходом 3,5 м3/ч. Конверсию продолжают в течение 48-74 часов. Получают выход (S)-гамма-гексалактона, равный 6 г/л.
Пример 5. Этапы c и d: Конверсия ундециленовой кислоты при помощи штаммов Mortierella sp.
Сразу после достижения необходимого количества и качества мицелия подают ундециленовую кислоту при расходе 0,3 г/л/ч в течение 6 часов, затем при расходе 0,53 г/л/ч в течение 72 часов, что в сумме составляет 40 г/л. Эту ундециленовую кислоту подают в смеси с гидрогенированным подсолнечным маслом (1/4 кислоты -3/4 масла); это масло подают при расходе 0,9 г/л/ч, затем 1,53 г/л/ч. Параллельно непрерывно подают глюкозу при расходе 0,36 г/л/ч в течение 72 часов. Во время всего периода ферментации рН поддерживают на уровне 7,5 при помощи NaOH 5 N. Скорость повышают до 505 об/мин и производят аэрацию при 1 объемном коэффициенте в минуту, то есть с расходом 3,5 м3/ч. Конверсию продолжают в течение 72 часов.
Получают выход гамма-ундеценолактона в 6,5 г/л, который имеет (S)-стереоизомерию.
Пример 6. Этапы c и d: Конверсия ундекановой кислоты при помощи штаммов Mortierella sp.
Сразу после достижения необходимого количества и качества мицелия подают ундекановую кислоту при расходе 0,3 г/л/ч в течение 6 часов, затем при расходе 0,53 г/л/ч в течение 3,5 часов, затем при расходе 0,75 г/л/ч в течение 3,5 часов, затем 1 г/л/ч в течение 48 часов. Эту ундекановую кислоту подают в смеси с гидрогенированным подсолнечным маслом (1/4 кислоты - 3/4 масла). Параллельно непрерывно подают глюкозу при расходе 0,36 г/л/ч в течение 24 часов. Во время всего периода ферментации рН поддерживают на уровне 7,5 при помощи NaOH 5 N. Скорость повышают до 505 об/мин и производят аэрацию при 1 объемном коэффициенте в минуту, то есть с расходом 12 м3/ч. Конверсию продолжают в течение 48 часов.
Получают выход гамма-ундекалактона в 19 г/л, который имеет (S)-стереоизомерию.
Пример 7. Этапы c и d: Конверсия ундециленовой кислоты при помощи штаммов Aspergillus sp.
Сразу после достижения необходимого количества и качества мицелия подают ундециленовую кислоту при расходе 0,3 г/л/ч в течение 6 часов, затем при расходе 0,53 г/л/ч - в течение 72 часов, что в сумме составляет 40 г/л. Эту ундециленовую кислоту подают в смеси с гидрогенированным подсолнечным маслом (1/4 кислоты - 3/4 масла). Параллельно непрерывно подают глюкозу при расходе 0,36 г/л/ч в течение 72 часов. Во время всего периода ферментации рН поддерживают на уровне 6,5 при помощи NaOH 5 N. Аэрацию производят при объемном коэффициенте 0,5 в минуту, то есть с расходом 6 м /ч. Конверсию продолжают в течение 80 часов.
Получают выход гамма-ундеценолактона в 0,5 г/л, который имеет (R)-стерео изомерию.
Пример 8. Этапы c и d: Конверсия капроновой кислоты при помощи штаммов Aspergillus sp.
Сразу после достижения необходимого количества и качества мицелия подают капроновую кислоту при расходе 1,64 г/л/ч - в течение 24 часов, затем при расходе 2 г/л/ч - в течение 72 часов, что в сумме составляет 183 г/л. Эту капроновую кислоту подают в смеси с гидрогенированным подсолнечным маслом (1/2 кислоты - 1/2 масла). Параллельно непрерывно подают глюкозу при расходе 0,36 г/л/ч. Во время всего периода ферментации рН поддерживают на уровне 6,5 при помощи NaOH 5 N. Аэрацию производят при объемном коэффициенте 0,5 в минуту, то есть с расходом 6 м3/ч. После 72-96 часов получают выход гамма-гексалактона в 15 г/л, который имеет (R)-стереоизомерию.
Пример 9. Этап е: экстрагирование - очистка
Производят подкисление при рН 1,5 с применением 1 л 85%-й фосфорной кислоты. Производят нагрев до температуры свыше 100°С в течение 30 минут, чтобы лактон в основном находился в своей циклической форме, а не в открытой форме гидроксикислоты. Лактон дозируют, добавляют экстрагирующий растворитель (предпочтительно циклогексан) и перемешивают в течение 1 часа при температуре окружающей среды. Производят центрифугирование и выделяют органическую фазу. Производят дозировку лактона. Растворитель концентрируют и таким образом получают маслянистый «сырой» продукт. Производят вакуумную дистилляцию. Получают «обессмоленный» лактон и истощенное масло. Затем осуществляют очистку путем вакуумного фракционирования лактона. Получают чистый продукт >99%, который является либо гамма-ундеценолактоном (>99% S), если использовали штамм Mortierella sp., либо гамма-ундеценолактоном (>99% R), если использовали штамм Aspergillus sp.
(R)- или (S)-гамма-ундеценолактон или смесь (R) и (S), а также (R)- или (S)-гамма-ундекалактон или смесь (R) и (S) можно использовать в парфюмерных композициях для придания им экзотического, цветочного или фруктового запаха, что позволило заявителю зарегистрировать товарный знак под названием «Tropicalone®», присвоенный гамма-ундеценолактону. В зависимости от назначения (R)-энантиомер или (S)-энантиомер или смесь двух энантиомеров следует использовать в количествах, определяемых специалистом.
1. Стереоселективный способ получения гамма-лактона общей формулы (I),
в которой лактоновое кольцо имеет или не имеет ненасыщенную связь между углеродным атомом №2 и углеродным атомом №3 и в которой R1 является С2-16-алкенилом, С2-16-алкинилом или С1-6-алкилом, причем указанный биосинтез проводят из жирной кислоты, содержащей от 5 до 20 атомов углерода, в качестве субстрата с использованием микроорганизмов Aspergillus sp.и Mortierella sp., которые позволяют осуществить специфическое гидроксилирование субстрата в положении С4; включающий следующие стадии:
a) селекцию подходящего микроорганизма, выбранного из микроорганизмов, позволяющих осуществить гидроксилирование субстрата в положении С4;
b) культивирование указанного микроорганизма в подходящей питательной среде, не содержащей пептонов, причем получаемая культура клеток образует «зернистый» мицелий, состоящий из септированных гифов без конидиоспор и содержащий вздутия, заполненные включениями; причем указанному культивированию необязательно предшествует стадия предварительного культивирования указанного микроорганизма;
c) добавление субстрата, способного к конверсии в гамма-лактон формулы (I);
d) превращение субстрата в гамма-лактон формулы (I),
e) выделение образовавшегося гамма-лактона.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используемый микроорганизм представляет собой Aspergillus oryzae.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используемый микроорганизм представляет собой Mortierella isabellina.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что субстрат выбирают из группы, включающей валериановую кислоту, капроновую кислоту, энантовую кислоту, каприловую кислоту, пеларгоновую кислоту, декановую кислоту, ундекановую кислоту, ундециленовую кислоту, лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, эйкозановую кислоту.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что субстрат добавляют на стадии с) в виде смеси, с, по меньшей мере, одним вспомогательным продуктом промышленного производства, предпочтительно выбранным из масел, в частности подсолнечного масла, являющегося гидрогенизированным либо обладающего высоким содержанием олеиновой кислоты; миглиола или глюкозы или смесь перечисленных ингредиентов.
6. Способ по любому из п.1, отличающийся тем, что стадия е) состоит в экстрагировании гамма-лактона гидродистилляцией с последующими необязательными этерификацией и удалением не прореагировавшего субстрата.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что стадия е) состоит в экстрагировании растворителем гамма-лактона, полученного по завершении стадии d).
