Способ получения живой клеточной вакцины для профилактики рака молочных желез

Изобретение относится к биотехнологии. Культивируют клетки доброкачественной спонтанной опухоли молочной железы мыши. Сначала in vitro в среде DMEM/RPMI-1640 с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота до 20 пассажей. Затем in vivo до 22 пассажей. Потом опять in vitro до 25 пассажей. После чего вводят 10 тысяч - 1 миллион полученных клеток в соединительнотканную капсулу, образованную у мышей линии Balb/c после введения им биосовместимого геля. Обеспечивают рост опухоли. Инкапсулированную опухоль асептически извлекают и подвергают трипсинизации с получением первичных эпителиальных культур клеток. Полученные клетки в концентрации 10 тысяч - 1 миллион вводят в капсулу, образованную гелем под кожей мышей линии Balb/c. Снова обеспечивают рост опухоли, предназначенной для вакцинации. При этом при культивировании in vitro клетки перевивают 1 раз в неделю, рассеивая в соотношении 1:3 - 1:4, дважды споласкивая монослой раствором ЕДТА и снимая его 0,25% раствором трипсина за 2-3 мин при комнатной температуре, а трипсинизацию останавливают добавлением 10% фетальной сыворотки к.р.с. Изобретение позволяет создавать противоопухолевую вакцину, применение которой основано на принципе прививки человеку живого патологического материала от животного со сходным заболеванием. 3 ил.

 

Изобретение относится к иммуноонкологии и представляет собой способ получения перевиваемой линии опухолевых клеток мыши, обладающих свойствами вакцины против аденокарциномы молочных желез. Являясь доброкачественной опухолью мышей линии Balb/c, полученная линия клеток предназначена для трансплантации на сингенных животных только при условии введения клеток в предварительно созданную соединительно тканую капсулу. При ксенотрансплантации человеку полученная таким образом линия клеток, называемая BBCV, может быть предложена как безопасный иммуногенный препарат для профилактики аденокарциномы молочной железы у женщин (Линия BBCV депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур и сохраняется в банке культур клеток МНИИМЭ, см. Приложение, Паспорт линии клеток BBCV).

Уровень техники.

В основу изобретения положена известная вакцина Дженнерра, вызывающая у человека сходный с болезнью патологический процесс, но ограниченный местом введения и создающий иммунитет против ангигенно родственного патологического начала.

Иммунопрофилактика в онкологии в настоящее время развивается по нескольким направлениям. Наиболее привлекательной для клиницистов является постхирургическая профилактика метастазирования и генерализации опухолевого процесса. Препараты, применяемые в этой области, именуются вакцинами, в том смысле, что они действуют как активные специфические стимуляторы противоопухолевого иммунитета. В определенном смысле их воздействие должно быть более терапевтическим, чем профилактическим, что принципиально отличает большинство разрабатываемых онкологических вакцин от классических профилактических вакцин, успешно применяемых в инфекционной патологии. Профилактика заболевания путем искусственного воспроизведения сходного, но доброкачественного процесса, была той исходной вакцинацией, которую сэр Эдвард Дженнер ввел в медицинскую практику более 200 лет назад. Прививка коровьей оспы, vaccinia, vacca - корова (лат.), по Дженерру начала борьбу с вирусом оспы человека задолго до появления самого слова вирус и описания вируса оспы

Инфекции, общие для человека и животных (зоонозы), и потенциальная опасность возникновения новых болезней при заражении человека вирусами животных препятствовала попыткам повторения схемы Дженнера - применению возбудителя болезни животного в качестве вакцины против болезни человека. Первая удачная пара такого рода - вирус оспы коров против оспы человека оказалась практически единственной. Но именно этот подход позволил ликвидировать оспу человека как заболевание во всем мире. При создании изобретения также принималось во внимание известное из уровня техники использование ангигенно модифицированных клеточных вакцин из раковых клеток для лечения онкологических заболеваний US 7094603, C12N 15/83, 08.22.2003 /1/.

Сущность изобретения.

Результатом, на который направлено изобретение, является создание противоопухолевой вакцины, применение которой основано на принципе прививки человеку живого патологического материала от животного со сходным заболеванием. При реализации заявленного способа получена вакцина, представляющая собой перевиваемую линию опухолевых клеток мыши, обладающих свойствами вакцины против аденокарциномы молочных желез. При этом были использованы принципы, раскрывающие возможность накопления кленовых линий клеток, описанные, например, в US 4003789, C12N 5/06, 18.01.1977 /2, 4/, а также принципы, подтверждающие возможность использование инертного геля для создания соединительнотканной капсулы, описанные в US 6972194, А61К 9/00, 06.12.2005 /3/.

В основу изобретения положена задача использования доброкачественной опухоли мышей Balb/c - линии клеток, перевиваемой при трансплантации на сингенных животных только при условии введения клеток в предварительно созданную соединительнотканую капсулу. При этом поскольку линия клеток может бесконечно долго культивироваться in vitro в питательной среде ДМЕМ/RPMI-1640 с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, что обеспечивает возможность накопления производственных количеств стандартного вакцинного материала.

Линия BBCV была получена из доброкачественной спонтанной опухоли молочной железы мыши линии Balb/c в лаборатории гибридомной биотехнологии МНИИМЭ и культивировалась в течение 7 лет in vitro и in vivo. Клетки BBCV культивировали in vitro 20 пассажей, затем прошли 22 пассажа in vivo на мышах линии Balb/c и далее культивировались in vitro 25 пассажей. Среда культивирования - DMEM/RPMI-1640 с 10% эмбриональной сыворотки к.р.с. Температура культивирования +37°С. Клетки перевивали 1 раз в неделю, рассевая 1:3-1:4. Монослой дважды споласкивали раствором ЕДТА и снимали 0.25% раствором трипсина за 2-3 мин при комнатной температуре.

Трансплантация опухоли не удавалась при введении 1.0 млн клеток внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно сингенным мышам линии Balb/c. Животные оставались здоровы при сроке наблюдения двенадцать месяцев.

Было выявлено, что линия BBCV вызывает доброкачественную солидную опухоль при ведении 10 тыс. - 1.0 млн клеток в соединительнотканную капсулу, образованную у мышей линии Balb/c после введения биосовместимого геля (Матригель, Силикон, Агароза и Полиакриламидного геля, приведенного в US 6972194, А61К 9/00, 06.12.2005 /3/). Эта линия клеток также не вызывает опухолей при подкожном и внутрибрюшинном введении 100 тыс. клеток мышам линий С3Н, ДВА.2 и C57Black/6.

При культивировании in vivo инкапсулированную опухоль асептически извлекали и подвергали трипсинизации по стандартной методике получения первичных эпителиальных культур клеток: 2,5% трипсин, 20 мин, 37°С. Трипсинизацию останавливали добавлением 10% фетальной сыворотки к.р.с. Клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин, ресуспендировали в среде RPMI-1640 до концентрации 1 млн/мл и вводили в дозе 10 тыс. - 1 млн в капсулу, образованную гелем под кожей мышей линии Balb/c. Рост опухолей начинается через 1-2 недели.

Свойство иммуногенности проявлялось следующим образом.

При аллогенной трансплантации 10 млн клеток в соединительную капсулу мышам линии C57Black/6 клетки BBCV не вызывают образования опухоли, но создают протективный иммунитет, защищающий мышей от развития сингенной аденокарциномы Са-755, введенной подкожно в дозе 100 млн клеток. На фиг.1 представлены суммарные результаты эксперимента по оценке вакцинирующего эффекта клеток BBCV для мышей C57Black/6. Три группы по 4 мыши были вакцинированы введением клеток в соединительнотканые капсулы, образованные под кожей в области лопатки предварительным введением 0.5 мл одного из следующих инертных гелей: 2% полиакриламидного, 2% агарозного и жидкого силиконового (наполнителя протезов груди), по 4 животных на каждый гель. Все гели были оценены по способности образовывать соединительнотканные капсулы и поддерживать рост клеток BBCV у сингенных мышей Balb/c в отдельном эксперименте. Гели были одинаково эффективны в поддержании роста сингенной опухоли, достигавшей размера 4-6 см2 через 20-30 дней после введения в них клеток BBCV мышам Balb/c. У мышей линии C57Black/6 клетки BBCV не вызывали образования опухолей и через месяц после их введения, вакцинированным таким образом мышам, вводили по 100 млн клеток сингенной аденокарциномы Са-755 (5, 6). У 10 контрольных животных опухоли появились на 6-7 день и развивались до состояния несовместимого с жизнью до 14-15 дня. У вакцинированных животных опухоли появлялись на 5-7 дней позже и вообще не образовались у 20% мышей (фиг.1).

Подкожное введение аллогенных клеток BBCV мышам линии C57Black/6, без использования соединительно тканной капсулы, не вызывало образования у животных протективного иммунитета против сингенной опухоли Са-755.

При использовании для трансплантации сингенной аденокарциномы меньшей дозы клеток Са-755 эффект вакцинации аллогенными клетками BBCV достигал 100%, при удлинении срока жизни животных в контроле до 45 дней (фиг.2).

Из проведенных экспериментов следует, что доброкачественная опухолевая линия BBCV, сингенная для мышей линии Balb/c, может служить профилактической аллогенной вакциной против аденокарциномы Са-755 у мышей линии C57Black/6.

Вакцинация животных клетками BBCV приводила к нарастанию в их сыворотках антител к клеткам опухоли молочных желез мыши Са-755 и человека MCF-7, культивируемых in vitro.

Исследования показали, что аденокарцинома молочной железы BBCV является трансплантируемой опухолью, сингенной для мышей линии Balb/c при условии трансплантации опухолевых клеток в соединительнотканную капсулу и, как следствие, был сделан вывод о том, что линия клеток BBCV может быть применена как живая аллогенная вакцина против аденокарциномы мышей.

Принципиальная возможность профилактической вакцинации при раке молочных желез ксеногенными опухолевыми клетками была нами показана в эксперименте по вакцинации мышей человеческой аденокарциномой MCF-7. В этом эксперименте четырем мышам С57Вlаск/6, с предварительно сформированной у них под кожей соединительнотканной капсулой, были введены клетки MCF-7, выращенные в условиях in vitro. Клетки осаждали центрифугированием и вводили в капсулу в объеме 0,25 мл в дозе 10 млн клеток на мышь. Через 30 дней четырем контрольным и четырем вакцинированным мышам под кожу было введено по 10 млн клеток сингенной аденокарциномы Са-755 (фиг.3).

Эффект ксеногенной вакцинации проявился в более позднем, на 8-10 дней, появлении опухолей у вакцинированных животных и в достоверном увеличении продолжительности их жизни на 14 дней. Несмотря на то, что у всех вакцинированных человеческой аденокарциномой мышей в конце концов развилась опухоль Са-755, защитный эффект вакцинации был достоверным. В момент гибели контрольных мышей все вакцинированные мыши были живы и их опухоли только начинали расти.

Невысокая эффективность ксеногенной вакцинации на модели MCF-7 - Са755 может объясняться, в первую очередь тем, что использованная человеческая аденокарцинома - это культура клеток с многолетней историей жизни in vitro, успевшая сильно измениться по сравнению с опухолью в живом организме. Опухоли мыши и человека, растущие в одинаковых условиях in vivo, могут иметь большее антигенное родство и, следовательно, могут служить более эффективными ксеногенными вакцинами.

При ксенотрансплантации человеку линия клеток BBCV может быть предложена как безопасный иммуногенный препарат для профилактики аденокарциномы молочной железы у женщин.

Реализация заявленного способа получения живой клеточной вакцины обеспечила создание линии клеток мыши, не вызывающей опухоли у сингенных мышей при обычных методах трансплантации. При этом данная линия клеток мыши, трансплантируемая как доброкачественная опухоль, не метастазирует при условии введения в соединительнотканную капсулу сингенной мыши. Данная линия клеток мыши, вызывающая защитный иммунитет (вакцина), может быть трансплантирована в соединительнотканную капсулу аллогенным и ксеногенным реципиентам. При этом аллогенным реципиентом является любая мышь, не линии Balb/c, a ксеногенным реципиентом является человек.

Литература

1. US 7034603, A61K 38/16, 08.22.2003.

2. US 4003789, C12N 5/06, 18.01.1977.

3. US 6972194, A61K 9/00, 06.12.2005.

4. A.D.Borowsky, R.Namba, L.J.T.Young, K.W.Hunter, J.G.Hadgson, C.G.Tepper, E.T.McGoldrick, W.J.Muller, R.D.Cardiff, J.P.Gregg. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: Two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22, 47-58, 2005.

5. Liautaud-Roger F., Desoize В., Mili H., Carpenter Y., Delvicourt C., Conix P. Serum enzymes and triglycerides in mice with a mammary tumor (Ca-755 adenocarcinoma), Pathol.Biol. (Paris), 1987, Oct, 35(8): 1119-22.

6. Niimura К., Furisho Т., Fujii M., Takahashi N., Matsunaga K., Sugita N., Toshikumi C., Kawai Y. Tumor and tissue distribution of 1251 - labeled natural and anti-tumor antibodies in murine experimental tumor systems. Anticancer Res. 1988, jul-Aug, 8(4); 589-93.

Приложение: Паспорт линии клеток BBCV на 3 л.

Способ получения живой клеточной вакцины для профилактики рака молочной железы, включающий культивирование клеток добракачественной спонтанной опухоли молочной железы мыши:
in vitro в среде DMEM/RPMI-1640 с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота до 20 пассажей;
in vivo до 22 пассажей;
in vitro до 25 пассажей;
вводят 10 тысяч-1 миллион полученных клеток в соединительнотканную капсулу, образованную у мышей линии Balb/c после введения им биосовместимого геля;
обеспечивают рост опухоли;
инкапсулированную опухоль асептически извлекают и подвергают трипсинизации с получением первичных эпителиальных культур клеток;
полученные клетки в концентрации 10 тысяч-1 миллион вводят в капсулу, образованную гелем под кожей мышей линии Balb/c;
обеспечивают рост опухоли, предназначенной для вакцинации;
при этом при культивировании in vitro клетки перевивают 1 раз в неделю, рассеивая в соотношении 1:3 - 1:4, дважды споласкивая монослой раствором ЕДТА и снимая его 0,25%-ным раствором трипсина за 2-3 мин при комнатной температуре, а трипсинизацию останавливают добавлением 10% фетальной сыворотки к.р.с.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, конкретно к созданию с помощью нанотехнологии радиоционного синтеза средства, увеличивающего резерв стволовых клеток в организме и обладающего низкой иммуногенностью, и может быть использовано в регенеративной медицине.

Изобретение относится к биотехнологии и экспериментальной онкологии, в частности к стабильной клеточной линии аденокарциномы яичника человека SKOV-kat. .

Изобретение относится к биотехнологии и экспериментальной онкологии, в частности к стабильной клеточной линии аденокарциномы яичника человека SKOV-kat. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к созданию опухолевых моделей, и может быть использовано для изучения механизмов канцерогенеза и скрининга противоопухолевых препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. .

Изобретение относится к лекарственным средствам и касается фармацевтической комбинации, включающей эффективные количества: (i) соединения 1 и (ii) по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства 2, выбранного из группы, состоящей из ингибиторов нуклеозиддифосфатредуктазы, выбранных из цитарабина и пеметрекседа, ингибиторов гистондезацетилазы, иринотекана, доцетаксела, цисплатина, таксотера, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-{[4-(N,N-диметиламино)-1-оксо-2-бутен-1-ил]амино}-7-((S)-тетрагидрофуран-3-илокси)-хиназолина или его фармацевтически приемлемой соли и 3-Z-[1-(4-(N-((4-метилпиперазин-1-ил)-метилкарбонил)-N-метиламино)-анилино)-1-фенилметилен]-6-метоксикарбонил-2-индолинона, для лечения онкологических заболеваний.

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения металлопроизводного арабиногалактана. .

Изобретение относится к области фармакологии и медицины и касается применения соединений общей формулы (1) для лечения заболеваний, характеризующихся аномальной пролиферацией клеток в организме человека или млекопитающего, не являющегося человеком, путем ингибирования polo-подобных киназ, как регуляторов митоза.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении лейкоза. .

Изобретение относится к области медицины и гинекологии и касается препаратов для лечения гиперпластических процессов репродуктивной системы. .

Изобретение относится к медицине, а именно к онкоторакальной хирургии, и может быть использовано при лечении пациентов с метастатическим поражением легких. .
Изобретение относится к медицине, в частности к реабилитации и лечению больных, отягощенных онкологическим процессом разной степени тяжести

Изобретение относится к биотехнологии

Наверх