Способ снижения агрегационной активности тромбоцитов in vitro
Владельцы патента RU 2410104:
Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр неврологии РАМН (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к способам исследования агрегационной активности тромбоцитов. Способ заключается в том, что антиагрегационный препарат вводят в богатую тромбоцитами плазму вместе с коллоидным раствором гликосфинголипидных (ГСФЛ) липосом, полученных экстракцией ГСФЛ фракции из гомогената головного мозга свиньи. В процессе предварительной подготовки препарата коллоидный раствор ГСФЛ смешивают с раствором антиагрегационного препарата, затем полученную смесь прогревают 30 минут при температуре 60°С. Использование способа позволяет повысить эффективность действия антиагрегантных препаратов и, вследствие этого, оптимизировать антиагрегантную терапию больных с церебро-васкулярными заболеваниями.
Изобретение относится к медицине, а именно к способам воздействия на агрегационную активность тромбоцитов in vitro, которые направлены на повышение эффективности медикаментозной коррекции гиперактивности тромбоцитарной функции. Изобретение может быть использовано для улучшения профилактики и лечения больных в ангионеврологических и кардиологических клиниках при применении существующих антиагрегантных препаратов или агента, повышающего эффективность их действия.
Известен способ оптимизации антиагрегантной терапии с помощью сочетания приема традиционных препаратов и потребления в пищу полиненасыщенных жирных кислот омега-3, а именно эйкола (ихтиеновое масло), в дозе 6-8 г в сутки в течение 4 месяцев. Этот способ применяется в случаях выявления неэффективности использования препаратов с антиагрегантными свойствами (патент RU №2188008, кл. А61K 31/202, 35/60, А61Р 25/00, 2000).
Известен также способ исследования агрегационной активности тромбоцитов и оптимизации антиагрегационной терапии у больных с церебро-васкулярными заболеваниями (ЦВЗ) путем введения препаратов, подавляющих агрегацию тромбоцитов (Voen - Med - Zn, 1994, Feb. p.63). Однако у значительной части больных наблюдается определенная резистентность тромбоцитов к воздействию этих препаратов.
Наиболее близким к изобретению является способ снижения агрегационной активности тромбоцитов с целью дальнейшей коррекции стратегии терапии больных в ангионеврологических и кардиологических клиниках путем подбора антиагрегационных препаратов. Он включает в себя забор крови, стабилизацию ее после забора, разделение с получением богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования, введение антиагрегационного препарата с последующим перемешиванием, инкубацию плазмы с препаратом и без него при 36,5-37,5°С. Используют тромбоцитарную тест-систему для оценки in vitro эффектов антиагрегационных препаратов, имеющих различные механизмы действия на тромбоциты (патент RU №2188419 кл. G01N 33/15, 33/86, 2000).
Этот способ позволяет определить индивидуальную чувствительность пациента к тому или иному препарату до назначения курса лечения. Однако остается вопрос о возможности применения минимальных доз антиагрегантов для нивелирования побочных эффектов препаратов.
В механизмах действия применяющихся в современной медицинской практике антиагрегационных препаратов на тромбоцитарные пластинки ведущую роль играет изменение рецепторной чувствительности мембран тромбоцитов (тиклопидин) или понижение активности внутриклеточных каскадов, участвующих в регуляции процесса агрегации. Эти пути включают связывание индуктора агрегации со своим рецептором на внешней мембране тромбоцита и передачу сигнала внутри клетки путем изменения концентрации вторичных внутриклеточных сигнальных факторов. Изложенные оба процесса приводят к активации рецепторов фибриногена, вследствие чего происходит его рецепция и связывание тромбоцитов друг с другом посредством фибриногеновых мостиков. Сопровождается это образованием активных форм тромбоцитов и их агрегатов.
Активация тромбоцитов может быть вызвана множеством различных биологически активных веществ (АДФ, адреналином, коллагеном и пр.), которые действуют через специфические рецепторы на поверхности мембран. Формирование ответа заключается в последовательной активации систем регуляции концентраций вторичных посредников с образованием цепи передачи сигнала и является общим для различных типов клеток.
Существование в кровяных пластинках многочисленных мембраносвязанных внутриклеточных механизмов активации позволяет вовлекать многоступенчатую модуляцию активности клеток в процесс тромбообразования.
Все это определяет существование многообразных биологически активных соединений, обладающих способностью изменять функцию тромбоцитов и способствующих вовлечению в процесс как активаторных, так и ингибиторных внутриклеточных механизмов. К числу биологически активных соединений, в том числе используемых в качестве лекарственных средств, относятся препараты, обладающие способностью модулировать функцию тромбоцитов посредством вовлечения в процессы ингибирования фосфолипазы А2, циклооксигеназы, тромбоксансинтазы, изменение фосфолипидной композиции мембран клеток, активности образования внутриклеточных посредников (цАМФ, цГМФ, NO) и блокирование специфических рецепторов на мембране клеток.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности действия антиагрегационных препаратов, вследствие чего достигается оптимизация антиагрегационной терапии больных с церебро-васкулярными заболеваниями.
Он достигается тем, что коллоидный раствор гликосфинголипидных (ГСФЛ) липосом, полученных экстракцией 0,01% коллоидного раствора ГСФЛ фракции из гомогената головного мозга свиньи, смешивают с раствором антиагрегационного препарата, затем полученную смесь прогревают при температуре 60 градусов в течение 30 минут и затем вводят ее in vitro в богатую тромбоцитами плазму в эффективных рабочих концентрациях антиагрегационного препарата 0,7 мг/л для аспирина и 0,3 мг/л для тиклопидина.
Для выделения ГСФЛ из головного мозга свиньи производят следующие операции: 1) получение гомогената; 2) обезвоживание холодным ацетоном, эктракция нейтральных липидов; 3) удаление остаточной части нейтральных липидов второй ацетоновой экстракцией; 4) экстракция фосфолипидов спиртом при температуре до 35°С; 5) экстракция ГСФЛ спиртом при температуре до 65°С; 6) кристаллизация ГСФЛ из спиртового раствора; 7) очистка ГСФЛ спиртом/ацетоном от примесей фосфолипидов/нейтральных липидов соответственно по схеме. Контроль состава полученной смеси проводится методом аналитической жидкостной хроматографии.
Способ выполняют следующим образом.
Антиагрегационный препарат вводят вместе с 0,01% коллоидным раствором гликосфинголипидных (ГСФЛ) липосом, полученных экстракцией ГСФЛ фракции из гомогената головного мозга свиньи. В процессе предварительной подготовки препарата коллоидный раствор ГСФЛ смешивают с раствором антиагрегационного препарата, затем полученную смесь прогревают 30 минут при температуре 60°С. При этом происходит разрыв ГСФЛ фибрилл и образование липосом тороидальной формы. Эффект проявляется в значительном снижении параметра АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. При этом проверено, что при воздействии чистого препарата ацетилсалициловой кислоты, АДФ-АТ в среднем снижается на 8,6%. При введении аспирина с помощью ГСФЛ нанокапсул снижение АДФ-АТ составляет 44,2%. При воздействии чистого препарата тиклопидина, АДФ-АТ в среднем снижается на 17%. При введении тиклопидина с помощью ГСФЛ нанокапсул снижение АДФ-АТ составляет 43,8%).
Статистический анализ совместного действия антиагрегационного препарата с ГСФЛ в группах пациентов с пониженной и нормальной чувствительностью к препаратам показывает существенное нивелирование разницы в индивидуальных ответах. Больше всего данный эффект выражен в случае аспирина. Наблюдаемый эффект является результатом собственного действия сфинголипидных липосом как антиагрегантов, так и действия их как агентов повышения эффективности входа других лекарственных антиагрегантных препаратов в клетку.
Таким образом, предложенное изобретение позволяет снизить агрегационную активность тромбоцитов, увеличить эффект антиагрегантных препаратов с различными механизмами действия, понизить их эффективную концентрацию и нивелировать развитие резистентности к антиагрегантным препаратам.
Способ снижения агрегационной активности тромбоцитов in vitro путем введения антиагрегационного препарата, отличающийся тем, что коллоидный раствор гликосфинголипидных (ГСФЛ) липосом, полученных экстракцией 0,01%-ного коллоидного раствора ГСФЛ фракции из гомогената головного мозга свиньи, смешивают с раствором антиагрегационного препарата в эффективных рабочих концентрациях 0,7 мг/л для аспирина и 0,3 мг/л для тиклопидина, затем полученную смесь прогревают при температуре 60° в течение 30 мин и затем вводят in vitro в богатую тромбоцитами плазму.
