Способ получения по меньшей мере одной неаллергенной пробиотической бактериальной культуры для изготовления пищевого продукта или фармацевтической композиции, предназначенных для лиц, пораженных целиакией и особенно чувствительных к аллергенным веществам глютенового и/или молочного типа (варианты)
Способ предусматривает выращивание пробиотической бактериальной культуры в неаллергенном культуральном субстрате, таком как пептон и/или белковый гидролизат растительного и/или животного происхождения. Культуральный субстрат включает глюкозу и/или другие моно- или дисахариды, полученные в результате гидролиза сложного полисахарида. Второй вариант осуществления способа предусматривает предварительную ферментативную обработку культурального субстрата для удаления следовых количеств аллергенов, появляющихся в результате перекрестного или случайного загрязнения, и выращивания на нем по меньшей мере одной пробиотической бактериальной культуры. Это обеспечивает получение неаллергенной пробиотической культуры, пригодной для изготовления пищевого продукта или фармацевтической композиции, предназначенных для лиц, пораженных целиакией и особенно чувствительных к аллергенным веществам глютенового и/или молочного типа. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 табл.
Целью настоящего изобретения является способ получения неаллергенных пробиотических бактериальных культур.
Известно, что желудочно-кишечный (ЖК) тракт человека содержит комплекс микроорганизмов, сообщество, называемое микробиота, состоящее главным образом из строго анаэробных бактерий, способных осуществлять разные действия, оказывая эффекты, затрагивающие локальный желудочно-кишечный уровень и косвенно общий системный уровень, включая почти все функции органов и хозяина.
Кишечная микрофлора, состоящая из большого множества разных видов (400-500), способных заселять и слизистую оболочку кишечника и частицы потребляемой пищи, следовательно, способна в значительной степени определять здоровье индивидуума.
Состав кишечной микрофлоры может изменяться в зависимости от ряда факторов, таких как возраст, физиологическое состояние индивидуума, наличие разных патологий, стресс и, главным образом, питание.
Под влиянием эндогенных и экзогенных негативных факторов происходит уменьшение количества полезных бактерий (обычно бактерий, принадлежащих к группе молочнокислых, в тонком кишечнике и бифидобактерий в толстом кишечнике) и увеличение количества патогенных энтеробактерий, стрептококков и клостридий.
Введение специфических пробиотиков с помощью лекарственных новинок, диетологии, интеграторов и прежде всего питания (так называемые «функциональные» или «нутрицевтические» пищевые продукты) позволяет уравновесить микрофлору организма хозяина путем восстановления оптимальной функции кишечника.
Термин «пробиотик» обычно относится к живым микроорганизмам, выбранным из кишечной микрофлоры здоровых индивидуумов, которые, при введении в подходящих количествах и в течение соответствующего времени, способны заселять, а также хотя бы на время, разные участки кишечника и осуществлять полезное воздействие на здоровье организма-хозяина.
К пробиотикам принадлежат главным образом некоторые виды родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Leuconostos и, в меньшей степени, Saccharomyces, Bacillus и Enterococcus.
Среди полезных и лечебных результатов, продемонстрированных в строгих клинических тестах, проводимых во всем мире, и индуцируемых у потребителя посредством потребления пробиотиков, можно упомянуть следующие:
1. Стимуляция иммунной системы;
2. Индукция антимутагенного и антигенотоксического эффектов;
3. Противоопухолевое и антиметастатическое действие в отношении, например:
- карциномы толстого кишечника,
- карциномы молочной железы,
- рака мочевого пузыря;
4. Улучшение всасывания питательных веществ;
5. Уменьшение симптомов лактозной непереносимости;
6. Улучшение моторики кишечника благодаря понижению рН и уменьшение запоров;
7. Уменьшение поглощения холестерина и жиров;
8. Противодиарейная, антигипертензивная, противодиабетическая активности, подавление инфекций женской урогенитальной системы;
9. Профилактика гериатрических патологий.
Пробиотики для перорального применения должны характеризоваться следующими общими и функциональными требованиями:
1) источник - кишечник человека; от индивидуумов с хорошим состоянием здоровья;
2) биологическая безопасность; они не должны вызывать побочные эффекты, особенно у ослабленных субъектов или субъектов с подавленным иммунитетом;
3) устойчивость и жизнеспособность; они должны иметь такую резистентность, которая позволит им выжить в желудочном соке, секрециях поджелудочной железы и желчных и достигнуть подвздошной кишки и толстой кишки неповрежденными и все еще полностью жизнеспособными.
Конкуренция, которая начинается между пробиотическими микроорганизмами и патогенной микрофлорой, может возникнуть, если только потребленные пробиотические микроорганизмы способны достигнуть кишечного тракта и, следовательно, выдержать кислотность желудка и высокую концентрацию солей желчных кислот. Сообщается, что в общем случае, как только они достигают кишечного тракта, они начинают конкурировать благодаря механизмам адгезии, в которые вовлечены белки и/или углеводы со специфическими адгезионными функциями в отношении кишечных ворсинок.
На промышленном уровне пробиотики производят в форме лиофильно высушенной бактериальной культуры, а именно регулируют рост клеток в подходящей среде (ферментация) и затем, после концентрирования и очистки биомассы, выполняют дегидратацию посредством лиофильной сушки. Такой процесс требуется для того, чтобы обеспечить возможность бактериям воспроизводить бактерии в достаточном количестве (стадия ферментации) и хранить их в течение длительного времени (стадия лиофильной сушки).
Для успешного проведения ферментативного процесса и с достаточными выходами необходимо обеспечить клетки источниками углерода и азота, микроэлементами и биоактиваторами в подходящих количествах.
Традиционно, имея дело с бактериями, обычно называемыми «молочными», выбранными субстратами, используемыми в качестве источника азота, являются сыворотка, белки молочной сыворотки, гидролизаты и казеиновые пептоны, казеинаты и т.д., в то время как в качестве источника углерода обычно используют лактозу и глюкозу, так как они могут легко метаболизироваться почти у всех живых организмов.
В последние годы, возможно по причине не слишком разнообразного и слишком богатого белками и жирами питания, в Европе и западных странах зарегистрировано чувствительное увеличение количества людей, страдающих патологиями аллергического типа.
"Аллергическими" называются иммунные реакции 4 типа или IgЕ-опосредованные реакции, при которых после первого сенсибилизирующего контакта (который может происходить в любое время жизни, также и внутриутробно) продуцируются специфические IgЕ по гистаминзависимому механизму.
Такие реакции с клиническими последствиями, которые могут меняться от простых легких кожных реакций до анафилактического шока и смерти, также могут быть вызваны очень низкими дозами молекул, называемых «аллергенами».
Из-за опасности этих веществ для некоторых людей, Европейское сообщество приняло правило о том, что на этикетке продуктов, принадлежащих следующим классам (Приложение 3 бис к вышеуказанной инструкции), должно быть отчетливо указано «применение в изготовлении и присутствие в пище» (ст.6(10) инструкция 2000/13/ЕС, изменения в соответствии с инструкцией 2003/89/ЕС):
глютенсодержащие злаки (такие, как пшеница, рожь, ячмень, овес, пшеница спельта, камут или их гибридные штаммы) и производные; ракообразные и продукты на их основе; яйца и продукты на их основе; рыба и продукты на основе рыбы; арахис и продукты на основе арахиса; соя и продукты на основе сои; молоко и молочные продукты (включая лактозу); плоды со скорлупой, такие как миндаль (Amigdalus communis L.), фундук (Corylus avellana), обыкновенный грецкий орех (Juglans regia), орех кэшью (Western Anacardium), орех пекан [Carya illinoieses (Wangenh) К. Koch], бразильский орех (Bertholletia excelsa), фисташковый орех (Pistacia vera), квинслендский орех (Macadamia ternifolia) и производные; сельдерей и продукты на его основе; горчица и продукты на основе горчицы; кунжутные семена и продукты на их основе; диоксид серы и сульфиты в концентрациях выше 10 мг/кг или 10 мг/л, выраженных через SO2.
Так как обычно для получения пробиотиков применяют субстраты на основе молока (в качестве источника азота) и производные глюкозы (в качестве источника углерода), которая обычно происходит из крахмала (также пшеничного крахмала), пробиотики могут считаться опасными при введении особенно чувствительным субъектам, даже если они в действительности могут содержать, самое большее, только незначительные следы аллергенов (полученных из молока и/или глютена).
В случае молока можно выделить два случая неблагоприятных реакций к такой пище: аллергию на белки коровьего молока (APLV) и непереносимость лактозы.
Молоко, вместе с яйцами, является наиболее аллергенной пищей; эта их особенность определяется белковыми веществами, содержащимися в них, главным образом альфа-лактоглобулином, бета-лактоглобулином и казеинами.
Аллергия к белкам коровьего молока является относительно часто встречающейся патологией на первом году жизни. Симптомология относится в 50-70% случаев к желудочно-кишечным типу, еще в 50-70% случаев это кожные расстройства, в 20-30% - респираторные расстройства и в 5-9% - системные расстройства (анафилаксия).
APLV несвойственна взрослым и имеет тенденцию постепенно ослабевать после первого года жизни и исчезать к 10 годам.
Противоположное течение имеет лактозная непереносимость, которая является весьма редкой на первом году жизни и очень частой у взрослых, в частности в некоторых популяциях (африканская, азиатская, американские индейцы).
Молоко является основной пищей, начиная с рождения, и у новорожденного уже продуцируются ферменты, необходимые для расщепления молочного сахара, лактозы, на ее простые компоненты - глюкозу и галактозу. После первого года жизни молоко становится менее важной пищей, и количество лактазы самопроизвольно понижается, так что у многих взрослых возникает непереносимость молока (не аллергия на молоко).
Целиакия является энтеропатическим, хроническим, иммуноопосредованным воспалительным заболеванием, возникающим от приема внутрь глютена, «накапливаемого» белка, естественно содержащегося в некоторых злаках.
Такая пищевая непереносимость действует на генетически предрасположенных лиц, иммунная система которых реагирует неправильным образом на прием белковых фракций, обычно пшеничного глютена, спелта (разновидности пшеницы), камута и спеллы (разновидности пшеницы), ячменя, ржи, тритикале (гибрида пшеницы и ржи) и их производных. У некоторых индивидуумов также присутствует непереносимость к белкам овса.
Технически термин «глютен» применяется к комбинации простых проламиновых (богатых пролином), называемых «глиадинами», и глютелиновых (богатых глютамином), называемых «глютенинами», белков вышеуказанных злаков.
В контексте целиакии термин «глютен» часто используют в отношении всех видов белков, содержащихся в злаках, даже если среди различных белковых фракций, образующих глютен, наиболее вредным представляется глиадин.
У людей, пораженных целиакией, принятие глютена, даже в небольших количествах, способно вызывать аномальный ответ иммунной системы: трансглютаминаза, фермент, существующий в слизистой оболочке ткани кишечника, связывается с глиадином и посредством дезамидирования превращает его в молекулу, способную активировать Т-клетки (клетки иммунной системы, способные опосредовать все иммунные ответы в отношении белковых антигенов), с последующим получением антитрансглютаминазы IgG и IgA и антиэндомизных IgA иммуноглобулинов.
На первой стадии происходит увеличение количества внутриэпителиальных кишечных активированных Т-клеток, в то время как по мере развития заболевания это увеличение будет относится и к лимфоцитам и к инфильтрующим клеткам плазмы собственной мембраны, с получением металлопротеиназ, ответственных за укорачивание ворсинок и, следовательно, за повреждение слизистой кишечника.
До сих пор не существует возможности предупреждения развития или лечения целиакии, следовательно, только безглютеновая диета, строго соблюдаемая на всем протяжении жизни, является единственной терапией, способной гарантировать людям, пораженным целиакией, хорошее здоровье.
Больные целиакией должны удалять и мельчайшие остатки порошка опасных злаков, потому что прием внутрь глютена, также в минимальных количествах, может инициировать аутоиммунный ответ.
Так как отношение количества принятого глютена к токсическому эффекту, индуцируемому на кишечном уровне, до сих пор не определено, термин «следы» имеет принципиальное практическое значение в лечении целиакии и имеет значения в плане продовольственного законодательства, потому что он относится к максимальному пределу «допустимого» глютена (пороговое значение) в продуктах, пригодных для диеты больных целиакией. Все специалисты соглашаются с тем, что доза глиадина 100 мг в сутки, эквивалентная 200 мг глютена, т.е. около 3 г хлеба, является достаточной, чтобы вызвать у большинства больных целиакией увеличение количества кишечных внутриэпителиальных лимфоцитов, раннего сигнала продолжительного кишечного воспаления.
В отношении минимального порогового значения представляется, что в некоторых научных работах, проводимых до настоящего времени, показано, что прием до 10 миллиграммов глиадина в сутки (что эквивалентно 20 частицам на миллион глютена) не способен чувствительно повредить слизистую оболочку кишечника, но может обуславливать, в меньшем числе случаев, возникновение желудочно-кишечных симптомов.
На уровне международного законодательства до сих пор в силе остается старый стандарт «Кодекс стандартов для безглютеновых пищевых продуктов», который утверждает в качестве максимального содержание глютена в лечебно-диетических продуктах 0,05 г азота на 100 г сухого продукта (по отношению к пшеничному крахмалу), что соответствует глютеновой фракции, равной примерно 500 млн-1.
Однако происходит правильный и надлежащий пересмотр вышеуказанного руководства, который, как представляется, предусматривает, что безглютеновые пищевые продукты из натуральных безглютеновых ингредиентов не должны содержать более чем 20 млн-1 глютена, в то время как безглютеновые пищевые продукты, получаемые из злаковых с глютеном, могут иметь максимально до 200 млн-1 глютена.
В ожидании пересмотра вышеуказанного руководства во Франции, Великобритании и Нидерландах считают максимальным пределом для безглютеновых пищевых продуктов 200 млн-1.
Действующая в настоящее время в национальных рамках правовая норма представляется более превентивной, чем норма Сообщества или международная, фактически установлен предел «20 частей на миллион» как для продуктов, приготовленных из естественно безглютенового сырья, так и для продуктов, очищенных от этого вещества.
Правило предусматривает, что «если в составе пищевого продукта или в составе одного или более ингредиентов (ароматизаторов, вспомогательных веществ или со-адъювантов), образующих его, присутствуют злаки, содержащие глютен или вещества, производные от него, и/или если в ходе процесса изготовления можно получить в конечном продукте количество глютена, аналитически определяемое как выше чем 20 частей на миллион, у такого продукта должны быть указаны на этикетке, в конце перечня ингредиентов и хорошо видимым образом, слова «глютенсодержащий продукт».
Полное исключение глютена из питания, однако, осуществить нелегко, учитывая, что уже на уровне мукомольной промышленности может иметь место явление перекрестного загрязнения злаков и производных (крахмалы, мука, крахмальные пудры и т.д.), в природе не содержащих глютена.
Такие продукты затем используются в пищевой промышленности в изготовлении сложных пищевых продуктов на основе многочисленных технологических ингредиентов, вспомогательных веществ, со-адъювантов различного происхождения и природы.
Недавние исследования показали, что вплоть до 6% «теоретически» безглютеновых продуктов, на основе описанных ингредиентов, в действительности содержат более 30 мг глиадина на 100 г готового продукта, что эквивалентно 600 млн'1 глютена.
Поэтому, с целью исключения возможного загрязнения глютеном, необходимо продумывать для каждого промышленно внедряемого пищевого продукта не только все используемые ингредиенты и обработку, но также всю производственную цепочку для каждого отдельного ингредиента.
Следовательно, сохраняется необходимость в возможности получения пробиотических бактериальных культур, не содержащих аллергенных веществ, обусловленных применением ферментативных субстратов на основе молока или злаков или альтернативно случайными или перекрестными загрязнениями. В действительности, все-таки существует возможность того, что из-за перекрестных, случайных и побочных загрязнений некоторые компоненты, используемые в производственном процессе, несут следовые количества аллергенов.
Следовательно, сохраняется необходимость в возможности предложить способ получения пробиотических бактериальных культур, который предусматривает на каждой стадии производственного процесса, включая ферментацию, применение неаллергенных веществ. В частности, желательно определить и выбрать ферментативные субстраты, отличные от молока и его производных и глютенсодержащих злаков, которые являются хорошим источником азота и углерода.
Поэтому все работающие в данной отрасли согласны, что до настоящего времени сохраняется очень сильная необходимость предложить способ получения пробиотических бактериальных культур, в котором возможно применение субстратов, альтернативных используемым до настоящего времени, и одновременно способный снизить перекрестные, случайные и дополнительные загрязнения, если они возникают.
В частности, сохраняется необходимость предложить способ получения пробиотических бактериальных культур, который предусматривает двойной уровень безопасности в отношении отсутствия аллергенных веществ.
Целью данного изобретения является предложение способа получения культуральной среды, способной преодолеть ограничения, известные из уровня техники.
Другой целью данного изобретения является предложение способа получения пробиотических бактериальных культур, безопасных для введения всему населению, а также людям, страдающим аллергиями.
Как будет видно из следующего подробного описания, эти и другие цели были достигнуты заявителем, который улучшил способ, включающий двойной уровень безопасности в отношении отсутствия аллергенов в процессах производства пробиотических бактериальных культур.
В частности, заявитель создал способ получения, в котором используют выбранные неаллергенные ферментативные субстраты (неаллергенное сырье), способные обеспечить пробиотические культуры подходящими источниками азота и углерода.
Способ получения неаллергенных пробиотических бактериальных культур, композиция, включающая указанную культуру, и применение указанной культуры для изготовления так называемых «функциональных» или «нутрицевтических» продуктов питания образуют предмет данного изобретения, характеризующийся признаками, описанными в прилагаемой формуле изобретения.
В одном воплощении изобретения штаммы указанной бактериальной культуры принадлежат родам: Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Bacillus, Saccharomyces, Enterococcus, Leuconostoc.
Предпочтительно, из рода Lactobacillus нашли применение следующие виды. L. pentosus, L. plantarum, L. casei, L. casei ssp. paracasei, L. casei ssp. rhamnosus, L. acidophilus, L. delbrueckii ssp.bulgaricus, L. fermentum, L. gasseri.
Примеры используемых штаммов указанных видов представлены в прилагаемой Таблице 1. Предпочтительно, из рода Bifidobacterium нашли применение следующие виды; В. longum, В. breve, В. lactis, В. adolescentis и В. pseudocatenulatum.
Примеры используемых штаммов указанных видов представлены в прилагаемой Таблице 1. Предпочтительно, из рода Lactococcus нашли применение следующие виды: L. lactis и L. lactis ssp. Lactis.
Примеры используемых штаммов указанных видов представлены в прилагаемой Таблице 1. Предпочтительно, из рода Streptococcus нашел применение следующий вид; S. thermophilus.
Примеры используемых штаммов указанных видов представлены в прилагаемой Таблице 1.
В особенно предпочтительном воплощении изобретения бактерии указанной бактериальной культуры выбраны из группы, включающей пробиотические бактериальные штаммы, представленные в прилагаемой Таблице 1.
Заявитель обнаружил, что полезно выбирать и использовать особое неаллергенное сырье. В частности, заявитель нашел, что в качестве источника азота можно использовать пептоны и/или белковые гидролизаты растительного и/или животного происхождения, естественно не содержащие глютен и аллергены молочного происхождения, и в качестве источника углерода - глюкозу и/или другие моно- или дисахариды, полученные в результате гидролиза более сложных полисахаридов, типичных для растительных видов, естественно не содержащих глютен и аллергены молочного происхождения.
Пептоны растительного происхождения выбирают из группы, включающей: рис, картофель, кукурузу, каштаны, тапиоку, маниоку, горох, кормовые бобы и их смеси, способные, однако, поддерживать ферментативный бактериальный рост, но без образования аллергенов как молочного, так и глютенового типов.
В первом предпочтительном воплощении способ по данному изобретению предусматривает применение в качестве источника азота одного или более пептонов и/или неаллергенных белковых гидролизатов и в качестве источника углерода - глюкозу и/или другие моно- или дисахариды, полученные в результате гидролиза сложного полисахарида (неаллергенное сырье).
Во втором предпочтительном воплощении способ по данному изобретению предусматривает предварительную обработку сырья ферментами, подходящими для удаления следовых количеств аллергенов, если они имеются, появившихся в результате перекрестного загрязнения, имеющего место в ходе производственной и/или дистрибутивной цепочки.
В контексте данного изобретения культуральный субстрат является неаллергенным культуральным субстратом растительного и/или животного происхождения, от природы не содержащим глютена, аллергенов, или молочного происхождения и всех веществ, относящихся к перечню в приложении III бис инструкций (неаллергенное сырье), упомянутых выше. Применение вышеупомянутого неаллергенного сырья позволяет получать сертифицируемые пробиотики для применения у больных аллергией, так как можно гарантировать неиспользование веществ, относящихся к перечню приложения III бис вышеуказанных инструкций Сообщества, и применение ингредиентов, сертифицированных поставщиком как не содержащих таких веществ.
Далее, на основании того факта, что отсутствие любых химических веществ в данном образце не является научно доказуемым, но можно просто определить, что возможно существующее количество ниже, чем предел обнаружения используемого аналитического способа (даже если использовали более чувствительный и улучшенный способ, известный в данной области техники), также использование ферментативной предварительной обработки также становится источником дополнительной гарантии.
Ниже представлены, в качестве простого примера, некоторые неаллергенные композиции среды для роста пробиотических бактериальных культур.
Компоненты культуральной среды должны нести источники азота (в этом случае пептоны и/или белковые гидролизаты), источники углерода (в этом случае глюкоза и/или другие моно- или дисахариды, полученные в результате гидролиза сложных полисахаридов), биоактиваторы роста и витамины (в этом случае из дрожжевого экстракта) и минеральные соли.
Например, культуральная среда может содержать:
- глюкозу, предпочтительно выбранную из: кукурузного крахмала, картофеля, свекольной сахарозы или тростниковой сахарозы;
- пептон, предпочтительно выбранный из: риса, картофеля, кукурузы, каштана, тапиоки, маниоки, гороха, кормовых бобов, бобов или, как правило, бобовых и их смесей;
- пептон, предпочтительно выбранный из мясного;
- дрожжевой экстракт; минеральные соли (такие как, в качестве всего лишь примера: ацетаты, карбонаты, фосфаты, кислые фосфаты, хлориды, цитраты, сульфаты и другие); модифицирующая добавка (если необходимо, такая как: твин, лецитины и другие) и питьевая вода.
Один из составов, подходящих для роста штаммов родов Lactobacillus и Bifidobacterium, может предпочтительно включать следующие ингредиенты:
| глюкоза (из вышеперечисленных источников) | 10-100 г/л |
| рисовый пептон | 10-50 г/л |
| мясной пептон | 10-50 г/л |
| дрожжевой экстракт | 2-20 г/л |
| минеральные соли | 1-10 г/л |
| модифицирующие добавки | 0-5 мл/л |
| питьевая вода | сколько требуется до желаемого объема |
Предпочтительный пример среды для неаллергенных пробиотических бактериальных культур может быть следующий:
| глюкоза (из кукурузного крахмала) | 20 г/л |
| рисовый пептон | 10 г/л |
| мясной пептон | 10 г/л |
| дрожжевой экстракт | 5 г/л |
| ацетат натрия | 5 г/л |
| цитрат аммония | 2 г/л |
| двухосновный фосфат калия | 2 г/л |
| сульфат магния | 0,1 г/л |
| сульфат марганца | 0,05 г/л |
| твин 80 | 1 мл/л |
| питьевая вода | сколько требуется до желаемого объема |
Ферментацию проводят согласно руководствам, известным специалистам в данной области техники и в общепринятых экспериментальных условиях.
Заявитель контролирует присутствие или отсутствие следовых количеств аллергенов в пробиотической культуре, растущей на сырье, что является объектом данного изобретения.
Например, в случае аллергенов молочного происхождения, аналитическое исследование β-лактоглобулина и лактозы в конечных продуктах, с подтверждением специфичными и чувствительными методами (анализ с набором ELISA, специфичным к β-лактоглобулину типа «Bovine β-lactoglubilins ELISA quantitation kit (Комплект для количественного анализа бычьих β-лактоглобулинов) - Bethyl Laboratories» с пороговым пределом 0,05 млн-1, анализ с помощью хемоферментативного набора и детекции лактозы в ультрафиолетовой и видимой области типа «Lactose/D-glucose (Лактоза/D-глюкоза) - Boehringer Mannheim, cod. 10986119, с пороговым пределом 7 млн-1) дает отрицательный результат, и, следовательно, содержание этих веществ, если они содержатся, несомненно должно быть ниже порога обнаружения.
В то же время, исследование глютена, выполняемое посредством более усовершенствованной и пока более чувствительной утвержденной методики (ELISA RIDASCREEN® Gliadin kit - R-Biopharm А, Дармштадт, Германия, с чувствительностью, равной 3 млн-1), позволяет подтвердить отсутствие глютена. Следовательно, даже если глютен присутствовал, его концентрация в любом случае должна была быть ниже порога обнаружения, то есть ниже 3 млн-1.
Ферментативная предварительная обработка сырья, проводимая или нет в зависимости от необходимости, может гидролизовать следы молока и производных, глютен и производные, случайно присутствующие в культуральной среде.
Такая обработка обеспечивает самый высокий стандарт безопасности для применения, подходящего также для аллергичных и особенно чувствительных людей.
Такая производственная стратегия пригодна для пробиотической продукции со степенью неаллергенной безопасности, называемой DSS - система двойной безопасности.
Ферментативная предварительная обработка предусматривает применение по меньшей мере протеолитического фермента и/или применение по меньшей мере гликозидазного фермента.
В контексте данного изобретения протеолитический фермент может осуществлять протеолиз. Протеолитический фермент выбирают из группы, включающей протеазы и/или пептидазы. Протеазы и пептидазы выбирают из группы, включающей: трипсин, химотрипсин, панкреатин, пепсин, папаин и бромелаин. Предпочтительно, протеазы и пептидазы выбирают из пепсина и/или бромелаина. В контексте данного изобретения гликозидазный фермент способен осуществлять гидролитическое разложение гликозида. Гликозидазный фермент выбирают из группы, включающей: альфа-гликозидазу и бета-гликозидазу, альфа-галактозидазу и бета-галактозидазу.
Преимущественно ферментативную предварительную обработку сырья, образующего ростовой бульон для пробиотиков, осуществляют протеазами (алкалазами и бромелаином) и гликозидазами.
Гликозидазы выбирают из группы, включающей: лактазу (или β-галактозидазу). В предпочтительном воплощении предварительная обработка сырья предусматривает применение в последовательности трех ферментов, включая: алкалазу, лактазу и бромелаин.
В предпочтительном воплощении выбор ферментов и их последовательность являются следующими:
- алкалаза, которая гидролизует практически все белки и особенно белки молока;
- лактаза, которая гидролизует лактозу;
- бромелаин, который гидролизует глютен.
Указанная последовательность является функцией рН, оптимального для гидролиза, с градиентом от основного до кислого; таким образом среда сохраняет пищевые свойства. Алкалаза, активная в отношении β-лактоглобулина, α-лактоальбумина и казеинов, позволяет удалять аллергенные остатки, если они имеются, появляющиеся в результате случайного и непреднамеренного перекрестного загрязнения молочными производными.
Такая обработка предусматривает добавление к сырью растворенного в воде некоторого количества фермента в интервале от 0,0025 до 0,0500 г/л, что соответствует 0,001-0,020 АЕ/л (единиц Ансона на литр).
Затем раствор доводят до температуры 45-55°С в течение 15-60 минут, при рН между 7 и 8; предпочтительно контролируемое значение рН 7,50±0,20.
Лактаза, также известная как β-галактозидаза, отвечает за гидролиз гликозидной связи между глюкозой и галактозой в дисахариде лактоза.
Обработку лактазой осуществляют после гидролиза алкалазами белков после доведения рН культурального бульона до значения между 6 и 7; предпочтительно значение 6,50±0,20, достигаемое при помощи органических кислот (предпочтительно молочной кислоты) путем добавления 250-2000 NLU/л (нейтральные лактазные единицы на литр), что соответствует 0,05-0,40 мл ферментного раствора, титрованного при 5000 NLU/г.
Раствор выдерживают при 37±5°С в течение периода, варьирующегося от 2 до 6 часов. Наконец, бромелаин представляет протеолитический фермент, естественно содержащийся в ананасе, способный эффективно гидролизовать глиадин на фрагменты, не распознаваемые иммунной системой и поэтому неаллергенные.
Обработку производят путем добавления ферментационной среды с ферментом до количества 0,005-0,010 г/л (эквивалентного 110-220 GDU/л, желатин-гидролизующие единицы на литр), после коррекции рН до значений 5,0-6,0 органическими кислотами (предпочтительно молочной кислотой). Рабочая температура должна поддерживаться 37,5±5°С в течение 1-6 часов.
После трех ферментативных обработок необходимо восстановить рН до оптимального значения для ферментации отдельных штаммов (предпочтительно при помощи 5 н. NaOH для подщелачивания или молочной кислоты для подкисления).
Затем проводят тепловую обработку для очистки среды (выполняли при температурах 90-145°С в течение промежутков времени, варьирующихся от нескольких секунд до 45 минут), которая, однако, денатурирует и инактивирует добавленные ферменты, без дополнительных рисков для готового продукта и намеченных людей из-за остатков использованного фермента.
Типичная схема промышленного производства, следовательно, предусматривает следующие стадии:
1. выбор неаллергенного сырья;
2. растворение этого сырья в воде;
3. коррекция рН и температуры до значений, подходящих для применения протеолитического фермента, предпочтительно алкалазы;
4. добавление фермента и его воздействие в течение необходимого времени;
5. коррекция рН и температуры до значений, подходящих для применения гликолитического фермента, предпочтительно лактазы;
6. добавление фермента и его воздействие в течение необходимого времени;
7. коррекция рН и температуры до значений, подходящих для применения протеолитического фермента, предпочтительно бромелаина;
8. добавление фермента и его воздействие в течение необходимого времени;
9. коррекция рН и температуры до значений, подходящих для ферментации;
10. очистка посредством пастеризации и/или стерилизации культуральной среды;
11. охлаждение до температуры инокуляции, характерной для пробиотического штамма при продуцировании (37±2°С);
12. инокуляция штамма;
13. ферментация;
14. отделение биомассы и криопротекция;
15. лиофильная сушка.
Итак, настоящее изобретение позволяет получать неаллергенные пробиотические штаммы и, особенно, с полным отсутствием аллергенов, более предпочтительно молочных и глютеновых производных, с широкой безопасностью применения для всех групп населения.
Преимущественно неаллергенные пробиотические культуры, полученные согласно указаниям данного изобретения, могут эффективно применяться для изготовления фармацевтических препаратов.
Ввиду большого количества лиц с аллергией к молоку (3-5% населения в возрасте до 2 лет) и больных целиакией (1% от всего населения) является полезной попытка разработать пробиотические бактерии, которые могут быть введены также и этим группам населения.
Настоящее изобретение, следовательно, является полезным:
- для потребителей, для которых является важной прозрачность маркировки;
- для производителей, которые, таким образом, могут надеяться на продукт с полной гарантией его неаллергенных свойств, который, следовательно, может быть предложен всему покупающему населению.
1. Способ получения по меньшей мере одной неаллергенной пробиотической бактериальной культуры для изготовления пищевого продукта или фармацевтической композиции, предназначенных для лиц, пораженных целиакией и особенно чувствительных к аллергенным веществам глютенового и/или молочного типа, включающий по меньшей мере одну стадию, на которой бактерии получают путем выращивания в неаллергенном культуральном субстрате.
2. Способ по п.1, в котором указанные бактерии выбраны из группы, включающей следующие пробиотические бактериальные штаммы:
| 1 | Streptococcus thermophilus | LMGP-18383 |
| 2 | Streptococcus thermophilus | LMGP-18384 |
| 3 | Lactobacillus pentosus | LMGP-21019 |
| 4 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21020 |
| 5 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21021 |
| 6 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21022 |
| 7 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21023 |
| 8 | Lactobacillus casei ssp.paracasei | LMGP-21380 |
| 9 | Lactobacillus acidophilus | LMGP-21381 |
| 10 | Bifidobacterium longum | LMGP-21382 |
| 11 | Bifidobacterium breve | LMGP-21383 |
| 12 | Bifidobacterium lactis | LMGP-21384 |
| 13 | Lactobacillus plantamm | LMGP-21385 |
| 14 | Lactococcus lactis ssp.lactis | LMGP-21387 |
| 15 | Lactococcus lactis ssp.lactis | LMGP-21388 |
| 16 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21389 |
| 17 | Streptococcus thermophilus | DSM 16506 |
| 18 | Streptococcus thermophilus | DSM 16507 |
| 19 | Bifidobacterium longum | DSM 16603 |
| 20 | Bifidobacterium breve | DSM 16604 |
| 21 | Lactobacillus casei ssp.rhamnosus | DSM 16605 |
| 22 | Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus | DSM 16606 |
| 23 | Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus | DSM 16607 |
| 24 | Streptococcus thermophilus | DSM 16590 |
| 25 | Streptococcus thermophilus | DSM 16591 |
| 26 | Streptococcus thermophilus | DSM 16592 |
| 27 | Streptococcus thermophilus | DSM 16593 |
| 28 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 16594 |
| 29 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 16595 |
| 30 | Bifidobacterium breve | DSM 16596 |
| 31 | Bifidobacterium pseudocatenulatum | DSM 16597 |
| 32 | Bifidobacterium pseudocatenulatum | DSM 16598 |
| 33 | Staphylococcus xylosus | DSM 17102 |
| 34 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 17103 |
| 35 | Lactobacillus plantarum | DSM 17104 |
| 36 | Streptococcus thermophilus | DSM 17843 |
| 37 | Streptococcus thermophilus | DSM 17844 |
| 38 | Streptococcus thermophilus | DSM 17845 |
| 39 | Lactobacillus fermentum | DSM 18295 |
| 40 | Lactobacillus fermentum | DSM18296 |
| 41 | Lactobacillus fermentum | DSM 18297 |
| 42 | Lactobacillus fermentum | DSM 18298 |
| 43 | Lactobacillus gasseri | DSM 18299 |
| 44 | Lactobacillus gasseri | DSM 18300 |
| 45 | Lactobacillus gasseri | DSM 18301 |
| 46 | Lactobacillus gasseri | DSM18302 |
| 47 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 18350 |
| 48 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 18351 |
| 49 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 18352 |
| 50 | Bifidobacterium catenulatum | DSM 18353 |
3. Способ по п.1, в котором неаллергенный культуральный субстрат включает по меньшей мере пептон и/или белковый гидролизат, причем пептон и/или белковый гидролизат выбраны из группы, включающей пептон и/или белковый гидролизат растительного и/или животного происхождения.
4. Способ по п.3, в котором пептон растительного происхождения выбран из группы, включающей: рис, картофель, кукурузу, каштаны, тапиоку, маниоку, горох, кормовые бобы, бобовые и/или их смеси; и пептон животного происхождения выбран из мясных пептонов.
5. Способ по п.1, в котором неаллергенный культуральный субстрат включает по меньшей мере вещество, выбранное из: глюкозы и/или моно- или дисахарида, полученного гидролизом сложных полисахаридов; глюкозы, полученной из кукурузного крахмала, картофельного крахмала или из свекольной или тростниковой сахарозы.
6. Способ по п.1, в котором неаллергенный культуральный субстрат включает: глюкозу, полученную из кукурузного крахмала, картофельного крахмала или из свекольной или тростниковой сахарозы; по меньшей мере мясной пептон и по меньшей мере пептон растительного происхождения, выбранный из группы, включающей: рис, картофель, кукурузу, каштаны, тапиоку, маниоку, горох, кормовые бобы, бобовые и их смеси.
7. Способ по п.1, в котором указанные бактерии, находящиеся в контакте с указанным неаллергенным культуральным субстратом, подвергают стадии ферментации и затем лиофильно сушат.
8. Способ по п.1, в котором полученные пробиотические бактериальные культуры представляют собой неаллергенные пробиотические бактериальные культуры, содержащие аллергены в количестве ниже предела обнаружения: 3 млн-1 для глютена, 7 млн-1 для лактозы и 0,05 млн-1 для бета-лактоглобулинов.
9. Способ получения по меньшей мере одной неаллергенной пробиотической бактериальной культуры для изготовления пищевого продукта или фармацевтической композиции, предназначенных для лиц, пораженных целиакией и особенно чувствительных к аллергенным веществам глютенового и/или молочного типа, где бактерии указанной культуры выбраны из группы, включающей следующие пробиотические бактериальные штаммы:
| 1 | Streptococcus thermophilus | LMGP-18383 |
| 2 | Streptococcus thermophilus | LMGP-18384 |
| 3 | Lactobacillus pentosus | LMGP-21019 |
| 4 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21020 |
| 5 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21021 |
| 6 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21022 |
| 7 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21023 |
| 8 | Lactobacillus casei ssp.paracasei | LMGP-21380 |
| 9 | Lactobacillus acidophilus | LMGP-21381 |
| 10 | Bifidobacterium longum | LMGP-21382 |
| 11 | Bifidobacterium breve | LMGP-21383 |
| 12 | Bifidobacterium lactis | LMGP-21384 |
| 13 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21385 |
| 14 | Lactococcus lactis ssp.lactis | LMGP-21387 |
| 15 | Lactococcus lactis ssp.lactis | LMGP-21388 |
| 16 | Lactobacillus plantarum | LMGP-21389 |
| 17 | Streptococcus thermophilus | DSM 16506 |
| 18 | Streptococcus thermophilus | DSM 16507 |
| 19 | Bifidobacterium longum | DSM 16603 |
| 20 | Bifidobacterium breve | DSM 16604 |
| 21 | Lactobacillus casei ssp.rhamnosus | DSM 16605 |
| 22 | Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus | DSM 16606 |
| 23 | Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus | DSM 16607 |
| 24 | Streptococcus thermophilus | DSM 16590 |
| 25 | Streptococcus thermophilus | DSM 16591 |
| 26 | Streptococcus thermophilus | DSM 16592 |
| 27 | Streptococcus thermophilus | DSM 16593 |
| 28 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 16594 |
| 29 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 16595 |
| 30 | Bifidobacterium breve | DSM 16596 |
| 31 | Bifidobacterium pseudocatenulatum | DSM 16597 |
| 32 | Bifidobacterium pseudocatenulatum | DSM 16598 |
| 33 | Staphylococcus xylosus | DSM 17102 |
| 34 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 17103 |
| 35 | Lactobacillus plantarum | DSM 17104 |
| 36 | Streptococcus thermophilus | DSM 17843 |
| 37 | Streptococcus thermophilus | DSM 17844 |
| 38 | Streptococcus thermophilus | DSM 17845 |
| 39 | Lactobacillus fermentum | DSM 18295 |
| 40 | Lactobacillus fermentum | DSM 18296 |
| 41 | Lactobacillus fermentum | DSM 18297 |
| 42 | Lactobacillus fermentum | DSM 18298 |
| 43 | Lactobacillus gasseri | DSM 18299 |
| 44 | Lactobacillus gasseri | DSM 18300 |
| 45 | Lactobacillus gasseri | DSM 18301 |
| 46 | Lactobacillus gasseri | DSM 18302 |
| 47 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 18350 |
| 48 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 18351 |
| 49 | Bifidobacterium adolescentis | DSM 18352 |
| 50 | Bifidobacterium catenulatum | DSM 18353 |
и где способ включает по меньшей мере одну стадию, на которой бактерии получают путем выращивания в неаллергенном культуральном субстрате, ранее подвергнутом ферментативной предварительной обработке для удаления следовых количеств аллергенов, появляющихся в результате перекрестного или случайного загрязнения.
10. Способ по п.9, в котором ферментативная предварительная обработка предусматривает применение по меньшей мере протеолитического фермента и/или по меньшей мере гликозидного фермента; причем протеолитический фермент выбран из группы, включающей протеазы и/или пептидазы, выбранные из группы, включающей: трипсин, химотрипсин, панкреатин, пепсин, папаин и бромелаин; и гликозидный фермент выбран из группы, включающей альфа-гликозидазу и бета-гликозидазу, альфа-галактозидазу и бета-галактозидазу.
11. Способ по п.9, в котором ферментативная предварительная обработка включает использование по меньшей мере протеазы, выбранной из алкалазы и бромелаина, и по меньшей мере гликозидазы, выбранной из лактазы или бета-галактозидазы.
12. Способ по п.9, в котором предварительная ферментативная обработка включает последовательное применение: алкалазы, лактазы и бромелаина.
13. Способ по п.12, в котором:
алкалазу и неаллергенный субстрат обрабатывают при температуре 45-55°С в течение 15-60 мин при рН 7-8;
лактазу и неаллергенный культуральный субстрат обрабатывают при температуре 30-40°С в течение 2-6 ч при рН 6-7;
бромелаин и неаллергенный культуральный субстрат обрабатывают при температуре 30-40°С в течение 1-6 ч при рН 5-6.
14. Способ по п.9, в котором в конце ферментативной предварительной обработки предусмотрены: стадия, на которой рН восстанавливают до значений, пригодных для ферментации отдельных штаммов, стадия тепловой обработки при температуре между 90 и 145°С для денатурации и инактивации ферментов, используемых в указанной ферментативной предварительной обработке, и стадия ферментации указанных штаммов.
15. Способ по п.9, в котором неаллергенный культуральный субстрат включает по меньшей мере пептон и/или белковый гидролизат, причем пептон и/или белковый гидролизат выбран из группы, включающей пептон и/или белковый гидролизат растительного и/или животного происхождения.
16. Способ по п.15, в котором пептон растительного происхождения выбран из группы, включающей: рис, картофель, кукурузу, каштаны, тапиоку, маниоку, горох, кормовые бобы и их смеси, и пептон животного происхождения выбран из мясных пептонов.
17. Способ по п.9, в котором неаллергенный культуральный субстрат включает по меньшей мере вещество, выбранное из: глюкозы и/или моно- или дисахарида, полученного гидролизом сложных полисахаридов, причем глюкоза получена из кукурузного крахмала, картофеля, или свекольной, или тростниковой сахарозы.
18. Способ по п.9, в котором неаллергенный культуральный субстрат включает: глюкозу, полученную из кукурузного крахмала, картофельного крахмала или из свекольной или тростниковой сахарозы; по меньшей мере мясной пептон и по меньшей мере пептон растительного происхождения, выбранный из группы, включающей: рис, картофель, кукурузу, каштаны, тапиоку, маниоку, горох, кормовые бобы, бобовые и/или их смеси.
19. Способ по п.9, в котором указанные бактерии, находящиеся в контакте с указанным неаллергенным культуральным субстратом, подвергают ферментации и затем лиофильно сушат.
20. Способ по п.9, в котором полученные пробиотические бактериальные культуры являются неаллергенными пробиотическими бактериальными культурами, содержащими аллергены в количестве ниже предела обнаружения: 3 млн-1 для глютена, 7 млн-1 для лактозы и 0,05 млн-1 для бета-лактоглобулинов.
