Средство для ингибирования фермента поли(адф-рибозо)полимеразы-1 человека

Изобретение относится к средству для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека, представляющему собой производные нуклеозидов общей формулы (I), где Х - Н или OR₁; один или два из заместителей R₁, R₂, R₃ - моносахаридные остатки, остальные - протоны водорода; В - азотистое основание, присоединенное в α- или β-положении. 1 табл., 2 ил.

 

Изобретение относится к молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии, конкретно к средствам для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека, представляющим собой производные нуклеозидов общей формулы (I),

где Х - Н или OR₁, один или два из заместителей R₁, R₂, R₃ - моносахаридные остатки, остальные - протоны водорода; В - азотистое основание, присоединенное в α- или β-положении.

В последние годы ведутся активные поиски ингибиторов фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 (ПАРП-1), который рассматривается как перспективный фермент-мишень для создания лекарственных препаратов для лечения инсульта, ишемии, диабета, артритов, колитов и других воспалительных заболеваний. Ингибиторы ПАРП-1 также могут быть использованы как потенциальные противораковые и противовирусные агенты [N.J.Curtin. Expert Rev Mol Med. 7, 1-20 (2005); P.Jagtap, C.Szabό. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 421-440 (2005)].

Поли-АДФ-рибозилирование - посттрансляционная модификация белков в эукариотических клетках. Процесс катализируется поли(АДФ-рибозо)полимеразами (ПАРП). Эти ферменты осуществляют превращение никотинамид-адениндинуклеотида (НАД⁺) в полимер, поли(АДФ-рибозу), с высвобождением никотинамида. В обзорах [D.D'Amours, et al. Biochem J. 342, 249-268 (1999); P.O.Hassa, et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70, 789-829 (2006)] рассматривается многообразная биологическая роль поли(АДФ-рибозы). Известно, что она вовлечена в процессы модуляции структуры хроматина, репликации, транскрипции, репарации ДНК (главным образом, процесс эксцизионной репарации оснований), дифференцировки клеток и клеточной гибели. Детальное изучение внутриклеточных функций поли(АДФ-рибозы) продолжается и в настоящее время.

В настоящее время клинические испытания проходят шесть ингибиторов ПАРП-1, относящихся к циклическим аминам [Leal A.P.; et al., PARP inhibitors: New partners in the therapy of cancer and inflammatory diseases, Free Radic. Biol. Med. (2009), doi:10.1016/j.freeradbiomed.2009.04.008]. Эти соединения являются узкоспецифичными препаратами, которые предполагается использовать для лечения конкретных видов новообразований, в то время как для других заболеваний, связанных с функционированием ПАРП-1, лекарств-ингибиторов ПАРП-1 пока не существует.

К недостаткам существующих ингибиторов ПАРП-1 в первую очередь следует отнести плохую растворимость гетероциклических соединений в воде, а также небольшое время жизни их в организме. В последнее время появляются данные о водорастворимых ингибиторах ПАРП-1 [напр., H.Nakajima, et al., J. Pharmacol. Exp.Therapeutics. 312:472-481, (2005)]. Хотя такие соединения обладают хорошими фармакокинетическими свойствами, их цитотоксичность не изучена.

Наиболее ближайшими к заявляемому средству для ингибирования ПАРП-1 - прототипом, являются рибонуклеозиды и 2'-дезоксинуклеозиды общей формулы (II)

где X - атом водорода или ОН-группа.

К недостаткам прототипа относится то, что природные нуклеозиды являются структурными элементами нуклеиновых кислот и участвуют в многочисленных процессах в клетке, что исключает специфичность их воздействия на определенный фермент, а также низкая эффективность (IС₅₀ составляет около 1 мМ) [Preiss et al., 1971, FEBS Lett., 19, 244-246].

Технической задачей изобретения является создание более эффективных и специфичных ингибиторов ПАРП-1 на основе нуклеозидов, содержащих дополнительные моносахаридные остатки, присоединенные к рибозе через O-гликозидную связь.

Поставленная техническая задача решается предлагаемыми соединениями общей формулы (I), представляющими собой нуклеозиды, содержащие дополнительные моносахаридные остатки, присоединенные к рибозе О-гликозидной связью, в качестве средства для ингибирования поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека (ПАРП-1).

Предлагаемые соединения получают известным способом, описанным в [E.V.Efimtseva, et al., Current Organic Chemistry, 11, No 4, 337-354 (2007)]. Метод синтеза заключается в конденсации небольшого избытка полностью ацилированного моносахарида с частично защищенными нуклеозидами, имеющими одну свободную гидроксильную группу, в присутствии тетрахлорида олова. O-гликозилирование протекает стереоспецифично с образованием β-гликозидной связи.

На фиг.1 представлена схема синтеза предлагаемых соединений, где R₁=1,1,3,3-O-тетра-изопропилдисилоксан-1,3-диил; R₂=O-трет-бутилдифенилсилил; В=Ura, Thy, Cyt^Bz, Ade^Bz, Gua^iBu; B'=Ura, Thy, Cyt, Ade, Gua; a - SnCl₄, ClСH₂CH₂Cl, 0°C; b - деблокирование, Bu₄NF/THF; 5 M NH₃/MeOH. R=H, OH.

В частном случае, в качестве примеров на фиг.1 представлены 1-O-ацетил-2,3,5-три-(9-бензоил-β-D-рибофураноза (соединение i) и 1,2,3,5-тетра-O-ацетил-β-D-рибопираноза (соединение ii). В реакции O-гликозилирования также использовались и другие ацилированные моносахариды: D-арабиноза, L-арабиноза, 5-амино-5-дезоксирибоза и D-эритроза.

Структура и чистота полученных соединений подтверждались данными ЯМР-, УФ-, КД-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Синтез 2'-О-β-D-рибофуранозилтимидина (1 на фиг.1)

На первом этапе синтеза осуществляли конденсацию N⁶-бензоил-3',5'-(1,1,3,3-O-тетра-изопропилдисилоксан-1,3-диил(ТIРDS))тимина (Markiewicz et al., 1986; CPNAC unit 2.4) и 1-O-ацетил-2,3,5-три-O-бензоил-β-D-рибофуранозы в присутствии тетрахлорида олова в 1,2-дихлорэтане при 0°С. Для того чтобы повысить выход целевых нуклеозидов и упростить процедуру их выделения, реакцию гликозилирования проводили в атмосфере азота, без доступа влаги воздуха.

Вторым этапом синтеза удаляли защитные группы с 3'- и 5'-положений полученного соединения действием фторид-ионов (тетрабутиламмония фторида тригидрата, TBAF). Реакцию проводили в 0,5 М растворе TBAF в тетрагидрофуране в течение 20-30 мин, при комнатной температуре.

На последнем этапе производили удаление бензоильных защитных групп с дополнительного сахарного остатка при помощи 5 М раствора аммиака в метаноле (полунасыщенный раствор при 0°С). Реакция полностью проходила за 2-3 дня при комнатной температуре.

Характеристики полученного соединения: Т_пл 236-237°С (этанол). R_f 0.16 (8:2 v/v СН₂Сl₂/МеОН). [α]²⁰ _D-52° (с 0.82, вода). УФ (рН 1-7): λ_mах 269 nm (ε9400); (рН 13): λ_mах 262 nm (ε7100). Масс-спектр: (C₁₅H₂₂N₂O₁₀+Н). Вычислено 391.1352. Найдено 391.1362. ¹Н ЯМР (400 МГц, D₂O): 7.66 кв (1H, J_6,CH3=1.2, Н-6, Thy), 6.03 д (1H, J_1',2' = 5.5, Н-1', Thd), 5.12 с (1H, Н-1', Rib), 4.44 дд (1H, J_2',3'=5.5, H-2', Thd), 4.38 дд (1H, J_3',4'=4.7, Н-3', Thd), 4.14 дд (1H, J_2',3'=4.7, J_3',4'=6.7, Н-3', Rib), 4.13 дд (1H, H-2', Rib), 4.11 ддд (1H, J_4',5'a=3.1, J_4',5'b=4.5, H-4', Urd), 3.99 ддд (1H, J_4',5'a=3.6, J_4'5'b=6.7, H-4', Rib), 3.88 дд (1H, J_5'a,5'b=-12.7, H-5'a, Thd), 3.81 дд (1H, H-5'b, Urd), 3.71 дд (1H, J_5'a,5'b=-12.1, H-5'a, Rib), 3.44 дд (1H, H-5'b, Rib), 1.91 д (1H, Ме-5). ¹³С ЯМР (D₂O): 167.28 (С-4), 152.71 (С-2), 138.49 (С-6), 112.82 (С-5), 107.71 (С-1', Rib), 88.50 (С-1', Thd), 85.60 (С-4', Thd), 83.88 (С-4', Rib), 79.17 (С-2', Thd), 75.32 (С-2', Rib), 71.74 (С-3', Rib), 69.32 (C-3', Thd), 64.03 (С-5', Rib), 61.71 (С-5', Thd), 12.47 (Ме-5).

Пример 2. Синтез 2'-O-β-D-рибофуранозилгуанозина (2 на фиг.1)

На первом этапе синтеза осуществляли конденсацию N⁶-бензоил-3',5'-(1,1,3,3-O-тетра-изопропилдисилоксан-1,3-диил(ТIРDS))гуанина (Markiewicz et al., 1986; CPNAC unit 2.4) и 1-O-ацетил-2,3,5-три-O-бензоил-β-D-рибофуранозы в присутствии тетрахлорида олова в 1,2-дихлорэтане при 0°С. Для того чтобы повысить выход целевых нуклеозидов и упростить процедуру их выделения, реакцию гликозилирования проводили в атмосфере азота, без доступа влаги воздуха.

Вторым этапом синтеза удаляли защитные группы с 3'- и 5'-положений полученного соединения действием фторид-ионов (тетрабутиламмония фторида тригидрата, TBAF). Реакцию проводили в 0,5 М растворе TBAF в тетрагидрофуране в течение 20-30 мин, при комнатной температуре.

На последнем этапе производили удаление бензоильных защитных групп с дополнительного сахарного остатка при помощи 5 М раствора аммиака в метаноле (полунасыщенный раствор при 0°С). Реакция полностью проходила за 2-3 дня при комнатной температуре.

9-(2-O-β-D-рибофуранозил-β-D-рибофуранозил)-гуанин (1В=Gua). Т_пл 215-216°С (EtOH). R_f 0.09 (8:2 v/v CH₂Cl₂/МеОН). [α]²⁰ _D -75° (с 0.92, вода). УФ (рН 1): λ_mах 257 nm (ε 10800); (рН 7): λ_mах 254 nm (ε 12000); (pH 13): λ_mах 263 nm (ε 10000). Масс-спектр: (C₁₅H₂₁N₅O₉+Н). Вычислено 416.1417. Найдено 416.1413. ¹Н ЯМР (400 МГц, D₂O): 8.03 с (1Н, Н-6, Gua), 6.01 д (1Н, J_1',2'=6.3, Н-1', Guo), 5,12 д (1Н, J_1',2'=0.8, Н-1', Rib), 4.81 дд (1Н, J_2',3'=5.3, Н-2', Guo), 4.56 дд (1Н, J_3',4'=3.3, H-3', Guo), 4.26 ддд (1Н, J_4',5'а=3.1, J_4',5'b=4.1, H-4', Guo), 4.17 дд (1Н, J_2',3'=4.6, H-2', Rib), 4.08 дд (1Н, J_3',4'=7.3, H-3', Rib), 3.92 ддд (1Н, J_4',5'a=3.8, J_4',5'b=6.8, H-4', Rib), 3.91 дд (1Н, J_5'a,5'b=-12.8, H-5'a, Guo), 3.85 дд (1Н, H-5'b, Guo), 3.47 дд (1Н, J_5'a,5'b=-11.9, H-5'a, Rib), 3.01 дд (1Н, H-5'b, Rib). ¹³С ЯМР (D₂O): 159.89 (C-6), 154.86 (C-2), 150.85 (C-4), 139.28 (C-8), 117.67 (C-5), 107.18 (С-1', Rib), 87.52 (С-1', Guo), 87.03 (C-4', Guo), 83.80 (C-4', Rib), 78.98 (C-2', Guo), 75.37 (C-2', Rib), 72.06 (C-3', Rib), 69.96 (C-3', Guo), 64.02 (C-5', Rib), 62.41 (C-5', Guo).

Пример 3. Синтез 3'-O-β-D-рибофуранозил-2'-дезокситимидина (3 на фиг.1)

На первом этапе проводили конденсацию 5'-O-трет-бутилдифенилсилил-тимидина с 1-O-ацетил-2,3,5-три-O-бензоил-β-D-рибофуранозой.

Вторым этапом синтеза удаляли защитные группы с 5'-положения нуклеозида действием фторид-ионов (тетрабутиламмония фторида тригидрата, Bu₄NFх3Н₂O). Реакцию проводили в 0,5 М растворе Bu₄NF в тетрагидрофуране в течение 20-30 мин, при комнатной температуре.

Затем проводили удаление бензоильных защитных групп с дополнительного углеводного остатка при помощи 5 М раствора аммиака в метаноле (полунасыщенный раствор при 0°С). Реакция полностью проходила за 2-3 дня при комнатной температуре.

Характеристики полученного соединения: R_f 0.42 (8:2 v/v СН₂Сl₂/ЕtOН). [α]²⁰ _D-28° (с 1.0, Н₂О). УФ (рН 1-7): λ_max 267 нм (ε 9600); (рН 13): λ_max 267 nm (ε 7400). Масс-спектр: (C₁₅H₂₂N₂O₉+Н). Вычислено 375.1404. Найдено 375.1419. ¹Н ЯМР (400 МГц, D₂O): 7.50 д (1Н, J_6,5=1,2 Гц, Н-6), 6.11 т (1Н, J_1',2'a=J_1',2'b=6.8 Гц, Н-1' Thd), 4.99 с (1Н, Н-1' Rib), 4.33 м (1Н, Н-3' Thd), 4.10 дд (1Н, J_3',2'=4.8 Гц, J_3',4'=6.3 Гц, Н-3' Rib), 4.01-3.87 м (3Н, Н-4', 5'а, 5'b Thd), 3.76-3.65 м (3Н, Н-2', 4', 5'а Rib), 3.57 дд (1Н, J_5'b,4'=6.6, J_5'b,5'a=-12.4 Гц, H-5'b Rib), 2.50-2.12 м (2Н, Н-2'а, 2'b Thd), 1.76 дд (3Н, Ме-5). ¹³С ЯМР (D₂O): 167.48 (С-4), 152.69 (С-2), 138.41 (С-6), 112.44 (С-5), 107.64 (С-1' Rib), 86.22 (С-1' Thd), 85.73 (С-4' Thd), 83.96 (C-4' Rib), 78.55 (C-3' Thd), 75.63 (С-2' Rib), 71.82 (C-3' Rib), 63.88 (С-5' Rib), 62.33 (С-5' Thd), 38.33 (С-2' Thd), 12.60 (Ме-5).

Пример 4. Синтез 3'-O-β-D-рибопиранозил-2'-дезокситимидина (5 на фиг.1)

На первом этапе проводили конденсацию 5'-O-трет-бутилдифенилсилил-тимидина с 1-O-ацетил-2,3,5-три-O-бензоил-β-D-рибопиранозой.

Вторым этапом синтеза удаляли защитные группы с 5'-положения нуклеозида действием фторид-ионов (тетрабутиламмония фторида тригидрата, Вu₄NFx3Н₂О). Реакцию проводили в 0,5 М растворе Bu₄NF в тетрагидрофуране в течение 20-30 мин, при комнатной температуре.

Затем проводили удаление бензоильных защитных групп с дополнительного углеводного остатка при помощи 5 М раствора аммиака в метаноле (полунасыщенный раствор при 0°С). Реакция полностью проходила за 2-3 дня при комнатной температуре.

Характеристики полученного 3'-O-β-D-рибопиранозил-2'-дезокситимидина: Т_пл 126-128°С. [а]_D-40.7° (с 0.73, вода). УФ (рН 1-7): λ_max 267 nm (ε 9400); (рН 13): λ_max 267 nm (ε 7100).

Масс-спектр: (C₁₅H₂₂N₅O₉+H). Вычислено 375.1404. Найдено 375.1380. ¹Н ЯМР (D₂O): 7.55 к (1Н, J_6,5=1.0 Гц, Н-6), 6.18 дд (1Н, J_1',2'a=6.2 Гц, J_1',2'b=7.3 Гц, Н-1' Thd), 4.77 д (1Н, J_1'2'=5.5 Гц, Н-1' Rib), 4.41 ддд (1Н, J_3',2a'=3.6 Гц, J_3',2'b'=6.8 Гц, J_3',4'=2.5 Гц, Н-3' Thd), 4.09 м (1Н, H-4' Thd), 4.00 т (1Н, J_3',2'=J_3',4'=2.9 Гц, Н-3', Rib), 3.85-3.53 м (6Н, H-5'a,5'b Thd, H-2',4',5'a,5'b Rib), 2.44 ддд (1Н, J_2'a,2'b=-14.1 Гц, H-2'a Thd), 2.32 ддд (1Н, H-2'b Thd), 1.80 д (3Н, Ме-5). ¹³С ЯМР (D₂O): 166.90 (С-4), 152.10 (С-2), 137.84 (С-6), 111.91 (С-5), 100.55 (С-1' Rib), 85.70 (С-1' Thd), 85.22 (С-4' Thd), 78.69 (С-3' Thd), 70.61 (С-2' Rib), 68.40 (С-3' Rib), 68.03 (С-4' Rib), 63.87 (С-5' Thd), 61.76 (С-5' Rib), 37.59 (С-2' Thd), 12.00 (Ме-5).

Пример 5. Исследование влияния нуклеозидов с дополнительными моносахаридными остатками на активность ПАРП-1

Рекомбинантная поли(АДФ-рибоза)-полимераза 1 человека (КФ 2.4.2.30) была экспрессирована в системе Escherichia coli (штамм BL21 DE3 (pLys E)). Синтез ПАРП-1 индуцировали добавлением IPTG до 1 мМ, далее клеточную культуру инкубировали в течение 3 ч при 37°С. Затем клетки осаждали центрифугированием и полученный осадок суспендировали в буфере, содержавшем 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 10%-ный глицерин, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ PMSF, 1 мМ бензамидин (буфер A), AntPrt-Coctail в количестве, рекомендованном производителем, и 2 М NaCl. Клетки разрушали ультразвуком. Дальнейшая схема очистки включала ряд последовательных хроматографий с использованием Ni-NTA (элюция 250 мМ имидазолом в буфере А), гепарин-сефарозы (элюция линейным градиентом NaCl (0,1-0,8 М) в буфере А) и одноцепочечной ДНК-целлюлозы (элюция линейным градиентом NaCl (0,1-1 М) в буфере А). Чистоту полученных препаратов ПАРП-1 контролировали на всех стадиях очистки с помощью электрофореза по методу Лэммли [Laemmli, U.K. (1970) Nature, 227, 680-685]. Диализ конечного препарата проводили против буфера А, содержавшего 0,1 M NaCl. Конечный препарат хранили в аликвотах по 20 мкл при -70°С.

В качестве тест-системы для определения ингибирующих свойств соединений использована реакция автополи(АДФ-рибозил)ирования, катализируемая ПАРП-1. Условия проведения реакции: 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 20 мМ MgCl₂, 150 мМ NaCl, 7 мМ β-меркаптоэтанол, активированная ДНК 2°А₂₆₀/мл, степень активации 25%, 0,3°мМ [³Н] НАД⁺ (изотопное разбавление 1:1000) при температуре 37°С. Концентрация потенциальных ингибиторов варьировалась в пределах от 10 нМ до 1 мМ. Реакцию запускали добавлением ПАРП-1 до конечной концентрации 500 нМ и останавливали нанесением на бумажные фильтры Whatman 1, пропитанные 5% ТХУ, через 30 сек. Фильтры отмывали в 5% ТХУ 4-кратно, затем удаляли ТХУ 90% этанолом. Фильтры сушили на воздухе.

Обсчет включения радиоактивности в кислотонерастворимый продукт проводили на сцинтилляционном счетчике QuantaSmart в толуольном сцинтилляторе. Детекция радиоактивномеченого продукта проводилась на линейном участке зависимости скорости от времени реакции при концентрации природного субстрата НАД, равной Km. В качестве показателя эффективности ингибирования использовали значение IC₅₀. Значение IC₅₀ представляет собой концентрацию испытуемого соединения, которая вызывает 50% снижение активности ПАРП-1. Расчет значений IС₅₀ проводили с помощью программы OriginPro 7.0.

На фиг.2 приведена типичная кривая зависимости скорости реакции автополи(АДФ-рибозил)ирования от концентрации ингибитора (3'Rib-α-dAde, (7) на фиг.1).

Из фиг.2 видно, что скорость включения радиоактивности в кислотонерастворимый продукт падает с увеличением концентрации ингибитора.

Соединения, использованные в качестве ингибиторов ПАРП-1, перечислены в таблице.

Из таблицы видно, что наиболее эффективными ингибиторами ПАРП-1 среди нуклеозидов с дополнительными моносахаридными остатками являются производные тимидина. Тимидиновые производные ингибируют фермент со значениями IС₅₀ от 0,2 мМ до 0,05 мМ, что в 5-20 раз меньше, чем у прототипа. Высокую ингибирующую активность проявили также 3-O-β-D-рибофуранозил-2-дезокси-α-D-аденозин (IС₅₀ 0,2 мМ, что в 5 раз меньше, чем у прототипа), и 9-(2-O-β-D-рибофуранозил-β-D-рибофуранозил)-гуанин (IС₅₀ 0,5 мМ, что в два раза меньше, чем у прототипа), и 9-(3-O-β-D-рибофуранозил-β-D-рибофуранозил)-цитозин (IС₅₀ 0,6 мМ, что в 1,7 раза меньше, чем у прототипа).

В таблице не приведены соединения урацила, которые не оказывали ингибирующего действия на ПАРП-1 ни в одной конфигурации сахарной части молекулы.

Пример 6. Исследование специфичности ингибирования ПАРП-1 предлагаемыми соединениями

Для оценки специфичности ингибирования ПАРП-1 предлагаемыми соединениями исследовали влияние этих соединений на два других фермента - участника эксцизионной репарации оснований (ЭРО): ДНК-полимеразу β (β-пол) и апуриновую/апиримидиновую эндонуклеазу 1 (АРЕ-1).

β-Пол - фермент ЭРО, участвующий как в короткозаплаточном пути (встраивание одного нуклеотида и удаление 5'-дезоксирибозофосфатного остатка), так и в длиннозаплаточном (включение первого нуклеотида, а по некоторым данным и ресинтез более протяженного участка) [Podlutsky A.J. et al., EMBO J. 2001. V.20. P.1477-1482; Matsumoto Y., et al., Science. 1995. V.269 P.699-702; Sobol R.W., et al., Nature. 1996. V.379. P.183-186]. Были исследованы ингибирующие свойства всех приведенных в таблице производных нуклеозидов (в концентрации 1 мМ) на активность β-пол в реакции синтеза ДНК с использованием активированной ДНК (смесь двухцепочечных ДНК с брешами различного размера). Установлено, что исследованные соединения не оказывали существенного влияния на активность β-пол (активность фермента в присутствии ингибиторов составляла 80-105% от контрольной). Отсутствие ингибирования β-пол этими соединениями указывает на их специфичность по отношению ПАРП-1.

Влияние предлагаемых соединений на активность АРЕ-1 оценивали на примере 3'RibdThy (3), наиболее эффективного из всех перечисленных в таблице ингибиторов ПАРП-1. АРЕ-1 является основным белком клеток человека, ответственным за процессинг АП-сайтов [Wilson 3^rd D.M., Barsky D. Mutat. Res. 2001. V.485. P.283-307]. Действие АРЕ-1 на поврежденную ДНК предшествует действию β-пол, предоставляя последней дуплекс с одноцепочечным разрывом, содержащим 3'-гидроксил и 5'-рибозофосфат для последующего удаления 5'-рибозофосфата и заполнения бреши.

Активность АРЕ-1 тестировали в присутствии 32-мерного дуплекса, содержащего АП-сайт в 16-м положении. Для получения этого субстрата сплавляли 32-мерный олигонуклеотид, радиоактивномеченый по 5'-концу и содержащий остаток dUMP в средине цепи, с комплементарной ему цепью. АП-сайт генерировали непосредственно перед экспериментом, удаляя остатки урацила за счет активности урацил-ДНК-гликозилазы. Отбирали аликвоты реакционных смесей и обрабатывали их боргидридом натрия, что делает нерасщепленные АП-сайты устойчивыми в процессе дальнейшего разделения продуктов реакции в полиакриламидном геле.

Установлено, что 3'RibdThy не влиял на активность АРЕ-1 в концентрации 1 мМ, что указывает на специфичность этого ингибитора по отношению к ПАРП-1. Все исследованные соединения осуществляют избирательное ингибирование поли(АDP-рибоз)илирования, не затрагивая ключевые этапы процесса эксцизионной репарации оснований.

Таким образом, предлагаемые соединения оказывают эффективное специфическое ингибирующее действие на фермент ПАРП-1, являясь дешевыми и доступными соединениями, расширяют арсенал специфических ингибиторов данного фермента и могут быть использованы для создания лекарственных препаратов, применимых в клинической медицине.

Значения IС50 * в реакции поли(АDР-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1 для различных дисахаридных нуклеозидов
Соединение	Структура	IС50	Соединение	Структура	IC50
2'RibThy 1		0.25 mM	2'RibGua 2		0.50 mM
3'RibdThy 3		0.07 mM	3'RibdCyt 4		0,6 mM
3'RibPyrdThy 5		0.05 mM	3'Rib5'RibdThy 6		0.20 mM
3'Rib-α-dAde 7		0.20 mM	* значения IC50 определены при концентрации природного субстрата НАД+ 0,3 mM, равной КМ

Средство для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека, представляющее собой производные нуклеозидов общей формулы (I)

где Х - Н или OR₁; один или два из заместителей R₁, R₂, R₃ - моносахаридные остатки, остальные - протоны водорода; В - азотистое основание, присоединенное в α- или β-положении.