Полимерный фрагмент пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий, способ его получения и его применение в качестве иммуностимулятора
Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в иммунофармакологии, в частности, для создания средств поддерживающей терапии, предназначенных для повышения иммунной резистентности организма. Предложен биополимер с выраженным иммуностимулирующим эффектом, состоящий из высокомолекулярного фрагмента пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий, повторяющееся звено (ПЗ) которого представляет собой тетрасахарид 4-O-{4-O-[4-O-(N-ацетил-β-D-глюкозаминил)-N-ацетил-β-D-мурамил]-N-ацетил-β-D-глюкозаминил}-N-ацетил-D-мурамовая кислота, к которому по карбоксильным группам обоих остатков мурамовой кислоты присоединяется тетрапептидный остаток: N-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин). Связь между ПЗ осуществляется за счет октапептидных мостиков (фиг.1), а количество ПЗ составляет от 5 до 20 или их комбинацию. Также предложены способ получения биополимера, фармацевтическая иммуностимулирующая композиция на его основе и ее использование в способах стимулирования иммунной системы млекопитающих и неспецифической защиты от бактериальных инфекций. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.
Область изобретения
Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в иммунофармакологии, в частности, для создания средств поддерживающей терапии, предназначенных для повышения естественной резистентности организма.
Уровень техники
В настоящее время наблюдается снижение естественной устойчивости людей к инфекционным агентам, следствием чего является рост инфекционной заболеваемости, происходящий практически во всех странах мира. Следствием этого является рост хронических инфекционно-воспалительных процессов, трудно поддающихся традиционным методам лечения. Поэтому актуальной задачей медицинской науки является создание высокоэффективных и безопасных иммуностимулирующих препаратов, повышающих устойчивость организма к различным инфекциям.
Одним из источников для создания иммуностимуляторов являются бактерии, которые в организме человека и животных являются главными активаторами иммунной системы. Полноценное функционирование иммунной системы полностью зависит от нормальной микрофлоры кишечника, дыхательных путей, кожи и др. Достаточно отметить, что у стерильных животных (гнотобионтов) иммунная система атрофирована, и они являются беззащитными даже перед условно-патогенными микроорганизмами.
Мощным иммуностимулятором бактериальной природы является пептидогликан клеточной стенки (ПКС) бактерии. На основании многочисленных данных структурного анализа фрагментов, полученных при гидролизе ПКС лизоцмом-ферментом, избирательно расщепляющим гликозидные связи остатков мурамовой кислоты, установлено, что ПКС представляет собой «сшитый» гетерополимер, который содержит линейные полисахаридные цепи, построенные из чередующихся остатков N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc) и N-ацетил-D-мурамовой кислоты (MurNAc), присоединенных β-(1→4)-гликозидными связями, причем лактильные группы остатков мурамовой кислоты несут короткие пептиды. В большинстве изученных грамотрицательных микроорганизмов пептидный фрагмент представлен тетрапептидным остатком: L-аланил-D-изоглутаминил-мезодиаминопимелоил-D-аланин. Часть «антенных» олигопептидных фрагментов образуют «мостиковые» структуры, обеспечивая создание пространственной структуры ПКС (Фиг.1 и 2).
Неоднократно отмечалось, что степень «сшитости», т.е. количество «мостиковых» фрагментов в ПКС, зависит не только от вида микроорганизма, но и от типа и условий культивирования.
В 1974 г. группа французских исследователей под руководством E.Lederer установила, что сравнительно небольшое по молекулярному весу вещество - мурамоил-L-лизил-D-глутаминовая кислота (мурамилдипептид, МДП), являющееся составным компонентом пептидогликана клеточной стенки, обладает таким же адъювантным эффектом, способностью стимулировать антиинфекционную резистентность, противоопухолевый иммунитет, активировать иммунокомпетентные клетки и индуцировать синтез ряда цитокинов, как и целые клетки микобактерий [Ellouz AF, Ciorubaru R, Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan subunits. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. 59. 1317-1325]. Однако из-за высокой пирогенности он оказался не пригодным для клинического применения. Поэтому был синтезирован ряд его аналогов, получивших разрешение на медицинское применение или проходящих в настоящее время клинические испытания [Werner G.H.. Jolles P. Immunostimulating agents: Europ. J. Biochem. 1996. 242, 1-19]. К числу таких аналогов могут быть отнесены такие мурамилпептидные соединения, как 6-О-тетрадецилгексадеканоил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин (вещество B30-MDP); препарат MTP-PE, в котором к мурамилтрипептиду ковалентно присоединен дипальмитоилфосфатидилэтаноламин, и весь этот комплекс включен в липосомы; Мурабутид, представленный N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин-a-n-бутиловым эфиром; Ромуртид - N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин-стеароил-L-лизин; а также β-N-ацетилглюкозаминил-(1→4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглютамин (ГМДП) - полусинтетический препарат Ликопид. В зависимости от бактериального источника (грамположительные или грамотрицательные микроорганизмы), способа его обработки и очистки могут быть выделены комплексы биологически активных фрагментов ПКС с различной структурой, которые могут стать основой для получения препаратов с характерными для каждого комплекса свойствами.
Из известных способов получения биологически активных веществ иммуностимулирующего действия наиболее близким к описываемому изобретению является способ получения биологически активной субстанции из вещества бактериальной природы (US №5185321 A61K 37/18, 1993 г.), включающий приготовление биомассы, выделение ПКС бактерии, расщепление его ферментативным гидролизом с применением лизоцима и выделение фрагментов ПКС в качестве целевого продукта.
Однако известный способ не обеспечивает освобождения реакционной смеси от белков, нуклеиновых кислот и других компонентов бактериальной клетки, которые остаются в целевом продукте. Полученные известным способом фрагменты ПКС, наряду с другими бактериальными биополимерами, непосредственно добавляют к ряду кисломолочных продуктов, что может вызывать при его применении нежелательные эффекты (аллергизация организма, эндотоксические эффекты, в частности пирогенный).
Кроме того, известный способ предполагает использование грамположительных бактерий Lactobacillus bulgaricus, в которых основные полисахаридные антигены грамположительных микроорганизмов - тейхоевые кислоты, присоединены к остатку мурамовой кислоты ПКС прочной ковалентной связью. Поэтому для очистки целевого продукта от тейхоевых кислот (или их фрагментов) требуется их предварительная химическая деградация, что представляет собой значительные технологические трудности на стадии очистки, а использование химических реагентов создает экологически неблагоприятные условия для осуществления известного способа.
Наличие побочных нежелательных эффектов, например индивидуальная чувствительность пациентов к синтезированным препаратам, возможность снижения терапевтического эффекта при длительном применении известных иммуностимуляторов, приводит к необходимости направленного поиска новых путей получения новых более эффективных и безопасных комплексов биологически активных веществ для восстановления естественной резистентности и повышения устойчивости к инфекционным агентам и прежде всего к возбудителям респираторных инфекций.
Сущность изобретения
При сравнительном анализе продуктов обработки ПКС различных грамотрицательных бактерий лизоцимом нами было установлено, что в большинстве случаев, наряду с не подвергшимся солюбилизации ПКС и низкомолекулярными продуктами ферментативного расщепления, гидролизат обычно содержит растворимые в воде высокомолекулярные фрагменты ПКС, появление которых обусловлено, очевидно, наличием в составе ПКС более или менее обширных участков с высоким содержанием «мостиковых» структур, что чисто пространственно может препятствовать действию лизоцима, причем эти участки соседствуют с участками, менее «насыщенными» «сшивками» и тем самым более легко расщепляемыми лизоцимом. Обнаружение в составе ПКС обширных областей, не солюбилизируемых лизоцимом, с максимальным содержанием пептидных «мостиков» между полисахаридными цепями, наряду с участками, которые при действии лизоцима расщепляются на растворимые в воде поли- и олигомерные фрагменты, подтверждает обнаруживаемую в многочисленных экспериментах сложность и неоднородность пространственного строения ПКС. Это связано, с одной стороны, с тем, что ПКС вносит основной вклад в обеспечение прочности бактериальной клетки, а с другой стороны, с наличием в клеточной стенке многочисленных каналов для транспорта необходимых для клетки соединений. Имеющиеся данные литературы позволяли нам предполагать, что обнаруженные нами высокомолекулярные соединения глюкозаминилмурамилпептидной природы, содержащие октапептидные «мостиковые» фрагменты, соответствующие природным, должны обладать более широким спектром и более высоким уровнем иммуностимулирующих характеристик, чем описанные ранее.
В этой связи настоящее изобретение раскрывает биополимер (БП), обладающий выраженным иммуностимулирующим эффектом. Этот БП выделен из грамотрицательных бактерий и состоит из высокомолекулярного фрагмента пептидогликана клеточной стенки (ПКС) бактерий, повторяющееся звено (ПЗ) которого представляет собой тетрасахарид 4-О-{4-O-[4-O-(N-ацетил-β-D-глюкозаминил)-N-ацетил-β-D-мурамил]-N-ацетил-β-D-глюкозаминил}-N-ацетил-D-мурамовая кислота, к которому по обеим карбоксильным группам обоих остатков мурамовой кислоты присоединяется тетрапептидный остаток: N-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин), при этом связь между ПЗ осуществляется за счет октапептидных мостиков, а в образование пептидных связей вовлечены карбоксильные группы терминальных остатков D-аланина и ω-аминогруппы остатков мезо-диаминопимелиновой кислоты. Количество ПЗ БП находится в интервале значений от 5 до 20.
Настоящее изобретение раскрывает способ получения вышеуказанного БП. Способ получения основан на выделении БП из ПКС и включает культивирование, выделение ПКС бактерий, расщепление нерастворимого ПКС препаративным ферментативным гидролизом с применением лизоцима и выделение биологически активной фракции с помощью колоночной гель-проникающей хроматографии.
Изобретение также раскрывает иммуностимулирующую композицию, содержащую полученый БП и фармацевтически приемлемый эксципиент (эксципиенты), в качестве которых могут быть использованы, в частности, хлористый натрий и поливинипирролидон. Композиция может быть представлена в сухой форме, которую восстанавливают водой или другим разбавителем перед применением.
Композиция по изобретению применяется при стимулировании иммунной системы млекопитающих, при этом млекопитающему вводится указанная фармацевтическая композиция. Композиция обеспечивает стимуляцию иммунной системы на уровне, достаточном для того, чтобы обеспечить защиту от бактериальных инфекций, в частности от смертельных доз стафилококка и сальмонелл.
В этой связи настоящее изобретение раскрывает способ неспецифической защиты от бактериальных инфекций, включающий введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции по п.8 до предполагаемого инфицирования.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в выделении из ПКС грамотрицательных бактерий БП с выраженным иммуностимулирующим эффектом, состоящего из высокомолекулярного фрагмента ПКС, ПЗ которого представляет собой тетрасахарид 4-О-{4-O-[4-O-(N-ацетил-β-D-глюкозаминил)-N-ацетил-β-D-мурамил]-N-ацетил-β-D-глюкозаминил}-N-ацетил-D-мурамовая кислота, к которому по обеим карбоксильным группам обоих остатков мурамовой кислоты присоединяется тетрапептидный остаток: N-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин). Связь между ПЗ осуществляется за счет октапептидных мостиков, причем в образование пептидных связей вовлечены карбоксильные группы терминальных остатков D-аланина и ω-аминогруппы остатков мезо-диаминопимелиновой кислоты, а количество ПЗ в БП выбирают из интервала значений от 5 до 20 или их комбинаций (Фиг.1). Водорастворимый высокомолекулярный БП образуется в результате обработки лизоцимом бактериального ПКС, который содержит участки с большим количеством октапептидных «мостиков», причем такие негидролизуемые лизоцимом фрагменты соседствуют с областями, в которых степень «сшитости» гораздо ниже и которые вследствие этого гораздо более подвержены ферментативному расщеплению.
Технический результат от реализации способа получения БП заключается в повышении степени очистки фрагментов ПКС.
Указанный технический результат достигается тем, что в способ получения БП с иммуностимулирующим действием из вещества бактериальной природы включены следующие операции в следующей последовательности: приготовление бактериальной массы, выделение ПКС бактерии, расщепление нерастворимого ПКС действием лизоцима-фермента, специфически расщепляющего гликозидные связи остатков мурамовой кислоты.
Уникальные свойства полученного БП обеспечивают предоставление новых лекарственных средств - иммуностимуляторов, которые, исходя из их эффективности, обеспечивают защиту от стафилококковой и сальмонелезной инфекции.
Описание чертежей
На фиг.1 представлена формула выделенного биополимера по настоящему изобретению.
На фиг.2 представлен ЯМР-спектр выделенного БП.
Раскрытие изобретения
Способ получения биополимера характеризуется определенной комбинацией стадий выделения БП из ПКС, включающей приготовление биомассы, содержащей вещества бактериальной природы, выделение ПКС бактерий, расщепление нерастворимого ПКС препаративным ферментативным гидролизом с применением лизоцима и буферного водного раствора и выделение БП, за счет того, что в качестве вещества бактериальной природы применены грамотрицательные бактерии, при этом выделение ПКС осуществляют экстракцией, расщепление нерастворимого ПКС проводят с одновременным удалением продуктов ферментативного гидролиза диализом с последующей лиофилизацией диализата, при этом в качестве буферного раствора используют буферный водный раствор лиофилизующихся компонентов при pH 4,5-8,9, а для выделения БП применяют колоночную гель-проникающую хроматографию.
В частности, в способе применяются, как предпочтительные, следующие режимы и операции:
экстракцию микробных клеток осуществляют 45%-ным водным фенолом при температуре от 70 до 90°С; экстракцию микробных клеток осуществляют водными растворами ионных и неионных детергентов;
освобождение от эндотоксичного ЛПС (детоксификацию) осуществляют нагреванием ПКС с 1-3%-ной водной органической кислотой при 100°С в течение 1-3 часов;
диализ проводят с применением диализных трубок;
диализ проводят с применением полупроницаемых мембран для ультрафильтрации с размером отсечки 1-10 kD;
для выделения БП применяют колоночную гель-проникающую хроматографию для разделения фрагментов ПКС с использованием гелей типа Сефадекс и Сефароза при элюции буферами, содержащими лиофилизующиеся компоненты.
Вполне очевидно, что конкретные режимы могут варьировать, исходя из применяемого оборудования, реактивов и материалов с учетом рекомендаций поставщиков и производителей.
Очевидные модификации и варианты выполнения настоящего изобретения входят в объем притязаний, определенных формулой изобретения.
Для осуществления способа согласно данному изобретению приготавливают биомассу, содержащую вещества бактериальной природы, в качестве которых применены грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriacea (Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri и другие) посредством их культивирования в питательной среде, последующего выделения бактериальных клеток центрифугированием или микрофильтрацией, и тщательной отмывкой бактериальных клеток от компонентов питательной среды.
Полученная таким образом биомасса, содержащая грамотрицательные бактерии, является источником для дальнейшего получения ПКС. Содержание ПКС в грамотрицательных бактериях хотя и ниже, чем в грамположительных, однако их применение исключает значительные трудности на стадии отделения целевого продукта от тейхоевых кислот (или их фрагментов) - основных полисахаридных антигенов грамположительных микроорганизмов, ковалентно присоединенных к остатку мурамовой кислоты ПКС. При использовании грамотрицательных бактерий предварительной химической деградации не требуется, так как основной полисахаридсодержащий антиген грамотрицательных бактерий - эндотоксичный липополисахарид (ЛПС) - легко элиминируется из внешней мембраны клеточной стенки в результате экстракции, причем на этой же стадии происходит освобождение от белков, нуклеиновых кислот и других нековалентно связанных с ПКС компонентов бактериальной клетки. В качестве экстрагента чаще всего используют 45%-ный водный фенол при температуре от 65-68°С (экстракция по Вестфалю), так как при этой температуре происходит полная гомогенизация смеси фенола и воды. Кроме того, для экстракции бактериальных клеток могут быть использованы водные растворы хаотропных соединений, а также детергентов, обладающих способностью разрушать агрегаты, образующиеся амфифильными полимерными молекулами.
В рамках данного изобретения наиболее эффективно использование 45%-ного водного фенола при температуре, более высокой, чем использовалась ранее, а именно при температуре 70-90°С, так как в указанном интервале температур наблюдается максимальное извлечение «посторонних» биополимеров.
Продукт экстракции (фактически клеточные стенки) далее кипятят с разбавленным водным раствором органической кислоты (муравьиной, уксусной, трихлоруксусной) для освобождения от следовых количеств ЛПС: в этих условиях чрезвычайно легко расщепляется кетозидная связь остатков кетодезоксиоктулозоновой кислоты, расположенной между полисахаридной и липидной компонентами ЛПС.
Суспензию ПКС в буферном водном растворе подвергают препаративному ферментативному гидролизу с применением эндо-N-ацетилмурамидаз, например лизоцима. Применение лизоцима обусловлено избирательностью расщепления гликозидных связей остатков мурамовой кислоты в полисахаридной части ПКС в сочетании с относительно низкой стоимостью, высокой эффективностью и стабильностью при достаточно высоких температурах и в широком диапазоне значений pH.
Одной из главных проблем при проведении препаративного ферментативного гидролиза является замедление реакции по мере увеличения концентрации продуктов гидролиза. Поэтому для повышения выхода и увеличения скорости ферментативного гидролиза ПКС в соответствии с настоящим изобретением расщепление ПКС проводят с одновременным удалением продуктов ферментативного гидролиза диализом. Диализ проводят в течение 1-5 суток при удалении буферного раствора, содержащего продукты гидролиза, и последующем прибавлении свежего диализационного буферного раствора, причем смену буферного раствора проводят 1-3 раза в течение суток.
Для проведения диализа в качестве буферного раствора используют буферный водный раствор лиофилизующихся компонентов при pH 4,5-8,9, например триэтиламина, аммиака, пиридина, а также муравьиную и уксусную кислоты, а также могут быть применены коммерчески доступные диализные трубки с различным диаметром пор или полупроницаемые мембраны для ультрафильтрации с размером отсечки 1-10 kD. При этом в буферный раствор, против которого проводится диализ, переходят низкомолекулярные продукты ферментативного гидролиза, что приводит к значительному повышению скорости процесса за счет непрерывного удаления продуктов гидролиза из реакционной смеси. Использование полупроницаемых мембран, в частности приспособлений и мембран для ультрафильтрации (как в «тупиковом», так и тангенциальном режиме), позволяет непрерывно разбавлять гидролизат «свежим» буферным раствором и с той же скоростью удалять буферный раствор, содержащий продукты гидролиза. Использование мембран с различными размерами пор позволяет осуществлять удаление низкомолекулярных продуктов гидролиза ПКС, например, с молекулярной массой 1-2 kD.
Далее по предлагаемой комбинации стадий осуществляют удаление нерасщепившегося лизоцимом нерастворимого ПКС центрифугированием и последующую лиофилизацию супернатанта, содержащего БП. Выделение (фракционирование) БП проводят с помощью колоночной гель-проникающей хроматографии, в частности гель-хроматографии с использованием гелей типа Сефадекс (Фармация) при элюции водой или водными буферными растворами, содержащими лиофилизующиеся компоненты. На этой стадии происходит также отделение обнаруживаемых в большинстве случаев крахмалоподобных запасных полисахаридов бактерий.
Структура полученного биополимера доказана традиционными методами анализа.
Биологическая активность его определялась в иммунологических исследованиях, после подтверждения его безопасности при применении (контроль токсичности и пирогенности).
На основе биополимера готовили фармацевтические композиции в жидких и сухих формах, применяя традиционные компоненты и методики получения фармкомпозиций.
В качестве фармацевтически приемлемых добавок использовали буферирующие средства, средства, регулирующие тоничность, консерванты и т.п.
Фармацевтическая композиция фасовалась во флаконы, либо герметически закупоривалась в стерильных условиях, либо подвергалась лиофилизации и укупорке.
Экспериментально установлено, что препарат можно вводить в дозе приблизительно 1,5 мкг действующего вещества на килограмм веса пациента в день. Эта дозировка может варьировать в пределах от 0,1 до 10 мкг, в зависимости от состояния пациента и переносимости лекарственных средств.
Длительность применения препарата составляет, как правило, 7-10 дней, хотя в случае хронической инфекции длительность применения может быть существенно увеличена, поскольку выработки антител на препарат или снижения его эффективности в течение срока применения до одного месяца не было выявлено. В некоторых случаях, определяемых на практике, достаточным может оказаться однократное применение препарата.
Установлено, что препарат обладает способностью усиливать поглощение бактерий лейкоцитами периферической крови человека и повышать способность этих клеток убивать микробы. При этом усиливается способность моноцитов крови человека продуцировать цитокины, активирующие иммунитет. Он усиливает синтез антител и повышает функциональную активность естественных киллеров, играющих важную роль в противовирусном иммунитете.
В этой связи препарат применяется в комплексной терапии с антимикробными лекарственными средствами для лечения вторичных иммунодефицитных состояний, проявляющихся в повышенной инфекционной заболеваемости.
К таким состояниям и заболеваниям относятся
- хирургические инфекции,
- хронический рецидивирующий фурункулез и другие гнойно-воспалительные заболевания кожи и мягких тканей;
- хронический рецидивирующий герпес любой локализации;
- хронические инфекции бронхолегочного аппарата;
- хронические инфекции мочеполовых путей.
Этот перечень заболеваний не носит ограничительного характера. Выбор состояний, при которых требуется повышение иммунного статуса, находится в пределах компетенции специалиста.
Препарат вводят, как правило, внутримышечно. Препарат совместим со всеми антимикробными и противоспалительными лекарственными средствами, которые были доступны авторам, из числа традиционно применяемых при лечении вышеуказанных.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры, приведенные в целях детализации и иллюстрации изобретения, не имеют цели ограничения притязаний настоящего изобретения.
Пример 1
I. Выделение ПКС
20 г высушенных ацетоном и эфиром (или 120-180 г влажных) бактериальных клеток S.typhi суспензировали при интенсивном перемешивании в 350 мл дистилированной воды. Полученную суспензию нагревали до температуры 68-70°C и прибавляли 350 мл нагретого до той же температуры 90%-ного водного фенола. Смесь перемешивали в течение 20-30 минут при температуре 85-87°C, после чего охлаждали до температуры 10-12°C и центрифугировали в течение 40 мин при 5000 об/мин. Осадок после декантации водного и фенольного слоев подвергали повторной экстракции по той же схеме (возможно 2-3-кратное уменьшение экстрагентов). Полученный в результате экстракции осадок промывали 0,2 М аммоний-бикарбонатным буфером до отсутствия поглощения при 260-280 нм в УФ-спектре супернатанта (область специфического поглощения нуклеиновых кислот и белков), а затем 2-3 раза водой.
Выход отмытого и лиофильно высушенного осадка, представляющего собой неочищенный ПКС, составлял 20-40% от веса сухих исходных клеток. Аминокислотный анализ показал, что, наряду с мономерными компонентами ПКС (мурамовая кислота, глюкозоамин, аланин, диаминпимелиновая и глутаминовая кислоты), полученный продукт, как правило, содержит значительное количество связанного белка.
II. Очистка ПКС
6 г неочищенного ПКС, содержащего примеси нуклеиновых кислот и водорастворимых белков, суспензировали в 120 мл буфера, содержащего 0,2 М NaCl, 0,05 M трис-HCl и 0,001 М MgCl2 и CaCl2, pH 7,2-7,6. Полученную суспензию перемешивали 2 часа при температуре 37°С с рибонуклеазой А (активность 50-100 единиц/мг, 50 мкг/мл раствора) и дезоксирибонуклеазой (активность 400-800 единиц/мг, 5 мкг/мл раствора), далее к раствору прибавляли динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕДТА) до концентрации 0,01М и далее протеиназу К (активность 10-20 единиц/мг, 20 мкг/мл раствора). Через 1 час перемешивания при температуре 50°С нерастворимый осадок отделяли от продуктов ферментативного гидролиза центрифугированием (3000 об/мин, 30 минут) и далее несколько раз промывали водой (до отсутствия поглощения в УФ-спектре при 260-280 нм) и лиофилизовали, выход около 5 г.
Аминокислотный анализ показал практически полное отсутствие в гидролизате очищенного таким образом ПКС аминокислот, соответствующих примесным белкам.
III. Депирогенизация ПКС
Продукт, полученный на предыдущей стадии, перемешивали со 100 мл 2%-ной уксусной кислоты при температуре 100°С в течение 2 часов, осадок после охлаждения отделяли центрифугированием, трижды промывали водой и лиофилизовали. Полученный продукт трижды экстрагировали (перемешивание в течение 30 минут) смесью хлороформ-метанол 2:1, осадок ПКС отделяли центрифугированием и высушивали в вакууме. Выход ПКС на данной стадии количественный.
IV. Ферментативный гидролиз ПКС лизоцимом
5 г ПКС суспензировали в 100 мл 0,2 М триэтиламмонийацетатного буфера pH 7,2. К перемешиваемой суспензии прибавляли 300 мг лизоцима и через час перемешивания реакционную смесь переносили в диализную трубку, которую помещали в сосуд с 300 мл описанного выше буфера. Диализ проводили при температуре 37°C, периодически (1-3 раза в сутки) в течение 3-х суток удаляя диализат и добавляя во внешний сосуд свежий буферный раствор. По окончании процесса суспензию, содержащуюся в диализной трубке, центрифугировали, супернатант лиофилизовали и остаток 2-3 раза лиофилизовали из воды. Выход неочищенного БП на данном этапе составил 7-8%.
V. Выделение и очистка БП
Препаративное выделение БП проводили с помощью гель-хроматографии на колонке с Сефадексом G-50 или G-75 в 0,05М аммоний-бикарбонатном буфере pH 8,3. Фракции, элюирующиеся вблизи свободного объема колонки и содержащие крахмалоподобный запасный глюкан (данные ЯМР-спектра), отбрасывают. Далее элюируются содержащие БП фракции, которые объединяли и лиофилизовали. В качестве альтернативы объединенные фракции могли быть подвергнуты обессоливанию на колонке с Сефадексом G-15 (элюент - деионизованная вода) или диализу с помощью мембран для ультрафильтрации с размером отсечения kDa.
Анализ гидролизата БП (4М HCl, 100°C, 16 час) с помощью аминокислотного анализатора показал, что в его состав входят эквимолярные количества глюкозамина, мурамовой, глутаминовой и диаминопимелиновой кислот, а также удвоенное количество аланина, что соответствует набору и соотношению компонентов в ПКС S.typhi.
Анализ спектра 13С-ЯМР позволил подтвердить строение БП, построенного из тетрасахаридных ПЗ, связанных октапептидными «мостиками», и отсутствие заметных количеств примесных веществ.
Пример 2
5 г высушенных ацетоном и эфиром клеток суспензировали в 500 мл воды и подвергали ультразвуковой обработке (процессор фирмы Cole-Parmer, 500 ватт, 20 кГц) при температуре менее 10°C в течение 30-40 минут. К полученной суспензии прибавляли хлористый натрий до 0,1 М концентрации, ТРИС до 0,1 М концентрации, ЭДТА до 0,01 М концентрации и додецилсульфат натрия до 2% концентрации. pH смеси доводили до значения 7,6 добавлением концентрированной HCl. Через 2 часа перемешивания при температуре 100°С к охлажденной реакционной смеси прибавляли 5-7 мг протеиназы К.
Ферментативную обработку ПКС протеиназой К проводили без предварительного действия нуклеаз (в присутствии детергентов они теряют активность) при температуре 56°С в течение 3 часов. Осадок ПКС отмывали последовательно буфером, не содержащим детергент, и далее водой.
Для получения целевых продуктов расщепления ПКС лизоцимом одновременно с ферментной обработкой проводили диализ с помощью ультрафильтрационной установки «Пелликон» или «Минитан» (фирма «Миллипор») с использованием кассет с размером отсечения 10 kD. Скорость подачи «свежего» буфера и отбора фильтрата, содержащего низкомолекулярные фрагменты ПКС, составляла 0,1-0,3 мл/мин. Время процесса 20-30 часов. Полученный т.о. продукт (выход 5-6%) по своей структуре и свойствам аналогичен БП, выделение которого описано в Примере 1.
На основе БП, выделенного по описанной технологии, готовили фармацевтический препарат (Пример 3) и оценивали его иммуностимулирующие свойства.
Пример 3.
Фармацевтический препарат
Состав препарата из расчета на 1 ампулу (флакон):
| 1. Биополимер (активное начало) | 0,1 мг |
| 2. Поваренная соль (NaCl) | 9 мг |
| 3. Поливинилпироллидон низкомолекулярный медицинский | 1,5 мг |
Соответствующие навески указанных ингредиентов растворяли в определенном объеме апирогенной воды, стерилизовали через фильтры с размером пор меньше 0,2 мкм, разливали в ампулы (флаконы) по 1 мл, лиофильно высушивали и стерильно запаивали.
Перед употреблением препарат разводили в 1 мл стерильной воды.
Пример 4
Оценка гуморального иммунного ответа
Важным свойством иммуностимулирующих препаратов является способность усиливать гуморальный иммунный ответ, определяемый по количеству антителопродуцирующих клеток (АОК) и по уровню специфических антител. В данном примере гуморальный иммунный ответ оценивали по способности образовывать АОК в ответ на введение тимусзависимого антигена - эритроциты барана (ЭБ). АОК определяли методом локального гемолиза в агаре по Ерне и Нордину (1965). Исследование проведено на мышах, самках (СВА×C57Bl/6)F1 массой 22±0,6 грамма. В каждой группе было по 10-12 мышей.
Препарат разводили физиологическим раствором и в объеме 200 мкл вводили мышам подкожно в холку в дозах 1, 10 и 100 мкг за 3 часа до внутрибрюшинной иммунизации ЭБ в дозе 5×106. Указанная доза ЭБ является субоптимальной для развития гуморального иммунного ответа. Контрольным животным вместо препарата вводили физиологический раствор и также иммунизировали их ЭБ. На 4-е сутки методом локального гемолиза в геле агарозы определяли количество антителообразующих клеток в селезенках. Результаты выражали в виде числа АОК на селезенку, на 1 миллион ядросодержащих клеток (ЯСК) селезенки и в виде индекса модуляции (ИМ) иммунного ответа по сравнению с контрольной группой (табл.1).
| Таблица 1 | |||||
| Влияние препарата на гуморальный иммунный ответ | |||||
| Обработка животных | АОК/селезенку (M±m) | АОК/106ЯСК сел. (M±m) | |||
| Доза препарата | Антиген | Количество | ИМ | Количество | ИМ |
| Контроль (ЗФР) | +ЭБ | 343,6±40,8 | 1,00±0,12 | 1,70±0,20 | 1,0±0,12 |
| 1 мкг | +ЭБ | 1080,9±167,6 | 3,15±0,49 | 4,50±0,70 | 2,7±0,41 |
| 10 мкг | +ЭБ | 1141,1±182,7 | 3,30±0,50 | 4,70±0,75 | 2,8±0,44 |
| 100 мкг | +ЭБ | 868,1±190,4 | 2,51±0,55 | 3,80±0,84 | 2,3±0,44 |
Установлено, что введение препарата в дозах 1, 10 и 100 мкг вызывает выраженную стимуляцию гуморального иммунного ответа. Число АОК к ЭБ при введении 1 мкг, 10 мкг и 100 мкг увеличивается в 3,15; 3,3 и 2,5 раза соответственно. Оптимальной дозой является доза в 10 мкг/мышь. В дозе 100 мкг дальнейшего нарастания числа АОК не происходит.
Таким образом, проведенные эксперименты показывают способность препарата стимулировать антителообразование у мышей.
Пример 5
Одним из важнейших показателей иммунотропной активности вещества является его способность стимулировать факторы врожденного иммунитета (неспецифической резистентности), что определяется по защите экспериментальных животных, стимулированных исследуемым веществом, от смертельной инфекции, вызванной патогенными бактериями. В данном примере изучение влияния биополимера по изобретению на неспецифическую резистентность мышей проводили на беспородных животных массой 12-14 грамм. В качестве инфекционных агентов использовали Salmonella typhimurium (штамм №415) и Staphylococcus aureus (штамм Wood 46). Заражение производили в дозе 1 DCL (абсолютно смертельная доза) внутрибрюшинно через 24 часа после введения препарата. Препарат вводили однократно, подкожно, в дозах 100 мкг, 10 мкг, 1 и 0,1 мкг/мышь. В качестве контроля животным вводили стерильный физиологический раствор. В каждой группе было по 10 мышей.
| Таблица 2 | |||||||
| Влияние препарата на неспецифическую резистентность мышей к патогенным бактериям | |||||||
| Доза БП | Бактерии | Гибель мышей (дни) | Выжило, % | Продолж. жизни | |||
| 1-й | 2-й | 3-й | 4-й | ||||
| 100 | S. typhimurium | - | - | 3 | 1 | 60 | 5,7 |
| 10 | - | 5 | 2 | 2 | 10 | 2,7 | |
| 1,0 | - | 8 | 1 | 1 | 0 | 2,2 | |
| 0,1 | - | 8 | 1 | 1 | 0 | 2,2 | |
| физ. р-р | 1 | 9 | * | * | 0 | 1,8 | |
| 100 | St. aureus | 3 | 2 | 0 | 0 | 50 | 2,5 |
| 10 | 5 | 2 | 1 | 2 | 0 | 1,5 | |
| 1,0 | 5 | 4 | 1 | * | 0 | 1,4 | |
| 0,1 | 7 | 3 | * | * | 0 | 1,2 | |
| физ. р-р | 8 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1,1 |
Из табл.2 видно, что биополимер по изобретению в дозе 100 мкг/мышь повышает устойчивость мышей к инфекциям, вызванным S. typhimurium и S. aureus, защищая от гибели в 50% и 60% соответственно. Меньшие дозы оказывают более слабый протективный эффект. Показано также, что препарат в дозе 100 мкг увеличивает продолжительность жизни экспериментальных животных по сравнению с контролем примерно в 3 раза при заражении S. typhimurium и в 2 раза при заражении S. aureus.
Таким образом, биополимер по изобретению обладает выраженной способностью защищать экспериментальных животных от смертельной инфекции, вызванной патогенными бактериями.
1. Биополимер (БП) с выраженным иммуностимулирующим эффектом из вещества бактериальной природы, состоящий из высокомолекулярного фрагмента пептидогликана клеточной стенки (ПКС) бактерий, повторяющееся звено (ПЗ) которого представляет собой тетрасахарид 4-O-{4-O-[4-O-(N-ацетил-β-D-глюкозаминил)-N-ацетил-β-D-мурамил]-N-ацетил-β-D-глюкозаминил}-N-ацетил-D-мурамовая кислота, к которому по обеим карбоксильным группам обоих остатков мурамовой кислоты присоединяется тетрапептидный остаток: N-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин), причем пептидная связь между ПЗ осуществляется за счет карбоксильных групп терминальных остатков D-аланина и ω-аминогрупп остатков мезо-диаминопимелиновой кислоты с образованием октапептидных «мостиковых» фрагментов, а количество ПЗ в БП выбирают из интервала значений от 5 до 20 или их комбинаций.
2. Способ получения БП по п.1, включающий приготовление биомассы, содержащей вещества бактериальной природы, выделение ПКС бактерий, депирогенизацию в разбавленном водном растворе органической кислоты при кипячении, расщепление нерастворимого ПКС препаративным ферментативным гидролизом с применением лизоцима и буферного водного раствора и выделение БП, где в качестве вещества бактериальной природы применены грамотрицательные бактерии, при этом выделение ПКС осуществляют экстракцией 45%-ным водным фенолом при температуре от 70 до 90°С, расщепление нерастворимого ПКС проводят с одновременным удалением продуктов ферментативного гидролиза диализом с последующей лиофилизацией диализата, при этом в качестве буферного раствора используют буферный водный раствор лиофилизующихся компонентов при pH 4,5-8,9, а для выделения БП применяют колоночную гель-проникающую хроматографию.
3. Способ получения БП по п.2, отличающийся тем, что в качестве вещества бактериальной природы применены клетки Salmonella typhi.
4. Способ получения БП по п.2, отличающийся тем, что экстракцию микробных клеток осуществляют водными растворами ионных и неионных детергентов при температуре 37-100°С.
5. Способ получения БП по п.2, отличающийся тем, что депирогенизацию для деградации бактериального липополисахарида осуществляют нагреванием ПКС с 1-3%-ной водной уксусной кислотой при 100°С в течение 1-3 ч.
6. Способ получения БП по п.2, отличающийся тем, что диализ проводят с применением диализных трубок с размером отсечки до 12 kD или с применением полупроницаемых мембран для ультрафильтрации с размером отсечки более 10 kD.
7. Фармацевтическая иммуностимулирующая композиция, содержащая биополимер по п.1 и фармацевтически приемлемый эксципиент (эксципиенты).
8. Композиция по п.7, содержащая в качестве эксципиентов хлористый натрий и поливинилпирролидон.
9. Композиция по п.7, представляющая собой сухой препарат, который восстанавливают водой перед применением.
10. Способ стимулирования иммунной системы млекопитающих, включающий введение указанным млекопитающим фармацевтической композиции по п.7.
11. Способ неспецифической защиты от бактериальных инфекций, включающий введение млекопитающему фармацевтической композиции по п.7 до предполагаемого инфицирования.
