Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком

Авторы патента:


Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком
Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком

 


Владельцы патента RU 2412253:

Мерц Фарма ГмбХ унд Ко.КГаА (DE)

Полипептиды или белки в двухцепочечной форме получают путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах Е. coli. Полипептид или белок проявляет свою биологическую активность в виде двухцепочечного полипептида или белка; С-концевая аминокислотная группа первой цепи представляет собой группу Arg или Lys; вторая цепь белка/полипептида имеет на своем N-конце от 1 до 20 аминокислотных групп и пентапептидную последовательность VPXGS (PRS), где Х представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, где V - Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro или Gly, P - Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val или Gly, G - Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe или Val, и S представляет собой Ser, Tyr, Trp или Thr. Способ получения продукта по изобретению включает следующие стадии: модификацию полипептида или белка на уровне нуклеиновой кислоты, так что этот полипептид или белок в его модифицированной форме содержит последовательность VPXGS в его области петли, где X, V, P, G и S - такие, как определено выше; введение конструкции, модифицированной на уровне нуклеиновой кислоты, в клетки Е. coli; культивирование, а затем лизис клеток-хозяев и выделение двухцепочечного полипептида или белка, представляющего собой, например, ботулинический нейротоксин, в частности ботулинический нейротоксин (BoNT(A)) типа А. Полученные белки/полипептиды обеспечивают цитотоксическое действие при малых дозах применения. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 9 ил.

 

Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения белков в двухцепочечной форме путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах Е. coli. Другой аспект настоящего изобретения относится к белкам или полипептидам в двухцепочечной и биологически активной форме, которые могут быть получены вышеупомянутым способом.

Важное преимущество по сравнению с соответствующими рекомбинантными белками/полипептидами, которые не проявляют признаки согласно изобретению, состоит в том, что нет необходимости подвергать их обработке специфичной протеазой для направленного расщепления полипептидной цепи, поэтому способ их получения значительно упрощается. Дополнительные аспекты настоящего изобретения составляют нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептиды/белки согласно настоящему изобретению; векторы, которые содержат такие нуклеиновые кислоты или последовательности нуклеиновых кислот; клетки-хозяева, которые, в свою очередь, содержат вышеупомянутые векторы; и, наконец, фармацевтические композиции, которые содержат двухцепочечные и биологически активные белки/полипептиды.

Клостридиальные нейротоксины являются сильными ингибиторами кальций-зависимой секреции нейротрансмиттеров в нейрональных клетках. После перорального приема ботулинических токсинов (BoNT), например, через испорченную пищу, возникнет клиническая картина, называемая ботулизмом, которая характеризуется параличом различных мышц. Паралич дыхательных мышц может в конечном итоге привести к смерти зараженного человека. В связи с этим передача сигнала от нерва к мышце прерывается при концевой двигательной пластинке, поскольку двигательные нейроны более не могут секретировать ацетилхолин. Ботулинические нейротоксины развивают свое ингибирующее действие посредством протеолитического расщепления белков, участвующих в процессах секреции, так называемых белков SNARE. В данном контексте нейротоксины различных серотипов обладают различной специфичностью в отношении белков SNARE и сайтов расщепления в соответствующих аминокислотных последовательностях. BoNT(A) и BoNT(Е) расщепляют SNARE белок SNAP-25, тогда как BoNT(C) распознает как SNAP-25, так и синтаксин-1 в качестве субстрата. Также токсины серотипов В, D, F и G, а также столбнячный токсин (TeNT) расщепляют VAMP-2 (синапробревин-2) (Schiavo et al., 1997).

Клостридиальные нейротоксины являются сильнейшими известными ядами. Например, введенная внутривенно летальная доза, при которой половина всех мышей группы дозировки погибает от ботулизма, составляет всего лишь 5 пг. То, что токсины большинства серотипов являются токсичными также при пероральном введении, является результатом комплексных белков, в которые они заключены и которые, таким образом, защищают их от разрушения пищеварительными ферментами, поскольку они проходят через желудочно-кишечный тракт. Им также приписывают функцию в резорбции токсинов через эпителий тонкого кишечника (Fujinaga, 1997).

В течение последних десятилетий ботулинические токсины серотипов А и В нашли терапевтические применения. Например, возможно путем направленной инъекции только минимальных доз расслабить индивидуальные мышцы при их хроническом спазме. Особым преимуществом является длительная эффективность, например, BoNT(A) и BoNT(B) в течение периода от более трех до шести месяцев. Первыми показаниями были, среди прочего, дистония, такая как кривошея, блефароспазм и страбизм; были добавлены дополнительные показания, такие как гипергидроз или косметические терапии для разглаживания морщин. Рынок ботулинического токсина в качестве терапевтического агента быстро растет, не только в связи с разработкой дополнительных показаний, но и в связи с более интенсивным использованием уже существующих применений. В этой связи предпринимаются попытки улучшить свойства нейротоксинов в отношении продолжительности действия, эффективности и антигенного потенциала. Испытания показали, что комплексные белки, которые содержатся в имеющихся в продаже препаратах (ВОТОХ, доступном от Allergen, и Dysport, доступном от Ipsen-Beaufort, как препаратах BoNT(A), а также в Myobloc/Neurobloc, доступном от Elan, как препарате BoNT(B)), не обладают положительными эффектами на продолжительность действия и эффективность, но в связи с более высоким количеством белка по сравнению с препаратом чистого нейротоксина с такой же активностью могут инициировать запуск иммунологических реакций у пациента, так что дальнейшие инъекции становятся неэффективными.

Поскольку комплексные белки не требуются в препарате активного ингредиента и даже обладают недостатками, и некоторые модификации для улучшения свойств могут быть достигнуты только с помощью генно-инженерной технологии, существует огромная потребность в получении нейротоксинов путем рекомбинантной экспрессии, например путем экспрессии в Escherichia coli (нейротоксины, образованные таким путем, свободны от вышеупомянутых комплексных белков). Новые показания следует разрабатывать, кроме того, в том направлении, что ботулиническим токсинам следует придавать различную клеточную специфичность. В этой связи путь посредством рекомбинантного токсина или производного токсина также является предпочтительным.

Ботулинические токсины, а также столбнячный токсин имеют высокие степени гомологии в отношении их аминокислотной последовательности и являются подобными, в частности, в отношении их доменной структуры. Они состоят из домена, связывающего рецептор (HC), домена транслокации (HN) и каталитической субъединицы (L), которая осуществляет в нервной клетке расщепление соответствующего SNARE белка. НС ответственен за специфичное связывание нейротоксинов с концевыми двигательными пластинками, тогда как домен транслокации обеспечивает прохождение L из эндосом в цитоплазму нейронов. HN (N-конец) и НС (С-конец) образуют тяжелую цепь 100 кДа, тогда как L представляет собой легкую цепь и образует каталитическую субъединицу 50 кДа. Обе полипептидные цепи соединены друг с другом дисульфидным мостиком. Между участвующими цистеиновыми остатками линкерная область или область петли (также называемая синонимом линкерная последовательность или последовательность петли, или, проще, линкером или петлей), длина которой между ботулиническим и токсинами индивидуальных серотипов очень варьирует. В последний момент высвобождения токсинов из клостридии в ходе клеточного лизиса петля расщепляется клостридиальной эндопептидазой, которая до сих пор не охарактеризована, где отношение расщепленных и нерасщепленных типов варьирует между серотипами. Для активности нейротоксинов расщепление петли до двухцепочечного токсина является существенным (Schiavo et al., 1997). Например, в случае ботулинического нейротоксина А декапептид вырезается из петли, то есть в последовательности петли VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL, которая имеет на N-конце, а также на С-конце цистеиновый остаток в качестве ближайшего соседнего остатка, не только одна пептидная связь расщепляется, но происходит два события протеолитического расщепления. В этой связи молекулярная масса биологически активного ботулинического нейротоксина А в природе ниже, чем исходного токсина, транслируемого клостридией. Поскольку клостридиальная протеаза отсутствует в других организмах-хозяевах, таких как Escherichia coli, рекомбинантные ботулинические токсины и их фрагменты или производные экспрессируются в них в виде одноцепочечных пептидов. Это, вероятно, также верно для любых других белков, которые осуществляют свою нормальную биологическую/биохимическую активность в виде двухцепочечного белка. Как правило, такие белки получают посредством технологии рекомбинантных ДНК в виде одноцепочечных белков, их биологическая/биохимическая активность, которую они проявляют в природе в виде двухцепочечных белков, следовательно, едва ли присутствует или вовсе отсутствует.

Ранее с целью создания активного белка, в частности активного ботулинического токсина было необходимо введение последовательности распознавания для специфичной к последовательности протеазы, такой как тромбин, фактор Ха АА или гененаза, так чтобы после очистки можно было осуществить расщепление и, следовательно, активацию путем добавления эндопротеазы. Применение такой эндопротеазы имеет два существенных недостатка: с одной стороны, не всегда можно исключить, что в аминокислотной последовательности присутствуют другие дополнительные сайты расщепления кроме одного сайта расщепления, который был добавлен с помощью методов генной инженерии. Даже когда в этих вторичных сайтах расщепления вырезание происходит значительно менее эффективно, после обработки протеазой в результате может образоваться смесь различных вариантов расщепления токсина, которые можно разделить только с трудом. С другой стороны, в случае фармацевтических препаратов по причинам фармацевтического законодательства (нормативных указаний) значительным недостатком является дополнительное добавление белка или возможность контакта препарата с дополнительным белком, поскольку должно быть гарантировано полное удаление этого белка и его возможно имеющихся примесей при дальнейшей обработке; это, как правило, требует значительных затрат.

Активация путем протеолитического расщепления до двухцепочечного полипептида с дисульфидным мостиком требуется также в случае других бактериальных токсинов, например псевдомонадного экзотоксина или дифтерийного токсина с целью осуществления ферментативным доменом токсического действия (например, путем АДФ-рибозилирования фактора элонгации и, таким образом, ингибирования синтеза белка). Эти токсины используют для получения так называемых иммунотоксинов, которые применяют, в частности, в терапии опухолей. Для данной цели клеточный связывающий домен токсина заменяют белковым доменом, который обладает высокой аффинностью связывания с опухолеспецифичным поверхностным белком (антигеном дифференциации или антигеном, ассоциированным с опухолью). Хотя в классических иммунотоксинах эти белковые домены состоят из моноклонального антитела или его фрагмента, специфичность к некоторым опухолевым клеткам можно также придавать с помощью цитокинов, ростовых факторов, а также мутированных и отобранных белков семейства аффилинов, белков с анкириновыми повторами или антикалинов, называя лишь немногие примеры. При рекомбинантной экспрессии таких слитых белков получают одноцепочечные полипептиды. Хотя, например, рицин не имеет сайта процессинга для протеаз, за исключением протеаз Ricinus communis, и такой сайт должен быть вставлен, фрагменты дифтерийного токсина и фрагменты псевдомонадного экзотоксина в качестве компонентов иммунотоксинов могут расщепляться после интернализации в эндосомном компартменте протеазой клетки-мишени. Это происходит в области петли между цистеиновыми остатками, которые образуют дисульфидный мостик. Однако только минимальная часть, а не все интернализованные молекулы иммунотоксина претерпевают процессинг таким путем (Ogata et al., 1990).

С целью получения рекомбинантных белков, в частности, полипептидов меньшего размера, в достаточных количествах и в растворимой форме во многих случаях необходимо экспрессировать их в виде слитого белка или гибридного белка, например, с глутатион-S-трансферазой или белком, связывающим мальтозу, в Escherichia coli. Кроме того, в продаже имеются различные системы экспрессии, с помощью которых желаемый полипептид экспрессируется посредством N-концевой или С-концевой метки для аффинной очистки, например метки His, метки Strep или метки FLAG. Во многих ситуациях в экспрессионной плазмиде имеется последовательность распознавания протеазы между множественными сайтами клонирования, где встроена последовательность ДНК, кодирующая желаемый белок, и кодирующая последовательность для партнера слияния или для аффинной метки. Эта последовательность предназначена для обеспечения того, чтобы после экспрессии и очистки слитого белка можно было отделить желаемый белок от дополнительных пептидных областей путем добавления подходящей специфичной к последовательности эндопротеазы (например, тромбина, фактора Ха или гененазы). Если эти два партнера слияния были связаны друг с другом ковалентной связью посредством дисульфидного мостика вместо пептидной связи, возможно было бы отделение одного от другого после очистки посредством простого восстановления тиолсодержащими веществами, такими как β-меркаптоэтанол, дитиотрейтол (ДТТ) или восстановленный глутатион. Например, желаемый белок можно было бы элюировать из аффинной матрицы, например, агарозы Ni-NTA или сефарозы StrepTactin вышеупомянутыми восстанавливающими агентами, тогда как аффинная метка остается связанной с матрицей. Следующую стадию очистки для отделения аффинной метки или добавленной эндопептидазы можно было бы, таким образом, устранить.

Следовательно, было бы желательно разработать способ рекомбинантной экспрессии белков/полипептидов в целом, в частности нейротоксинов, а также фрагментов и производных указанных нейротоксинов, а также слитых белков или гибридных белков, в частности иммунотоксинов, которые уже присутствуют после лизиса клеток-хозяев, в их биологически активной двухцепочечной структуре, где эти две цепи связаны дисульфидными мостиками. Такой способ получения таких белков и полипептидов предложен в данном изобретении.

Неожиданно автор изобретения обнаружил, что как фрагмент LHN BoNT(А), так и полноразмерный нейротоксин А, оба полученные путем рекомбинантной экспрессии в виде одной цепи, но проявляющие свою нормальную биологическую/биохимическую активность в двухцепочечной форме с дисульфидными мостиками, получают путем рекомбинантной экспрессии в двухцепочечной форме, когда фрагмент LHN или полноразмерный токсин, предпочтительно на уровне нуклеиновой кислоты, подвергают по меньшей мере одной определенной модификации. Последующие тесты, проведенные автором изобретения, показали, что это остается верным также для любых других белков/полипептидов ввиду того, что их получают в соответствии с общепринятыми рекомбинантными методами в виде одной цепи, но они проявляют свою биологическую активность в двухцепочечной форме с дисульфидными мостиками.

Вышеупомянутая "по меньшей мере одна модификация" в случае BoNT(A) или в случае фрагмента LHN BoNT(A) относится к вставке пентапептидной последовательности, называемой PRS (сайт распознавания протеазы). В общем случае белка/полипептида пентапептидная последовательность, которая присутствует в этом белке/полипептиде, который нужно модифицировать (предпочтительно на уровне нуклеиновой кислоты), может быть модифицирована таким путем (например, путем по меньшей мере одной замены аминокислотного остатка, либо путем вставки только нескольких аминокислотных остатков PRS, либо путем делеции аминокислотных остатков), чтобы она совпадала с пентапептидной последовательностью PRS, встроенной в уже присутствующую последовательность. Таким же путем может быть вставлена гекса/гепта/окта- (и т.д.) пептидная последовательность с необходимостью или без необходимости делеции либо одного, либо двух, либо трех, либо нескольких аминокислотных остатков. В соответствии с изобретением единственным преимуществом является то, что конечный экспрессированный полипептид имеет PRS (пентапептид) последовательность в его области петли, где область петли согласно изобретению определяют как аминокислотную последовательность, которая находится между двумя цистеиновыми остатками, участвующими в дисульфидном мостике. Когда эта последовательность PRS присутствует в области петли, следствием этого является то, что после расщепления одноцепочечного полипептида, соседнего с полипептидной последовательностью PRS (на аминокислотном уровне), последовательности, которые присутствуют в природе в двух различных цепях, также распределяются на две различные цепи. В случае ботулинического нейротоксина А (BoNT(А)) эта последовательность PRS предпочтительно встроена в петлю путем делеции пентапептида Asp443-Asp447 BoNT(A) (см. Фиг.3-1). В других белках/полипептидах (например, в случае BoNT(B), BoNT(C1), BoNT(D), BoNT(E), в случае рицина, в случае РЕ40 псевдомонадных экзотоксинов или в случае дифтерийного токсина (DT)) вместо этого предпочтительно встраивать модифицированную петлю BoNT(A) в последовательность петли (см. Фиг.3-2 - 3-5), где аминокислотные остатки природной последовательности петли могут быть либо делетированы, либо не делетированы. Модифицированная последовательность петли на Фиг.3-2 - 3-5 представляет собой последовательности без двух концевых остатков Cys, где центральная аминокислота последовательности PRS может представлять собой не только R, Y, Н или Q, но также любую другую встречающуюся в природе аминокислоту. В случае вышеупомянутых других белков/полипептидов особенно предпочтительно встраивать только часть модифицированной петли BoNT(A), в частности последовательность GIITSKTKSLVPXGSKALNDL (X = встречающаяся в природе аминокислота), где аминокислотные остатки природной последовательности петли могут быть либо делетированы, либо не делетированы). Модифицированные последовательности петли на Фиг.3-2 - 3-5 представляют собой последовательности без двух концевых остатков Cys.

Для фрагмента LHN BoNT(A) или для полноразмерного рекомбинантного токсина это означает, таким образом, что модификация последовательности представляет собой изменение в области петли между L и HN, и это изменение обеспечивает присутствие последовательности PRS. Согласно изобретению последовательность PRS, и не только для BoNT(А), представляет собой пентапептидную последовательность Val-Pro-Xaa-Gly-Ser. Xaa означает любую встречающуюся в природе аминокислоту. Независимо от того, представляет ли собой Xaa Arg или любую другую встречающуюся в природе аминокислоту, на пентапептидную последовательность Val-Pro-Xaa-Gly-Ser в любом случае ссылаются как на пентапептидную последовательность. Когда, однако, один из четырех других аминокислотных остатков последовательности PRS заменен, что действительно возможно в контексте настоящего изобретения, в частности, соответствующими гидрофильными/гидрофобными или полярными униполярными остатками, эту последовательность будут называть в данном контексте и в дальнейшем как вариант PRS-пентапептидной последовательности. Варианты присутствуют, например, когда Val заменен Leu, Ile, Ala, Phe, Pro или Gly. Кроме того, варианты присутствуют, когда (также или только) пролин во втором положении PRS, смотря с N-конца, заменен Leu, Ile, Ala, Phe, Val или Gly. Также глицин в четвертом положении PRS может быть, например, заменен Leu, Ile, Ala, Pro, Phe или Val; это приводит к другим вариантам. И когда серин в пятом положении PRS заменен, например, Tyr, Trp, Thr, возможно также Cys или Met, присутствует еще один тип варианта. Согласно изобретению те последовательности, которые содержат по меньшей мере в одном из положений 1, 2, 4 и 5 последовательности PRS аминокислотный остаток, который является отличным от Val-1, Pro-2, Gly-4 и/или Ser-5, называют вариантами пентапептидной последовательности.

Когда фрагмент LHN BoNT(A) (или полноразмерный токсин) или любой другой белок/полипептид, обычно получаемый путем рекомбинантной экспрессии в виде одноцепочечного белка/полипептида, но обладает биологической/биохимической активностью (только) в двухцепочечной форме, содержит пентапептидную последовательность Val-Pro-Xaa-Gly-Ser (где Хаа представляет собой любую из 20 встречающихся в природе аминокислот и где четыре другие аминокислоты могут быть заменены в соответствии со значением, данным в предыдущем абзаце), он будет присутствовать в лизате клеток-хозяев Е. coli (например, Е. coli К12, в частности клетки-хозяева Е. coli К12 штаммов M15[pREP4], XL1-BLUE или UT5600) в двухцепочечной форме, где в случае BoNT(A) легкая цепь связана ковалентной связью с HN или полноразмерной тяжелой цепью дисульфидным мостиком (фиг.7). Расщепление полипептидной цепи осуществляется либо непосредственно после лизиса клеток, либо по существу завершается после нескольких часов инкубации клеточного лизата. Автопротеолиз за счет активности протеазных доменов токсина или фрагмента токсина можно исключить, поскольку мутанты, неактивные по протеазе, которые модифицированы соответственно в области петли, также присутствуют в двухцепочечной структуре после экспрессии и разрушения клеток-хозяев Е. coli. Очевидно, протеаза штамма-хозяина Е. coli ответственна за расщепление пентапептидной последовательности PRS.

Следующая предпочтительная модификация в соответствии с абзацем, начинающимся "Неожиданно автор изобретения…" четырьмя абзацами выше, состоит в том, что на N-конце последовательности PRS на расстоянии от 1 до 20 аминокислотных остатков (аминокислота в направлении N-конца, которая расположена непосредственно рядом с остатком валина пентапептидной последовательности PRS, в случае Фиг.3-2 - Фиг.3-5 остаток лейцина, имеет расстояние 1 аминокислотный остаток от последовательности PRS), в частности, на расстоянии от 3 до 15 аминокислотных остатков, особенно на расстоянии от 3 до 10 аминокислотных остатков, особенно предпочтительно на расстоянии от 3 до 8 аминокислотных остатков и даже более предпочтительно на расстоянии 3 аминокислотных остатков присутствует основный аминокислотный остаток, предпочтительно остаток лизина или остаток аргинина, где на С-конце протеаза клетки-хозяина Е. coli расщепляет последовательность петли. После расщепления, таким образом, образуется полипептид, который, например, имеет два аминокислотных остатка (где определенное выше расстояние составляет 3 аминокислотных остатка) - концевые от остатка валина последовательности PRS. В настоящем случае "модификация" не обязательно означает модификацию в истинном смысле, то есть вставку или замену аминокислотного остатка, так чтобы в результате на N-конце последовательности PRS на определенном выше расстоянии от 1 до 20 аминокислотных остатков был расположен основный аминокислотный остаток (например, остаток лизина). Важно только, чтобы основный аминокислотный остаток (такой как остаток лизина или остаток аргинина) присутствовал на N-конце последовательности PRS на вышеупомянутом расстоянии.

Другая модификация, также необязательная, но предпочтительная, в соответствии с абзацем "Неожиданно автор изобретения…" пятью абзацами выше, состоит в том, что последовательность петли, в которой протеаза клеток-хозяев E. coli расщепляет, имеет длину по меньшей мере девять аминокислотных остатков. Предпочтительные длины последовательностей петли составляют по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 18, по меньшей мере 20 и по меньшей мере 23 аминокислотных остатка. Особенно предпочтительные длины последовательности петли составляют от 15 до 22, в частности от 18 до 22 аминокислотных остатков.

Способ по изобретению представляет собой в самом общем виде способ получения белков/полипептидов в двухцепочечной форме, где две цепи связаны дисульфидным мостиком, путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах Е. coli, где (1) белок/полипептид проявляет свою биологическую активность в виде двухцепочечного белка/полипептида с дисульфидным мостиком; (2) С-концевой аминокислотный остаток первой цепи представляет собой остаток Arg или остаток Lys; (3) вторая цепь белка/полипептида имеет N-конец из цистеинового остатка в качестве N-концевого от 1 до 20 аминокислотных остатков и пентапептидной последовательности VPXGS, обозначенной как PRS, где Х представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, где V представляет собой Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro или Gly, где Р представляет собой Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val или Gly, где G представляет собой Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe или Val, и где S представляет собой Ser, Tyr, Trp или Thr; и (4) этот способ включает следующие стадии: (а) модификацию белка/полипептида на уровне нуклеиновой кислоты, так чтобы белок/полипептид в его модифицированной форме имел в пределах его области петли вышеупомянутую пентапептидную последовательность (VPXGS); (б) введение конструкции, модифицированной на уровне нуклеиновой кислоты, в клетки Е. coli; (в) культивирование и последующий лизис клеток-хозяев; и (г) выделение двухцепочечных белков/полипептидов.

Согласно изобретению первая цепь белка/полипептида предпочтительно представляет собой цепь, которая кодируется N-концом соответствующей ДНК, тогда как вторая цепь белка/полипептида соответственно представляет собой цепь, которая кодируется С-концом соответствующей ДНК. Поскольку экспрессия 5'-ДНК-3' приводит к N-полипептид-С, в вышеупомянутом предпочтительном случае изобретения это означает, что экспрессия может быть представлена следующим образом: 5' ДНК-3' экспрессируется до N-первая полипептидная цепь-С-петля-N-вторая полипептидная цепь-С. Согласно изобретению петля расщепляется уже in situ, так что в конечном итоге полипептид/белок N-первая полипептидная цепь-С-N-вторая полипептидная цепь-С согласно изобретению образуется в двухцепочечной структуре.

Выражение "вторая цепь белка/полипептида имеет N-конец из цистеинового остатка в качестве N-концевого от 1 до 20 аминокислотных остатков и пентапептидной последовательности VPXGS, обозначенной как PRS" означает, что N-конец не образован, например, остатком валина пентапептидной последовательности VPXGS, но другим (любым) аминокислотным остатком. Между последним и остатком валина PRS могут быть дополнительно расположены от 1 до 19 аминокислотных остатков, но N-концевой аминокислотный остаток может быть связан непосредственно, например, с остатком валина, посредством пептидной связи, то есть может представлять собой ближайший остаток, соседний с остатком валина PRS.

Белки/полипептиды по изобретению, которые могут быть выделены в их (биологически) активной двухцепочечной структуре, представляют собой белки, в которых С-конец первой цепи имеет основный аминокислотный остаток, в частности остаток Arg или остаток Lys, и в которых вторая цепь обеспечена N-концом с 1-20 аминокислотными остатками и с пентапептидной последовательностью VPXGS, называемой PRS, где X, V, Р, G и S определены, как указано выше.

Согласно настоящему изобретению в случае иммунотоксинов, которые основаны на рекомбинантном рицине, например, обработка специфичной к последовательности протеазой, такой как тромбин или фактор Ха, для активации является излишней. Например, в случае иммунотоксинов на основе дифтерийного токсина или псевдомонадного токсина следовало ожидать значительного повышения эффективности, и оно действительно также получено, поскольку обработка протеазой клетки-мишени в качестве ограничивающей скорость стадии для перемещения ферментативного домена токсинов в цитоплазму больше не требуется. Такие иммунотоксины, которые уже присутствуют в виде двухцепочечного полипептида с дисульфидным мостиком, могут применяться в малых дозах и все же обеспечивать такое же цитотоксическое действие. Это снижает, с одной стороны, стоимость терапии и, с другой стороны, уменьшает риск образования антител, которые делали бы иммунотоксины неэффективными при последующих применениях. Способ получения двухцепочечных с дисульфидным мостиком и, следовательно, активированных иммунотоксинов предложен настоящим изобретением.

Способом, предложенным в данном изобретении, также возможно получение слитых белков или гибридных белков, то есть белков с пептидной меткой для аффинной очистки, в двухцепочечной форме, две полипептидные цепи которых ковалентно связаны дисульфидным мостиком, и после аффинной хроматографии или других методов очистки могут быть отделены простым восстановлением тиолсодержащими веществами, такими как β-меркаптоэтанол, ДТТ или восстановленный глутатион.

Рекомбинантная экспрессия клостридиальных нейротоксинов и их фрагментов (например, фрагмента LHN или производного клостридиального нейротоксина, например, с модифицированной клеточной специфичностью) в экспрессионных штаммах Е. coli, таких как M15[pREP4] или BL21(DE3), дает одноцепочечные полипептиды. В результате обработки этих полипептидов трипсином расщепление имеет место в области последовательности петли в области перехода протеазного домена в домен транслокации. Поскольку трипсин не является протеазой, специфичной к последовательности, вероятно расщепление, обычно нежелательное, в дополнительных областях полипептида. Например, BoNT(А) дополнительно расщепляется трипсином между HN и НС, так что получаются двухцепочечный фрагмент LHN и фрагмент НС. С целью обеспечения избирательного расщепления в области петли, желательного в большинстве случаев, необходимо присутствие, возможно после вставки, последовательности распознавания для специфичных эндопротеаз.

Расщепление рекомбинантных слитых белков/гибридных белков посредством специфичных к последовательности эндопротеаз, таких как тромбин, фактор Ха, гененаза и т.д., находится в пределах области общеизвестного спектра методов. Возможно отделение после очистки партнера слияния, который придает улучшенную растворимость рекомбинантному белку/полипептиду и/или улучшенную экспрессию, либо служит в качестве пептидной метки для аффинной очистки. Для этой цели раствор белка инкубируют с растворимой эндопротеазой в растворимой форме или в иммобилизованной форме на матрице.

Эту методику можно использовать также для экспрессии вышеупомянутых рекомбинантных белков/полипептидов, которые проявляют свою нормальную биологическую/биохимическую активность в виде двухцепочечного белка/полипептида, но посредством технологии рекомбинантных ДНК получаются в виде неактивных одноцепочечных белков/полипептидов (например, экспрессия клостридиальных нейротоксинов, фрагментов клостридиальных нейротоксинов, таких как фрагменты LHN, или производных клостридиальных нейротоксинов, например, с модифицированной клеточной специфичностью). Последовательность распознавания для эндопротеазы клонируют в полипептид, предпочтительно на уровне нуклеиновых кислот, например, в области петли между L и HN, и, кроме того, клонируют на N-конце или на С-конце дополнительную последовательность распознавания для той же или дополнительной эндопротеазы, фланкированную пептидной меткой для аффинной очистки. Затем одноцепочечный экспрессированный белок/полипептид активируют путем обработки соответствующей эндопротеазой или эндопротеазами одновременно или последовательно посредством расщепления в области петли между L и HN и пептидную метку удаляют.

Помимо затрат на использование таких эндопротеаз и необходимости, таким образом, в дополнительных стадиях обработки, их применение в фармацевтических препаратах (например, применение рекомбинантных ботулинических токсинов или их производных) в высокой степени проблематично по причинам фармацевтического законодательства (нормативов). С одной стороны, чистота используемой эндопротеазы должна быть экспериментально подтверждена и, с другой стороны, полное удаление и, в частности, свобода препарата от вирусов в ходе протокола дальнейшей очистки должны быть точно документированы; это в целом требует огромных затрат на анализы. Поскольку в будущем ботулинические токсины, например, с улучшенными свойствами или модифицированной клеточной специфичностью также следует изготавливать путем рекомбинантной экспрессии, существует огромная необходимость в способе экспрессии, который обеспечивает получение вышеупомянутых рекомбинантных белков/полипептидов, которые проявляют свою нормальную биологическую/биохимическую активность в виде двухцепочечных белков/полипептидов, но получены посредством технологии рекомбинантных ДНК в форме неактивных одноцепочечных белков/полипептидов, в частности, обеспечивает получение ботулинических токсинов или их производных в виде двухцепочечных с дисульфидным мостиком, а следовательно, биологически активных полипептидов/белков, без необходимости использования эндопротеаз.

В изобретении, которое будет более подробно объяснено далее, предложен в самом широком смысле способ, при котором белки, такие как клостридиальные нейротоксины, а также их фрагменты и производные могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах Е. coli и могут быть выделены в их двухцепочечной с дисульфидным мостиком, а следовательно, биологически активной форме, без их активации, требующей добавления эндопротеазы.

В первом предпочтительном воплощении изобретения аминокислотная последовательность области петли BoNT(A) между остатками цистина 430 и 454 (см. Фиг.3-1 - 3-5) модифицирована таким образом, что экспрессированный токсин или его фрагменты/производные в лизате клеток-хозяев E. coli уже присутствуют в виде двухцепочечного полипептида. Эти две цепи ковалентно связаны друг с другом с участием остатка цистина 430 и 454 посредством дисульфидного мостика. В особенно предпочтительном воплощении изобретения, как объяснено на Фиг.3, пентапептид Asp443-Asn447 (DKGYN) может быть заменен Val-Pro-Arg-Gly-Ser (VPRGS). В дополнительных предпочтительных воплощениях изобретения пентапептид Asp443-Asn447 (DKGYN) может быть также заменен Val-Pro-Tyr-Gly-Ser (VPYGS), Val-Pro-His-Gly-Sr (VPHGS) или Val-Pro-Gln-Gly-Ser (VPQGS). В данном контексте также остается верным то, что не только центральный аминокислотный остаток может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, но также то, что четыре других аминокислотных остатка могут быть также заменены, как подробно объяснено выше (при замене по меньшей мере одного из этих остатков вариант последовательности PRS присутствует в значении изобретения). Кроме того, в отношении как данного воплощения, так и всех других предпочтительных воплощений, которые будут объяснены в дальнейшем, остается верным, что в дополнение предпочтительно, когда последовательность петли имеет на N-конце к PRS на расстоянии от 1 до 28 аминокислот основный аминокислотный остаток, в частности остаток лизина или аргинина.

Специалисту в данной области техники очевидно, что дополнительные замены индивидуального или нескольких аминокислотных остатков либо вставка или делеция дополнительных аминокислотных остатков в области охарактеризованных выше петель BoNT(А) также приводит к результату, что экспрессированный токсин согласно изобретению или образованные от него фрагменты/производные в лизате присутствуют в виде двухцепочечных полипептидов. Эти возможные варианты также охватываются настоящим изобретением.

Специалисту в данной области техники также легко очевидно, что пентапептид Asp443-Asn447 (DKGYN), присутствующий в BoNT(A) дикого типа, может быть замещен гексапептидом, гептапептидом, октапептидом и т.д. настолько, чтобы в экспрессированном и транслированном в одноцепочечном виде полипептиде/белке в области петли присутствовала PRS-пентапептидная последовательность или один из ее возможных вариантов. Как объяснено выше, предпочтительно, когда на N-конце этого пентапептида присутствует основный аминокислотный остаток (предпочтительно лизин).

Кроме того, специалисту в данной области техники очевидно, что предпочтительное воплощение пентапептида (Val-Pro-Arg-Gly-Ser) PRS представляет собой участок возможной последовательности распознавания для протеазы тромбина, которая играет важную роль в каскаде свертывания крови и обладает высокой специфичностью к последовательности. Следует особенно отметить, что, во-первых, ни в ботулиническом нейротоксине типа А, ни в других полипептидах не требуется расщепление тромбином с целью получения желаемой двухцепочечной формы с дисульфидным мостиком и что, во-вторых, последовательность распознавания тромбина сама по себе, то есть в ее иммобилизованной форме, благоприятна для расщепления протеазной активностью лизата Е. coli, но не обязательна. Воплощения пентапептидных последовательностей PRS, которые встроены или сконструированы в соответствующих полипептидах (лучше: в их петлях), которые не содержат остаток аргинина, при С-конце которых тромбин может расщеплять (вместо этого присутствует другая встречающаяся в природе аминокислота), также приводят к расщеплению в петле, как объяснено выше. Это расщепление осуществляется предпочтительно при остатке лизина петли, который находится на N-конце пентапептида, как объяснено выше (см. также пример 2; Фиг.3).

Поскольку другие серотипы ботулинического токсина, такие как BoNT(В) и BoNT(С1) как нейротоксины длительного действия и BoNT(Е) как нейротоксины кратковременного действия, а также полностью отличные полипептиды/белки, которые могут экспрессироваться рекомбинантным путем в виде одной цепи, но проявляют свою биологическую активность только в виде двойной цепи, можно применять терапевтически, было бы желательно, чтобы эти нейротоксины, а также их фрагменты или производные (а также другие полипептиды/белки) могли быть также получены в виде двухцепочечных полипептидов/белков с дисульфидным мостиком из лизатов Е. coli. В частности, в случае BoNT(B) полное расщепление рекомбинантного токсина в лизате Е. coli до двухцепочечного полипептида/белка обеспечило бы значительное преимущество по сравнению с нативными нейротоксинами, которые секретируются в Clostridium botulinum, которые в целом составляют 40 процентов присутствующих в виде одноцепочечного и, следовательно, неактивного полипептида и не могут быть отделены от активной двухцепочечной формы. Также очевидно, что области петли нейротоксинов серотипов В, С1 и Е между остатками цистеина, участвующими в дисульфидном мостике, относительно петли BoNT(А) значительно короче (Фиг.3 и 4). Если в случае BoNT(A) присутствуют 23 аминокислотных остатка (Val431-Leu453), в BoNT (В) только 8 (Lys438-Ile445), в BoNT(С1) 15 (His438-Asp452) и в BoNT(E) 13 аминокислотных остатков (Lys413-Ile425) присутствуют в этом участке. Вместо этого, за исключением BoNT(B), было обнаружено, что эти сравнительно укороченные участки являются достаточно длинными, чтобы обеспечить расщепление цепи и образование дисульфидных мостиков, когда они имеют последовательность PRS в соответствии с настоящим изобретением. Даже хотя BoNT(B), когда пентапептид в петле заменен пентапептидной последовательностью PRS (таким образом, длина полноразмерной последовательности петли только восемь аминокислотных остатков), расщеплялся на две цепи (легкую и тяжелую) в значении изобретения, были получены лучшие результаты, то есть в соответствии с изобретением предпочтительно иметь петлю по меньшей мере из 9, по меньшей мере из 15, по меньшей мере из 20 или даже по меньшей мере из 22, аминокислотных остатков. Одно из последних упомянутых воплощений, в котором петля имеет 22 аминокислотных остатка, объяснено на примерах последовательностей Фиг.4-1 и 4-2 или сравнения между этими двумя.

Также экспериментально доказано, что замена областей петли в подтипах В, С1 и т.д. или их существенных участков областью петли BoNT(A) или ее существенными участками была бы предпочтительна в отношении расщепления нейротоксинов до двухцепочечных полипептидов/белков с дисульфидным мостиком, в частности, когда таким путем петля продлевается по меньшей мере до 9, предпочтительно до 15 остатков, и/или на N-конце PRS встроен основный аминокислотный остаток (например, и предпочтительно, остаток Lys) (ввиду того, что ранее N-концевой основный или Lys остаток не присутствовал). Особенно предпочтительными являются замены, как проиллюстрировано на Фиг.4 (где последовательности PRS на Фиг.4 представляют собой VPRGS, но в то же время, и также предпочтительно, представляют собой, однако, последовательности VPYGS, VPHGS, VPQGS, VPKGS, VPIGS и VPAGS).

В других воплощениях изобретения аминокислотные последовательности и генные участки, кодирующие, таким образом, области петли в ботулинических токсинах серотипов В, С1, D, Е, F и G, а также столбнячного токсина, модифицированы между остатками цистеина, участвующими в дисульфидном мостике между L и HN, таким образом, что экспрессированные токсины или образованные от них фрагменты/производные в лизате клеток-хозяев Е. coli уже присутствуют в виде двухцепочечных полипептидов, в которых две цепи ковалентно связаны дисульфидным мостиком (то же остается верным также для любых других полипептидов/белков, которые образуются путем рекомбинантной экспрессии в виде одной цепи, но развивают биологическую активность только в двухцепочечной форме). В предпочтительных воплощениях изобретения полноразмерные области петли (или их участки) нейротоксинов или фрагменты/производные токсина, образованные от него, могут быть заменены полноразмерной областью петли BoNT(A), как охарактеризовано на Фиг.3, либо участками области петли BoNT(А), где пентапептид Asp443-Asn447 замещен предпочтительно, например, Val-Pro-Arg-Gly-Ser (VPRGS). В следующих предпочтительных воплощениях изобретения пентапептид Asp443-Asn447 может быть также замещен Val-Pro Tyr-Gly-Ser, Val-Pro-His-Gly-Ser или Val-Pro-Gln-Gly-Ser. В особенно предпочтительных воплощениях изобретения области петли или участки областей петли вышеупомянутых нейротоксинов и образованных от них фрагментов/производных могут быть замещены олигопептидом Arg/Ser-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala (18-мер: R/SGIITSKTKSLVPRGSKA). Дополнительные замены, вставки или делеции индивидуальных или нескольких аминокислотных остатков в области вышеописанной последовательности петли, как показано, например, на Фиг.4, которые также приводят к экспрессированному нейротоксину или его фрагменту/производному после экспрессии в Е. coli (например, в клетках-хозяевах Е. coli К12 или его производных) в виде двухцепочечного полипептида/белка с дисульфидным мостиком, прямо охватываются данным изобретением (то же остается верным также для любых других полипептидов/белков, которые могут быть образованы путем рекомбинантной экспрессии в виде одной цепи, но обладают биологической активностью только в двухцепочечной форме).

Как часто повторялось выше, способом согласно изобретению в соответствии со следующим воплощением изобретения можно также получить слитые белки или гибридные белки, которые имеют, например, следующие компоненты А, В и С:

- эффекторный домен, который за счет его ферментативной активности способен, например, ингибировать секрецию в клетках-мишенях или уничтожать их (А);

- последовательность петли, которая согласно изобретению, как объяснено выше, модифицирована и которая имеет определенную выше пентапептидную PRS-последовательность VPXGS (например, модифицированная последовательность петли BoNT(А) или ее варианты, как проиллюстрировано на Фиг.3, и к которой может быть присоединен остаток цистеина на N-конце и/или на С-конце (В); а также

- домен, связывающий клетку, который придает клеточную специфичность слитому белку или гибридному белку (С).

Компонент В (последовательность петли) может также находиться в обоих воплощениях, упомянутых непосредственно выше, предпочтительно подобно (1) модифицированной последовательности петли, как проиллюстрировано на Фиг.4, (2) любой из последовательностей, образованной от нее, ввиду того что центральный остаток PRS может представлять собой остаток любой встречающейся в природе аминокислоты, либо (3) варианту (определение варианта см. выше) (1) или (2). На Фиг.4 соответствующие последовательности петли BoNT(B), BoNT(C1) или BoNT(E), за исключением одного или двух N-концевых и двух С-концевых аминокислотных остатков, делетированы, и делетированные аминокислотные остатки замещены 17-мером GIITSKTKSLVPRGSKA (Фиг.4-2 и 4-6) или 18-мером RGIITSKTKSLVPRGSKA (Фиг.4-4) модифицированной последовательности петли BoNT(A).

В дополнение к вышеупомянутым компонентам А, В и С слитые/гибридные белки могут иметь домен трансляции (который в случае ботулинических нейротоксинов локализован между последовательностью петли и доменом, связывающим клетку). Этот дополнительный домен способствует внедрению эффекторного домена в цитоплазму клетки-мишени. Экспрессия таких слитых белков в E. coli (например, Е. coli К12 или его производных) приводит к двухцепочечным полипептидам/белкам, в которых один домен находится на одной цепи, а два других домена находятся на второй цепи (в случае ботулинических токсинов эффекторный домен на легкой цепи ковалентно связан дисульфидным мостиком с двумя другими доменами на тяжелой цепи.

Эти слитые или гибридные белки по изобретению могут представлять собой так называемые иммунотоксины, которые, в частности, находят применение в терапии опухолей. В этой связи домену токсина придают специфичность к определенному типу клеток, в целом опухолевых клеток, путем присоединения домена, связывающего клетку. В качестве домена токсина прежде всего используют ферментативные домены дифтерийного токсина, псевдомонадного токсина и рицина. Эти токсины принадлежат к двухцепочечным токсинам АВ, в которых А-цепь, которая обеспечивает ферментативную активность, ковалентно связана посредством дисульфидного мостика с В-цепью, которая объединяет активность транслокации и активность связывания клетки. Однако в иммунотоксинах возможны другие токсины или фрагменты токсинов, ввиду того что желаемое действие (например, уничтожение опухолевых клеток) развивается в клетках-мишенях. Если первое поколение иммунотоксинов получено путем химического сочетания домена токсина, как, например, А-цепи рицина, с моноклональным антителом, иммунотоксины второго поколения получают путем рекомбинантной экспрессии в виде Fab токсинов, одноцепочечных Fv токсинов (scFv токсинов) или стабилизированных дисульфидной связью Fv (dsFv токсинов), но также в виде слитых белков с ростовыми факторами или цитокинами, прежде всего в Е. coli (Reiter, 2001). В будущих поколениях иммунотоксинов клеточную специфичность можно также придавать посредством модифицированных полипептидов, которые выбраны в соответствии с высокой аффинностью связывания, например, с опухолеспецифическим поверхностным белком, например, из семейств белков аффилинов, белков с анкириновыми повторами или антикалинов.

При всех возможных вариантах иммунотоксинов должно быть гарантировано, что ферментативный домен токсина может проходить в цитоплазму клетки-мишени с целью развития там токсического действия. Поскольку иммунотоксины в Е. coli экспрессируются в виде одноцепочечного полипептида, протеолитическое расщепление, а также восстановление дисульфидного мостика необходимо с целью отделения, в отношении цепей, ферментативного домена токсина от области транслокации и домена, связывающего клетку. В случае рекомбинантных фрагментов дифтерийного токсина и рекомбинантного фрагмента псевдомонадного экзотоксина расщепление осуществляется после интернализации в эндосомном компартменте клетки-мишени клеточной протеазой, такой как фурин (Williams et al., 1990). Рицин, с другой стороны, не имеет такого сайта процессинга и, следовательно, требует искусственно введенной последовательности распознавания протеазы с той целью, чтобы вводить его в виде уже двухцепочечного иммунотоксина с дисульфидным мостиком. Однако в случае иммунотоксинов, которые основаны на дифтерийном токсине и псевдомонадном экзотоксине, только минимальная часть интернализованных слитых белков расщепляется таким образом, что только минимальная равная часть ферментативных доменов может достичь цитоплазмы (Ogata et al., 1990). В представленных далее предпочтительных воплощениях изобретения описаны способы и конструкции, где с помощью этих способов варианты иммунотоксинов, как описано в предыдущих абзацах, получены путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах Е. coli и могут быть выделены в их двухцепочечной с дисульфидными мостиками и, следовательно, биологически (ферментативно) активной форме без их активации, требующей клеточной эндопротеазы или эндопротеазы, добавленной in vitro. Эти иммунотоксины способны транспортировать ферментативный домен токсина в клетку-мишень в форме, компетентной к транслокации, так что расщепление клеточной протеазой не требуется и значительно уменьшает дозы иммунотоксинов, которые можно применять в целях достижения желаемых цитотоксических эффектов.

Следующее предпочтительное воплощение изобретения включает соответственно дополнительно слитый белок или гибридный белок, который имеет следующие компоненты А, В и С:

- домен токсина или его фрагмент/производное (А);

- последовательность петли, которая согласно изобретению, как описано выше, модифицирована и которая имеет определенную выше пентапептидную PRS-последовательность VPXGS (например, модифицированная последовательность петли BoNT(А) или ее варианты, как проиллюстрировано на Фиг.3) и к которой может быть присоединен остаток цистеина на N-конце и/или на С-конце (В); а также

- домен, связывающий клетку, который может быть взят от представителя белковых семейств моноклональных антител, их фрагментов, аффилинов, белков с анкириновыми повторами, антикалинов, ростовых факторов (например, TGF-альфа, FGF, VEGF или IGF-1) или цитокинов (например, интерлейкинов IL2, IL4 или IL6) (С).

В соответствии с этим последним предпочтительным воплощением компонент В (последовательность петли) может быть подобен (1) модифицированной последовательности петли, как проиллюстрировано на Фиг.4, (2) любой из последовательностей, образованной от нее, ввиду того что центральный остаток PRS может представлять собой остаток любой встречающейся в природе аминокислоты, либо (3) варианту (определение варианта см. выше) (1) или (2).

Домен токсина может представлять собой А-цепь рицина, фрагмент псевдомонадного экзотоксина, такой как РЕ40 или РЕ38 (домены II и III с доменом или без домена Ib; Фиг.2) или фрагмент дифтерийного токсина. Вышеупомянутый эффекторный домен или домен токсина и домены, связывающие клетку, следует понимать только как примеры. Все белки или белковые фрагменты охватываются изобретением таким образом, что, с одной стороны, придают слитому белку/гибридному белку специфичную связывающую активность к поверхностному антигену клетки-мишени, например опухолевой клетки, и, с другой стороны, в клетке-мишени после интернализации проявляют определенное действие, например уничтожение клетки, где экспрессия таких слитых/гибридных белков согласно изобретению в E. coli дает двухцепочечные полипептиды/белки, в которых домен токсина или его производные коваленто связаны дисульфидным мостиком с доменом, связывающим клетку.

Для улучшения эффективности и специфичности иммунотоксинов на основе псевдомонадного экзотоксина ранее выбирали различные подходы. Например, домен, связывающий рецептор (домен Ia с аминокислотными остатками 1-152), заменен фрагментами моноклонального антитела, и в то же время область петли (Фиг.2 и 5) в домене транслокации (домен II) между остатками цистеина 13 и 35 (нумерация относительно домена II) модифицирована таким образом, чтобы последняя более не была чувствительна к расщеплению распространенной повсеместно клеточной протеазой фурином, но вместо этого чувствительна к специфичным протеазам, которые экспрессируются в большей степени и частично секретируются только некоторыми опухолевыми клетками (патент США 6426075). Эта модифицированная чувствительность к протеазам была предназначена для придания иммунотоксинам повышенной клеточной специфичности в дополнение к замененному домену, связывающему рецептор. Однако не следует ожидать, что усиленное расщепление в петле и, следовательно, улучшенная эффективность транслокации ферментативного домена III будут получены в результате посредством других клеточных протеаз.

Согласно следующему подходу для иммунотоксина домен, связывающий рецептор, и N-концевую область домена транслокации удаляли вплоть до остатка аргинина 27 внутри области петли. Необходимую клеточную специфичность в таком иммунотоксине придавали, например, путем вставки домена VH моноклонального антитела, с которым был связан домен VL посредством дисульфидного мостика в сайте домена Ib между доменами II и III или путем присоединения к С-концу домена III (патент США 5980895). В таких конструкциях активация протеазой более не требовалась; с одной стороны, это будет способствовать значительно повышенной эффективности транспортировки. Однако, с другой стороны, следует ожидать, что транслокация посредством доменов, связывающих рецептор, локализованных на N-конце или С-конце ферментативного домена III, будет снижена подобно домену VH моноклонального антитела или TGF-альфа. Поскольку эти домены, связывающие рецептор, не отделены от ферментативного домена, следует ожидать отрицательных эффектов на ферментативную активность и, следовательно, токсичность в клетках-мишенях. Относительно максимальную степень цитотоксической активности получают с иммунотоксином на основе псевдомонадного экзотоксина, когда, с одной стороны, петля между остатками цистеина 13 и 35 уже присутствует в расщепленной форме с дисульфидными мостиками, и активация клеточной протеазой, следовательно, не требуется, и когда, с другой стороны, домен, связывающий рецептор, слит вместо домена I экзотоксина с N-концом домена транслокации таким образом, что после восстановления в цитоплазме он отделяется от доменов токсина и, следовательно, не может снизить ферментативную активность домену III.

Особенно предпочтительное воплощение изобретения включает, таким образом, слитый/гибридный белок, содержащий домен, связывающий клетку, который может быть взят от представителя белковых семейств моноклональных антител, их фрагментов, аффилинов, белков с анкириновыми повторами, антикалинов, ростовых факторов (например, TGF-альфа, FGF, VEGF или IGF-1) или цитокинов (например, IL2, IL4 или IL6), с которым слит на С-конце модифицированный фрагмент РЕ38, который может нести на крайнем С-конце сигнал удерживания для эндоплазматического ретикулума, Lys-Asp-Gly-Leu, или его варианты. Модификация фрагмента РЕ38 состоит в замене полноразмерной последовательности петли (или только ее участка) между остатками цистина 13 и 35 на пентапептидную последовательность PRS VPXGS, предпочтительно модифицированной последовательностью петли BoNT(A), проиллюстрированной на Фиг.3, или ее вариантами, в частности пептидной последовательностью Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala (Фиг.5) (см. выше определение вариантов). Предпочтительно в данном воплощении также гарантировано, что основный аминокислотный остаток локализован на N-конце к PRS на расстоянии от 1 до 20 аминокислотных остатков, как проиллюстрировано в последовательности Фиг.5. Соответственно, модифицированный фрагмент РЕ38, а также слитые/гибридные белки, которые содержат этот модифицированный фрагмент, присутствуют в лизате клеток-хозяев E. coli (например, M15[pREP4]) в двухцепочечной форме с дисульфидными мостиками.

В противоположность псевдомонадному экзотоксину ферментативный домен дифтерийного токсина, А-цепь, присутствует на N-конце. На С-концевой В-цепи присутствуют домен транслокации и домен, связывающий рецептор. Обе цепи соединены последовательностью петли, в которой по остатку аргинина 193 при секреции из клеток Corynebacterium diphtheriae имеет место протеолитическое расщепление протеазой (Collier, 2001). Две цепи после расщепления остаются ковалентно связанными друг с другом дисульфидным мостиком между остатками цистеина 186 и 201. В этом отношении дифтерийный токсин подобен по его доменной структуре ботулиническим токсинам и столбнячному токсину.

Для получения рекомбинантных иммунотоксинов домен, связывающий рецептор, или его участок был заменен, например, VEGF или IL2 (Arora et al., 1999; Williams et al., 1990) с целью придания слитому белку новой клеточной специфичности. Чтобы А-цепь достигла цитоплазмы клеток-мишеней, с одной стороны, полипептидная цепь иммунотоксина, экспрессированная в виде одной цепи в Е. coli, должна быть расщеплена в области петли между А-цепью и В-цепью и, с другой стороны, дисульфидный мостик должен быть восстановлен. Хотя последнее происходит в ходе процесса транслокации, протеолитическое расщепление клеточной протеазой является неполным, так что только минимальная часть А-цепей может высвобождаться в цитоплазму (Williams et al., 1990). Если иммунотоксин присутствовал в двухцепочечной форме с дисульфидными мостиками уже в момент введения, можно было бы ожидать значительного повышения эффективности, поскольку все А-цепи были бы доступны в форме, компетентной для транслокации.

Следующее особенно предпочтительное воплощение изобретения включает, таким образом, слитый или гибридный белок, содержащий домен, связывающий клетку, который может быть взят от представителя белковых семейств моноклональных антител, их фрагментов, аффилинов, белков с анкириновыми повторами, антикалинов, ростовых факторов (например, TGF-альфа, FGF, VEGF или IGF-1) или цитокинов (например, IL2, IL4 или IL6), с которым слит на его N-конце модифицированный фрагмент дифтерийного токсина. Этот фрагмент токсина может содержать А-цепь, а также по меньшей мере один домен транслокации В-цепи (Gly1-Phe389 или Gly1-Asn486). Модификация фрагмента дифтерийного токсина состоит в том, что полноразмерная последовательность петли (или только ее участок) между остатками цистеина 186 и 201 заменена модифицированной последовательностью петли BoNT(A), проиллюстрированной на Фиг.3, или ее вариантами, в частности пептидной последовательностью Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala (Фиг.5) (см. выше определение вариантов). Соответственно, модифицированный фрагмент дифтерийного токсина, а также слитые белки, которые содержат этот модифицированный фрагмент, присутствуют в лизате клеток-хозяев Е. coli, как, например, M15[pREP4], в двухцепочечной форме с дисульфидными мостиками.

Иммунотоксины первого поколения на основе рицина получали путем сшивки А-цепи рицина с моноклональным антителом. Ранее этого достигали путем получения производного антитела с химической линкерной молекулой, которая образовывала дисульфидный мостик с тиоловой функциональной группой остатка цистеина, локализованного на С-конце А-цепи. Такие конъюгаты были гетерогенными из-за ненаправленного получения производного антитела. Эффективность против опухолей была незначительной не только из-за размера конъюгата и отсутствия домена транслокации, локализованного при В-цепи. Когда В-цепь в нативной форме также присутствует в качестве компонента иммунотоксина, токсичность значительно возрастает, но в результате лектиноподобных клеточно-связывающих свойств В-цепи также имеет место неспецифичный захват в клетки, отличные от желаемых клеток-мишеней. С этим конфликтом мишени боролись с помощью стратегии, согласно которой В-цепь была модифицирована таким образом, чтобы транслокационная активность оставалась незатронутой, но аффинность связывания для гликоструктур на клеточных поверхностях была, однако, значительно снижена (патентная заявка WO 89/04839). Экспрессированные рекомбинантным путем иммунотоксины, которые содержат такую модифицированную В-цепь, имеют, однако, одноцепочечную структуру, так что в результате отсутствия последовательности распознавания для клеточной протеазы в линкерном пептиде между А-цепью и В-цепью высвобождение и транслокация А-цепи после захвата иммунотоксинов в клетку-мишень невозможны вовсе или возможны только очень неэффективно. В патенте США 6593132 документированы модификации этого нативного линкерного пептида, которые представляют собой последовательности распознавания для различных протеаз с клеточной специфичностью. Варианты рицина с такими модификациями будут обладать соответствующей клеточной специфичностью ввиду того, что соответствующая протеаза, которая способна к протеолитическому расщеплению модифицированного линкерного пептида, экспрессируется только в желаемых клетках-мишенях по сравнению с другими типами клеток в значительно повышенных количествах. Однако следует полагать, что расщепление имеет место только во фракции интернализованных молекул токсина и, следовательно, также только соответствующее минимальное количество А-цепей перемещается в цитоплазму. Желательными были бы двухцепочечные иммунотоксины на основе рицина, в которых А-цепь сшита дисульфидным мостиком с модифицированной В-цепью, в которой активность транслокации остается незатронутой, но пектиноподобные свойства неспецифического связывания клеток подавлены, и которые подвергнуты слиянию на их С-конце со специфичным доменом, связывающим клетку. Такие иммунотоксины объединили бы клеточную специфичность и высокую токсичность.

Следующее предпочтительное воплощение изобретения включает, таким образом, слитый белок, который имеет следующие компоненты А, В и С:

- А-цепь рицина (А);

- последовательность петли, которая модифицирована согласно изобретению, как описано выше, и которая имеет определенную выше пентапептидную PRS-последовательность VPXGS (например, модифицированная последовательность петли BoNT(А) или ее варианты, как проиллюстрировано на Фиг.3, и к которой может быть присоединен остаток цистеина на N-конце и/или на С-конце (В); а также

- домен, связывающий клетку, который может быть взят от представителя белковых семейств моноклональных антител, их фрагментов, аффилинов, белков с анкириновыми повторами, антикалинов, ростовых факторов (например, TGF-альфа, FGF, VEGF или IGF-1) или цитокинов (например, IL2, IL4 или IL6) (С).

Компонент В в соответствии с этим последним предпочтительным воплощением может быть подобен (1) одной из модифицированных последовательностей петли, проиллюстрированных на Фиг.4, (2) любой последовательности, образованной от нее, ввиду того что центральный остаток PRS может представлять собой остаток любой встречающейся в природе аминокислоты, либо (3) варианту (определение варианта см. выше) (1) или (2).

В частности, последовательность петли может содержать пептидную последовательность Ala-Pro-Pro-Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Asp-Val (Фиг.5-6), то есть модифицированную петлю А-цепи рицина. Остаток цистеина предпочтительно дополнительно представлен на С-конце последовательности петли. В PRS-последовательности Val-Pro-Arg-Gly-Ser, содержащейся там, Arg может, однако, представлять собой любую другую встречающуюся в природе аминокислоту Хаа. С обоих концов последовательность петли может быть удлинена дополнительными аминокислотными остатками (например, остатками глицина и серина). Кроме того, А-цепь рицина может быть сшита с полноразмерной В-цепью либо ее участками или вариантами, последовательностью петли, которая замещает аминокислотные остатки между остатками цистеина 259 и 283 последовательности про-рицина дикого типа полностью или частично и по меньшей мере охватывает область модифицированной петли BoNT(A), описанной на Фиг.3, или ее вариантов. В этой связи дисульфидный мостик образован остатками цистеина 259 и 283 (относительно последовательности про-рицина дикого типа). Домен, связывающий клетку, слит с С-концом В-цепи и взят от вышеупомянутых семейств полипептидов. Соответствующие слитые/гибридные белки присутствуют в лизате клеток-хозяев Е. coli, например клеток штамма M15[pREP4], в двухцепочечной форме с дисульфидными мостиками.

Следующее воплощение изобретения относится к рекомбинантным слитым белкам, которые имеют следующие компоненты А, В и С:

- белок или олигопептид, который придает слитому белку лучшую растворимость, способствует более высокой скорости экспрессии и/или обеспечивает аффинную очистку (например, глутатион-3-трансфераза (GST), белок, связывающий мальтозу (МВР), метка His, метка Strep, метка FLAG) (A);

- последовательность петли, которая модифицирована согласно изобретению, как описано выше, и содержит определенную выше пентапептидную PRS-последовательность VPXGS (например, модифицированную последовательность петли BoNT(А), проиллюстрированную на Фиг.3, или ее варианты) и к которой может быть присоединен остаток цистеина на N-конце и/или на С-конце; а также

- любой тип полипептида (С).

Компонент В (последовательность петли) в соответствии с этим последним предпочтительным воплощением может быть подобен (1) одной из модифицированных последовательностей петли, проиллюстрированных на Фиг.4, (2) любой последовательности, образованной от нее, ввиду того что центральный остаток PRS может представлять собой остаток любой встречающейся в природе аминокислоты, либо (3) варианту (определение варианта см. выше) (1) или (2).

В частности, петля может иметь пептидную последовательность Val-Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Leu-Asn-Asp-Leu, где Arg в центре PRS может опять же представлять собой Хаа. С обоих концов она может быть удлинена дополнительными аминокислотными остатками (например, остатками глицина и серина). Экспрессия таких слитых белков в Е. coli приводит к двухцепочечным полипептидам/белкам, две цепи которых ковалентно связаны дисульфидным мостиком и после завершения очистки могут быть отделены друг от друга без добавления протеазы в результате простого восстановления тиолсодержащими веществами (например, β-меркаптоэтанолом, ДТТ или восстановленным глутатионом). Такая экспрессионная система особенно пригодна для рекомбинантных белков, которые должны быть снабжены на одном из двух концов цистеиновым остатком с целью получения после очистки и отделения партнера слияния реактивной тиоловой группой сайта для реакций сочетания, например, с тиолореактивными линкерными молекулами, или модификаций с, например, полиэтиленгликолем.

Изобретение включает, кроме того, все нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептиды по изобретению, описанному в предшествующих разделах, принимая во внимание различные возможности использования кодонов. Кроме того, изобретение охватывает имеющиеся в продаже или индивидуально сконструированные клонирующие и экспрессионные плазмиды, которые содержат кодирующие последовательности ДНК для соответствующих полипептидов по изобретению, а также подходящие клонирующие и экспрессионные штаммы Е. coli, которые трансформированы соответствующими экспрессионными плазмидами и которые могут экспрессировать соответствующие полипептиды по изобретению в их активной двухцепочечной форме с дисульфидными мостиками. Одним из примеров такой экспрессионной системы является экспрессионная плазмида серии pQE в сочетании со штаммом-хозяином Е. coli M15[pREP4].

Для специалиста в данной области техники, который имеет дело, в частности, с разработкой фармацевтически применимых полипептидов/белков, четко следуют преимущества, которые связаны с тем фактом, что для активации этих полипептидов/белков не нужно добавлять эндопротеазы. Огромная часть полипептидов/белков по изобретению, описанному в предшествующих разделах, конкретно предназначена для фармацевтического применения. Изобретение, таким образом, также охватывает фармацевтические препараты, которые содержат один из полипептидов/белков по изобретению или смесь полипептидов/белков по изобретению в качестве активных ингредиентов, а также полезные добавки, которые придают препарату достаточную стабильность и состав которых соответствует желаемой форме введения.

Прилагаемые графические материалы и перечень последовательностей описаны ниже.

На Фиг.1 показана схематическая иллюстрация высвобождения ботулинического нейротоксина типа А с петлей дикого типа или модифицированной петлей по изобретению из Clostridium botulinum или Escherichia coli K12. A: при лизисе клеток Clostridium botulinum нейротоксин расщепляется в области петли между легкой цепью (L) и тяжелой цепью (Н) клостридиальной эндопротеазой. Обе цепи соединены друг с другом дисульфидным мостиком. В: После экспрессии рекомбинантного нейротоксина с петлей дикого типа в Е coli и лизиса клеток он присутствует в одноцепочечной форме. C: Когда рекомбинантный нейротоксин с петлей, модифицированной согласно изобретению, высвобождается из клеток Е. coli, расщепление в области петли осуществляется эндопротеазой.

На Фиг.2 показана схематическая иллюстрация различных рекомбинантных токсинов с областями петли дикого типа, а также с областями петли, модифицированными согласно изобретению, в сравнении после высвобождения из клеток Е. coli. А: ботулинические нейротоксины; B: псевдомонадный экзотоксин; С: дифтерийный токсин.

На Фиг.3 показано сравнение петли дикого типа с выборкой последовательностей петли BoNT(A), модифицированных согласно изобретению. Проиллюстрированы нуклеотидные последовательности и выведенные аминокислотные последовательности, которые включают ограничивающие остатки цистеина легкой цепи и тяжелой цепи. Стрелкой отмечен сайт расщепления для эндопротеазы в лизате Е. coli.

На Фиг.4 показано сравнение петли дикого типа с примерной последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, ботулинических нейротоксинов серотипов В, С1 и Е соответственно. Проиллюстрированы нуклеотидные последовательности и выведенные аминокислотные последовательности, которые включают ограничивающие остатки цистеина легкой цепи и тяжелой цепи. Стрелкой отмечен сайт расщепления для эндопротеазы в лизате Е. coli.

На Фиг.5 показано сравнение петли дикого типа с примерной последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, фрагмента РЕ40 псевдомонадного экзотоксина, дифтерийного токсина (DT) и рицина соответственно. Проиллюстрированы нуклеотидные последовательности и выведенные аминокислотные последовательности, которые включают ограничивающие остатки цистеина легкой цепи и тяжелой цепи. Стрелкой отмечен сайт расщепления для эндопротеазы в лизате Е. coli.

На Фиг.6 показана комбинация олигонуклеотидов, которые были использованы для клонирования рекомбинантных токсинов и фрагментов токсинов. Последовательности распознавания для рестрикционных эндонуклеаз подчеркнуты.

На Фиг.7 показан анализ рекомбинантных фрагментов LHN BoNT(A) с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН). Экспрессию фрагмента LHN осуществляли в клетках M15[pREP4], которые были трансформированы плазмидой pQE-BoNT(A)-Lmod1HN. Дорожки 2 и 5: фрагмент LHN, очищенный на агарозе Ni-NTA; дорожки 1 и 4: фрагмент LHN после инкубации с тромбином; дорожка 3: маркер молекулярной массы. Нанесение образцов в восстанавливающих условиях (дорожки 1 и 2) и в не восстанавливающих условиях (дорожки 4 и 5).

На Фиг.8 показан анализ рекомбинантного фрагмента LHN BoNT(B) с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, на полиакриламидном геле с ДСН. Экспрессию фрагмента LHN осуществляли в клетках M15[pREP4], которые были трансформированы плазмидой pQE-BoNT(B)-Lmod1HN. Дорожки 1 и 4: фрагмент LHN, очищенный на агарозе Ni-NTA; дорожка 2: маркер молекулярной массы; дорожка 3: нет нанесения. Нанесение образцов в восстанавливающих условиях (дорожка 1) и в не восстанавливающих условиях (дорожка 4).

На Фиг.9 показан анализ рекомбинантного BoNT(C1) с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, на полиакриламидном геле с ДСН. Экспрессию токсина осуществляли в клетках M15[pREP4], которые трансформировали плазмидой pQE-BoNT(C1)-Lmod1HNHC. Дорожки 1 и 4: токсин, очищенный на агарозе Ni-NTA; дорожка 2: маркер молекулярной массы; дорожка 3: нет нанесения. Нанесение образцов в восстанавливающих условиях (дорожка 1) и в не восстанавливающих условиях (дорожка 4).

SEQ ID NO: 1 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный ботулинический нейротоксин типа А с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(A)-mod1).

SEQ ID NO: 2 представляет собой пример рекомбинантного ботулинического нейротоксина типа А с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(A)-mod1).

SEQ ID NO: 3 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный фрагмент LHN ботулинического нейротоксина типа А с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(A)-Lmod1HN). Эта последовательность соответствует SEQ ID NO: 1, где нуклеотиды 2620-3888 делетированы.

SEQ ID NO: 4 представляет собой пример рекомбинантного фрагмента LHN ботулинического нейротоксина типа А с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(A)-Lmod1HN). Эта последовательность соответствует SEQ ID NO: 2, где аминокислотные остатки 874-1296 делетированы.

SEQ ID NO: 5 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный фрагмент LHNHCN ботулинического нейротоксина типа А с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(A)-Lmod1HNHCN). Эта последовательность соответствует SEQ ID NO: 1, где нуклеотиды 3286-3888 делетированы.

SEQ ID NO: 6 представляет собой пример рекомбинантного фрагмента LHNHCN ботулинического нейротоксина типа А с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(A)-Lmod1HNHCN). Эта последовательность соответствует SEQ ID NO: 2, где аминокислотные остатки 1096-1296 делетированы.

SEQ ID NO: 7 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный ботулинический нейротоксин типа В с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(B)-mod1).

SEQ ID NO: 8 представляет собой пример рекомбинантного ботулинического нейротоксина типа В с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(B)-mod1).

SEQ ID NO: 9 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный фрагмент LHN ботулинического нейротоксина типа В с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(В)-Lmod1HN). Эта последовательность соответствует SEQ ID NO: 7, где нуклеотиды 2623-3915 делетированы.

SEQ ID NO: 10 представляет собой пример рекомбинантного фрагмента LHN ботулинического нейротоксина типа В с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(В)-Lmod1HN). Эта последовательность соответствует SEQ ID NO: 8, где аминокислотные остатки 875-1305 делетированы.

SEQ ID NO: 11 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинангный ботулинический нейротоксин типа С1 с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(C1)-mod1).

SEQ ID NO: 12 представляет собой пример рекомбинантного ботулинического нейротоксина типа С1 с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(C1)-mod1).

SEQ ID NO: 13 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный фрагмент LHN ботулинического нейротоксина типа С1 с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(C1)-Lmod1HN). Эта последовательность соответствует SEQ ID NO: 11, где нуклеотиды 2599-3858 делетированы.

SEQ ID NO: 14 представляет собой пример рекомбинантного фрагмента LHN ботулинического нейротоксина типа С1 с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(C1)-Lmod1HN). Эта последовательность соответствует SEQ ID NO: 12, где аминокислотные остатки 867-1286 делетированы.

SEQ ID NO: 15 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный ботулинический нейротоксин типа Е с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(E)-mod1).

SEQ ID NO: 16 представляет собой пример рекомбинантного ботулинического нейротоксина типа Е с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rBoTN(E)-mod1).

SEQ ID NO: 17 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный 40 кДа фрагмент псевдомонадного экзотоксина, содержащий домены II, Ib и III, с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (PE40-mod1).

SEQ ID NO: 18 представляет собой пример рекомбинантного 40 кДа фрагмента псевдомонадного экзотоксина, содержащего домены II, Ib и III, с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (PE40-mod1).

SEQ ID NO: 19 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный фрагмент дифтерийного токсина, содержащего А-цепь и N-концевой фрагмент В-цепи, с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (DT389-mod1).

SEQ ID NO: 20 представляет собой пример рекомбинантного фрагмента дифтерийного токсина, содержащего А-цепь и N-концевой фрагмент В-цепи, с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (DT389-mod1).

SEQ ID NO: 21 представляет собой пример нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует рекомбинантный токсин рицин с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rRicin-mod1).

SEQ ID NO: 22 представляет собой пример рекомбинантного токсина рицина с последовательностью петли, модифицированной согласно изобретению, и С-концевой гексагистидиновой меткой (rRicin-mod1).

Примеры

Пример 1: Клонирование и экспрессия фрагмента LHN ботулинического нейротоксина типа А с модифицированной петлей

Для клонирования последовательностей ДНК легкой цепи, а также домена транслокации хромосомную ДНК выделяли из культуры Clostridium botulinum типа А (штамм АТСС 3502). С помощью ПЦР-амплификации с праймерами #1 и #2 (Фиг.6) был получен фрагмент гена, кодирующий легкую цепь BoNT(A), с модифицированной последовательностью петли и С-концевой меткой His. Продукт ПЦР-амплификации клонировали в экспрессионной плазмиде pQE-60 по сайтам рестрикции Nco 1 и Sal 1, так что в результате получили плазмиду pQE-BoNT(A)-Lmod1. С помощью ПЦР-амплификации с праймерами #3 и #4 (Фиг.6) был получен фрагмент гена, кодирующий домен транслокации BoNT(A). По сайтам рестрикции для Stu I и Xho I он был клонирован между последовательностью петли и последовательностью для His метки в pQE-BoNT(A)-Lmod1 (плазмида pQE-BoNT(A)-Lmod1HN; последовательность #2, Фиг.3, №2). Экспрессионный штамм Е. coli M15[pREP4] (Qiagen) трансформировали плазмидой pQE-BoNT(A)-Lmod1HN. Экспрессию модифицированного фрагмента LHN осуществляли путем ступенчатой индукции 500 М конечной концентрацией изопропилтиогалактозида (ИПТГ) при 25 градусах Цельсия в течение ночи. Клетки подвергали лизису в 50 мМ фосфатном буфере при pH 8,0 с 300 мМ NaCl путем обработки лизоцимом и ультразвуковой обработки. Центрифугированный лизат подвергали хроматографии на колонке с агарозой Ni-NTA. Анализ на полиакриламидном геле с ДСН показал, что в восстанавливающих условиях две зоны при примерно 50 кДа, а также зона при 100 кДа окрашивались Кумасси, тогда как в не восстанавливающих условиях наблюдали одну зону при 100 кДа (Фиг.7). Таким образом, однозначно продемонстрировали, что фрагмент LHN высвобождался из бактерий более чем на 75 процентов в виде двухцепочечного полипептида, в котором две цепи ковалентно связаны друг с другом дисульфидным мостиком. Результатом последующей обработки тромбином было, с одной стороны, расщепление одноцепочечной формы и, с другой стороны, укорочение домена транслокации в двухцепочечном полипептиде (Фиг.7). Двухчасовая инкубация лизата Е. coli перед очисткой фрагмента LHN привела в результате к полному расщеплению в двухцепочечном полипептиде.

Соответственно, экспрессированный и очищенный фрагмент LHN с нативной последовательностью петли (Фиг.3, №1) показал на полиакриламидном геле в ДСН как в не восстанавливающих, так и в восстанавливающих условиях зону при 100 кДа. Одноцепочечный полипептид можно было превратить только после обработки трипсином в двухцепочечный фрагмент LHN с дисульфидным мостиком.

Пример 2: Клонирование и экспрессия фрагмента LHNHCN ботулинического нейротоксина типа А с модифицированной петлей и характеристика сайта расщепления

Фрагмент HNHCN (домен транслокации с N-концевой половиной домена, связывающего рецептор, BoNT(А)) сконструировали с помощью ПЦР-амплификации с праймерами #3 и #5 (Фиг.6) и клонировали по сайтам рестрикции для Stu I и Xho I в плазмиде pQE-BoNT(A)-Lmod1 (плазмида pQE-BoNT(A)-Lmod1HNHCN; последовательность #3). Экспрессию и очистку проводили в соответствии со схемой, описанной в примере 1. Анализ на полиакриламидном геле с ДСН показал в дополнение к слабой зоне, которая соответствовала одноцепочечному полипептиду, и дополнительным неспецифичным зонам, зону при 50 кДа, а также при 75 кДа, которые соответствовали легкой цепи и фрагменту HNHCN. N-концевое секвенирование первых четырех аминокислотных остатков фрагмента HNHCN дало последовательность Ser-Leu-Val-Pro. Расщепление протеазной активностью в лизате Е. coli имело место, таким образом, после Lys440 и, следовательно, в N-концевом направлении полипептида Val-Pro-Arg-Gly-Ser, встроенного в петлю.

Пример 3: Клонирование и экспрессия фрагмента LHN ботулинического нейротоксина типа В с модифицированной петлей

Для клонирования последовательностей ДНК легкой цепи, а также домена транслокации хромосомную ДНК выделяли из культуры Clostridium botulinum типа В (штамм Okra). С помощью ПЦР-амплификации с праймерами #6 и #7 (Фиг.6) сконструировали фрагмент гена, который кодирует легкую цепь BoNT(В) с модифицированной последовательностью петли BoNT(А). С праймерами #8 и #9 (Фиг.6) сконструировали фрагмент гена, кодирующий домен транслокации BoNT(B). Клонирование в экспрессионной плазмиде pQE-60 осуществляли сначала путем замены фрагмента гена BoNT(A)-L в pQE-BoNT(A)-Lmod1 продуктом амплификации BoNT(B)-Lmod1 по сайтам рестрикции для Nco I и Stu I. Затем продукт амплификации BoNT(В)-HN клонировали за ним по сайтам рестрикции для Stu I и Xho I, так что в результате получили плазмиду pQE-BoNT(B)-Lmod1HN (последовательность #5). Экспрессию в штамме-хозяине M15[pREP4] и очистку фрагмента LHN проводили по аналогии с примером 1. Анализ на полиакриламидном геле с ДСН показал, что в восстанавливающих условиях две зоны при примерно 50 кДа и 55 кДа окрашивались Кумасси, тогда как в не восстанавливающих условиях наблюдали зону при примерно 105 кДа (Фиг.8). Это определенно показало, что фрагмент LHN высвобождался из бактерий по существу в виде двухцепочечного полипептида, в котором две цепи более чем на 80 процентов были ковалентно связаны друг с другом дисульфидным мостиком.

Пример 4: Клонирование и экспрессия фрагмента LHN ботулинического нейротоксина типа С1 с модифицированной петлей и характеристика сайта расщепления

Для клонирования последовательностей ДНК легкой цепи, а также домена транслокации был получен препарат хромосомной ДНК из культуры Clostridium botulinum типа С1 (штамм С205). С помощью ПЦР-амплификации с праймерами #10 и #11 (Фиг.6) сконструировали фрагмент гена, который кодирует легкую цепь BoNT(C1) с модифицированной последовательностью петли BoNT(A). С праймерами #12 и #13 (Фиг.6) сконструировали фрагмент гена, кодирующий домен транслокации BoNT(C1). Клонирование в экспрессионной плазмиде pQE-60 осуществляли сначала путем замены фрагмента гена BoNT(A)-L в pQE-BoNT(A)-Lmod1 продуктом амплификации pQE-BoNT(C1)-Lmod1 по сайтам рестрикции для Nco I и Stu I. Затем продукт амплификации BoNT(C1)-HN клонировали за ним по сайтам рестрикции для Stu I и Xho I, так что в результате получили плазмиду pQE-BoNT(C1)-Lmod1HN (последовательность #7). Экспрессию в штамме-хозяине M15[pREP4] и очистку фрагмента LHN проводили по аналогии с примером 1. Анализ на полиакриламидном геле с ДСН показал, что в восстанавливающих условиях две зоны при примерно 50 кДа и 55 кДа окрашивались Кумасси, тогда как в не восстанавливающих условиях наблюдали зону при примерно 105 кДа. Это определенно показало, что фрагмент LHN высвобождался из бактерий более чем на 90 процентов в виде двухцепочечного полипептида, в котором две цепи ковалентно связаны друг с другом дисульфидным мостиком. В результате N-концевого секвенирования первых четырех аминокислотных остатков фрагмента HN получили последовательность Ser-Leu-Val-Рго. Расщепление протеазной активностью в лизате Е. coli имело место позади Lys447 и, таким образом, в направлении N-конца пентапептида Val-Pro-Arg-Gly-Ser, встроенного в петлю BoNT(A). С помощью направленного мутагенеза остаток аргинина встроенного пентапептида заменяли гистидином, тирозином и глутамином. Мутированные фрагменты LHN, экспрессированные таким же путем, присутствовали после двух часов инкубации лизата Е. coli более чем на 90 процентов в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком, где эффективность расщепления несколько ниже, чем для фрагмента LHN, который содержит петлю BoNT(А), модифицированную пентапептидом Val-Pro-Arg-Gly-Ser.

Пример 5: Клонирование и экспрессия рекомбинантного ботулинического нейротоксина типа С1 с модифицированной петлей

Путем использования хромосомной ДНК штамма Clostridium botulinum С205 фрагмент гена, кодирующий тяжелую цепь, амплифицировали с праймерами #12 и #14 (Фиг.6). По сайтам рестрикции для Stu I и Xho I его клонировали в плазмиде BoNT(C1)-Lmod1HN между участком последовательности, кодирующим легкую цепь, и последовательностью для His-метки (плазмида pQE-BoNT(C1)-Lmod1HNHC; последовательность #6). Экспрессионный штамм E. coli M15[pREP4] (Qiagen) трансформировали соответствующей экспрессионной плазмидой. Экспрессию в штамме-хозяине M15[pREP4] и очистку проводили по аналогии с примером 1. Анализ на полиакриламидном геле с ДСН показал, что в восстанавливающих условиях две зоны при примерно 50 кДа и 105 кДа окрашивались Кумасси, тогда как в не восстанавливающих условиях наблюдали зону при примерно 155 кДа (Фиг.9). Таким образом, это определенно показало, что рекомбинантный нейротоксин высвобождался из бактерий более чем на 90 процентов в виде двухцепочечного полипептида, в котором две цепи ковалентно связаны друг с другом дисульфидным мостиком. В результате теста на активность в анализе правого или левого купола диафрагмы получили токсичность, которая является сравнимо высокой по сравнению с нативным нейротоксином типа С1, выделенным из Clostridium botulinum. Модификация области петли между легкой цепью и доменом транслокации, таким образом, не обладает эффектом на токсичность.

Пример 6: Клонирование и экспрессия рекомбинантного фрагмента псевдомонадного экзотоксина (Ре40) с модифицированной петлей

Путем использования хромосомной ДНК штамма Pseudomonas aeruginosa 103 фрагмент гена, кодирующий область домена II, который локализован в С-концевом направлении петли между остатками цистеина 13 и 36, а также домен III, амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами #17 и #18 (Фиг.6). Продукт амплификации клонировали в плазмиде pQE-BoNT(A)-Lmod1 по Nco I и Mlu I в обмен на фрагмент гена BoNT(A)-Lmod1 (плазмида pQE-PEII3 III). Участок последовательности для области домена II, которая является N-концевой областью петли, встраивали путем гибридизации олигонуклеотида #15 и #16 (Фиг.6) и клонирования по сайтам рестрикции Nco I и Kpn I в плазмиду pQE-PEII3 III (плазмида pQE-PEIImod III; последовательность #9). Экспрессионный штамм Е. coli M15[pREP4] (Qiagen) трансформировали соответствующей экспрессионной плазмидой. Экспрессию в штамме-хозяине M15[pREP4] и очистку проводили по аналогии с примером 1. Результатом анализа на полиакриламидном геле с ДСН в восстанавливающих условиях была более слабая зона при 40 кДа, а также более сильная зона при 37 кДа. В не восстанавливающих условиях, однако, наблюдали только одну зону при 40 кДа. При инкубации клеточного лизата по меньшей мере в течение двух часов при комнатной температуре перед очисткой аффинной хроматографией зона при 40 кДа была уже не обнаружимой в восстанавливающих условиях. В результате замены области петли между остатками цистеина 13 и 36 в домене II фрагмента РЕ40 модифицированной петлей BoNT(A) расщепление полипептидной цепи, таким образом, происходило, где вышеупомянутые остатки цистеина образовали дисульфидный мостик. N-концевой фрагмент примерно 3 кДа был уже не обнаружимым после восстановления в 12-процентном ДСН-геле.

Пример 7: Клонирование и экспрессия рекомбинантного фрагмента дифтерийного токсина (Dt389) с модифицированной петлей

Путем использования хромосомной ДНК штамма Corynebacterium diphtheria NCTC 13129 фрагмент гена, который кодирует А-цепь дифтерийного токсина, амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами #19 и #20 (Фиг.6). По сайтам рестрикции для Nco I и Stu I продукт амплификации клонировали в плазмиду pQE-BoNT(A)-Lmod1 (см. пример 1) (плазмида pQE-DT-Amod1). Таким же путем фрагмент гена, кодирующий N-концевой фрагмент В-цепи, амплифицировали с праймерами #21 и #22 (Фиг.6) и клонировали по сайтам рестрикции Stu I и Xho I в плазмиду pQE-DT-Amod1 (плазмида pQE-DT389-mod1; последовательность #10). Экспрессионный штамм Е. coli M15[pREP4] (Qiagen) трансформировали соответствующей экспрессионной плазмидой. Экспрессию в штамме-хозяине M15[pREP4] и очистку проводили по аналогии с примером 1. Анализ на полиакриламидном геле с ДСН показал, что в восстанавливающих условиях две зоны при примерно 22 кДа окрашивались Кумасси, тогда как в не восстанавливающих условиях наблюдали одну зону при примерно 43 кДа. Это определенно показало, что рекомбинантный фрагмент дифтерийного токсина высвобождался из бактерий более чем на 90 процентов в виде двухцепочечного полипептида, в котором две цепи ковалентно связаны друг с другом дисульфидным мостиком.

Пример 8: Клонирование и экспрессия рекомбинантного рицина с модифицированной петлей

Путем использования мРНК семян Ricinus communis фрагмент гена, кодирующий А-цепь рицина, амплифицировали с помощью ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) с праймерами #23 и #24 (Фиг.6). По сайтам рестрикции для Nco I и Xho I его клонировали в плазмиду pQE-BoNT(A)-Lmod1 (см. пример 1) (плазмида pQE-ricin-A). Таким же путем фрагмент гена, кодирующий В-цепь, амплифицировали с праймерами #25 и #26 (Фиг.6) и клонировали в pQE-ricin-A по сайтам рестрикции для Kpn I и Xho I (плазмида pQE-ricin-mod1; последовательность #11). Экспрессионный штамм Е. coli M15[pREP4] (Qiagen) трансформировали соответствующей экспрессионной плазмидой. Экспрессию в штамме-хозяине M15[pREP4] и очистку растворимой части экспрессированного рицина проводили по аналогии с примером 1. Анализ на полиакриламидном геле с ДСН показал, что в восстанавливающих условиях две зоны при примерно 19 кДа и 42 кДа окрашивались Кумасси, тогда как в не восстанавливающих условиях наблюдали зону при примерно 62 кДа. Это определенно показало, что растворимая часть рекомбинантного рицина высвобождалась из бактерий более чем на 90 процентов в виде двухцепочечного полипептида, в котором две цепи ковалентно связаны друг с другом дисульфидным мостиком.

Научная литература

Arora et al. (1999), Cancer Res. 59: 183-8

Collier (2001), Toxicon 39 (11): 1793-803

Fujinaga (1997), Microbiology 143: 3841-47

Ogata et al. (1990), J. Biol. Chem 265 (33); 20678-85

Reiter (2001), Adv. Cancer Res. 81: 93-124

Schiavo and Montecucco (1997), The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic Press, San Diego: 295-322

Williams et al. (1990) J. Biol Chem, 265 (33): 20673-77

Патентная литература

Borgford, US patent 6,593,132

Brown and Jones, WO 89/04839

Fitzgerald et al., US patent 6,426,075

Pastan et al., US patent 5,980,895

1. Способ получения полипептидов или белков, обладающих свойствами токсина, в двухцепочечной форме, где эти две цепи связаны дисульфидным мостиком, путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах Е. coli, где
1) полипептид или белок проявляет свою биологическую активность в виде двухцепочечного полипептида или белка с дисульфидным мостиком,
2) С-концевой аминокислотный остаток первой цепи представляет собой остаток основной аминокислоты,
3) вторая цепь белка/полипептида имеет на N-конце в направлении от N к С от 1 до 20 аминокислотных остатков и пентапептидную последовательность VPXGS, называемую PRS, где Х представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, где V представляет собой Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro или Gly, где Р представляет собой Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val или Gly, где G представляет собой Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe или Val и где S представляет собой Ser, Tyr, Trp или Thr; и
4) способ включает следующие стадии:
а) модификацию полипептида или белка на уровне нуклеиновой кислоты таким образом, что этот полипептид или белок в его модифицированной форме в его области петли имеет последовательность VPXGS, где X, V, Р, G и S являются такими, как определено выше, и где указанная область петли определена как аминокислотная последовательность, локализованная между остатками Cys, которые образуют дисульфидный мостик;
б) введение конструкции, модифицированной на уровне нуклеиновой кислоты, в клетки E. coli;
в) культивирование и последующий лизис клеток-хозяев и
г) выделение двухцепочечного полипептида или белка с дисульфидным мостиком без предварительной стадии добавления белка типа эндопротеазы.

2. Способ по п.1, где остаток основной аминокислоты представляет собой остаток Arg или Lys.

3. Способ по п.1 или 2, где первая цепь полипептида/белка представляет собой более легкую цепь указанного полипептида/белка, а вторая цепь представляет собой более тяжелую цепь указанного полипептида/белка, в частности, где белок представляет собой гибридный белок.

4. Способ по п.1 или 2, где полипептид или белок представляет собой ботулинический нейротоксин, в частности ботулинический нейротоксин серотипа A (BoNT(A)), и в частности фрагмент LHN BoNT(A).

5. Способ по п.4, где PRS-последовательность VPXGS встроена между аминокислотами Leu442 и Lys448 BoNT(A) с делецией аминокислот 443-447, в частности, где встроена PRS-последовательность VPRGS, VPYGS, VPHGS или VPQGS.

6. Способ по п.1 или 2, где PRS-последовательность VPXGS встроена в октапептид Lys438-Ile445 BoNT(B), в 15-мер His438-Asp452 BoNT(C1) или в 13-мер Lys413-Ile425 BoNT(E) с делецией по меньшей мере одной аминокислоты, в частности, где PRS-последовательность VPXGS встроена в форме 17-мера GIITSKTKSLVPRGSKA или 18-мера RGIITSKTKSLVPRGSKA.

7. Способ по п.3, где гибридный белок имеет следующие компоненты А, В и С:
эффекторный домен, который посредством своей ферментативной активности способен ингибировать секрецию в клетках-мишенях или уничтожать их, либо домен токсина (компонент А);
последовательность петли, которая содержит последовательность VPXGS (компонент В); а также
домен, связывающий клетку, который придает клеточную специфичность слитому белку или гибридному белку (компонент С), и возможный компонент D:
домен транслокации.

8. Способ по п.7, где домен токсина (А) представляет собой домен дифтерийного токсина, псевдомонадного экзотоксина или рицина, в частности, где домен токсина (А) представляет собой фрагмент РЕ40 (домен III, домен II и домен Ib) или фрагмент РЕ38 (домен III и домен II) псевдомонадного экзотоксина или А-цепь рицина.

9. Способ по п.7, где домен, связывающий клетку (С), представляет собой моноклональное антитело, аффилин, белок с анкириновыми повторами, антикалин, ростовой фактор, такой, как фактор роста Т-клеток альфа (TGF-альфа), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) или инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) или цитокин, такой, как интерлейкин IL2, IL4 или IL6.

10. Способ по п.3, где гибридный белок имеет следующие компоненты А, В и С:
белок или олигопептид, который придает слитому белку лучшую растворимость, способствует более высокой скорости экспрессии и/или обеспечивает аффинную очистку (компонент А);
последовательность петли, содержащая последовательность VPXGS (компонент В); а также
любой тип полипептида (компонент С).

11. Способ по п.10, где компонент А представляет собой глутатион-S-трансферазу (GST), белок, связывающий мальтозу (МВР), метку His, метку Strep или метку FLAG.

12. Способ по любому из пп.1-11, где клетки E. coli представляют собой клетки E. coli K12, в частности клетки E. coli K12 штаммов M15[pREP4], XL1-BLUE или UT5600.

13. Полипептид или белок, обладающий свойствами токсина, представленный в виде двухцепочечного полипептида/белка с дисульфидным мостиком и являющийся биологически активным, характеризующийся тем, что С-конец первой цепи полипептида/белка представляет собой остаток основной аминокислоты и вторая цепь полипептида/белка содержит на N-конце в направлении от N к С от 1 до 20 аминокислотных остатков и пентапептидную последовательность VPXGS, называемую PRS, где Х представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, где V представляет собой Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro или Gly, где Р представляет собой Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val или Gly, где G представляет собой Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe или Val и где S представляет собой Ser, Tyr, Trp или Thr.

14. Полипептид по п.13, где остаток основной аминокислоты представляет собой остаток Arg или Lys.

15. Полипептид или белок по п.14, где первая цепь полипептида/белка представляет собой более легкую цепь указанного полипептида/белка, а вторая цепь представляет собой более тяжелую цепь указанного полипептида/белка, в частности, где С-конец первой цепи представляет собой остаток Lys.

16. Полипептид или белок по п.14 или 15, где вторая цепь имеет на N-конце пентапептидную последовательность VPXGS, гексапептидную последовательность XVPXGS или гептапептидную последовательность XXVPXGS.

17. Полипептид или белок по п.14 или 15, где этот полипептид/белок содержит ботулинический нейротоксин, производное или фрагмент ботулинического нейротоксина, в частности фрагмент LHN, или обладает биологической активностью ботулинического нейротоксина, в частности, где этот полипептид/белок содержит ботулинический нейротоксин серотипа A (BoNT(A)) или обладает биологической активностью BoNT(A), в частности, где этот полипептид или белок представляет собой фрагмент LHN BoNT(A) или обладает биологической активностью BoNT(A).

18. Полипептид или белок по п.14 или 15, где вторая цепь имеет на N-конце гептапептидную последовательность SLVPXGS, в частности, где Х представляет собой R, Y, Н или Q.

19. Полипептид или белок по п.14 или 15, где белок представляет собой гибридный белок, в частности, где гибридный белок имеет следующие компоненты А, В и С:
эффекторный домен, который посредством своей ферментативной активности способен ингибировать секрецию в клетках-мишенях или уничтожать их, либо домен токсина (компонент А);
последовательность петли, которая содержит последовательность VPXGS (компонент В); а также
домен, связывающий клетку, который придает клеточную специфичность слитому белку или гибридному белку (компонент С); и возможный компонент:
домен транслокации в качестве компонента D.

20. Полипептид или белок по п.19, где домен токсина (А) представляет собой домен дифтерийного токсина, псевдомонадного экзотоксина или рицина, в частности, где домен токсина (А) представляет собой фрагмент РЕ40 (домен III, домен II и домен Ib) или фрагмент РЕ38 (домен III и домен II) псевдомонадного экзотоксина или А-цепь рицина.

21. Полипептид или белок по п.19, где домен, связывающий клетку (С), представляет собой моноклональное антитело, аффилин, белок с анкириновыми повторами, антикалин, ростовой фактор, такой, как TGF-альфа, FGF, VEGF или IGF-1, или цитокин, такой, как IL2, IL4 или IL6.

22. Полипептид или белок по п.19, где гибридный белок имеет следующие компоненты А, В и С:
белок или олигопептид, который придает слитому белку лучшую растворимость, способствует более высокой скорости экспрессии и/или обеспечивает аффинную очистку (компонент А);
последовательность петли, содержащая последовательность VPXGS (компонент В); а также
любой тип полипептида (компонент С),
в частности, где компонент А представляет собой глутатион-8-трансферазу (GST), белок, связывающий мальтозу (МВР), метку His, метку Strep или, метку FLAG.

23. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид или белок, обладающий свойствами токсина, по любому из пп.13-22 в качестве активного ингредиента и полезные добавки.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению гормонов, и может быть использовано в разведении беспозвоночных. .

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам и устройствам для получения окрашивающих веществ, и может быть использовано в пищевой и косметической промышленности, а также при проведении различного рода биологических исследований.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения биогенного поверхностно-активного вещества сурфактина, обладающего множественной биологической активностью.

Изобретение относится к медицине и касается гуманизированных антител, которые распознают веротоксин II, и продуцирующей их линии клеток. .

Изобретение относится к способу получения циклоспорина А высокой чистоты путем очистки сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, путем многоступенчатой хроматографии на силикагеле при высокой загрузке колонны от 10 до 52%, с использованием в качестве элюента смеси толуола с ацетоном в количестве от 10 до 30 об.% или толуола с этилацетатом в количестве от 10 до 35 об.%, циклоспорина А высокой чистоты с содержанием в нем циклоспорина L, U и D менее 0,05% и содержанием в нем циклоспорина В и С < 0,02 об.%, промышленного способа очистки циклоспорина А от сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс.

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию иммуногенных композиций и вакцин для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями.

Изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей TolC, плазмиде, содержащей такую нуклеотидную последовательность, протеину или пептиду, кодированному такой нуклеотидной последовательностью, бактерии, содержащей такую нуклеотидную последовательность, а также к различным применениям таких бактерий.

Изобретение относится к полипептидам с установленной аминокислотной последовательностью, обладающим противомикробной активностью. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине для профилактики, лечения и диагностики заболеваний, обусловленных Neisseria meningitidis. .
Наверх