Микробный препарат для очистки объектов от нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии и касается микробных препаратов, которые могут быть использованы для очистки объектов от нефти и нефтепродуктов. Микробный препарат состоит из смеси природных углеводородокисляющих культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов, причем культуры микроорганизмов выделены из сообщества микроорганизмов, обитающих на морских бурых водорослях, по крайней мере, одного биологического рода. Изобретение позволяет вести очистку воды и любых твердых объектов от нефти и нефтепродуктов с более высокой скоростью и эффективностью очистки даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре, в том числе в районах с коротким тепловым периодом.

 

Изобретение относится к области экологии и прикладной микробиологии и касается микробных препаратов, которые могут быть использованы для очистки объектов от нефти и нефтепродуктов.

Известен микробный препарат на основе штамма микроорганизмов Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, который может быть использован для очистки от нефти и нефтепродуктов солоноватоводных экосистем (патент RU №2268934, МПК C12N 1/20, 2003).

Известен микробный препарат на основе ассоциации штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, который может быть использован для очистки объектов (почвы, пресной и морской моды) от нефти и нефтепродуктов (патент RU №2312891, МПК C12N 1/20, 2006).

Наиболее близким к заявляемому является известный микробный препарат для очистки объектов (почвы и воды) от нефти и нефтепродуктов, состоящий из смеси природных углеводородокисляющих (УВ) культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов, находящихся в очищаемой воде или почве (патент RU №2057724, МПК C02F 3/34, 1994) - прототип. При получении данного препарата селекцию культур микроорганизмов проводят традиционным методом в присутствии смеси питательной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния, с нефтью или нефтепродуктами.

Недостатками известного микробного препарата являются его относительно невысокие скорость и эффективность очистки загрязненных объектов от нефти и нефтепродуктов, а также относительно узкая область его применения.

Технической задачей изобретения является разработка нового микробного препарата, позволяющего вести очистку различных объектов от нефти и нефтепродуктов с более высокой скоростью и эффективностью даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре, в том числе в районах с коротким тепловым периодом, а также расширение области применения микробного препарата.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном микробном препарате для очистки объектов от нефти и нефтепродуктов, состоящем из смеси природных УВ культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов в присутствии смеси питательной водной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния, с нефтью или нефтепродуктом, культуры микроорганизмов выделяют из сообщества микроорганизмов, обитающих на морских бурых водорослях, по крайней мере, одного биологического рода, и препарат используют с титром не менее 10⁵ колониеобразующих единиц (KOE) на мл при использовании суспензии препарата в водной среде и с титром не менее 10⁵ KOE на грамм при использовании водной суспензии препарата, иммобилизованного на твердом носителе.

В предлагаемом техническом решении селекцию культур микроорганизмов необходимо проводить в присутствии смеси водной питательной среды с нефтью или нефтепродуктом, причем более целесообразно использовать для этих целей сырую нефть. В отсутствие нефти или нефтепродукта получить микробный препарат не удается.

В качестве питательной среды, используемой при селекции МС, можно использовать традиционные для таких целей питательные среды, содержащие, по крайней мере, соединения азота, фосфора, магния и калия.

При этом микробный препарат можно хранить в виде суспензии отселектированного сообщества микроорганизмов в водной питательной среде или в воде, либо в виде высушенного отселектированного микробного сообщества (МС), а также в виде отселектированного МС, иммобилизованного на твердом носителе.

При получении микробного препарата сушить отселектированное МС, а также иммобилизовать его на твердом носителе можно как в присутствии биогенной добавки, так и в ее отсутствие. При этом биогенная добавка должна содержать, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия, магния. В качестве биогенной добавки можно использовать как легкорастворимые, так и труднорастворимые минеральные или органоминеральные соединения. Кроме того, биогенная добавка может содержать еще и микроэлементы.

Микроскопическими, культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими методами было показано, что предлагаемый препарат состоит из бактерий, относящихся к различным биологическим родам, например, таким как Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Mycobacterium, Acinetobacter, Phyllobacterium, Marinobacter, Alcanivorax, Oleispira, Cycloclasticus и т.д. В предлагаемом изобретении для выделения культур микроорганизмов могут быть использованы различные морские бурые водоросли, например, бурые водоросли биологических родов Fucus sp., Laminarya sp., Phyllariella sp. и т.д. Эти водоросли широко распространены в морских экосистемах, например, в Белом море, Баренцевом море и Дальневосточных морях и т.д. Можно использовать, как бурые водоросли одного биологического рода, например рода Fucus sp., так и водоросли двух и более биологических родов.

Сушку биомассы препарата можно осуществлять как лиофильно, так распылением суспензии биомассы препарата в газовом потоке, например, в воздухе, в азоте, в аргоне и т.д.

В качестве твердого носителя для иммобилизации отселектированного МС можно использовать различные неорганические и органические, преимущественно пористые объекты, например, такие как природные пористые цеолиты, перлит, торф, опилки, почву и др.

Иммобилизацию можно проводить путем обработки носителя суспензией отселектированного сообщества микроорганизмов в жидкой среде посредством распыления, смешения и т.д. с последующей сушкой, которую можно осуществлять как при атмосферном, так и при пониженном давлении.

Микробный препарат получают следующим образом. Образцы бурых водорослей собирают, как правило, в зоне литорали. Фрагменты таллома (кусочки водорослей) размером примерно от 1 см² или более помещают в водную питательную среду, например, следующего состава (г/л): KNO₃ - 4,0; KH₂PO₄ - 0,6; Na₂HPO₄ - 1,4; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 20,0. В качестве источника углерода для жизнедеятельности МС используют либо нефтепродукт, либо, преимущественно, сырую нефть, вводимые в питательную среду в количестве нескольких массовых процентов. pH среды с нефтью 7,0.

Для получения культуры, окисляющей нефть или нефтепродукт, МС, засеянное как описано выше, инкубируют на лабораторной качалке при скорости вращения 280-300 об/мин, при температуре преимущественно не выше 15°С. Таким методом получают так называемую накопительную культуру микроорганизмов, за развитием которой наблюдают визуально и микроскопически. Через семь суток накопительную культуру помещают в холодильник, поддерживающий температуру в 10-12°С.

Селекцию УВ сообщества микроорганизмов проводят в течение нескольких месяцев, путем последовательных нескольких (5-6) пересевов 1 мл накопительной культуры в новую порцию питательной среды с нефтью или нефтепродуктом указанного выше состава.

Культивируемое разнообразие бактерий и определение титра микроорганизмов в накопительной культуре осуществляют путем десятикратного разведения стерильной среды без нефти и высева 0,01 мл накопительной культуры на чашки Петри, содержащие среду, состоящую из мясопептонного бульона и сусла, взятых в соотношении 1:1, с добавлением 1,7% агар-агара. После этого чашки Петри инкубируют при 10°С в течение 7 дней.

Из отдельных колоний микроорганизмов, выросших в этих условиях, традиционными методами выделяют штаммы чистых культур микроорганизмов. Способность чистых культур микроорганизмов потреблять УВ сырой нефти проверяют в тех же условиях, что и у накопительной культуры.

Морфологические и культуральные свойства колоний микроорганизмов, их микроскопию и проверку их окрашиваемости по Граму изучают традиционными микробиологическими методами.

Используемый в изобретении микробный препарат представляет собой смесь бактерий, включает одиночные клетки и их группирования в недлинные цепочки или иные скопления, за счет выделяемой слизи. Морфологически - это палочки разных размеров и толщины, кокки, коккобациллы, изогнутые палочки, у-образные пары клеток. Некоторые из них подвижные, другие - нет. Бактерии являются гетеротрофными аэробами, сапротрофными, грамположительными и грамотрицательными, не разжижающими агар, использующими простые субстраты, такие как углеводы, аминокислоты, органические кислоты, спирты и углеводороды.

Предлагаемый микробный препарат не обладает токсичными и токсигенными свойствами, не обладает раздражающими действиями на слизистые оболочки, не аллергичен. Он продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, которые повышают скорость и степень очистки от нефти и нефтепродуктов.

Микробный препарат можно использовать в виде суспензии отселектированного МС в водной среде с тиром микроорганизмов не менее 10⁵ KOE/мл. При использовании водной суспензии препарата, иммобилизованного на твердом носителе, концентрация микроорганизмов на носителе должна составлять не менее 10⁵ KOE/г носителя. Предлагаемый препарат экологичен и может быть использован для очистки различных объектов, таких как вода, в том числе, морская, почва, металлические и другие загрязненные поверхности от нефти и нефтепродуктов, в том числе при повышенной концентрации соли в различных географических широтах, в том числе в районах Крайнего Севера и других районах с коротким тепловым периодом.

Препарат способен очищать объекты от нефти и нефтепродуктов только в присутствии влаги. В ее отсутствие микробный препарат неэффективен. Очистку объектов с помощью предлагаемого микробного препарата можно осуществлять как в присутствии биогенной добавки, так и в ее отсутствие. При этом биогенная добавка должна содержать, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния.

Контроль за эффективностью и скоростью очистки объектов от нефти и нефтепродуктов можно проводить с помощью любых традиционных для таких целей методов, например, таких как, хроматография, гравиметрия, респирометрия и т.д.

Предлагаемый препарат удобен для использования. Хранят микробный препарат в виде его суспензии в водной питательной среде, либо в замороженном виде после отделения микроорганизмов от питательной среды, либо в высушенном виде, а также в иммобилизованном виде на твердом носителе после высушивания. Срок годности препарата, хранящегося в виде суспензии в питательной среде при 10°С, без пересева в новую питательную среду составляет не менее 6 месяцев. Высушенный препарат, а также иммобилизованный препарат может храниться более года.

Преимущества предлагаемого препарата иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Образцы морских бурых водорослей биологического рода Fucus sp. собирают в зоне литорали Белого моря в районе Кандалакшской губы при температуре морской воды 12°С. Кусочки таллома водоросли, размером около 2 см² помещают в стерильные конические стеклянные колбы, емкостью 750 мл, заполненные 100 мл водной питательной среды, содержащей растворенные нижеуказанные соли, взятые в количестве (г/л): KNO₃ - 4,0; KH₂PO₄ - 0,6; Na₂HPO₄ - 1,4; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 20,0. В колбы добавляют по 2 мл сырой Бакинской нефти, используемой в качестве источника углерода для жизнедеятельности МС. Колбы закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками и закрепляют на лабораторной качалке. Включают качалку, работающую со скоростью 300 об/мин, и проводят инкубацию МС при 12°С в течение 7 суток. Затем колбы помещают в холодильник с температурой 10°С. За развитием культур микроорганизмов наблюдают визуально и микроскопически.

Селекцию УВ сообщества микроорганизмов проводят в течение 2,5 месяцев путем последовательных 10 пересевов 1 мл полученной суспензии микроорганизмов в 100 мл новой вышеуказанной питательной среды с нефтью.

Культивируемое разнообразие бактерий МС и определение титра микроорганизмов в полученном сообществе осуществляют путем десятикратного разведения в стерильной среде без нефти и высева 0, 01 мл этой культуры на чашки Петри, содержащие среду, состоящую из мясопептонного бульона и сусла, взятых в соотношении 1:1, с добавлением 1,7% агар-агара. После этого чашки Петри инкубируют при 10°С в течение 7 дней. Получают микробный препарат с титром 10⁸ KOE/мл, содержащий 10 биологических родов грамотрицательных и грамположительных бактерий, следующего морфологического состава: кокки, палочки, изогнутые и коринеформные бактериальные клетки.

Способность полученного микробного препарата очищать морскую воду от нефти и нефтепродуктов проверяют в микрокосмном эксперименте, имитирующем условия Белого моря. Эксперимент проводят при 12°С в специальных павильонах Беломорской биологической станции МГУ им. М.В.Ломоносова в 3-х пластиковых аквариумах, объемом 5 л с площадью зеркала аквариума 30×40 см, с протоком морской воды и имитацией физико-химических и биологических условий акватории Белого моря. Скорость протока регулируют таким образом, чтобы соответствовать скорости колебания воды в прибойной зоне моря.

Микробную биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8 тыс.об/мин и полученную густую пастообразную массу, содержащую 10¹⁰ KOE/мл, хранят в замороженном виде.

Для иммобилизации препарата осуществляют ресуспендирование 1 мл препарата в 1 л вышеуказанной питательной среды без нефти с последующим введением в полученную суспензию 300 г твердого плавучего носителя, в качестве которого используют природный цеолит. Полученную смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре, затем цеолит с иммобилизованным препаратом отделяют от суспензии и сушат при комнатной температуре до воздушно сухого состояния. Получают микробный препарат, иммобилизованный на твердом носителе, содержащий 10⁷ KOE/г носителя. На поверхность каждого из аквариумов, заполненных морской водой, вносят по 100 мл сырой Бакинской нефти, затем на водную поверхность каждого из аквариумов вносят по 5 г цеолита с иммобилизованным на нем микробным препаратом. Опыт проводят при 12°С в течение 7 суток. За это время эффективность очистки морской воды от нефти, определенная гравиметрическим методом, составляет в среднем 96%.

Пример 2.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако полученный биопрепарат на цеолите не иммобилизуют, и в качестве очищаемого объекта используют 200-литровую металлическую бочку, загрязненную изнутри нефтью. В бочку заливают 200 л морской воды, затем туда добавляют 3 мл полученного биопрепарата и биогенную добавку, содержащую 80 г KNO₃, 12 г KH₂PO₄; 28 г Na₂HPO₄ и 16 г MgSO₄. Получают водную суспензию препарата с титром 1.5×10⁵ KOE/мл. Опыт проводят в течение 5 суток при 10°С при периодическом интенсивном перемешивании. За это время эффективность очистки бочки от нефти достигает 90%.

Пример 3 (контрольный, по прототипу).

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако культуру микроорганизмов выделяют из морской воды, загрязненной нефтепродуктами и взятой из акватории Мурманского морского порта. За 7 суток эффективность очистки морской воды от нефти составляет 51%.

Пример 4.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако при получении биологически активного препарата используют смесь образцов морских бурых водорослей биологических родов Laminarya sp. и Phyllariella sp., обитающих в акватории Баренцева моря, селекцию природного сообщества микроорганизмов проводят в присутствии дизельного топлива, биопрепарат на цеолите не иммобилизуют и лиофильно сушат, а в качестве очищаемого объекта используют поверхность трех участков засоленной почвы площадью по 1 м², каждый из которых равномерно загрязнен 600 мл дизельного топлива.

В 10 л воды суспендируют полученный препарат, затем туда добавляют биогенную добавку, содержащую 0,8 г KNO₃, 0,12 г KH₂PO₄; 0,28 г Na₂HPO₄ и 0,16 г MgSO₄. Получают водную суспензию препарата с титром 1×10⁵ KOE/мл. Каждый участок загрязненной почвы перекапывают и рыхлят, затем каждый участок равномерно обрабатывают 10 л вышеназванной водной суспензии препарата. Опыт проводят при 12°С. За 7 суток эффективность очистки почвы от дизельного топлива составляет в среднем 86%.

Пример 5.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют микробный препарат, иммобилизованный на твердом носителе - цеолите, с титром 10⁸ KOE/г носителя, и очистку воды осуществляют от мазута. За 9 суток эффективность очистки морской воды от мазута составляет в среднем 92%.

Пример 6 (контрольный, с меньшим, чем заявлено титром препарата).

Опыт проводят аналогично примеру 2, однако используют водную суспензию микробного препарата с титром 10⁴ KOE/мл. За 5 суток эффективность очистки бочки от нефти составила 40%.

Пример 7 (контрольный, с меньшим, чем заявлено титром препарата).

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют водную суспензию препарата с титром 10⁴ KOE/г носителя. За 7 суток эффективность очистки морской воды от нефти составила 50%.

Таким образом, из примеров видно, что предложенный новый микробный препарат действительно позволяет повысить эффективность очистки объектов от нефти и нефтепродуктов с 51 до 92-96% и существенно повышает скорость процесса очистки даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре в условиях Крайнего Севера России, что обусловлено микробиологическим составом препарата. Кроме того, препарат существенно расширяет область своего применения, распространяя ее на любые твердые объекты, загрязненные нефтью или нефтепродуктами.

Микробный препарат для очистки объектов от нефти и нефтепродуктов, состоящий из смеси культур природных углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов в присутствии смеси питательной водной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния, с нефтью или нефтепродуктом, отличающийся тем, что культуры микроорганизмов выделены из сообщества микроорганизмов, обитающих на морских бурых водорослях, по крайней мере, одного биологического рода, и в случае необходимости иммобилизованы на твердый носитель, при содержании клеток не менее 10⁵ КОЕ на мл суспензии или на 1 г твердого носителя.