Штамм бактерий escherichia coli eb387 для защиты животных семейства псовых от токсикозов, вызванных цитотоническими токсинами типа a1b5, и пробиотический препарат на его основе

Изобретение относится к ветеринарной медицине и биотехнологии. Штамм получают путем встраивания в геном Escherichia coli, изолированной от клинически здорового представителя семейства псовых, генов, детерминирующих синтез микроцина С51, В-субъединицы токсина, а также вакцинного варианта elt-оперона и А-субъединицы, усиливающий иммунный ответ. Штамм обладает выраженной адгезией к слизистой оболочке кишечника животных семейства псовых. Лиофилизированная высушенная культура Escherichia coli ЕВ387 представляет собой пробиотический препарат для защиты животных семейства псовых от токсикозов, вызванных цитотоническими токсинами типа A1B5. Изобретение обеспечивает нормализацию и стабилизацию качественного и количественного состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта представителей семейства псовых. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к ветеринарной медицине и биотехнологии и может быть использовано для защиты домашних и диких представителей семейства псовых (Canidae) от токсикозов, обусловленных цитотоническими токсинами типа A1B5.

Цитотонические токсины типа A1B5 широко распространены среди различных таксономических групп микроорганизмов: энтеробактерий, вибрионов, псевдо- и аэромонад, хеликобактерий. В последние годы отмечается расширение круга продуцирующих эти токсины бактерий, что связано с дрейфом кодирующих их генов в бактериальных популяциях.

Токсины этой группы поражают пищеварительную и выделительную системы организма, органы размножения, кожные покровы. Активируют внутриклеточных паразитов, отягощают течение вирусных и паразитарных заболеваний. Эти токсины способны поражать и людей, являясь одной из основных причин диареи путешественников.

Особенности формирования антитоксического иммунитета делают малоэффективными лечебные и профилактические препараты, основанные на парентеральном применении.

Наиболее близкими по сущности и достигаемому положительному эффекту к заявляемому штамму являются штаммы Escherichia coli M17 (патент РФ №1633817) и Е. coli BKM СК-322Д (патент РФ №1819428), обладающие антибактериальной активностью и предназначенные для профилактики кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных, но не имеющих адгезии к клеткам слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и штамм Е. coli РНМБ (патент РФ №2259213), обладающий адгезивными свойствами, но не способный вызывать эффективное образование местного иммунного ответа из-за отсутствия в рекомбинантной плазмиде pLTB фрагмента гена субъединицы А токсина, придающего генному продукту суперантигенные свойства.

Задачей изобретения является получение нового пробиотического штамма, обладающего выраженной адгезией к слизистой оболочке кишечника плотоядных животных семейства псовых и способного защищать их от токсикозов, обусловленных токсинами типа A1B5 за счет образования местного иммунитета, обусловленного иммуноглобулинами класса А и экранирования специфических клеточных рецепторов для этих токсинов - ганглиозидов GM1.

Задача достигается тем, что в геном штамма Е. coli, изолированного от клинически здорового представителя семейства псовых, были встроены гены, детерминирующие синтез микроцина С51 и вакцинного варианта elt-токсоида с делецией в гене эффекторной А-субъединицы токсина, обеспечивающей утрату токсической функции. В то же время присутствие А-субъединицы резко усиливает иммунный ответ за счет суперантигенных свойств последней. Наличие в геноме штамма рецепторной В-субъединицы обеспечивает экранирование клеточных рецепторов от действия цитотонических токсинов типа A1B5. Микроцин С51 подавляет развитие патогенных и условно патогенных энтеробактерий, не оказывая при этом угнетающего действия на нормофлору. Помимо этого штамм Escherichia coli ЕВ387 оказывает стимулирующее действие на облигатную микрофлору желудочно-кишечного тракта, в частности способствуя восстановлению ее видового и количественного состава при дисбиотических состояниях.

Штамм Е. coli №97/3 был выделен из фекалий клинически здоровой собаки. Первичная идентификация осуществлена на основании морфологических и культуральных свойств. Окончательно видовая принадлежность определена на основании АР-теста. Штамм не содержал плазмидной ДНК и не нес детерминант лекарственной устойчивости, но обладал ярко выраженными адгезивными свойствами по отношению к эритроцитам морской свинки.

Рекомбинантная плазмида р ΔABLT была получена на основе природной плазмиды рН74114, несущей в своем составе полноразмерный elt-оперон.

Для этого из штамма Е. coli H74114 была выделена и очищена плазмидная ДНК. Выделение и очистку проводили следующим образом. Бактериальные клетки из 10 мл ночной бульонной культуры осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 0,5 мл буфера STET следующего состава: сахароза 8%, тритон Х-100 - 0,5%, ЭДТА 25 мМ, Трис-HCL 25 мМ, рН 8,0. После этого к ним добавляли 0,25 мл 0,3М NaOH, помещали на водяную баню при температуре 70°С и инкубировали в течение 15 минут. Затем к образцу добавляли смесь равных объемов фенола с хлороформом и после энергичного перемешивания центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут. Отбирали водную фазу, к которой последовательно добавляли 0,07 мл 3М раствора ацетата натрия и 0,7 мл изопропанола, перемешивали и центрифугировали. Осадок ДНК дважды промывали 70% этанолом, подсушивали под вакуумом и растворяли в 0,05 мл деионизованной воды.

Полученный таким образом препарат ДНК плазмиды рН74114 подвергали гидролизу посредством рестриктазы PstI. Реакцию проводили в буфере, содержавшем 10 мМ Трис-НСl (рН 8,5 при 37ºС), 10 мМ MgCl, 100 мМ КСl при температуре 37°С в течение 1 часа. Реакцию останавливали прогреванием (15 мин при 65°С). Таким же образом обрабатывали ДНК векторной плазмиды, рестрикты смешивали в соотношении 1:4 (вектор:вставка), обрабатывали ДНК-лигазой бактериофага Т4 при 4°С в течении ночи.

Полученной лигазной смесью трансформировали клетки лабораторного штамма Е. coli DH5. Трансформацию осуществляли следующим образом: ночную культуру реципиентного штамма разводили в 100 раз средой LB и выращивали до середины логарифмической стадии роста. Летки в объеме 40 мл осаждали центрифугированием и промывали 0,15 М NaCl, суспендировали в 2 мл 50 мМ раствора CaCl2. После 20 минут инкубации к ним добавляли 20 мкл лигазной смеси и инкубировали еще 40 минут в ледяной бане. После температурного шока(42°С, 3 минуты) клетки разводили 0,5 мл среды LB, инкубировали при 37°С в течение 90 минут, высевали на чашки с агаризованной средой LB и помещали в термостат при температуре 37°С. Выросшие колонии отбирали и анализировали на наличие elt-оперона. По результатам анализа клонов был отобран один, несший в своем составе полноразмерный elt-оперон. Из клеток этого клона вышеприведенным способом была изолирована плазмидная ДНК. Выделенную ДНК последовательно обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами XbaI, BclI и нуклеазой S1, экстрагировали нейтральным фенолом и переосаждали 2 объемами этанола. Полученный таким образом препарат обрабатывали ДНК-лигазой бактериофага Т4 и посредством трансформации вводили в штамм Е. coil №97/3. В результате, таким образом, был сконструирован и отобран клон, обозначенный как Е. coli 97/3/28, несший в своем составе рекомбинантную плазмиду р ΔABLT.

Из клеток штамма Е. coli M17 приведенным выше способом была выделена плазмида р74, детерминирующая синтез микроцина С51. Полученной ДНК был протрансформирован штамм Е. coli 97/3/28, несший в своем составе рекомбинантную плазмиду p ΔABLT. Эффективность трансформации составляла 102 трансформантов на 1 мкг ДНК. Электрофоретический анализ плазмидных профилей трансформантов показал наличие двух плазмид p ΔABLT и р74. Таким образом, был сконструирован и отобран клон, обозначенный как Е. coli EB387, несший в своем составе рекомбинантную плазмиду p ΔABLT и плазмиду р74.

Для определения иммунологической активности белка, синтезируемого под контролем плазмиды p ΔABLT был применен метод двойной радиальной диффузии по методу Ухтерлони. Для этого клетки штамма Е. coli EB387 культивировали в 250 мл среды МПБ в течение 24 часов, осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0,01 М трис-НСl буфере рН 8,6, содержавшем 0,15 NaCl. Полученную клеточную суспензию подвергали обработке на ультразвуковом дезинтеграторе ME 150.

Для постановки реакции использовали 1% агар, приготовленный на вышеуказанном буфере, и поликлональную сыворотку к полноразмерной молекуле LT.

Полученный лизат образовывал полосы преципитации с поликлональной сывороткой к полноразмерной молекуле LT в разведении 1:128. Иммуноблот, поставленный с данным лизатом, показал наличие двух полос с молекулярной массой 24 и 12,7 кД соответственно, что соответствует молекулярным массам А и В субъединиц LT.

С целью изучения апатогенности пробиотического штамма Е. coli ЕВ387 бульонную культуру штамма в дозе 1-5×109 вводили перорально и внутрибрюшинно лабораторным мышам массой 16-20 г. Ни в одном из случаев гибели животных не наблюдалось. При вскрытии животных патологические изменения в органах не наблюдались.

При пероральном введении препарата в дозе 1-5×109 на голову щенкам собаки, вуалевого песца и серебристо-черной лисы, а также молодняку кроликов токсичность не обнаруживалась. Срок персистенции штамма пробиотика в организме представителей семейства псовых при пероральном введении не менее 280 дней (срок наблюдения).

Полученный штамм бактерий Е. coli EB387 депонирован в коллекции штаммов возбудителей заболеваний пушных зверей музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства им. В.А.Афанасьева РАСХН (НИИПЗК).

Характеристика штамма Е. coli EB387.

Рекомбинантный резидентный антитоксический штамм Е. coli EB387 обладает пролонгированным действием, продуцируемый им микроцин С51 подавляет развитие токсигенных энтеробактерий, а делетированный вариант термолабильного токсина экранирует специфические рецепторы на поверхности энтероцитов от действия голатоксина и активирует специфический иммунитет. Резидентные свойства штамма обеспечивают его включение в состав микробиоты, что позволяет примерять его реже и в меньших дозах.

Генетические маркеры: Содержит гены микроциногении (С51), делетированный вакцинный вариант elt-оперона эшерихий, устойчив к канамицину (100 мкг/мл) и тетрациклину (50 мкг/мл).

Морфологические, культуральные, ферментативные свойства: грамотрицательные неспорообразующие, подвижные палочки с закругленными концами размером (1,2-1,5)×(2,0-5,0) мкм. Хорошо растут на МПА, агаризованной среде Хоттингера, минимальных средах с глюкозой и глицерином. Суточные культуры на жидких средах образуют равномерное помутнение. На плотных средах формируют серо-желтые колонии S-формы, на среде Эндо красные с металлическим блеском колонии (1-2 суток при 37°С).

Факультативный анаэроб. Температурный оптимум 37°С.

Расщепляет с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, рамнозу, арабинозу, манит, инозит. Не утилизирует сорбит, цитрат и малонат натрия. Уреазная активность отсутствует. Сероводород не образует. Синтезирует галактозидазу. Образует индол. Не синтезирует фенилаланиндезаминазу. Желатиназная активность отсутствует, молоко сбраживает. Активность лизиндекарбоксилазы и орнитиндекарбоксилазы обнаруживается, аргининдегидролаза отсутствует.

Вирулентность для животных (ЛД50): не патогенен для белых мышей, крыс, кроликов, собак, песцов и лисиц при пероральном применении.

Биологическая активность в чувствительной системе: на средах Адамса и М9 ингибирует индикаторный штамм Е. coli В с зоной подавления роста от 10 до 50 мм, положительно реагирует с поликлональной сывороткой против LT в реакции двойной диффузной преципитации по Ухтерлони. Геммагглютинацией эритроцитов морской свинки выявляется адгезивный антиген штамма Е. coli EB387.

Срок хранения и периодичность пассажей на чувствительной системе: пересев на МПА каждые два месяца, проверка специфической активности каждые шесть месяцев. В лиофилизированном виде штамм хранится не менее 1 года при температуре 4°С.

Контроль за состоянием штамма осуществляется двояко: раз в три месяца проверяют культуральные, морфологические и биохимические свойства и перед применением подтверждают специфическую активность, тестируя наличие микроциногении на среде Адамса с использованием индикаторной культуры Е. coli В и выявляя биосинтез токсоида в иммунохимическом тесте с моноклональными антителами.

На основе полученного штамма Е. coli EB387 был создан пробиотический препарат, представляющий собой лиофильно высушенную культуру микроорганизмов, предназначенный для профилактики токсикозов у животных семейства псовых, вызванных цитотоническими токсинами типа A1B5.

Проверку протективной активности пробиотического препарата на основе штамма Е. coli EB387 проводили на представителях семейства псовых - песцах породы вуалевый на базе племенных заводов «Пушкинский» и «Салтыковский» Московской области. Установлено, что препарат обладает длительным сроком персистенции в кишечнике представителей семейства псовых, прием препарата способствовал нормализации кишечной микрофлоры и предотвращал развитие токсикозов у экспериментальных животных семейства псовых.

Пример 1. Сроки персистенции и элиминации препарата.

В опытах на песцах породы вуалевый на базе племенных заводов «Пушкинский» и «Салтыковский» было установлено, что после недельного курса приема пробиотика в дозе 1,5 млн. КОЕ на голову экспериментального животного пробиотический штамм Е. coli EB387 высевался в составе просветной микрофлоры в течение 260 дней (срок наблюдения).

В опытах, поставленных на самках песца породы вуалевый, было установлено, что после их обработки пробиотическим препаратом на основе штамма Е. coil EB387 в период подготовки к гону последний обнаруживался в составе кишечной микрофлоры рожденных ими щенков.

Пример 2. Влияние препарата на кишечную микрофлору.

В опытах проведенных на 30 головах молодняка песца породы вуалевый на базе племенного завода «Салтыковский» было установлено, что после недельного курса приема пробиотика в дозе 1,5 млн. КОЕ на голову экспериментального животного у последних происходила нормализация качественного и количественного состава кишечной микрофлоры: исчезали условно патогенные неферментирующие эшерихии, количество норальной кишечной палочки возрастало на 1-2 порядка и достигало нормальных значений 107; также на 2-3 порядка возрастало количество лактобацилл и энтерококков до уровня 108-109. Количество бифидобактерий не изменялось и соответствовало норме - 109-1011. Таким образом, под действием препарата происходит нормализация и стабилизация качественного и количественного состава нормофлоры желудочно-кишечного тракта представителей семейства псовых.

Пример 3. Протективная активность препарата.

В опытах на лабораторных животных обработка белых мышей пробиотическим препаратом на основе штамма Е. coli EB387 предотвращала появление диарейного синдрома и гибель последних при их заражении патогенным штаммом Escherichia coli. Обработка препаратом на основе штамма Е. coli EB387 самок и молодняка вуалевых песцов предотвратила их дорегистрационную гибель и повысила выход щенков на 0,6 головы на самку по сравнению с необработанным контролем.

1. Штамм бактерий Escherichia coli ЕВ 387, депонированный в коллекции штаммов-возбудителей пушных зверей и кроликов музея бактериальных культур ГНУ НИИПЗК им. В.А.Афанасьева РАСХН № ЕВ 387, предназначенный для защиты животных семейства псовых от токсикозов, вызванных цитотоническими токсинами типа A1B5.

2. Пробиотический препарат для защиты животных семейства псовых от токсикозов, вызванных цитотоническими токсинами типа A1B5, характеризующийся тем, что представляет собой лиофильно высушенную культуру Escherichia coli по п.1.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования микроорганизмов в искусственных питательных двухфазных средах. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к профилактике кишечного заболевания, такого как связанная с антибиотиками диарея, приобретенная диарея, вызванная Clostridium difficile, воспалительное кишечное заболевание и желудочно-кишечное заболевание, введением эффективного количества бактерий Bacillus, которые продуцируют липопептиды.
Изобретение относится к биотехнологии для выращивания легионелл. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при диагностике туберкулеза. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается применения штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») в качестве тест-штамма для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов и их производных).

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для разложения токсичных органических соединений, а именно для разложения фенола. .
Изобретение относится к кормопроизводству, в частности к способам приготовления биологически активных кормовых добавок для млекопитающих, птиц, рыб, повышающих эффективность пищеварения, оказывающих разностороннее действие на животный организм и позволяющих применять их как для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, так и для стимуляции роста и повышения продуктивности животных.
Изобретение относится к биотехнологии, спиртовой и кормовой промышленности, может быть использовано при производстве кормовых добавок, обогащенных белком и аминокислотами.

Изобретение относится к профилактике кишечного заболевания, такого как связанная с антибиотиками диарея, приобретенная диарея, вызванная Clostridium difficile, воспалительное кишечное заболевание и желудочно-кишечное заболевание, введением эффективного количества бактерий Bacillus, которые продуцируют липопептиды.
Изобретение относится к биотехнологии для выращивания легионелл. .

Изобретение относится к медицине, а именно к профилактике и лечению инфекционной патологии у человека и других млекопитающих. .

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аспартата или метаболита, являющегося производным L-аспартата, с использованием бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, модифицированной таким образом, что в ней активность -кетоглутаратдегидрогеназы и цитратсинтазы снижена; активность фосфоенолпируваткарбоксилазы или пируваткарбоксилазы и глутаматдегидрогеназы или глутаматсинтазы повышена.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при диагностике туберкулеза. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к питательным средам для культивирования микроорганизмов, и может быть использовано при промышленном приготовлении бактерийных вакцин.

Изобретение относится к области ветеринарии. .

Изобретение относится к ветеринарной медицине и биотехнологии

Наверх