Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи, содержащая их композиция и способ лечения в-клеточной опухоли
Заявленная группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения В-клеточной опухоли у млекопитающего. Способ лечения В-клеточной опухоли заключается во введении терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид, имеющий любую из последовательностей SEQ ID NO: 1-9. Также предложены способ индуцирования апоптоза клеток В-клеточной опухоли, способ увеличения экспрессии CD40 на клетках В-клеточной опухоли и способ индуцирования продукции IL-10 клетками В-клеточной опухоли посредством контактирования указанных клеток В-клеточной опухоли с композицией, содержащей олигонуклеотид, имеющий любую из последовательностей SEQ ID NO: 1-9. Предложена также фармацевтическая композиция, содержащая (1) олигонуклеотид, имеющий любую из последовательностей SEQ ID NO: l-9, и (2) агент против В-клеточной опухоли. Заявленная группа изобретений обеспечивает эффективное лечение В-клеточной опухоли за счет индуцирования апоптоза клеток опухоли, который обусловлен увеличением экспрессии CD40 на клетках В-клеточной опухоли и стимулированием продукции IL-10 клетками В-клеточной опухоли. 5 н. и 16 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящим изобретением обеспечиваются девять олигонуклеотидов с последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1-9, или их функциональные гомологи, содержащая их композиция и способ лечения В-клеточной опухоли с использованием олигонуклеотидов путем индуцирования апоптоза клеток В-клеточной опухоли, увеличения экспрессии CD40 на клетках В-клеточной опухоли и стимуляции продуцирования IL-10 клетками В-клеточной опухоли. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи можно использовать по отдельности или вместе или использовать в комбинации с химиотерапией, иммунотерапией и облучением для лечения В-клеточной опухоли.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Основываясь на классификационной системе WHO (American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121), лимфоидные злокачественные опухоли группируют в три основных класса: В-клеточная опухоль, Т-клеточная/NK-клеточная (естественные киллеры) опухоль и лимфомы Ходжкина.
В-клеточную опухоль далее разделяют на две группы: опухоль из В-клеток-предшественников и периферическая В-клеточная опухоль. Опухоль из В-клеток-предшественников включает острый лимфобластный лейкоз из В-клеток-предшественников (В-клеточный острый лимфобластный лейкоз, B-ALL)/лимфобластную лимфому (LBL). Периферическая В-клеточная опухоль включает В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-CLL), лимфому из малых лимфоцитов, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмацитарную лимфому/иммуноцитому, лимфому коры головного мозга, фолликулярную лимфому, фолликулярную лимфому кожи, экстранодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны MALT-типа, нодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны (+/- моноцитоидные В-клетки), лимфому маргинальной зоны селезенки (+/-ворсинчатые лимфоциты), волосатоклеточный лейкоз, плазмацитому/плазмаклеточную миелому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, медиастинальную (тимусную) крупноклеточную В-клеточную лимфому, интраваскулярную крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную лимфому с выпотом и лимфому Беркитта.
В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-CLL) и В-клеточный острый лимфобластный/лимфоцитарный лейкоз (B-ALL) представляют собой два типа В-клеточного лейкоза. Клетки B-CLL экспрессируют CD19, CD5 и CD23 (Nicholas Chiorazzi, M.D., et al. N. Engl. J. Med. 2005; 352: 804-15). Клетки B-ALL экспрессируют маркеры CD19 и CD10.
Лимфома из малых лимфоцитов является В-клеточной опухолью. Клетки лимфомы из малых лимфоцитов экспрессируют CD19, CD5 и CD23 (Catherine Thieblemont, et al. Blood. 2004; 103: 2727-2737).
В зависимости от типа В-клеточной опухоли существующими в настоящее время вариантами лечения являются химиотерапия, радиотерапия и иммунотерапия.
CD40, экспрессируемый на клеточной поверхности нормальных В-лимфоцитов и дендритных клеток, является членом семейства рецепторов факторов некроза опухоли (TNFR). CD40L (CD154), экспрессируемый на Т-лимфоцитах, является членом семейства факторов некроза опухоли (Castle BE, et al. J. Immunol. 1993; 151: 1777-1788). Взаимодействие CD40L и CD40 стимулирует пролиферацию, дифференциацию В-лимфоцитов, дендритных клеток и моноцитов и презентацию ими антигенов (Ranheim EA, et al. J. Exp.Med. 1993; 177: 925-935; Yellin MJ, et al. J. Immunol. 1994; 153: 666-674; Banchereau J., et al. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12: 881-922; M.von Bergwelt-Baildon MS, et al. Blood 2002; 99: 3319-3325).
CD40 также экспрессируется на клетках В-клеточной опухоли. Показано, что увеличение экспрессии CD40 стимулирует апоптоз клеток В-клеточной опухоли (Peter Chu, et al. PNAS, March 19, 2002, vol.99, no.6: 3854-3859; Frank Dicker, et al. Blood, 15 April, 2005, Volume 105, Number 8: 3193-3198).
И эксперименты in vitro, и эксперименты in vivo указывали на то, что стимуляция и увеличение экспрессии CD40 индуцируют ингибирование роста клеток В-клеточной опухоли (Funakoshi, et al., Blood 83: 2787-2794, 1994; Murphy, et al., Blood 86: 1946-1953, 1995; Eliopoulos, A.G., et al. 1996. Oncogene 13: 2243; Hirano A., et al. 1999. Blood 93: 2999; Tong A.W., et al. 2001. Clin. Cancer Res. 7: 691).
Стимуляция экспрессии CD40 на клетках В-клеточной опухоли, как сообщалось, усиливает антигенные свойства клеток В-клеточной опухоли и, следовательно, благоприятствует образованию цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), специфичных в отношении этих клеток. CTL могут эффективно уничтожать клетки В-клеточной опухоли (Dilloo D., et al. Blood. 1997; 90: 1927-1933; Kato K., et al. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1133-1141; Wierda WG, et al. Blood. 2000; 96: 2917-2924; Takahashi S., et al. Hum. Genе Ther. 2001; 12: 659-670; Takahashi S., et al. Cancer Gene Ther. 2001; 8: 378-387). В присутствии CD40L CD40-экспрессирующие клетки В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза могут быть уничтожены с помощью CD4-цитотоксических Т-лимфоцитов (Frank Dicker, et al. Blood, 15 April, 2005, Vol.105, Num. 8: 3193-3198). Взаимодействие CD40L и CD40 на клетках лимфомы Беркитта может стимулировать презентацию этими клетками опухолевых антигенов специфическим CTL (Khanna R., et al. 1997. J. Immunol. 159: 5782). В экспериментах in vivo и в клинических испытаниях также продемонстрировано, что активация CD40 может усиливать иммуногенность клеток В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (B-CLL) и, следовательно, индуцировать образование CTL, специфичных в отношении этих клеток (Kato K., et al. 1998. J. Clin. Invest. 101: 1133; Wierda W.G., et al. 2000. Blood 96: 2917).
Вместе взятые эти данные указывают на то, что увеличение экспрессии CD40 на клетках В-клеточной опухоли может стимулировать противоопухолевый иммунитет против В-клеточной опухоли. Противоопухолевый иммунитет включает, без ограничения, следующее:
1) стимулирование апоптоза клеток В-клеточной опухоли;
2) ингибирование роста клеток В-клеточной опухоли;
3) усиление иммуногенности клеток В-клеточной опухоли и, следовательно, благоприятствование образованию CTL, специфичных в отношении этих клеток.
Интерлейкин-10 (IL-10) представляет собой гомодимерный цитокин, продуцируемый определенными Т-клетками, моноцитами, макрофагами и некоторыми относящимися к опухолям клетками, происходящими из В-клеток, Т-клеток или NK-клеток (Kitabayashi, et al., 1995; Masood, et al., 1995; Sjoberg, et al., 1996; Beatty, et al., 1997; Boulland, et al., 1998; Jones, et al., 1999). Активность IL-10 опосредуется специфичным в отношении него рецептором клеточной поверхности, экспрессируемым на антиген-презентирующих клетках, лимфоцитах и клетках В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (B-CLL). Обнаружено, что добавление экзогенного IL-10 ингибирует пролиферацию клеток B-CLL, недавно выделенных из больных (Jesper Jurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan, et al. Characterization of interleukin-10 receptor expression on B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood, Vol.89, No.11 (June 1), 1997: pp.4146-4152). Также сообщалось, что IL-10 ингибирует пролиферацию клеток B-CLL и усиливает апоптоз клеток B-CLL (Anne-Catherine Fluckiger, Isabelle Durand and Jacques Banchereau. Interleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med. Volume 179, January, 1994, 91-99). Иммуностимулирование противораковых свойств IL-10 обсуждалось в обзоре, на основании которого можно предположить, что сверхэкспрессия IL-10 в опухолевой микросреде может катализировать иммунное отторжение злокачественной опухоли (Simone Mocellin, Francesco M., Marincola and Howard A. Young. Interleukin-10 and the immune response against cancer: a counterpoint. Journal of Leukocyte Biology. 2005; 78: 1043-1051).
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечиваются девять олигонуклеотидов, также обозначаемых Олиго1, Олиго3, Олиго4, Олиго5, Олиго6, Олиго7, Олиго8, Олиго9, Олиго10, с последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 соответственно, и их функциональные гомологи. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут иметь модификацию в фосфатном остове, которая представляет собой модификацию в виде фосфоротиоата или фосфородитиоата, являющуюся частичной или полной. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут иметь химические модификации или замены редкими основаниями. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут являться функциональными частями любых других ДНК-фрагментов, или они могут быть клонированы в плазмидный, бактериальный, вирусный вектор или ДНК-вакцину соответственно. Олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 1-9 можно модифицировать добавлением одного или нескольких оснований (предпочтительно от 1 до 10 оснований) к каждому из их концов или изменением в них от одного до нескольких оснований. Специалисты в данной области могут определить, как использовать олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 1-9 или их функциональные гомологи по отдельности или вместе или как использовать ДНК-фрагменты, включающие олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 1-9 соответственно, для достижения цели настоящего изобретения, основываясь на том, что хорошо известно в данной области техники, и на доктрине настоящего изобретения.
Во втором варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается способ лечения у субъекта В-клеточной опухоли с использованием олигонуклеотидов или их функциональных гомологов настоящего изобретения по отдельности или вместе или с использованием композиции, содержащей олигонуклеотиды или их функциональные гомологи настоящего изобретения. Субъектом является человек или животное. В-клеточная опухоль включает, но не ограничивается перечисленными, В-клеточный лейкоз, В-клеточную лимфому и миелому.
В третьем варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается способ лечения В-клеточной опухоли с использованием олигонуклеотидов или их функциональных гомологов настоящего изобретения по отдельности или вместе или с использованием композиции, содержащей олигонуклеотиды или их функциональные гомологи настоящего изобретения, путем индуцирования апоптоза клеток В-клеточной опухоли.
В четвертом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается способ лечения В-клеточной опухоли с использованием олигонуклеотидов или их функциональных гомологов настоящего изобретения по отдельности или вместе или с использованием композиции, содержащей олигонуклеотиды или их функциональные гомологи настоящего изобретения, путем увеличения экспрессии CD40 на клетках В-клеточной опухоли.
В пятом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается способ лечения В-клеточной опухоли с использованием олигонуклеотидов или их функциональных гомологов настоящего изобретения по отдельности или вместе или с использованием композиции, содержащей олигонуклеотиды или их функциональные гомологи настоящего изобретения, путем стимуляции продуцирования IL-10 клетками В-клеточной опухоли.
В другом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается композиция, содержащая терапевтически эффективное количество олигонуклеотидов или их функциональных гомологов настоящего изобретения по отдельности или в/с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Композицию вводят энтерально, парентерально и местно или путем ингаляции.
В еще одном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается способ лечения В-клеточной опухоли, включающий введение терапевтически эффективного количества олигонуклеотидов или их функциональных гомологов настоящего изобретения по отдельности или вместе или содержащей их композиции или с по крайней мере одним агентом против В-клеточной опухоли, в том числе химиотерапевтическими, иммунотерапевтическими агентами и агентами, применяемыми в радиотерапии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1. Влияние олигонуклеотидов на увеличение экспрессии CD40 на клетках B-CLL.
Клетки B-CLL инкубировали с олигонуклеотидами или без них в течение 7 дней и затем окрашивали с помощью меченного FITS (ФИТЦ) антитела против CD40 для анализа экспрессии CD40 с использованием проточной цитометрии. Уровень экспрессии указан числом MFI (среднекратный прирост).
Фиг.2. Влияние олигонуклеотидов на увеличение экспрессии CD40 на клетках лимфомы из малых лимфоцитов.
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов инкубировали с олигонуклеотидами или без них. На 7 день клетки окрашивали с помощью меченного FITS (ФИТЦ) антитела против CD40 для анализа экспрессии CD40 с использованием проточной цитометрии. Уровень экспрессии указан числом MFI.
Фиг.3. Влияние олигонуклеотидов на пролиферацию нормальных PBMS человека.
Нормальные PBMS человека культивировали с олигонуклеотидами или без них и подвергали включению [3H]-тимидина для определения пролиферации клеток. Пролиферацию клеток выражали в имп/мин.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
В настоящем изобретении следующие термины имеют указанные ниже значения.
"Олигонуклеотид" означает полинуклеотиды (т.е. молекулы, включающие сахар (например, дезоксирибозу), связанный с фосфатной группой и с взаимозаменяемым органическим основанием). Существуют четыре органических основания: цитозин (С), тимин (Т), аденин (А) и гуанин (G). Олигонуклеотид можно синтезировать с помощью автоматизированного синтезатора олигонуклеотидов, имеющегося на рынке, или приготовить из уже существующих последовательностей нуклеиновых кислот с использованием известных методов.
"Модификация в остове" олигонуклеотида означает, что олигонуклеотид может иметь модифицированный в виде фосфоротиоата фосфатный остов (т.е. по крайней мере один кислород фосфата заменен серой) или другой модифицированный остов.
"Химическая модификация" олигонуклеотида означает модификацию с использованием активных групп нуклеотида или с созданием аналогов нуклеотидов. Модификации могут происходить или во время синтеза олигонуклеотида, или после него. Во время синтеза модифицированные основания (в т.ч., без ограничения, аналоги тимидина) могут быть включены внутрь или на 5'-конце. После синтеза модификацию можно осуществить с использованием активных групп (посредством аминомодификатора, через 3'- или 5'-гидроксильные группы или через фосфатную группу).
"В-клеточная опухоль" означает заболевание, развившиеся в результате аномальной пролиферации клеток В-лимфоцитарной линии. В-клеточные опухоли можно сгруппировать в В-клеточный лейкоз, В-клеточную лимфому и миелому (плазмацитому/плазмаклеточную миелому). В-клеточный лейкоз включает В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-CLL), острый лимфобластный лейкоз из В-клеток-предшественников (В-клеточный острый лимфобластный лейкоз, B-ALL), В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и волосатоклеточный лейкоз. В-клеточная лимфома включает лимфому из малых лимфоцитов, лимфоплазмацитарную лимфому/иммуноцитому, лимфому коры головного мозга, фолликулярную лимфому, фолликулярную лимфому кожи, экстранодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны MALT-типа, нодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны (+/- моноцитоидные В-клетки), лимфому маргинальной зоны селезенки (+/-ворсинчатые лимфоциты), диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, медиастинальную (тимусную) крупноклеточную В-клеточную лимфому, интраваскулярную крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную лимфому с выпотом и лимфому Беркитта.
"Субъект" означает млекопитающее, в том числе, но без ограничения, человека, обезьяну, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, козу, овцу, мышь и крысу. Олигонуклеотид настоящего изобретения можно вводить субъекту с В-клеточной опухолью.
"Агент против В-клеточной опухоли" означает агент, используемый для лечения В-клеточной опухоли у субъекта. Агент включает олигонуклеотиды настоящего изобретения, химиотерапевтические агенты, иммунотерапевтические агенты и агенты, используемые в радиотерапии. Олигонуклеотиды настоящего изобретения можно вводить до, вместе с или после введения одного или нескольких других агентов против В-клеточной опухоли для достижения синергического эффекта при лечении В-клеточной опухоли.
"Химиотерапия" означает химиотерапию, с помощью которой лечат В-клеточную опухоль в комбинации с олигонуклеотидами настоящего изобретения. Олигонуклеотиды настоящего изобретения можно использовать с одним или несколькими химиотерапевтическими агентами при лечении В-клеточной опухоли. Химиотерапевтические агенты включают, но не ограничиваются перечисленными, алкилирующие агенты, такие как циклофосфамид или хлорамбуцил, винка-алкалоиды (например, винкристин и винбластин), прокарбазин, метотрексат, преднизон, антрациклин, L-аспарагиназу, аналоги пурина (например, флударабин монофосфат, 2-хлордезоксиаденозин и пентостатин), цитозин, арабинозид, цисплатин, этопозид и ифосфамид. Олигонуклеотиды настоящего изобретения можно также использовать с одной или несколькими химиотерапевтическими комбинациями при химиотерапии. Комбинации включают, но не ограничиваются перечисленными, CVP (циклофосфамид, винкристин и преднизон), CHOP (CVP и доксорубицин), С-МОРР (циклофосфамид, винкристин, преднизон и прокарбазин), САР-ВОР (CHOP плюс прокарбазин и блеомицин), m-BACOD (CHOP плюс метотрексат, блеомицин и лейковорин), ProMACE-MOPP (преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид и лейковорин плюс стандартная МОРР), ProMACE-CytaBOM (преднизон, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, цитарабин, блеомицин, винкристин, метотрексат и лейковорин), МАСОР-В (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, преднизон установленной дозы, блеомицин и лейковорин), IMVP-16 (ифосфамид, метотрексат и этопозид), MIME (метил-гаг, ифосфамид, метотрексат и этопозид), DHAP (дексаметазон, цитарабин высокой дозы и цисплатин), ESHAP (этопозид, метилпреднизолон, цитарабин высокой дозы, цисплатин), CEPP(B) (циклофосфамид, этопозид, прокарбазин, преднизон и блеомицин), САМР (ломустин, митоксантрон, цитарабин и преднизон), CHOP плюс блеомицин, метотрексат, прокарбазин, нитроген мустард, цитозин, арабинозид и этопозид, МОРР (мехлорэтамин (нитроген мустард), винкристин (онковин), прокарбазин и преднизон), ABVD (например, адриамицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин), ChIVPP (хлорамбуцил, винбластин, прокарбазин и преднизон), CABS (ломустин, доксорубицин, блеомицин и стрептозотоцин), МОРР плюс ABVD, МОРР плюс ABV (доксорубицин, блеомицин и винбластин) или BCVPP (кармустин, циклофосфамид, винбластин, прокарбазин и преднизон) и САР (циклофосфамид, доксорубицин и преднизон).
"Иммунотерапия" означает иммунотерапию, с помощью которой лечат В-клеточную опухоль в комбинации с олигонуклеотидами настоящего изобретения. Олигонуклеотиды настоящего изобретения можно использовать с одним или несколькими иммунотерапевтическими агентами при лечении В-клеточной опухоли. Иммунотерапевтические агенты включают, без ограничения, антитела против CD20. Антитела против CD20 включают иммуноглобулины и их фрагменты, которые специфически взаимодействуют с белком CD20 на клеточной поверхности клеток В-клеточной опухоли. Антитела против CD20 могут быть поликлональными и моноклональными антителами, химерными антителами, двуспецифическими антителами и гуманизированными антителами. "CD20" является мембранным белком В-клеток (Tedder, et al., Immunology Today 15: 450-454 (1994)) и экспрессируется и на нормальных, и на относящихся к опухоли В-клетках (John C. Byrd, et al. J. Clin. Oncol. 2001; 19: 2165-2170; Huhn D., et al. Blood, 2001, 98: 1326-1331).
"Фармацевтически приемлемый носитель" обозначает один или несколько твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые пригодны для введения субъекту олигонуклеотидов настоящего изобретения. Носитель может быть органическим, неорганическим, встречающимся в природе или синтетическим. Носитель включает любой и все растворы, разбавители, растворители, дисперсные среды, липосому, эмульсии, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотоничные агенты и замедляющие абсорбцию агенты и любой другой носитель, пригодный для введения олигонуклеотидов настоящего изобретения, и их применение хорошо известно в данной области техники.
"Терапевтически эффективное количество" олигонуклеотидов настоящего изобретения относится к дозе, используемой для достижения желаемого результата лечения В-клеточной опухоли у субъекта. Дозу можно определить с помощью стандартных методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, и доза может варьировать в зависимости от факторов, включающих, но не ограничивающихся перечисленными, размер и/или общее состояние здоровья субъекта или тяжесть заболевания. Введение олигонуклеотидов настоящего изобретения можно осуществить в виде единичного введения или на протяжении ряда введений. Подлежащие введению дозы олигонуклеотидов настоящего изобретения находятся в диапазоне от приблизительно 1 мкг до 100 мг на введение. Однако для лечения В-клеточной опухоли можно использовать дозы в диапазоне, превышающем в 10-1000 раз указанный выше диапазон доз. Специалисты в данной области могут регулировать схему приема лекарственного средства для обеспечения оптимального терапевтического эффекта.
"Способ" введения олигонуклеотидов настоящего изобретения означает энтеральное, парентеральное и местное введение или ингаляцию. Используемый здесь термин "энтеральное" включает оральное введение, введение в желудок, введение в кишечник и ректальное введение. Термин "парентеральное" включает внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Термин "местное" означает применение олигонуклеотидов наружно на эпидермис, в щечный карман и в ухо, глаз и нос.
"Фармацевтическая композиция" означает композицию, содержащую терапевтически эффективное количество олигонуклеотидов с фармацевтически приемлемым носителем или без него. Композиция включает, но не ограничивается перечисленными, водные или солевые растворы, частицы, аэрозоли, пилюли, гранулы, порошки, таблетки, покрытые таблетки, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли и другие фармацевтические композиции, пригодные для использования для множества систем доставки лекарственного средства. Композиции пригодны для инъекции, перорального, трансбуккального, ректального и вагинального использования, ингаляции и применения для хранения на складе. Во всех случаях композиция должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения и защищена от микробного заражения. Композиция для инъекции включает водные растворы или дисперсии и порошки для приготовления экспромтом инъецируемых растворов или дисперсии. "Порошок" в этом изобретении относится к композиции, которая содержит тонко диспергированные твердые частицы, содержащие олигонуклеотиды. Можно составить композицию порошка с другими фармацевтически приемлемыми носителями (например, водой, PBS (ЗФР), физиологическим раствором и другими фармацевтически приемлемыми буферами) перед использованием. Растворы можно приготовить путем включения олигонуклеотидов в один или несколько подходящих растворителей и других требуемых ингредиентов. Дисперсии можно приготовить путем включения олигонуклеотидов в носитель, который содержит дисперсную среду (например, глицерин, жидкие полиэтиленгликоли и масла) и другие требуемые ингредиенты. Композицию для орального введения готовят со съедобными носителями с формированием таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, шламов, суспезий и т.п. Композиция для трансбуккального введения представляет собой таблетки или лепешки обычного сорта. Композиция для ингаляции представляет собой аэрозоль из находящихся под давлением упаковок, или распылитель, или сухой порошок и может быть выбрана квалифицированным в данной области специалистом. Олигонуклеотиды можно также приготовить в виде фармацевтически приемлемых композиций для ректального или вагинального применения или применения для хранения на складе. В композиции можно использовать только олигонуклеотиды или их комбинацию с одним или несколькими другими агентами, включающими, но не ограничивающимися перечисленными, химиотерапевтические агенты, иммунотерапевтические агенты и лиганд, узнаваемый специфическим рецептором или молекулой клетки-мишени. Олигонуклеотиды в комбинации с другим агентом могут быть отдельными композициями и использоваться следующим образом: 1) до введения олигонуклеотиды смешивают со вторым агентом; 2) олигонуклеотиды и второй агент вводят субъекту в различное время; 3) олигонуклеотиды и второй агент вводят в различные места субъекта. Кроме того, композиция может содержать плазмидные, бактериальные векторы, вирусные векторы и вакцины из нуклеиновых кислот, несущие последовательность олигонуклеотидов настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры являются иллюстративными и не должны рассматриваться в качестве ограничения объема настоящего изобретения. Здесь можно осуществить без отклонения от объема настоящего изобретения приемлемые вариации, такие как те, которые приходят на ум специалисту.
Пример 1
Синтез олигонуклеотида
Авторы настоящего изобретения сконструировали и синтезировали олигонуклеотиды со следующими последовательностями и номенклатурой:
Олиго1: 5'-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3' (указанный в SEQ ID NO: 1)
Олиго3: 5'-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3' (указанный в SEQ ID NO: 2)
Олиго4: 5'-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3' (указанный в SEQ ID NO: 3)
Олиго5: 5'-TCgTTgCCgTCgg-3' (указанный в SEQ ID NO: 4)
Олиго6: 5'-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3' (указанный в SEQ ID NO: 5)
Олиго7: 5'-TCgTCgggTgCgATCgCAgggggg-3' (указанный в SEQ ID NO: 6)
Олиго8: 5'-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3' (указанный в SEQ ID NO: 7)
Олиго9: 5'-tcgtcgggtgcgacgtcgca-3' (указанный в SEQ ID NO: 8)
Олиго10: 5'-TCggggACgATCgTCgggggg-3' (указанный в SEQ ID NO: 9).
Для анализа функций вышеуказанных олигонуклеотидов также синтезировали два контрольных олигонуклеотида: 2006 с последовательностью 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' и 2216 с последовательностью 5'-gggggacgatcgtcgggggg-3'.
Все олигонуклеотиды синтезировали в Sangon Biotech Company (Shanghai, China), проверяли на эндотоксин в реакции с лизатом амебоцитов мечехвоста Limulus (Associates of Cape Cod, Inc.) и манипулировали в свободных от пирогенов реагентах. 2006 (J. Immunol. 2000; 164: 1617) является хорошо исследованным олигонуклеотидом, который сильно активирует нормальные В-клетки. 2216 (Eur. J. Immunol. 2001; 31: 2154) представляет собой другой хорошо исследованный олигонуклеотид, который индуцирует большие количества интерферона типа I в плазмацитоидных дендритных клетках.
Способы синтеза олигонуклеотида хорошо известны специалистам в данной области техники, и среди прочих, как правило, используется твердофазный синтез. В частности, в процессе синтеза используется твердая подложка, представляющая собой шарик из стекла с контролируемым размером пор (CPG). Этот шарик имеет поверхность с порами и длинными порами, и именно в них происходит прикрепление защищенного нуклеотида. Синтез олигонуклеотида начинается с наиболее 3'-концевого нуклеотида и продолжается благодаря ряду циклов, состоящих из пяти стадий, которые повторяют до тех пор, пока не присоединится наиболее 5'-концевой нуклеотид. Этими стадиями являются снятие защиты, активация, присоединение, кэппирование и стабилизация.
Стадия 1. Снятие защиты
Защитную группу в защищенном нуклеозиде, прикрепленном к шарику из CPG (стекла с контролируемым размером пор), удаляют с помощью трихлоруксусной кислоты (ТСА) с высвобождением реакционноспособной 5'-гидроксильной группы.
Стадия 2. Активация
На этой стадии тетразол атакует присоединяющийся нуклеозид в виде фосфорамидита с образованием промежуточного соединения тетразолилфосфорамидита.
Стадия 3. Присоединение
Промежуточное соединение тетразолилфосфорамидит взаимодействует с гидроксильной группой реципиента, и образуется 5'-3'-связь. Тетразол восстанавливается, и процесс продолжается.
Стадия 4. Кэппирование
На этой стадии используется ацетилирующий реагент, состоящий из уксусного ангидрида и N-метилимидазола, для блокирования реакционноспособной гидроксильной группы на наиболее 5'-концевом нуклеотиде для избежания неправильного присоединения.
Стадия 5. Стабилизация
После выполнения стадии кэппирования последней стадией цикла является окисление, которое стабилизирует фосфатную связь между растущей олигонуклеотидной цепью и последним из добавленных оснований. Эту стадию осуществляют в присутствии йода в качестве слабого окислителя в тетрагидрофуране (THF) и воде.
После этой конечной стадии цикл повторяют с каждым нуклеотидом в последовательности. После завершения синтеза одноцепочечную ДНК-молекулу очищают с помощью таких методов, как HAP, PAGE, HPLC, C18 и OPC.
Пример 2
Индуцируемый олигонуклеотидами апоптоз клеток B-CLL человека
1. Приготовление клеток B-CLL человека
Образцы крови от не проходивших лечения больных B-CLL (патологически идентифицированных) (The First Hospital, Jilin University, China) брали после получения утвержденного согласия в письменной форме. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла-пака (Pharmacia). Клетки CD5+CD19+CD23-B-CLL в РВМС очищали с помощью набора для выделения В-клеток (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) до чистоты, составляющей более 95% CD5+CD19+CD23-клеток (B-CLL-клеток). Приготовление клеток осуществляли в соответствии с руководством Miltenyi Biotec.
2. Индуцируемый олигонуклеотидами апоптоз клеток B-CLL человека
Клетки B-CLL инкубировали с Олиго1, Олиго3, Олиго4, Олиго5, Олиго6, Олиго7, Олиго8, Олиго9, Олиго10, 2006 или 2216 соответственно в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI 1640 (HyClone) с 10% АВ-сыворотки человека при 106 клеток/лунку в 48-луночном планшете. Олигонуклеотиды разводили в свободной от сыворотки среде RPMI 1640 (HyClone). Равный объем среды для разведения (свободной от сыворотки среды RPMI 1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (Среды).
На 3, 5 и 7 день инкубации клетки подсчитывали и окрашивали с помощью тетраметилродамина этилового эфира (TMRE) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. Vol.279, No. 23, Issue of June 4, pp.24152-24162, 2004) в течение 10 минут. TMRE-позитивные (жизнеспособные) и TMRE-негативные (апоптозные) клетки B-CLL определяли с помощью проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Количество жизнеспособных клеток B-CLL рассчитывали умножением общего числа клеток на процент TMRE-позитивных клеток в каждый момент времени. Эксперимент повторяли с десятью образцами крови от больных B-CLL, и усредненный результат (n=10) показал, что олигонуклеотиды значительно индуцируют апоптоз клеток B-CLL (таблица 1).
| Таблица 1 | |||
| Индуцируемый олигонуклеотидами апоптоз клеток B-CLL | |||
| Жизнеспособные клетки В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (%) (n=10) | |||
| Группы | Время инкубации (дни) | ||
| 3 | 5 | 7 | |
| Олиго1 | 55,7 | 27,7 | 19 |
| Олиго3 | 85,5 | 37,3 | 31,6 |
| Олиго4 | 60,1 | 38,8 | 27,5 |
| Олиго5 | 58,1 | 38,1 | 23,2 |
| Олиго6 | 52,3 | 34,9 | 31,7 |
| Олиго7 | 59,6 | 38,4 | 30,2 |
| Олиго8 | 51,1 | 34,2 | 29,6 |
| Олиго9 | 52,8 | 37,9 | 24,3 |
| Олиго10 | 54,6 | 35,4 | 28,3 |
| Среда | 82,2 | 79,5 | 81,3 |
| 2006 | 66,5 | 44,4 | 40,2 |
| 2216 | 67,7 | 57,7 | 50,7 |
Пример 3
Увеличение экспрессии CD40 на клетках B-CLL человека с помощью олигонуклеотидов
1. Приготовление клеток B-CLL человека
Клетки B-CLL человека выделяли от больных B-CLL с помощью методов, описанных в примере 2.
2. Увеличение экспрессии CD40 на клетках B-CLL человека с помощью олигонуклеотидов
Клетки B-CLL инкубировали с Олиго1, Олиго3, Олиго4, Олиго5, Олиго6, Олиго7, Олиго8, Олиго9, Олиго10, 2006 или 2216 соответственно в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI 1640 (HyClone) с 10% АВ-сыворотки человека при 106 клеток/лунку в 48-луночном планшете. Олигонуклеотиды разводили в свободной от сыворотки среде RPMI 1640 (HyClone). Равный объем среды для разведения (свободной от сыворотки среды RPMI 1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (Среды).
На 7 день инкубации клетки подсчитывали и окрашивали с помощью меченного FITS антитела против CD40 (Becton Ickinson) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. Vol.279, No. 23, Issue of June 4, pp.24152-24162, 2004) в течение 10 минут. Окрашенные антителом против CD40 клетки B-CLL определяли с помощью проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Результат (Фиг.1) показал, что олигонуклеотиды значительно увеличивают экспрессию CD40 на клетках B-CLL, что указывает на то, что олигонуклеотиды можно использовать для лечения B-CLL путем увеличения экспрессии CD40 на клетках. Увеличение экспрессии CD40 стимулирует апоптоз клеток B-CLL, индуцирует ингибирование роста клеток B-CLL и делает клетки B-CLL более иммуногенными для стимулирования образования CТL, специфичных в отношении клеток B-CLL. Эксперимент повторяли с по крайней мере десятью образцами крови от больных B-CLL с получением схожих результатов.
Пример 4
Индуцируемый олигонуклеотидами апоптоз клеток лимфомы из малых лимфоцитов человека
1. Приготовление клеток лимфомы из малых лимфоцитов человека
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов выделяли из ткани биопсии лимфотического узла больных (The First Hospital, Jilin University, China) лимфомой из малых лимфоцитов (патологически идентифицированных) после получения утвержденного согласия в письменной форме. Ткань биопсии измельчали с использованием предметных стекол с неровной поверхностью с высвобождением клеток в 5 мл среды RPMI 1640 (HyClone) с 10% АВ-сыворотки человека в 6-см культуральной чашке. Высвободившиеся клетки фильтровали через отверстие сита из нержавеющей стали и собирали в 50-мл коническую пробирку, содержащую 15 мл свободной от сыворотки среды RPMI 1640. Пробирку центрифугировали при 300g в течение 10 минут и затем супернатант отбрасывали. CD5+CD19+CD23-клетки лимфомы из малых лимфоцитов очищали с помощью набора для выделения В-клеток (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) до чистоты, составляющей более 95% CD5+CD19+CD23-клеток (клетки лимфомы из малых лимфоцитов). Приготовление клеток осуществляли в соответствии с руководством Miltenyi Biotec.
2. Индуцируемый олигонуклеотидами апоптоз клеток лимфомы из малых лимфоцитов
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов инкубировали с Олиго1, Олиго3, Олиго4, Олиго5, Олиго6, Олиго7, Олиго8, Олиго9, Олиго10, 2006 или 2216 соответственно в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI 1640 (HyClone) с 10% АВ-сыворотки человека при 106 клеток/лунку в 48-луночном планшете. Олигонуклеотиды разводили в свободной от сыворотки среде RPMI 1640 (HyClone). Равный объем среды для разведения (свободной от сыворотки среды RPMI 1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (Среды).
На 3, 5 и 7 дни инкубации клетки подсчитывали и окрашивали с помощью тетраметилродамина этилового эфира (TMRE) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. Vol.279, No. 23, Issue of June 4, pp.24152-24162, 2004) в течение 10 минут. TMRE-позитивные (жизнеспособные) и TMRE-негативные (апоптозные) клетки лимфомы из малых лимфоцитов определяли с помощью проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Количество жизнеспособных клеток лимфомы из малых лимфоцитов рассчитывали умножением общего числа клеток на процент TMRE-позитивных клеток в каждый момент времени. Эксперимент повторяли с пятью образцами от больных лимфомой из малых лимфоцитов, и усредненный результат (n=5) показал, что олигонуклеотиды значительно индуцируют апоптоз клеток лимфомы из малых лимфоцитов (таблица 2), что указывает на то, что олигонуклеотиды можно использовать для лечения лимфомы из малых лимфоцитов путем индуцирования апоптоза клеток.
| Таблица 2 | |||
| Индуцируемый олигонуклеотидами апоптоз клеток лимфомы из малых лимфоцитов | |||
| Жизнеспособные клетки лимфомы из малых лимфоцитов (%) (n=5) | |||
| Группы | Время инкубации (дни) | ||
| 3 | 5 | 7 | |
| Олиго1 | 53,5 | 26,7 | 18 |
| Олиго3 | 83,9 | 38,4 | 29,1 |
| Олиго4 | 61,1 | 36,9 | 29,7 |
| Олиго5 | 57,2 | 37,4 | 21,3 |
| Олиго6 | 56,2 | 36,1 | 32,1 |
| Олиго7 | 60,5 | 40,3 | 31,1 |
| Олиго8 | 50,2 | 37,4 | 30,2 |
| Олиго9 | 54,2 | 39,7 | 25,4 |
| Олиго10 | 56,5 | 37,6 | 29,3 |
| Среда | 81,2 | 78,4 | 77,1 |
| 2006 | 67,6 | 45,3 | 41,1 |
| 2216 | 68,5 | 58,7 | 52,1 |
Пример 5
Индуцируемое олигонуклеотидами увеличение экспрессии CD40 на клетках лимфомы из малых лимфоцитов
1. Приготовление клеток лимфомы из малых лимфоцитов человека
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов человека выделяли от больных с помощью методов, описанных в примере 4.
2. Индуцируемое олигонуклеотидами увеличение экспрессии CD40 на клетках лимфомы из малых лимфоцитов
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов инкубировали с Олиго1, Олиго3, Олиго4, Олиго5, Олиго6, Олиго7, Олиго8, Олиго9, Олиго10, 2006 или 2216 соответственно в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI 1640 (HyClone) с 10% АВ-сыворотки человека при 106 клеток/лунку в 48-луночном планшете. Олигонуклеотиды разводили в свободной от сыворотки среде RPMI 1640 (HyClone). Равный объем среды для разведения (свободной от сыворотки среды RPMI 1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (Среды).
На 7 день инкубации клетки подсчитывали и окрашивали с помощью меченного FITS антитела против CD40 (Becton Ickinson) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. Vol.279, No. 23, Issue of June 4, pp.24152-24162, 2004) в течение 10 минут. Окрашенные антителом против CD40 клетки лимфомы из малых лимфоцитов определяли с помощью проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Результат (Фиг.2) показал, что олигонуклеотиды значительно увеличивают экспрессию CD40 на клетках лимфомы из малых лимфоцитов, что указывает на то, что олигонуклеотиды можно использовать для лечения лимфомы из малых лимфоцитов путем увеличения экспрессии CD40 на клетках. Увеличение экспрессии CD40 стимулирует апоптоз клеток лимфомы из малых лимфоцитов, индуцирует ингибирование роста клеток лимфомы из малых лимфоцитов и делает клетки лимфомы из малых лимфоцитов более иммуногенными для стимулирования образования CТL, специфичных в отношении клеток лимфомы из малых лимфоцитов. Эксперимент повторяли с пятью образцами с получением схожих результатов.
Пример 6
Индуцируемый олигонуклеотидами апоптоз клеток B-АLL человека
1. Приготовление клеток B-АLL человека
Образцы крови от не проходивших лечения больных B-АLL (патологически идентифицированных) (The First Hospital, Jilin University, China) брали после получения утвержденного согласия в письменной форме. РВМС выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла-пака (Pharmacia). CD19+CD10-клетки B-АLL в РВМС очищали с помощью набора для выделения В-клеток (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) до чистоты, составляющей более 95% CD19+CD10-клеток (B-АLL-клетки). Приготовление клеток осуществляли в соответствии с руководством Miltenyi Biotec.
2. Индуцируемый олигонуклеотидами апоптоз клеток B-АLL человека
Клетки B-АLL инкубировали с Олиго1, Олиго3, Олиго4, Олиго5, Олиго6, Олиго7, Олиго8, Олиго9, Олиго10, 2006 или 2216 соответственно в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI 1640 (HyClone) с 10% АВ-сыворотки человека при 106 клеток/лунку в 48-луночном планшете. Олигонуклеотиды разводили в свободной от сыворотки среде RPMI 1640 (HyClone). Равный объем среды для разведения (свободной от сыворотки среды RPMI 1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (Среды).
На 3, 5 и 7 день инкубации клетки подсчитывали и окрашивали с помощью тетраметилродамина этилового эфира (TMRE) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. Vol.279, No. 23, Issue of June 4, pp.24152-24162, 2004) в течение 10 минут. TMRE-позитивные (жизнеспособные) и TMRE-негативные (апоптозные) клетки B-АLL определяли с помощью проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Количество жизнеспособных клеток B-АLL рассчитывали умножением общего числа клеток на процент TMRE-позитивных клеток в каждый момент времени. Эксперимент выполняли с десятью образцами крови от больных B-АLL, и усредненный результат (n=10) показал, что олигонуклеотиды значительно индуцируют апоптоз клеток B-АLL (таблица 3), демонстрируя, что олигонуклеотиды можно использовать для лечения B-АLL путем индуцирования апоптоза клеток B-АLL.
| Таблица 3 | |||
| Индуцируемый олигонуклеотидами апоптоз клеток B-АLL | |||
| Жизнеспособные клетки B-АLL (%) (n=10) | |||
| Группы | Время инкубации (дни) | ||
| 3 | 5 | 7 | |
| Олиго1 | 66,9 | 60,1 | 59,5 |
| Олиго3 | 67,9 | 64,1 | 65 |
| Олиго4 | 69,2 | 66,2 | 65,7 |
| Олиго5 | 70,6 | 68,2 | 67 |
| Олиго6 | 66,4 | 61 | 60,3 |
| Олиго7 | 75,9 | 70,1 | 69,2 |
| Олиго8 | 80,1 | 74,9 | 72,3 |
| Олиго9 | 67,2 | 63,1 | 62,9 |
| Олиго10 | 72,6 | 68,1 | 65,3 |
| Среда | 91,5 | 92,7 | 93,1 |
| 2216 | 94,9 | 95 | 93,5 |
| 2006 | 62,9 | 58,4 | 59 |
Пример 7
Увеличение экспрессии CD40 на клетках B-АLL с помощью олигонуклеотидов
1. Приготовление клеток B-АLL человека
Клетки B-АLL человека получали из образцов крови больных с помощью методов, описанных в примере 6.
2. Увеличение экспрессии CD40 на клетках B-АLL человека с помощью олигонуклеотидов
Клетки B-АLL инкубировали с Олиго1, Олиго3, Олиго4, Олиго5, Олиго6, Олиго7, Олиго8, Олиго9, Олиго10, 2006 или 2216 соответственно или без них в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI 1640 (HyClone) с 10% АВ-сыворотки человека при 106 клеток/лунку в 48-луночном планшете. Олигонуклеотиды разводили в свободной от сыворотки среде RPMI 1640 (HyClone). Равный объем среды для разведения (свободной от сыворотки среды RPMI 1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (Среды).
На 3, 5 и 7 день инкубации клетки подсчитывали и окрашивали с помощью меченного FITS антитела против CD40 (Becton Ickinson) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. Vol.279, No. 23, Issue of June 4, pp.24152-24162, 2004) в течение 10 минут. Окрашенные антителом против CD40 клетки B-АLL определяли с помощью проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Эксперимент повторяли с десятью образцами, и усредненный результат (таблица 4) показал, что олигонуклеотиды значительно увеличивают экспрессию CD40 на клетках B-АLL, что указывает на то, что олигонуклеотиды можно использовать для лечения B-АLL путем увеличения экспрессии CD40 на клетках. Увеличение экспрессии CD40 стимулирует апоптоз клеток B-АLL, индуцирует ингибирования роста клеток B-АLL и делает клетки B-АLL более иммуногенными для стимулирования образования CТL, специфичных в отношении клеток B-АLL.
| Таблица 4 | |||
| Увеличение экспрессии CD40 на клетках B-АLL с помощью олигонуклеотидов | |||
| Экспрессия CD40 на клетках В-клеточного острого лимфоцитарного лейкоза (MFI) (n=10) | |||
| Группы | Время инкубации (дни) | ||
| 3 | 5 | 7 | |
| Олиго1 | 33,6 | 33,9 | 34,2 |
| Олиго3 | 29,9 | 29,1 | 30,2 |
| Олиго4 | 30,1 | 29,9 | 31,6 |
| Олиго5 | 25,3 | 26,6 | 26,9 |
| Олиго6 | 32,9 | 32,8 | 33,1 |
| Олиго7 | 27,8 | 28,1 | 29,2 |
| Олиго8 | 15,9 | 17,2 | 17,8 |
| Олиго9 | 28,2 | 28,1 | 29,2 |
| Олиго10 | 26,9 | 27,4 | 27,8 |
| Среда | 7,2 | 7,9 | 8,5 |
| 2216 | 9,9 | 9,5 | 10,6 |
| 2006 | 33,7 | 33,8 | 34,1 |
Пример 8
Индуцируемая олигонуклеотидами продукция IL-10 клетками B-СLL
1. Приготовление клеток B-CLL человека
Клетки B-CLL человека выделяли от больных B-CLL с помощью методов, описанных в примере 2.
2. Индуцируемая олигонуклеотидами продукция IL-10 клетками B-СLL
Клетки B-CLL инкубировали с Олиго1, Олиго3, Олиго4, Олиго5, Олиго6, Олиго7, Олиго8, Олиго9, Олиго10 соответственно или без них в конечной концентрации 3 мкг/мл в свободной от сыворотки среде RPMI 1640 (HyClone) при 106 клеток/лунку в 48-луночном планшете в трех повторах. Олигонуклеотиды разводили в свободной от сыворотки среде RPMI 1640 (HyClone). Равный объем среды для разведения (свободной от сыворотки среды RPMI 1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (Среды).
Супернатант культур собирали через 24 часа или в указанные моменты времени и оценивали в отношении IL-10 в системе иммунологических ранжированных рядов Fluorokine MAP Immunoarray (R&D Systems). Полученные авторами настоящего изобретения данные показали, что пусковой механизм с использованием олигонуклеотидов приводит к продукции высокого уровня IL-10 клетками B-CLL (таблица 5). Кроме того, полученные в дальнейшем авторами настоящего изобретения данные показали, что добавление экзогенного rh-IL-10 (Schering Corp.) к культурам клеток B-CLL индуцирует апоптоз клеток B-CLL зависимым от дозы IL-10 способом, который можно специфически блокировать антителом против IL-10 (R&D Systems). Эти открытия демонстрируют, что олигонуклеотиды можно использовать для лечения B-CLL путем индукции продукции IL-10, который провоцирует апоптоз клеток B-CLL аутокринным способом. Эксперимент повторяли с по крайней мере десятью образцами от больных B-CLL с получением схожих результатов.
| Таблица 5 | |
| Индуцируемая олигонуклеотидами продукция интерлейкина-10 клетками B-СLL | |
| Продукция IL-10 клетками B-СLL | |
| Группа | пг/мл |
| Олиго1 | 800 |
| Олиго3 | 621 |
| Олиго4 | 469 |
| Олиго5 | 523 |
| Олиго6 | 112 |
| Олиго7 | 576 |
| Олиго8 | 502 |
| Олиго9 | 455 |
| Олиго10 | 752 |
| Среда | 1,2 |
Пример 9
Влияние олигонуклеотидов на пролиферацию нормальных PBMS человека
PBMS человека выделяли из лейкоцитных пленок нормальной крови доноров (The Blood Center of Jilin Province, China) с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака (Pharmacia). Жизнеспособность PBMS составляла 95-99%, как определено по исключению трипанового синего.
PBMS (6×105/лунку) помещали в 96-луночные планшеты с U-образным дном (Сostar) и культивировали с Олиго1, Олиго3, Олиго4, Олиго5, Олиго6, Олиго7, Олиго8, Олиго9, Олиго10, 2006 или 2216 соответственно в конечной концентрации 6 мкг/мл в трех повторах в течение 36 часов с последующим добавлением [3H]-тимидина (New England Nuclear, Boston, MA) и инкубированием в течение 16 часов. Клетки собирали на фильтры из стекловолокна и определяли в сцинтилляционном счетчике. Пролиферацию клеток выражали в имп/мин (из лунок трех повторов). Представлены данные, полученные при использовании пяти образцов нормальной крови. В качестве контролей использовали 2006 и 2216. Результаты показали, что олигонуклеотиды явно могут стимулировать пролиферацию PBMS (Фиг.3), что указывает на то, что олигонуклеотиды, вместо индуцирования апоптоза, являются стимулирующими пролиферацию нормальных PBMS человека и не являются токсичными в отношении культивируемых клеток.
После описания настоящего изобретения в деталях и со ссылкой на предпочтительные варианты осуществления для специалистов в данной области будет очевидно, что возможны модификации и вариации без отклонения от объема изобретения, определяемого следующей прилагаемой формулой изобретения.
1. Способ лечения В-клеточной опухоли у млекопитающего, предусматривающий введение субъекту, которому требуется лечение, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид, имеющий любую из последовательностей SEQ ID NO:1-9.
2. Способ по п.1, предусматривающий индуцирование апоптоза клеток В-клеточной опухоли.
3. Способ по п.1, предусматривающий увеличение экспрессии CD40 на клетках В-клеточной опухоли.
4. Способ по п.1, предусматривающий стимулирование продукции IL-10 клетками В-клеточной опухоли.
5. Способ по п.1, в котором В-клеточная опухоль представляет собой В-клеточный лейкоз, В-клеточную лимфому или миелому.
6. Способ по п.5, в котором указанным В-клеточным лейкозом является В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз или В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз.
7. Способ по п.5, в котором указанной В-клеточной лимфомой является лимфома из малых лимфоцитов.
8. Способ по п.1, в котором указанным млекопитающим является человек.
9. Способ по п.1, в котором указанную фармацевтическую композицию вводят энтерально, парентерально, или местно, или путем ингаляции.
10. Способ индуцирования апоптоза клеток В-клеточной опухоли, предусматривающий контактирование указанных клеток В-клеточной опухоли с композицией, содержащей олигонуклеотид, имеющий любую из последовательностей SEQ ID NO:1-9.
11. Способ увеличения экспрессии CD40 на клетках В-клеточной опухоли, предусматривающий контактирование указанных клеток В-клеточной опухоли с композицией, содержащей олигонуклеотид, имеющий любую из последовательностей SEQ ID NO:1-9.
12. Способ индуцирования продукции IL-10 клетками В-клеточной опухоли, включающий контактирование указанных клеток В-клеточной опухоли с композицией, содержащей олигонуклеотид, имеющий любую из последовательностей SEQ ID NO:1-9.
13. Способ по любому из пп.10-12, в котором указанными клетками В-клеточной опухоли являются клетки В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (B-CLL).
14. Способ по п.10 или 11, в котором указанными клетками В-клеточной опухоли являются клетки В-клеточного острого лимфоцитарного лейкоза (B-ALL).
15. Способ по п.10 или 11, в котором указанными клетками В-клеточной опухоли являются клетки лимфомы из малых лимфоцитов.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая (1) олигонуклеотид, имеющий любую последовательность SEQ ID NO:1-9, и (2) агент против В-клеточной опухоли.
17. Композиция по п.16, в которой указанным агентом против В-клеточной опухоли являются химиотерапевтические, иммунотерапевтические агенты или агенты, применяемые в радиотерапии.
18. Композиция по п.17, в которой указанный химиотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из флударабина, пентостатина, винкристина, циклофосфамида и преднизона.
19. Композиция по п.17, в которой указанный химиотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из CVP (циклофосфамид, винкристин и преднизон) и CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон).
20. Композиция по п.17, в которой указанным иммунотерапевтическим агентом является антитело против CD20.
21. Композиция по п.17, в которой указанная радиотерапия представляет собой внешнее облучение или обработку антителами, меченными радиоактивными изотопами.
