Инсерционный мутант burkholderia pseudomallei - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий



Инсерционный мутант burkholderia pseudomallei - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий
Инсерционный мутант burkholderia pseudomallei - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий
Инсерционный мутант burkholderia pseudomallei - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий
Инсерционный мутант burkholderia pseudomallei - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий
Инсерционный мутант burkholderia pseudomallei - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий

 


Владельцы патента RU 2413763:

Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение касается конструирования транспозон-индуцированного мутанта возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei, несущего инактивированные последовательности генов лекарственного эффлюкса (multidrug efflux pumps) и хромосомных β-лактамаз класса А. Штамм получен в результате направленного генетического конструирования, включающего этапы инсерционного мутагенеза клеток полирезистентного штамма В. pseudomallei 57576 SMCP с высоким уровнем устойчивости к цефалоспоринам и фтор-хинолонам. Штамм депонирован в ГК «Микроб» под №КМ31. Штамм по изобретению является стабильным мутантом, несущим инсерции Тn9 в последовательностях генов blaD, omp27 и отр71, сохраняющим свои свойства при хранении, культивировании на питательных средах и при пассажах через организм лабораторных животных, и предназначенного для исследования роли данных R-детерминант в развитии лекарственной устойчивости множественного типа у возбудителя мелиоидоза и близкородственных микроорганизмов. Штамм КМ31 может быть использован для исследования функциональной роли генов эффлюкса антибиотиков и детерминант ферментативной модификации/инактивации антимикробных препаратов у патогенных видов рода Burkholderia. 3 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии и касается конструирования транспозон-индуцированного мутанта возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei, несущего инактивированные последовательности генов лекарственного эффлюкса (multidrag efflux pumps) и хромосомных b-лактамаз класса А для использования в качестве модельного микроорганизма при анализе молекулярно-генетических основ множественной лекарственной устойчивости В. pseudomallei и близкородственных видов бактерий. Штамму присвоен номер КМ31 Государственной Коллекции Патогенных Бактерий «Микроб» (ГКПБ «М»). Особенностями штамма являются опосредованные инсерциями транспозона Тn9 дефекты продукции хромосомной b-лактамазы класса D (BlaD) и мембранных эффлюкс-белков Mr 27 и 71 kDa, сопровождающиеся снижением резистентности к антибиотикам цефалоспоринового ряда.

Микроорганизмы рода Burkholderia характеризуются высокой природной устойчивостью к различным антимикробным соединениям, однако, молекулярные основы лекарственной резистентности патогенных видов буркхольдерий (В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis) остаются мало изученными. Предполагается, что резистентность В. pseudomallei к отдельным классам антимикробных соединений может быть обусловлена функционированием эффлюкс-систем широкого спектра [4, 5, 6, 10], расширением спектра ферментной инактивации ингибиторов [12], изменением проницаемости клеточных оболочек для ряда антимикробных соединений [3].

Расшифровка механизмов формирования множественной лекарственной резистентности требует разработки адекватных модельных систем, позволяющих идентифицировать и осуществлять анализ последовательностей генома, детерминирующих устойчивость к тем или иным группам антимикробных соединений. Необходимыми элементами здесь являются специальные маркированные штаммы с измененной чувствительностью к антибактериальным препаратам.

Известен ряд примеров конструирования маркированных штаммов различных видов патогенных буркхолдерий. Так, для анализа систем генетического обмена возбудителей мелиоидоза и сапа, методами химического и инсерционного мутагенеза был получен набор штаммов В. pseudomallei и В. mallei, несущих маркеры ауксотрофности, температурочувствительности, дефекты продукции отдельных внеклеточных ферментов [1, 2]. Для функциональной характеристики системы лекарственного эффлюкса amrAB-oprD был получен штамм В. pseudomallei с делетированной последовательностью эффлюкс-оперона, характеризующийся утратой устойчивости к антибиотикам аминогликозидной и макролидной групп [10]. Для изучения феномена расширения спектра субстратной специфичности хромосомных b-лактамаз возбудителя мелиоидоза получены лабораторные варианты, несущие аминокислотные замены в консервативных доменах ферментов и мутации в генах репрессоров blaA и blaD [7, 8, 12]. Вместе с тем, маркированных штаммов патогенных буркхолдерий, несущих изменения в детерминантах резистентности различных функциональных групп и предназначенных для генетического анализа механизмов формирования множественной лекарственной устойчивости до настоящего времени получено не было.

Штамм В. pseudomallei 57576 SMR2, послуживший прототипом сконструированному штамму В. pseudomallei 57576 SMRT21 (КМ31), является селекционированным стабильным вариантом штамма дикого типа В. pseudomallei 57576 и имеет повышенный уровень резистентности к антимикробным соединениям цефалоспоринового (МПК 200 мкг/мл) и фторхинолонового (МПК>500 мкг/мл) рядов. Данный полирезистентный вариант характеризуется повышенной экспрессией ряда мембранных эффлюкс-протеинов и продуцирует b-лактамазу класса D с цефалоспориназной активностью.

Целью изобретения является получение стабильного мутанта В. pseudomallei с инактивированным геном хромосомной b-лактамазы класса D {blaD) и дефектами продукции эффлюкс-белков Mr27 и 71kDa, сохраняющего свои свойства при хранении, культивировании на питательных средах и при пассажах через организм лабораторных животных, и предназначенного для исследования роли данных R-детерминант в развитии лекарственной устойчивости множественного типа у возбудителя мелиоидоза и близкородственных микроорганизмов.

Заявляемый штамм В. pseudomallei KM31 получен в результате направленного генетического конструирования, включающего этапы инсерционного мутагенеза клеток полирезистентного варианта В. pseudomallei 57576, отличающегося высоким уровнем устойчивости к цефалоспоринам и фторхинолонам, путем встраивания в его хромосому транспозона Tn9 из репликона RP1::Tn9 TS от донора Е. coli K-12 (RP1::Tn9) TS, отбор мутантных клонов, утративших устойчивость к препаратам b-лактамной группы с последующим скринингом дефектов продукции индивидуальных поринов наружной мембраны и экспрессии хромосомной b-лактамазы класса D.

Основные свойства штамма:

кулътурально-морфологические: грамотрицательные полиморфные палочки, растут в факультативных аэробных условиях на полноценных питательных средах (L-агар, МПА, МПБ, agar и бульон Хоттингера, Nutrient agar (Difco), Nutrient broth (Difco), Pseudomonas agar P (Difco) при оптимуме температуры 37°С и оптимальной рН 6.8-7.2. На плотных питательных средах через 24 ч культивирования формируются полупрозрачные колонии цвета среды в S-форме, через 48 ч и более происходит морфологическая диссоциация колоний с образованием S-R вариантов. В бульоне через 24-48 ч культура вызывает помутнение среды и образование пленки на поверхности;

биохимическая активность: в тесте Хью-Лейфсона окисление глюкозы (+), ферментация (-); оксидаза (+), каталаза (+), желатиназа (+), аргининдигидролаза (+), лизиндекарбоксилаза (-), орнитиндекарбоксилаза (-), Аrа (-);

устойчивость к антибиотикам: резистентен к офлоксацину (МПК>500 мкг/мл), пефлоксацину (МПК>500 мкг/мл), хлорамфениколу, канамицину (МПК>500 мкг/мл), чувствителен к цефтазидиму (МПК<25 мкг/мл);

отношение к видовым диагностическим сывороткам: агглютинируется диагностической мелиоидозной сывороткой;

антигенный спектр: дефектен по продукции белков наружной мембраны Mr27 и 71kDa;

вирулентность: обладает сниженной вирулентностью для белых мышей (LD50>1×103 м.к.).

питательные потребности: прототроф

генетические особенности: OfxR PfxR CazS (chr::Tn9) RP1::Tn9 TS CmR TcR KmR BlaD-

Полученный в результате конструирования штамм В. pseudomallei 57576 SMRT21 депонирован в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий «Микроб» (ГКПБ «М») под номером КМ31.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Определение основных культуральных свойств инсерционного мутанта В. pseudomallei КМЗ 1.

При посеве в L-бульон (рН 6.8) через 48 ч при 37°С культура штамма В. pseudomallei КМ31 дает рост в виде равномерного помутнения питательной среды с образованием на поверхности тонкой пленки. На пластинках L-агара через 24-48 ч образует полупрозрачные колонии цвета среды в гладкой (S) форме. При посеве на агар Хоттингера через 48 ч наблюдается образование диссоциативных S-R или R-вариантов. В мазках из бульонных и агаровых культур клетки имеют вид грамотрицательных полиморфных палочек.

Штамм имеет спектр биохимической активности, характерный для В. pseudomallei.

На среде Хью-Лейфсона окисляет, но не ферментируют глюкозу; обладает оксидазной, каталазной, аргининдигидролазной и желатиназной активностями; не проявляет лизиндекарбоксилазную и орнитиндекарбоксилазную активность; не утилизирует из минимальной среды арабинозу (Аrа-).

Результаты определения устойчивости штамма к антибиотикам различных классов приведены в таблице 1.

Вирулентность мутанта В. pseudomallei KM31 определяли на белых мышах. Животных заражали внутрибрюшинно (10 животных в группе) культурой штамма в дозах 1×102, 1×103, 1×104 м.к. В течение времени наблюдения (20 сут) отмечали гибель 50% животных от дозы 1×104 м.к. (LD50 дикого штамма -1×102 м.к.).

Пример 2. Анализ экспрессии мажорных белков клеточных мембран инсерционного мутанта В. pseudomallei КМ31.

Для изучения экспрессии белков клеточных мембран у сконструированного штамма В. pseudomallei использовали электрофорез в SDS-полиакриламидных гелях по Laemmli [9] и иммуноблоттинг по Towbin [11] препаратов мембранных белков с иммуноглобулинами поликлональных козлиных сывороток к препарату наружной мембраны В. pseudomallei.

Анализ препаратов клеточных мембран, выделенных из исследованных штаммов, в SDS-PAGE и иммуноблоттинге показал, что у полирезистентного варианта 57576 SMR2 наблюдалась гиперпродукция мажорных белков Mr27, 39, 71 kDa и исчезновение белка Mr45 kDa (фиг.1), тогда как инсерционный мутант KM31 характеризовался утратой продукции мажорных мембранных протеинов Mr27 и 71 kDa (фиг.2).

Пример 3. ПЦР-анализ последовательности гена blaD инсерционного мутанта В. pseudomallei КМ31.

Детекцию последовательности blaD проводили в полимеразной цепной реакции с парой праймеров blaDfw и blaDrv, специфичных фланкирующим регионам кодирующих последовательностей b-лактамаз класса D Burkholderia pseudomallei (табл.2).

Культуры исследуемых штаммов выращивали на Nutrient agar (Difco) в течение 24-48 ч при 37°С. 200 мкл бактериальной суспензии в 0.15 М NaCl pH 7.2 плотностью 2×109 м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ КСl, 5 мМ MgCl2 0.2 мг/мл желатина, 0.9% Nonidet P-40, 0.9% Твин 20, 150 мкг/мл про-теиназы К), аккуратно перемешивали, инкубировали при 65°С 120 мин и прогревали при 96°С 30 мин для инактивации фермента. Пробы центрифугировали (10.000 об/мин, 1 мин), 10 мкл супернатанта использовали при постановке ПЦР. Последовательность гена blaD амплифицировали по программе: прогрев 94°С 5 мин, 35 циклов (94°С 30 с, 60°С 30 с, 72°С 45 с), финальная элонгация 72°С 5 мин. Продукты ПЦР анализировали в 1,5% агарозном геле.

В результате проведенного анализа установлено, что штаммы В. pseudomallei дикого типа и вариант с высоким уровнем устойчивости к препаратам цефалоспоринового ряда несут интактную последовательность гена b-лактамазы D, тогда как у инсерционного мутанта В. pseudomallei КМЗ 1 данная последовательность нарушена в результате инсерции Tn9 и не детектируется в ПЦР со специфическими праймерами (фиг.3).

Таблица 1
Устойчивость исходных штаммов и транспозон-индупированного мутанта В. pseudomallei к антибиотикам различных классов
Штамм Фенотип резистентности МПК, мкг/мл
Ofx Pfx Caz Cm Km
57576 OfxS PfxS CfzS CmR 10 10 25 >100 >100
57576 SMR2* OfxR PfxR CfzR CmR >500 >500 200 >500 >100
57576 SMRT21 (КМ31) OfxR PfxR CfzS CmR >500 >500 <25 >500 >100
Примечания: Ofx - офлоксацин, Pfx - пефлоксацин, Caz - цефтазидим. Cm - хлорамфеникол, Km - канамицин, * - полирезистентный вариант, использованный при транспозонном мутагенезе. МПК определена для инокулума 5×104 м.к. на L-агаре.

Инсерционный мутант Burkholderia pseudomallei KM31 (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб») - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу получения новых чувствительных к тетрациклину штаммов рода Bifidobacteriaum sp., содержащих мутантный ген tet на хромосоме, а также к новым чувствительным к антибиотикам штаммам, получаемым из устойчивых к антибиотикам пробиотических штаммов.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. .

Изобретение относится к области растениеводства и может быть использовано для повышения продуктивности растений путем облучения одних растений излучением других растений.

Изобретение относится к генетике и селекции и может быть использовано для получения наследственных изменений при создании исходного материала для селекции сельскохозяйственных культур.

Изобретение относится к гербицидоустойчивым растениям кукурузы, ее семенам и потомству. .

Изобретение относится к области биологии, точнее молекулярной генетики. .
Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в производстве кормового белка, клонировании ценных растений, в птицеводстве, рыбоводстве, шелководстве, пчеловодстве и т.д.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штаммам микроорганизмов. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к изготовлению бактериального удобрения под сою. .
Изобретение относится к кормопроизводству, в частности к способам приготовления биологически активных кормовых добавок для млекопитающих, птиц, рыб, повышающих эффективность пищеварения, оказывающих разностороннее действие на животный организм и позволяющих применять их как для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, так и для стимуляции роста и повышения продуктивности животных.
Изобретение относится к биотехнологии, спиртовой и кормовой промышленности, может быть использовано при производстве кормовых добавок, обогащенных белком и аминокислотами.

Изобретение относится к профилактике кишечного заболевания, такого как связанная с антибиотиками диарея, приобретенная диарея, вызванная Clostridium difficile, воспалительное кишечное заболевание и желудочно-кишечное заболевание, введением эффективного количества бактерий Bacillus, которые продуцируют липопептиды.
Изобретение относится к биотехнологии для выращивания легионелл. .

Изобретение относится к медицине, а именно к профилактике и лечению инфекционной патологии у человека и других млекопитающих. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования микобактерий из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией
Наверх