Способ анализа кормовых дрожжей на содержание нуклеотидной фракции
Владельцы патента RU 2413942:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева (НГТУ) (RU)
Изобретение относится к контролю качества кормовых дрожжей. Способ анализа кормовых дрожжей на содержание нуклеотидной фракции, включающий осаждение белка сульфатом меди в щелочной среде, выделение его в медно-белковый комплекс и последующее определение количества белка в двух одинаковых навесках одной анализируемой пробы, причем в первой навеске определяют массовую долю белков по оптической плотности селективно окрашенного белка реактивом Фолина, из второй навески выделяют белки, осуществляя отгонку аммиака из медно-белкового комплекса, определяя общую массу азота и по ней вычисляя массовую долю белка, а массовую долю нуклеотидной фракции оценивают как разность содержания белков во второй и первой навесках. Способ позволяет осуществлять предварительную экспересс-оценку массовой доли нуклеотидов в промышленной продукции микробиологического синтеза кормового белка. 2 табл.
Изобретение относится к сфере экоаналитического контроля качества кормовых дрожжей - целевой продукции крупнотоннажных предприятий микробиологического синтеза кормового белка из растительной клетчатки или из парафинов нефти и газа.
Основным показателем качества указанной белковой продукции является массовая доля простых протеинов, хорошо усвояемых сельскохозяйственными животными и птицей. Применяемые в контроле качества кормовых дрожжей методы определения массовой доли «сырого протеина» (по Кьельдалю) и «истинного белка» (по Барнштейну)) не удовлетворяют современным требованиям рутинного контроля биопроизводства как в отношении их достоверности и селективности, так и в отношении контроля экологической чистоты и безопасности выпускаемой биопродукции (Востоков В.М., Ивашкин Е.Г., Карташов В.Р. // Аналитический контроль содержания протеинов в продукции предприятий микробиологического синтеза кормового белка / Заводская лаборатория. Диагностика материалов. - 2007, Т.73. - Вып.3. - С.21-24.) В обоих случаях анализа массовую долю белка оценивают по содержанию общего азота, входящего в состав всех белковых и небелковых соединений. Одни белки являются полезными нутриентами, другие могут нанести вред живому организму, например генетически неадекватные нуклеотиды и нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК), которые способствуют мутагенезу, вызывают аллергические и астмоидные заболевания, становятся опасными загрязнителями биосферы.
Эти методы не являются достоверными, т.к. в анализируемых веществах может быть азот небелковой природы. Известны и другие недостатки метода Кьельдаля, снижающие его практическую значимость: продолжительность, сложность работы с горячей концентрированной серной кислотой и др.
В качестве прототипа принят способ количественного определения истинного белка в кормовых дрожжах (см. авт. свид. СССР №1401380, G01N 33/48, опубл. 07.06.1988), основанный на способе Лоури и предусматривающий осаждение белка сульфатом меди в щелочной среде, отделение осадка с последующей оценкой результатов, с целью повышения достоверности и сокращения времени определения, после отделения осуществляют солюбилизацию белка путем выделения его в медно-белковый комплекс и разрушение при нагревании в течение 30 мин на водяной бане в 0,25 М растворе комплексона 111 с последующим разбавлением раствора дистиллированной водой, а оценку результатов осуществляют спектрофотометрически.
В указанном авторском свидетельстве была также заложена предпосылка о содержании в кормовых дрожжах нуклеотидов на основании анализа модельных смесей из белка и нуклеиновых кислот и указано, что при использовании способа по авт. свид. №1401380 небелковые азотсодержащие соединения (нуклеиновые кислоты) искажают результат измерения истинного белка в кормовых дрожжах, а по способу Барнштейна значительно завышают результаты измерения истинного белка. Содержание нуклеотидов в кормовых дрожжах в данном способе не определяют.
Задачей предлагаемого изобретения является расширение технологических возможностей известного способа.
Технический результат - осуществление экспресс-оценки массовой доли экологически опасных геномодифицированных нуклеотидов в промышленной продукции микробиологического синтеза кормового белка. Этот технический результат достигается тем, то в способе анализа кормовых дрожжей при контроле их качественного и количественного состава, включающем определение истинного белка путем его осаждения из навески сульфатом меди в щелочной среде, выделение его в медно-белковый комплекс, который разрушают при нагревании в растворе комплексона 111 с последующим спектрофотометрированием и определение массовой доли простых истинных белков по оптической плотности селективно окрашенного белка с реактивом Фолина, одновременно в одинаковых условиях анализируют две одинаковые навески анализируемой пробы кормовых дрожжей, из второй навески выделяют все простые и сложные белки, осуществляя отгонку аммиака из медно- белкового комплекса, определяя общую массу азота и по ней вычисляя массовую долю белка по формуле:
mБ=mNk100/а(1-ω/100),
где mN - общая масса азота, г,
k - коэффициент пересчета на белок,
а - масса навески, г,
ω - массовая доля влаги в кормовых дрожжах, %
и оценивают массовую долю нуклеотидов как разность содержания белков во второй и первой навесках.
Предлагаемый способ является комбинационным решением, где сочетаются два известных и независимых способа определения массовой доли белка: по авт. свид. №1401380 на основе метода Лоури и по Барнштейну, которые значительно отличаются друг от друга по выполнению и по селективности. Белок, определенный методом Барнштейна по общему содержанию азота, по составу отличается от белка, найденного фотометрическим методом на основе специфической реакции Лоури. В первом случае в состав «истинного белка» входят все белковые соединения, включая протеины и нуклеотиды. Во втором случае нуклеотиды не определяются, не дают характерного окрашивания с реактивом Фалина. Предлагается по разности результатов оценить массовую долю нуклеотидов в кормовых дрожжах.
Способ осуществляют следующим образом.
Берут одновременно две одинаковые навески из одной анализируемой пробы кормовых дрожжей и анализируют их в одинаковых условиях. Подготовку обеих проб до выделения медно-белкового комплекса осуществляют одинаково, а непосредственное определение белков - по-разному: в первой навеске - по способу-прототипу, во второй - по методу Барнштейна и определяют количество нуклеотидов как разность содержания белков во второй и первой навесках.
Пример осуществления способа.
Берут точную навеску пробы кормовых дрожжей массой 0,4 г, помещают ее в стакан вместимостью 200 см3, добавляют доведенную до кипения дистиллированную воду, 10 см3 2%-ного раствора сульфата меди и по каплям, при перемешивании, 10 см3 2,5%-ного раствора гидроксида натрия. После отстаивания осадка его отделяют путем фильтрования через бумажный фильтр, одновременно промывая его методом декантации двумя порциями (по 20 см3) дистиллированной воды. Промытый осадок медно-белкового комплекса, выделенный на бумажном фильтре, возвращают в исходный стакан вместе с фильтром и добавляют туда при перемешивании 20 см3 0,25 М раствора комплексона 111 и 60 см3 1 М раствора едкого натра. Содержимое стакана нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Раствор переносят в мерную колбу на 500 см3, оставляя фильтр в стакане, промывая его небольшими порциями горячей воды и сливая все промывные воды в мерную колбу с анализируемым раствором. После охлаждения до комнатной температуры раствор в колбе доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Аликвоту 100 см3 полученного раствора переносят в мерную колбу на 250 см3, раствор доводят до метки водой и перемешивают. Для удаления взвешенных частиц около 20 см3 раствора фильтруют в сухой стакан через фильтр с синей лентой, отбрасывая первую порцию фильтрата. С помощью пипетки отбирают 5 см3 фильтрата, помещают его в мерную колбу на 25 см3. Добавляют туда 15 см3 свежеприготовленной смеси растворов, содержащей гидроксид и карбонат натрия, калий-натрий винно-кислый и сульфат меди. После 10 мин перемешивания в мерную колбу добавляют 1,5 см3 свежеприготовленного раствора Фолина, доводят раствор до метки водой, перемешивают и дают ему постоять около 30 мин. Указанные растворы готовят известными методами, которые описаны, например, в авт. свид. №1401380. Полученный окрашенный раствор синего цвета фотометрируют в кювете на 1 см при длине волны λ=690 нм. В качестве нулевого используют раствор «холостого опыта», в котором отсутствует белок. По величине оптической плотности исследуемого раствора, используя метод градуировочного графика, находят содержание белка в анализируемой навеске (γ мкг) и вычисляют массовую долю «истинного белка» (mЛ) по формуле:
mЛ=γ·0,025/а(1-ω/100),
где 0,025 - коэффициент, учитывающий разбавление и соотношение размерностей;
а - масса навески дрожжей, г;
ω - массовая доля влаги в кормовых дрожжах, %.
Берут вторую такую же навеску кормовых дрожжей массой 0,4 г из той же пробы. Подготавливают ее так же, как и навеску 1. Затем осуществляют «мокрое сожжение» выделенного медно-белкового комплекса и производят отгонку аммиака в стандартный раствор серной кислоты. Методом обратного титрования полученных аммонийных солей определяют общую массу азота (mN, г) и вычисляют массовую долю белка (mБ) по формуле:
mБ=mNk100/а(1·ω/100),
где mN - общая масса азота, г,
k - коэффициент пересчета на белок,
а - масса навески, г,
ω - массовая доля влаги в кормовых дрожжах, %.
Массовую долю нуклеотидов в кормовых дрожжах оценивают по разности
mМ=mБ-mЛ.
Проведены испытания предлагаемого способа в лабораторных (табл.1) и производственных условиях (табл.2).
Экспериментальное подтверждение, когда предлагаемым способом были исследованы модельные белковые смеси, состоящие их чистого альбумина ("бычьего белка") и стандарта ДНК, приведено и табл.1.
1. В модельной смеси без добавки ДНК («холостой опыт») оба метода показывают одинаковое содержание белка.
2. Анализ модельной смеси, составленной из чистого альбумина и ДНК, дал разные результаты: фотометрическим методом определен лишь простой протеин, а методом Барнштейна определяется суммарное содержание обоих компонентой модельной смеси - альбумина и ДНК.
3. Сравнение результатов анализа модельных смесей, имитирующих белковый состав кормовых дрожжей микробиологического производства, разными способами подтверждает возможность определения предлагаемым способом массовой доли нуклеотидной фракции в кормовых дрожжах.
| Таблица 2 | |||
| Заводы БВК | Среднее значение массовой доли белка, % | Массовая доля нуклеотидов | |
| По прототипу | По Барнштейну | ||
| Астраханский ГДЗ | 48,94 | 52,54 | 3,60 |
| Волжский ГДЗ | 30,02 | 33,36 | 3,34 |
| Кировский БХЗ | 35,94 | 40,40 | 4,46 |
Способ анализа кормовых дрожжей на содержание нуклеотидной фракции, включающий осаждение белка сульфатом меди в щелочной среде, выделение его в медно-белковый комплекс и последующее определение количества белка в двух одинаковых навесках одной анализируемой пробы, причем в первой навеске определяют массовую долю белков по оптической плотности селективно окрашенного белка реактивом Фолина, из второй навески выделяют белки, осуществляя отгонку аммиака из медно-белкового комплекса, определяя общую массу азота и по ней вычисляя массовую долю белка, а массовую долю нуклеотидной фракции оценивают как разность содержания белков во второй и первой навесках.
