Способ получения прегненового гликозида "худикол", подавляющего аппетит

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Сухую измельченную наземную часть растения Hoodia Gordonii обрабатывают спиртом этиловым 95% при 40°С в течение 45 мин при соотношении сырье-экстрагент, равном 1:10. После фильтрации отгоняют экстрагент, а сухой остаток растворяют в деионизированной воде. Для удаления липофильных веществ водный раствор 4-5 раз обрабатывают гексаном. После отделения гексанового слоя к водному раствору приливают ацетонитрил до соотношения объемов ацетонитрил - водный раствор 1:2,3 и наносят полученный раствор на патрон BondElute, заполненный обращенно-фазным сорбентом C₁₈. Сорбированный на патроне целевой продукт элюируют смесью: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (50/50). Из полученного элюата в вакууме отгоняют ацетонитрил и трифторуксусную кислоту. Полученный раствор вводят в препаративный хроматограф с колонкой с обращенно-фазным сорбентом Phenomenex Luna C₁₈, используя подвижную фазу состава ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (50/50), и собирают фракцию элюата, соответствующую пику целевого продукта. Для выделения целевого продукта из полученного элюата отгоняют в вакууме ацетонитрил и трифторуксусную кислоту, а водный раствор целевого продукта подвергают лиофилизации. Изобретение позволяет получить целевой продукт с выходом до 0,15% от массы абсолютно сухого растительного сырья и чистотой 92-96%.

 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, конкретно, к способу получения средства растительного происхождения, способного подавлять аппетит.

Способность подавлять аппетит была, в частности, показана для одного из выделенных из экстракта Hoodia Gordonii соединений, которое получило название Р-57 [1, 2, 3, 4, 5]. В работах последних лет [6, 7] показано, что в экстракте Hoodia Gordonii присутствует ряд других соединений, также имеющих в основе оксипрегненовый скелет как агликон.

Для экстракта растения Hoodia Gordonii в целом была показана способность подавлять аппетит, что приписывается группе соединений - прегненовых гликозидов, содержащихся в экстракте Hoodia Gordonii [2, 3].

Известен способ выделения, идентификации и установления структуры нескольких соединений ряда прегненовых гликозидов из экстракта Hoodia Gordonii и недостатком известных способов является выделение целевых соединений в микроколичествах, необходимых для идентификации и структурных исследований физико-химическими методами (высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании со спектрофотометрией, масс-спектрометрией и спектроскопией ядерного магнитного резонанса) [5].

Идентификация и структурные исследования компонентов экстракта Hoodia Gordonii проводились без выделения соответствующих соединений с использованием последовательности физико-химических, инструментальных методов - разделение компонентов экстракта Hoodia Gordonii методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, далее последовательно регистрация пиков диодно-матричным детектором и затем масс-спектрометрическим детектором [6].

Ближайшим прототипом настоящего изобретения является способ выделения соединения класса прегненовых гликозидов, получившего название Р-57 [8], включающий следующие стадии.

Измельчение и гомогенизация сухого растительного сырья в среде смеси органических растворителей, например спирт метиловый - метилен хлорид. Отделение экстракта от твердой фракции методом фильтрации или центрифугирования с последующей регенерацией растворителей методом фракционной разгонки и получения сухого остатка. Сухой остаток обрабатывается одновременно метилен хлоридом и водой. Смесь разделяется на две фракции - метилен хлоридную и водную. Метилен хлоридный экстракт упаривается и образовавшийся сухой остаток обрабатывается смесью метанол-гексан. Полученная смесь разделяется на метанольный и гексановый экстракты. Метанольный экстракт упаривается насухо, а полученный сухой остаток вновь растворяется в метаноле. Метанольный раствор подвергается первичному фракционированию методом колоночной хроматографии на силикагеле в подвижной фазе хлороформ - метанол.

Полученные фракции подвергаются более детальному фракционированию на колонках с силикагелем. Из фракции, проявляющей наибольшую биологическую активность (подавление аппетита), выделяется индивидуальное соединение - гликозид прегненового ряда. Изучение его структуры показало, что это известный прегненовый гликозид Р-57.

Недостатками известного способа являются многостадийность и длительность процесса выделения целевого продукта, большой расход растворителей и реактивов при низком выходе продукта, токсичность применяемых растворителей (метанол, хлороформ, хлористый метилен).

Технической задачей изобретения является повышение выхода целевого продукта, качество которого должно удовлетворять требованиям по чистоте, предъявляемым к стандартным образцам природных соединений, при сокращении числа технологических операций с применением нетоксичных растворителей.

Сырьем для получения указанного соединения является растение Hoodia Gordonii (отдел - Plantae; подотдел - Magnoliophyta; класс - Magnoliopsida; отряд - Gentianalis; семейство - Apocynaceae; род - Stapeliae; вид - Hoodia Gordonii).

Поставленная техническая задача решается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Сухую измельченную наземную часть растения Hoodia Gordonii (размер частиц 1-3 мм) обрабатывают спиртом этиловым 95% при 40°С на УЗ-бане при соотношении сырье - экстрагент, равном 1:10, для извлечения экстрактивных веществ. Экстракт фильтруют, затем упаривают насухо в ротационном испарителе в вакууме, при температуре до 40°С. К сухому остатку приливают деионизированную воду до полного растворения сухого остатка.

Для удаления липофильных веществ водный раствор 4-5 раз обрабатывают гексаном при соотношении водный раствор - гексан, равном 1:1. После отделения гексанового слоя к водному раствору прибавляют ацетонитрил до соотношения ацетонитрил - водный раствор, равного 1:2,3. Полученный раствор фильтруют и наносят на патрон BondElute, заполненный обращенно-фазным сорбентом C₁₈, вытек отбрасывают. Сорбированный на патроне целевой продукт элюируют смесью: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (50:50). Из полученного элюата в вакууме полностью отгоняют ацетонитрил и трифторуксусную кислоту, используя роторный испаритель. Полученный таким образом раствор целевого продукта вводят в препаративный хроматограф с колонкой с обращенно-фазным сорбентом Luna C₁₈ 10 мкм, используя подвижную фазу состава: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде. Собирают фракцию элюата, соответствующую пику целевого продукта. Контроль за составом и чистотой целевого продукта осуществляют методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии на аналитическом хроматографе с колонкой Phenomenex Luna C₁₈, 5 мкм, 4,6×150 мм, используя подвижную фазу: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (38:62), при скорости потока 1 мл/мин. Хроматограмму регистрируют, используя диодно-матричный детектор с аналитической длиной волны 220 нм.

Предложенный способ позволяет получать целевой продукт, прегненовый гликозид "Худикол", с выходом целевого продукта до 0,15% от массы абсолютно сухого растительного сырья.

Определяющими относительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются:

1. Экстракция сырья осуществляется спиртом этиловым 95% при температуре до 40°С при соотношении сырье - экстрагент, равном 1:10, что позволяет провести одну первичную экстракцию одним растворителем и получить один рабочий раствор вместо трех последовательных экстракций смешанными растворителями с последующим разделением нескольких экстрактов.

2. Далее после упаривания экстракта и реэкстракции сухого остатка деионизированной водой, промывка водного раствора одним растворителем (гексан) позволяет удалить все липофильные посторонние примеси.

3. Очищенный от липофильных посторонних примесей водный раствор целевого продукта, содержащий только родственные соединения в качестве примесей, после разведения его ацетонитрилом до соотношения ацетонитрил - водный раствор, равного 1:2,3, методом твердофазной экстракции на патроне BondElute с обращенно-фазным сорбентом C₁₈, освобождается от большей части родственных примесей. Операция позволяет сконцентрировать целевой продукт в растворе.

4. Элюат с патрона BondElute C₁₈, содержащий целевой продукт и некоторое количество родственных соединений, подвергается очистке с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Phenomenex Luna C₁₈, 10 мкм, 50×250 мм.

Применение этого метода очистки позволяет получить после отгонки ацетонитрила и трифторуксусной кислоты водный раствор целевого продукта, который после лиофилизации дает кристаллический препарат "Худикол" чистотой 92-96%.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Сухие наземные части растения Hoodia Gordonii измельчают в пропеллерном дезинтеграторе до размеров частиц 1-3 мм. Навеску сухой измельченной растительной массы 100 г переносят в коническую колбу вместимостью 2 л, заливают 1 л спирта этилового 95% и помещают в УЗ-баню на 45 мин при 40°С. Полученную смесь оставляют на 30 мин для охлаждения и осаждения твердой фракции. Супернатант отделяют методом фильтрации через бумажный фильтр Whathman №1. Из полученного фильтрата полностью удаляют растворитель методом отгонки в вакууме на роторном испарителе. К полученному остатку приливают 70 мл воды деонизированной и помещают в шейкер на 30 мин, при частоте 200 кол/мин. Полученный раствор переносят в делительную воронку вместимостью 250 мл и приливают 70 мл гексана. Делительную воронку помещают в шейкер на 5 мин при частоте 300 кол/мин. После этой операции делительную воронку оставляют в вертикальном положении на 15 мин. Собирают нижний (водный) слой, отбрасывая верхний (гексановый). Водный слой помещают в делительную воронку вместимостью 250 мл, приливают 70 мл гексана и повторяют последовательность операций 5 раз. Полученный водный раствор фильтруют через бумажный фильтр Whathman №1 на воронке Бюхнера под вакуумом. Фильтрат переносят в мерный цилиндр вместимостью 100 мл и доводят до объема 70 мл водой деионизированной. К полученному раствору добавляют ацетонитрил до 100 мл. Полученный раствор переносят в коническую колбу вместимостью 150 мл и перемешивают.

Полученный раствор наносят на патрон BondElute, HF-Mega BE-C₁₈ под вакуумом, вытек отбрасывают. Сорбент в патроне сушат в потоке воздуха 5 мин. Элюируют сорбат 50 мл смеси: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (50:50). Полученный элюат вводят в препаративный хроматограф Varian PrepStar.

Условия хроматографирования:

колонка Phenomenex Luna С₁₈, 10 мкм, 50×250 мм,

подвижная фаза: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (45:55),

изократический режим, скорость потока - 40 мл/мин,

температура - комнатная,

объем пробы - 10 мл,

УФ детектор, аналитическая длина волны - 220 нм,

время разгонки - 25 мин.

Собирают фракцию от 16,0 до 18,0 мин объемом 80 мл. Из полученного элюата отгоняют ацетонитрил и трифторуксусную кислоту в вакууме на ротационном испарителе. Полученный водный раствор целевого продукта лиофилизируют. Получено сухой субстанции 0,08 г.

Около 10 мг полученной сухой субстанции (точная навеска) переносят в мерную колбу, вместимостью 25 мл, приливают 15 мл смеси ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (38:62), перемешивают до полного растворения и доводят объем колбы до метки этой же смесью растворителей. Пробу вводят в аналитический хроматограф Varian ProStar.

Условия хроматографирования:

колонка Phenomenex Luna C₁₈, 5 мкм, 4,6×150 мм,

подвижная фаза: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (38:62),

изократический режим, скорость потока - 1 мл/мин,

температура - комнатная,

объем пробы - 20 мкл,

УФ детектор, аналитическая длина волны - 220 нм,

время разгонки - 5 мин.

На хроматограмме должен быть один пик с временем удерживания около 10 мин.

Пример 2.

Сухие наземные части растения Hoodia Gordonii измельчают в пропеллерном дезинтеграторе до размеров частиц 1-3 мм. Навеску сухой измельченной растительной массы 200 г переносят в плоскодонную колбу вместимостью 4 л, заливают 2 л спирта этилового 95% и помещают в УЗ-баню на 45 мин при 40°С. Полученную смесь оставляют на 30 мин для охлаждения и осаждения твердой фракции. Супернатант отделяют методом фильтрации через бумажный фильтр Whathman №1. Из полученного фильтрата полностью удаляют растворитель методом отгонки в вакууме на роторном испарителе. К полученному остатку приливают 140 мл воды деонизированной и помещают в шейкер на 30 мин, при чистоте 200 кол/мин. Полученный раствор переносят в делительную воронку вместимостью 500 мл и приливают 140 мл гексана. Делительную воронку помещают в шейкер на 5 мин при частоте 300 кол/мин. После этой операции делительную воронку оставляют в вертикальном положении на 15 мин. Собирают нижний (водный) слой, отбрасывая верхний (гексановый). Водный слой помещают в делительную воронку вместимостью 500 мл, приливают 140 мл гексана и повторяют последовательность операций 5 раз. Полученный водный раствор фильтруют через бумажный фильтр Whathman №1 на воронке Бюхнера под вакуумом. Фильтрат переносят в мерный цилиндр, вместимостью 200 мл и доводят до объема 140 мл водой деионизированной. К полученному раствору добавляют ацетонитрил до 200 мл, при этом объемное соотношение ацетонитрил - водный раствор составляет 1:2,3. Полученный раствор переносят в коническую колбу, вместимостью 250 мл и перемешивают.

Полученный раствор наносят на патрон BondElute, HF-Mega BE-C₁₈, под вакуумом, вытек отбрасывают. Сорбент в патроне сушат в потоке воздуха 5 мин. Элюируют сорбат 50 мл смеси ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (50:50). Полученный элюат вводят в препаративный хроматограф Varian PrepStar.

Условия хроматографирования:

колонка Phenomenex Luna C₁₈, 10 мкм, 50×250 мм,

подвижная фаза: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (45:55),

изократический режим, скорость потока - 40 мл/мин,

температура - комнатная,

объем пробы - 10 мл,

УФ детектор, аналитическая длина волны - 220 нм,

время разгонки - 25 мин.

Собирают фракцию от 16,0 до 18,0 мин объемом 80 мл. Из полученного элюата отгоняют ацетонитрил и трифторуксусную кислоту в вакууме на ротационном испарителе. Полученный водный раствор целевого продукта лиофилизируют. Получено сухой субстанции 0,160 г.

Около 10 мг полученной сухой субстанции (точная навеска) переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 15 мл смеси ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (38:62), перемешивают до полного растворения и доводят объем колбы до метки этой же смесью растворителей. Пробу вводят в аналитический хроматограф Varian ProStar.

Условия хроматографирования:

колонка Phenomenex Luna C₁₈, 5 мкм, 4,6×150 мм,

подвижная фаза: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде (38:62),

изократический режим, скорость потока - 1 мл/мин,

температура - комнатная,

объем пробы - 20 мкл,

УФ детектор, аналитическая длина волны - 220 нм,

время разгонки - 15 мин.

На хроматограмме должен быть один пик с временем удерживания около 10 мин.

Общая формула прегненового гликозида "Худикол" C₅₈H₉₄O₂₆, молекулярная масса 1207.105.

Название по номенклатуре ИЮПАК:

(3β,20S)-3-[(2,6-dideoxy-4-O-{6-deoxy-3-O-methyl-4-O-[(2E)-2-methyl-2-butenoyl]-β-D-threo-hexopyranosyl}-3-O-methyl-β-D-threo-hexopyranosyl)oxy]-14-hydroxypregn-5-en-20-yl 6-O-(6-O-β-D-glycero-hexopyranosyl-β-D-glycero-hexopyranosyl)-β-D-glycero-hexopyranoside.

Данный способ дает возможность получить продукт с чистотой 92-96%, который удовлетворяет требованиям по чистоте, предъявляемым к стандартным образцам природных соединений, при сокращении числа технологических операций с применением нетоксичных растворителей.

Способ получения прегненового гликозида, подавляющего аппетит, включающий экстракцию сухого измельченного растения Hoodia Gordonii спиртом этиловым 95% при температуре 40°С в течение 45 мин при соотношении сырья и экстрагента, равном 1:10, с последующим упариванием экстракта досуха, далее сухой остаток реэкстрагируют деионизированной водой, водный экстракт обрабатывают гексаном 4-5 раз, отделяют водную фракцию и к водной фракции добавляют ацетонитрил при объемном соотношении ацетонитрил-водная фракция, равном 1:2.3, полученный раствор наносят на патрон для твердофазной экстракции BondElute C₁₈, целевой продукт элюируют с патрона смесью: ацетонитрил/0,03% трифторуксусная кислота в деионизированной воде при соотношении, равном 50/50, аликвоту элюата вводят в жидкостный хроматограф с колонкой Phenomenex Luna С₁₈, собирают фракцию элюата, соответствующую пику целевого продукта, из отобранной фракции в вакууме отгоняют ацетонитрил и трифторуксусную кислоту и оставшийся водный раствор целевого продукта лиофилизируют.