Способ определения функциональной активности нейтрофилов по реакции восстановления нитросинего тетразолия

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лабораторным методам исследования функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови, и касается способа определения функциональной активности нейтрофилов по реакции восстановления нитросинего тетразолия. Сущность способа заключается в том, что в лунки планшета вносят гепаринизированную кровь, изотонический раствор, содержащий 0,1% нитросинего тетразолия. Смесь инкубируют 30 минут при 37°С, вносят раствор 3%-ной уксусной кислоты, гепаринизированную кровь, предварительно растворенную в изотоническом растворе вакцины БЦЖ с содержанием 0,1% нитросинего тетразолия. Далее полученную смесь инкубируют 30 минут при 37°С, вносят раствор 3%-ной уксусной кислоты. Проводят подсчет нейтрофилов с наличием в цитоплазме отложений гранул формазана фиолетово-синего цвета в камере Горяева, учитывая 100-200 нейтрофилов, и определяют процент положительно реагирующих НСТ-клеток. Использование способа позволяет повысить точность и достоверность определения функциональной активности нейтрофилов и сократить время проведения исследования. 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лабораторным методам исследования функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови, и может быть использовано для оценки иммунного статуса людей и животных.

Одним из наиболее объективных методов оценки функционально-метаболической активности лейкоцитов считается проба восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Тест основан на способности гранулоцитов фагоцитировать бесцветный краситель тетразолиевого ряда - НСТ и затем восстанавливать его в нерастворимый формазан темно-синего цвета с помощью НАД Н- и НАДФ·Н-оксидаз.

Повышение активности показателей НСТ-теста свидетельствует об активации функциональной (фагоцитарной) активности нейтрофильных гранулоцитов при системных бактериальных инфекционных заболеваниях (Б.С.Нагоев, М.Г.Шубич. Значение теста восстановления нитросинего тетразолия для изучения функциональной активности лейкоцитов // Лаб. дело. - №4. - 1981. - С.195-198).

Существует два методических принципа проведения НСТ-теста. Один из них (Вагнер В.К., Насонкин О.С., Борискина Н.Д. Количественная оценка теста восстановления нитросинего тетразолия // Лаб. дело. - 1989. - №12. - С.31-33; Кубась В.Г., Данилова О.П., Н.А. Никифорова. Количественная характеристика редукции нитросинего тетразолия нейтрофилами при экспериментальном системном кандидозе // ЖМЭИ. - 1987. - №4. - С.58-59) основан на спектрофотометрическом определении количества формазана, эстрагированного органическим растворителем диоксаном, из крови, инкубированной с НСТ. Однако использование больших объемов реагентов и кипящих токсических растворителей существенно ограничивает производительность и повышает трудоемкость.

В клинико-лабораторной практике наибольшее распространение получил визуальный цитохимический метод (Pack B.H., Fikrig S.M., Smithwich E.M. Infection and nitrobluetetrazolium reduction by neutrophils; a diagnostic aid // Lancet. - 1968. - Vol.11. - №2. - P.532-534), основанный на определении нейтрофилов, имеющих в цитоплазме гранулы формазана. Однако этот метод не свободен от существенных недостатков. Поэтому предлагаются модификации с более низкой концентрацией гепарина (Шубич М.Г., Медникова В.Г. NBT-тест у детей в норме и при гнойно-бактериальных инфекциях // Лаб. дело. - 1978. - №9. - С.515-518) и другие.

Наиболее близким техническим решением к заявленному является способ диагностики активности туберкулеза у детей (см. В.Г.Савватеева, А.В.Кочкин. Авторское свидетельство №1387991, кл. А61В 10/00 от 15.04.88. Бюл. №14). Способ включает динамическое исследование крови in vitro путем постановки реакции НСТ. Для этого одновременно в две лунки полимерного планшета для иммунологических реакций вносят по 0,02 гепарина (20 ЕД гепарина на 1 мл крови), затем по 0,1 мл капиллярной крови; в одну лунку добавляют 0,1 мл 0,1%-ного раствора НСТ, приготовленного ех tempore (смесь равных объемов 0,2%-ного НСТ на 0,15 М фосфатном буфере рН 7,2 и изотонического раствора), спонтанный вариант, в другую лунку добавляют предварительно растворенный в физиологическом растворе NaCl туберкулин из расчета 1 ампула ППД-Л (500 тыс. ТЕ) на 1 мл 0,9%-ного NaCl (стимулированная реакция). Инкубируют 30 минут при 37°С. Перемешивание воздухом после каждого этапа. После инкубации готовят мазки, высушивают на воздухе и фиксируют метанолом. Окрашивание 0,1%-ным раствором нейтрального красного на физиологическом растворе 40 мин. Подсчитывают под иммерсией 100-200 нейтрофилов. Процент клеток, содержащих в цитоплазме формазан, окрашенный в темно-синий цвет, определяет величину НСТ-теста в спонтанном варианте и в стимулированном. К НСТ-тест-положительным относят нейтрофилы с ясно определяемым отложением формазана в виде гранул и глыбок темно-синего цвета.

Все вышеописанные модификации НСТ-теста предусматривают учет реакции, связанный с приготовлением мазков, при котором неизбежны потери клеток, что может привести к ложным результатам.

Задачей изобретения являются повышение точности и достоверности, сокращение времени и снижение материальных затрат.

Эта задача достигается тем, что в лунки 96-луночного планшета для иммунологических исследований с круглым дном вносят по 20 мкл гепаринизированной крови и оценивают функциональное состояние нейтрофилов по уровням спонтанной и стимулированной активности, причем для определения уровня спонтанной активности в лунку вносят 20 мкл изотонического раствора, содержащего 0,1% нитросинего тетразолия, а для определения уровня стимулированной активности в лунку вносят 20 мкл предварительно растворенной в изотоническом растворе NaCl вакцины БЦЖ в оптимальном разведении с содержанием 0,1% нитросинего тетразолия, после внесения всех реагентов планшет с пробами инкубируют 30 минут при 37°С, затем для гемолиза эритроцитов вносят в каждую лунку по 160 мкл 3%-ной уксусной кислоты, таким образом получая десятикратное разведение крови. Подсчет нейтрофилов проводят в камере Горяева, учитывая 100-200 нейтрофилов (активированные клетки содержат темно-фиолетовые гранулы формазана, не активированные не содержат гранул формазана).

Отличительными признаками предложенного способа являются: уровень стимулированной активности определяют путем внесения предварительно растворенной в изотоническом растворе вакцины БЦЖ, в каждую лунку вносят 3%-ный раствор уксусной кислоты, подсчет нейтрофилов проводят в камере Горяева.

Предлагаемый способ определения нейтрофилов позволяет повысить точность и достоверность метода за счет исключения длительного этапа приготовления мазка, который ведет к механическому повреждению исследуемых клеток, кроме того, сокращает время проведения реакции и снижает материальные затраты.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. Определение уровня функциональной активности нейтрофилов. Проводят исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия предлагаемым способом (табл.1) у 20 морских свинок, которых делят на 2 группы. 1-я группа - 10 морским свинкам была введена вакцина БЦЖ в дозе 0,1 мг, 2-я контрольная (10 животных). Кровь у морских свинок берут на 30 день после вакцинации. Для выяснения возможности замены стимулятора с целью повышения точности способа в опыте использовали в качестве стимуляторов ППД-туберкулин и вакцину БЦЖ (см. Г.И.Рыковская, М.Г.Шубич / Авторское свидетельство №1168257, кл. А61К 39/00 от 23.07.85. Бюл. №27. «Способ дифференциальной диагностики туберкулеза»).

При постановке реакции предлагаемым способом в три лунки полимерного планшета для иммунологических реакций вносят по 20 мкл гепаринизированной крови, затем в одну лунку добавляют 20 мкл смеси равных объемов 0,1%-ного НСТ на изотоническом растворе (спонтанный вариант), во вторую лунку добавляют 20 мкл смеси равных объемов 0,1%-ного НСТ и предварительно растворенный в изотоническом растворе NaCl туберкулин из расчета 1 ампула ППД-Л (500 тыс. ТЕ) на 1 мл изотонического раствора NaCl (стимулированная реакция), в третью лунку добавляют 20 мкл смеси равных объемов 0,1%-ного НСТ и предварительно растворенную в изотоническом растворе NaCl (1000 мкг/мл) вакцину БЦЖ (стимулированный вариант). Инкубируют 30 минут при 37°С, затем с помощью 3%-ной уксусной кислоты гемолизируют эритроциты. Заправляют пробу в камеру Горяева (объектив ×40), подсчитывают 100-200 нейтрофилов, определяют процент положительно реагирующих НСТ-клеток. В цитоплазме клеток, положительно реагирующих с НСТ, отмечается отложение гранул формазана фиолетово-синего цвета. В цитоплазме отрицательно реагирующих с НСТ-клеток гранулы формазана отсутствуют.

Таблица 1
Сравнительные показатели функциональной активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием у морских свинок при использовании разных стимуляторов
Группа животных	Символы статистики	НСТ-тест, %
Спонтанный	с ППД	с БЦЖ
Вакцинированные	М±m	4,00±0,31	7,80±1,24	42,60±4,50
БЦЖ	P	<0,01	>0,05	<0,05
Контроль	М±m	2,00±0,31	6,20±2,26	21,00±6,25

Из таблицы 1 видно, что у вакцинированных БЦЖ морских свинок по сравнению с контрольной группой с высокой степенью достоверности (Р<0,05) усиливается функциональная активность нейтрофилов как в спонтанном, так и в стимулированном БЦЖ варианте теста с нитросиним тетразолием. Функциональная активность нейтрофилов при использовании ППД-туберкулина также возрастает, однако не достигает достоверной разницы. Проведенные исследования подтверждают тот факт, что предпочтительнее использовать в качестве стимулятора вакцину БЦЖ для более точного определения функциональной активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием.

Пример 2. Проводят исследование крови у 28 детей путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по общепринятой методике и по предлагаемому способу с использованием в качестве стимулятора вакцины БЦЖ (табл.2).

Таблица 2
Сравнительные показатели функциональной активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием у детей, проведенном по известному и предлагаемому способу, М±m
Известный способ (В.Г.Савватеева, А.В.Кочкин)	Предлагаемый способ	Достоверность различий, Р
Спонтанный НСТ-тест (контроль)
17,10±2,05%	17,73±2,03%	>0,05
Стимулированный НСТ-тест (опыт)
54,26±3,68%	76,89±4,63%	<0,01
Опыт/контроль
4,24±0,6	5,97±0,98	>0,05

Из таблицы 2 видно, что контрольные показатели при постановке НСТ-теста известным способом незначительно ниже в отличие от данных с использованием предлагаемого способа (соответственно 17,10±2,05%; 17,73±2,03%). Результаты исследований предлагаемым способом НСТ-теста, стимулированного вакциной БЦЖ, с высокой степенью достоверности увеличиваются (Р<0,01) по сравнению с показателями, полученными известным способом, так как при приготовлении мазков исследуемые клетки подвергаются механическому воздействию и часть их разрушается. Предлагаемый метод исключает этап приготовления мазков, что повышает достоверность исследования.

Полученные результаты НСТ-теста, стимулированного вакциной БЦЖ, подтверждают, что предлагаемый способ определения функциональной активности нейтрофилов точнее, так как кратность различий между покоящимися и стимулированными клетками (опыт/контроль) превосходит аналогичные показатели известного способа.

Пример 3. Проводят исследование крови у 8 кроликов путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известной методике и по предлагаемому способу (табл. 3).

Таблица 3
Сравнительные показатели функциональной активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием у кроликов, проведенном известным и предлагаемым способами, М±m
Известный способ (В.Г.Савватеева, А.В.Кочкин)	Предлагаемый способ	Достоверность различий, Р
Спонтанный НСТ-тест (контроль)
7,0±1,36%	7,87±2,01%	>0,05
Стимулированный НСТ-тест (опыт)
15,0±2,50%	23,75±3,28%	≤0,05
Опыт/контроль
2,98±0,79	5,33±1,51	>0,05

Из таблицы 3 видно, что показатели при постановке спонтанного НСТ-теста предлагаемым способом незначительно увеличиваются по сравнению с показателями при использовании известного способа (Р>0,05), в то время как при постановке НСТ-теста, стимулированного вакциной БЦЖ, увеличиваются с высокой степенью достоверности (Р≤0,05).

Следовательно, предлагаемый способ определения функциональной активности нейтрофилов не требует дорогостоящего оборудования, позволяет уменьшить объем исследования крови и материальные затраты за счет использования меньших объемов реактивов, исключения применения метанола и красителей, сократить время постановки реакции за счет отсутствия необходимости в приготовлении, фиксации и окраске мазков, повышает точность и достоверность за счет предупреждения повреждения нейтрофилов, которое неизбежно при приготовлении мазков. При нейтропении, когда затруднен подсчет нейтрофилов, а тем более определение активированных форм этих клеток, содержащих гранулы формазана, отбор надосадка позволяет концентрировать клетки в исследуемой пробе, значительно сокращая время анализа, а при необходимости многократно проводить повторный подсчет лабораторного образца. Метод также позволяет одновременно проводить подсчет общего количества лейкоцитов, а также учитывать количество моно- и полинуклеаров.

Способ определения функциональной активности нейтрофилов по реакции восстановления нитросинего тетразолия, заключающийся в том, что в лунки планшета вносят гепаринизированную кровь, изотонический раствор, содержащий 0,1% нитросинего тетразолия, смесь инкубируют 30 мин при 37°С, вносят раствор 3%-ной уксусной кислоты, гепаринизированную кровь, предварительно растворенную в изотоническом растворе вакцины БЦЖ с содержанием 0,1% нитросинего тетразолия, смесь инкубируют 30 мин при 37°С, вносят раствор 3%-ной уксусной кислоты, проводят подсчет нейтрофилов с наличием в цитоплазме отложений гранул формазана фиолетово-синего цвета в камере Горяева и определяют процент положительно реагирующих НСТ-клеток.