Применение специфических молочнокислых бактерий для получения композиции, пригодной для стимуляции иммунного ответа при заболеваниях, связанных с изменениями в иммунной системе

Штаммы Lactobacillus salivarius CNCM I 1794 и Lactobacillus paracasei CNCM I 1688, по отдельности или в комбинации применяют для получения композиции, пригодной для стимуляции иммунного ответа при заболеваниях, связанных с изменениями в иммунной системе. Композиция представляет собой пероральную композицию, диетическую композицию, пищевую композицию или нутрицевтическую композицию, содержащую полезные для здоровья добавки. Изобретение позволяет стимулировать определенные ответы иммунной системы, делая ее более активно стимулирующей. 13 з.п. ф-лы.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к применению некоторых особенных лактобактерий для получения иммуномодулирующих композиций, в особенности, изобретение имеет отношение к применению следующих двух штаммов Lactobacillus salivarius I 1794 and Lactobacillus paracasei I 1688, самостоятельно или в виде смеси двух штаммов.

Уровень техники, к которому относится изобретение

Описано влияние на иммунитет животных и людей некоторых продуцирующих молочную кислоту бактерий (LAB), которые присутствуют, главным образом, в молочнокислых продуктах питания и в пробиотических лекарственных препаратах. В частности, было доказано, что некоторые из бактерий LAB способны взаимодействовать с иммунной системой, изменяя способ и степень защиты от патогенов и опухолевых перерождений; было также показано усиление иммунной реакции на уровне слизистой оболочки (Int. J. Immunopathol. Pharmacol., 2004; 17: 127-134; Infection and Immunity, 2000; 68 (2): 752-59).

Описание изобретения

Известно также, что не все лактобактерии являются пробиотическими и только некоторые из них обладают влиянием на иммунную систему. Иммунологические исследования in vitro, проведенные с различными штаммами LAB, привели к противоречивым и, в некоторых отношениях, к противоположным результатам, показав, таким образом, что невозможно не только предсказать, будут ли бактерии LAB активны в отношении иммунной системы, но также показав и то, что некоторые штаммы способны ингибировать активность других видов того же рода (J.Immunol., 2002, 168: 171-178).

В настоящее время установлено, что два специфических штамма лактобактерий обладают сильным иммуномодулирующим эффектом, по отдельности или совместно, и, следовательно, могут быть применены для лечения патологий, связанных с перестройками иммунной системы.

В частности, было неожиданно обнаружено, что два штамма лактобактерий Lactobacillus salivarius I 1794 и Lactobacillus paracasei I 1688 непосредственно влияют на иммунную систему, стимулируя ответы, главным образом, ответы лимфоцитов, Т-регуляторов и природных клеток-киллеров (NK-клеток), которые приводят к положительному результату у субъектов с предрасположенностью к патологиям иммунной системы, в особенности, но не только, у субъектов, страдающих аллергией, и/или субъектов с иммунодефицитом.

Таким образом, в соответствии с одним из своих воплощений, изобретение имеет отношение к применению, по меньшей мере, одной лактобактерии, которую выбирали из Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 и их смеси, для получения композиции, применимой для модулирования иммунной системы.

Lactobacillus paracasei I 1688 и Lactobacillus salivarius I 1794 впервые были описаны в Европейском патенте №0861905, выданном 24.11.2004, на имя того же заявителя для лечения нарушений кишечной системы.

Термин "смесь" в соответствии с настоящим изобретением означает объединение двух указанных выше штаммов лактобактерий в любой пропорции по отношению друг к другу.

Выражение "модулировать иммунную систему" означает, в соответствии с настоящим изобретением, что композиция в соответствии с изобретением способна стимулировать определенные ответы иммунной системы, делая ее более активно реагирующей, например, вмешиваясь через образование специфических цитокинов в развитие клеток, вовлеченных в иммунный ответ.

В соответствии с предпочтительным воплощением, смесь по изобретению включает две определенные выше лактобактерии в соотношении приблизительно 10:1, более предпочтительно, в следующих соответствующих пропорциях: 92% Lactobacillus paracasei I 1688 и 8% Lactobacillus salivarius I 1794.

Смесь, включающая 92% Lactobacillus paracasei I 1688 и 8% Lactobacillus salivarius I 1794, известна сама по себе, как лекарственное средство, применяемое при лечении нарушений желудочно-кишечного тракта, таких как дисбактериоз, и имеет общепринятое и коммерческое наименование "PS MIX" (заявка на товарный знак).

Другие смеси, включающие различные относительные количества двух лактобактерий, которые, если необходимо, комбинируют с другими лактобактериями или подходящими активными веществами, могут быть также применены в соответствии с изобретением.

Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 и их смеси, такие как были определены выше, в дальнейшем в этом документе также называемые "активными компонентами", в особенности были полезны в качестве лекарственных средств для предупреждения и лечения патологий, связанных с перестройками иммунной системы.

В действительности было показано, что указанные активные компоненты способны стимулировать иммунные клетки различного типа, в особенности, при патологиях, в которые вовлечены реакции лимфоцитов, главным образом, Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов с CD25, природных клеток-киллеров, В-лимфоцитов, дендритных клеток и цитокинов, включая, например, TNFα, IFNγ, IL-10 и IL-12.

Подробное описание проведенных тестов и неожиданные результаты, полученные с активными компонентами изобретения, приведены в экспериментальном разделе настоящего описания.

Следовательно, Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 и их смеси могут быть применены, например, при лечении и предупреждении аллергий и вызываемых ими патологий.

Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 и их смеси могут быть также применены при лечении и предупреждении иммунодефицитов любого происхождения и вызываемых ими патологий.

Таким образом, в соответствии с другими своими воплощениями, изобретение имеет отношение к применению композиций по изобретению, преимущественно композиций в пероральной форме, для лечения бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний, таких как инфекции дыхательных путей, инфекции желудочно-кишечного тракта, инфекции слизистых оболочек, инфекции кожи и все инфекции, возникающие как следствие состояний иммунодефицита.

В условиях иммунодефицита защита организма от патогенов снижена с последующим изменением в отношении Th1/Th2, например, так, как при физиологических иммунодефицитах (новорожденные младенцы, беременность), врожденных иммунодефицитах (генетические заболевания) и приобретенных иммунодефицитах (СПИД, аутоиммунные заболевания).

Композиции по изобретению могут также быть полезны для поддержания естественных иммунных защитных сил организма, в особенности, например, в состояниях стресса, таких как психофизический стресс, который, при условии чрезмерного усиления или продолжительности, может привести к ситуации иммунодефицита, клинически выражающейся в инфекционных заболеваниях различной интенсивности.

Активные компоненты по изобретению, т.е. Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 и их смеси, для того, чтобы они могли произвести свое действие, предпочтительно вводят системно, преимущественно перорально, в виде композиций, возможно, но не необязательно, объединенных с одним или несколькими физиологически и/или фармацевтически приемлемыми наполнителями или средами-растворителями.

Термин "композиции" в соответствии с настоящим изобретением означает любую композицию, фармацевтическую, диетическую, пищевую композицию или нутрицевтическую композицию, содержащую полезные для здоровья добавки, преимущественно пероральную композицию, которая включает описанные выше лактобактерии или их смеси.

Указанные композиции получали в соответствии с известными методиками, принимая во внимание, в особенности, природу активных компонентов по изобретению, состоящих из живых материалов, т.е. лактобактерии, которые, следовательно, должны подвергаться обработке таким образом, чтобы они могли выжить в процессе производства, хранения и введения.

В соответствии с предпочтительным воплощением композиции для применения в соответствии с изобретением находятся в форме единичных доз для введения один или несколько раз в день, в соответствии с типом и с тяжестью патологии, которую предполагается лечить, и с учетом возраста и веса пациента. В общем, указанные единичные дозы содержат от 10³ до 10¹², преимущественно от 10⁵ до 10¹⁰, например, от 10⁸ до 10¹⁰ КОЕ (колониеобразующих единиц) активных компонентов на грамм композиции.

Для адекватного лечения обычно вводят, например, от 1-ой до 3-х единичных доз в день.

Активные компоненты для применения в соответствии с изобретением предпочтительно вводят перорально и в лиофилизированной форме, включая их в подходящие композиции, возможно, но необязательно с наполнителями и общепринятыми стабилизаторами, в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в этой области техники.

Таким образом, для применения в соответствии с изобретением композиции, содержащие активные компоненты, вводят в течение соответствующего периода времени, который, если необходимо, устанавливается специалистом, ответственным за проведение лечения, и который, в общем, может меняться от 1-ой недели до 1-го месяца или даже более. Возможно также более короткое или более длительное лечение, так как активные компоненты представляют собой нетоксичные компоненты, это позволяет применять их даже в избытке без вредных побочных эффектов для здоровья субъекта, принимающего лечение.

Фармацевтические, диетические, пищевые композиции или нутрицевтические композиции, содержащие полезные для здоровья добавки, в соответствии с изобретением включают любое лекарственное средство, продукты питания, диетический продукт или нутрицевтический продукт, содержащий полезные для здоровья добавки, способный обеспечить среду-растворитель для описанных выше лактобактерий в организме. В качестве более точной иллюстрации они включают, например, лекарственные средства; диетические продукты питания; продукты питания, получаемые из молока, такие как йогурт, сыр, сливки; кондитерские изделия; фруктовые соки и т.д. Указанные композиции могут включать другие полезные для организма вещества, например, такие, как витамины, минеральные соли и/или другие совместимые активные компоненты, например пребиотические соединения, такие как инулины, фосфоолигосахариды (FOS), волокна и т.д.

Изобретение также имеет отношение к способу профилактики и лечения патологий иммунной системы, таких, как было определено выше, который включает введение млекопитающему эффективных доз активного компонента, который выбирали из Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 и их смесей.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение без каких-либо ограничений.

Пример 1

Оценка прямого влияния смеси Lactobacillus salivarius I 1794 и Lactobacillus paracasei I 1688 на клетки соматической иммунной системы

Оценивали пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови некоторых субъектов, как реакцию на следующие дозы Lactobacillus salivarius I 1794 и Lactobacillus paracasei I 1688 и на две смеси этих же бактерий.

Перед выполнением различных описанных ниже определений бактерии подвергали гамма-облучению в течение 24 часов с помощью источника цезия с целью полностью блокировать самопроизвольное размножение этих же бактерий.

Лимфоциты 15-ти здоровых субъектов изолировали центрифугированием в градиенте плотности Fycoll-Hypaque (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway), ресуспендировали в среде RPMI 1640 (Gibco BRL, Life Technologues, Paisley, Scotland), в которую были добавлены 2 мМ L-глутамин, 50 мкг/мл гентамицин (Gibco) и 10% фетальной сыворотки теленка (FCS, Euroclone-Celbio, Milan, Italy) (RPMI-FCS), и культивировали (1X10⁵/200 мкл) в трех повторах, на 96-луночных микропланшетах с U-образным дном (не стимулированные культуры) или (стимулированные культуры) с Lactobacillus salivarius (I 1794) (1X10⁵/200 мкл), Lactobacillus paracasei (I 1688) (1X10⁵/200 мкл), PS MIX (заявка на товарный знак) (1X10⁵/200 мкл) или Candida albicans (2X10⁵/200 мкл), в качестве позитивного контроля, при 37°С во влажной атмосфере, в присутствии 5% СО₂. Через восемнадцать часов накопления в каждую лунку вносили 1 мкСi [3H]TdR (Amershampharmacia Biotec, Milan, Italy).

Для пролиферативных тестов применяли следующие отношения бактерии/лимфоциты периферической крови:

бактерии: лимфоциты

200:1

100:1

20:1

10:1

5:1

1:1

0,5:1

0,1:1

0,01:1

0,005:1

0,001:1

и сравнивали с пролиферативной реакцией Candida Albicans при двух отношениях (0,2:1 и 2:1) в шестидневной культуре, при 37°С в атмосфере с 5%-ным CO₂.

Результаты выражали как Индекс стимуляции (SI: cpm стимулируемых культур /cpm не стимулируемых культур, где cpm означает "число импульсов в минуту"), который отражает определение узнавания лимфоцитами бактериальных агентов и их способности реагировать путем размножения на распознавание антигена.

Результаты

Наблюдали отличный пролиферативный ответ на со-культуру бактерии/клетка, который означал распознавание лимфоцитами антигенных детерминант лактобактерий и активацию лимфоцитов в результате указанного распознавания.

Пример 2

Фенотип лимфоцитарных субпопуляций

Фенотип лимфоцитарных субпопуляций определяли в нулевой момент времени, перед культивированием бактерий, и после 6-ти дней культивирования, для установления того, какой фенотип был индуцирован.

Для определения Т-лимфоцитарных популяций и субпопуляций применяли моноклональные анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8, анти-CD25, анти-HLA, анти-CD16 антитела, для определения природных клеток-киллеров применяли анти-CD56, анти-CD20, анти-CD38 антитела и для определения В-лимфоцитарных популяций и плазмацитов применяли анти-CD79 антитела. Данные получали с помощью трехцветного способа.

Результаты

Наблюдали значительное увеличение природных клеток-киллеров, которые, как известно, обеспечивают лучший ответ на клетки, инфицированные вирусами, и клетки, претерпевшие злокачественное перерождение.

Наблюдалось также увеличение в лимфоцитах Т-хелперах и цитотоксических Т-лимфоцитах с мембраной CD25, которые представляют собой субпопуляцию, наиболее непосредственно затрагиваемую модуляцией иммунного ответа.

Пример 3

С помощью способа ELISA, разработанного для каждого цитокина (TNF-альфа, IFN-гамма, IL-10, IL-12, IL-4), было установлено, что в лейкоцитной пленке клеточных культур происходит образование некоторых цитокинов.

Результаты

Образование IL-4 в супернатанте в ответ на активацию лимфоцитов лактобактериями было ниже уровня, измеряемого с помощью теста ELISA, что свидетельствует о том, Т-хелперы 2 (Th2), ответственные за индукцию аллергенного явления, не были активированы.

С другой стороны, были обнаружены высокие величины TNF-альфа и IFN-гамма, что указывает на активацию Т-хелперов 1 (Th1).

Были обнаружены также существенные количества IL-10 и IL-12; первые, как известно, индуцируют дифференциацию В-лимфоцитов, ингибируют активацию макрофагов и защищают от риска воспалительного заболевания кишечника (IBD), вторые активируют природные клетки-киллеры, индуцируя продукцию IFN-гамма, ключевого агента на первых фазах инфекции.

Пример 4

Готовили пероральную композицию, в форме порошка, включающую следующие компоненты для каждой единичной дозы:

PS MIX (заявка на товарный знак) (лиофилизированный) 1×10⁸-1×10¹⁰

Сахароза; Солодовые декстрины; Ароматизатор; Диоксид кремния; Витамин В2; Витамин В1.

1. Применение штамма Lactobacillus salivarius CNCM I 1794, Lactobacillus paracasei CNCM I 1688 или их смеси для получения композиции, пригодной для стимуляции иммунного ответа при заболеваниях, связанных с изменениями в иммунной системе.

2. Применение по п.1 смеси Lactobacillus salivarius CNCM I 1794 и Lactobacillus paracasei CNCM I 1688 в любых пропорциях.

3. Применение по п.2 смеси, включающей 8% Lactobacillus salivarius CNCM I 1794 и 92% Lactobacillus paracasei CNCM I 1688.

4. Применение по п.1 для получения композиции для профилактики и лечения заболеваний, связанных с изменением в функции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов с CD25, природных клеток-киллеров, В-лимфоцитов, дендритных клеток и цитокинов, включая TNFα, IFNγ, IL-4, IL-10 и IL-12.

5. Применение по п.4 для получения пероральной композиции для профилактики и лечения аллергии.

6. Применение по п.4 для получения пероральной композиции для профилактики и лечения иммунодефицитов и вызываемых ими патологий.

7. Применение по п.1, в котором Lactobacillus salivarius CNCM I 1794, Lactobacillus paracasei CNCM I 1688 или их смесь содержатся в виде пероральной композиции с одним или несколькими физиологически и/или фармацевтически приемлемыми наполнителями и/или средами-растворителями.

8. Применение по п.1, в котором Lactobacillus salivarius CNCM I 1794, Lactobacillus paracasei CNCM I 1688 или их смесь содержатся в композиции в количестве, по меньшей мере, 1·10⁸-1·10¹⁰ КОЕ/г композиции.

9. Применение по п.1, в котором Lactobacillus salivarius CNCM I 1794, Lactobacillus paracasei CNCM I 1688 или их смесь содержатся в композиции после восстановления лиофилизированной формы.

10. Применение по п.1, в котором Lactobacillus salivarius CNCM I 1794, Lactobacillus paracasei CNCM I 1688 или их смесь содержатся в композиции в виде единичных доз.

11. Применение по п.1, в котором указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

12. Применение по п.11, в котором композиция представляет собой пероральную композицию для лечения инфекций бактериального или вирусного происхождения, возникших как следствие состояния иммунодефицита.

13. Применение по п.11, в котором композиция представляет собой пероральную композицию для лечения инфекций дыхательных путей, инфекций желудочно-кишечного тракта, инфекций слизистых оболочек, инфекции кожи, возникших как следствие состояния иммунодефицита.

14. Применение по п.1, в котором композиция представляет собой диетическую композицию, пищевую композицию или нутрицевтическую композицию, содержащую полезные для здоровья добавки.