Вакцинный штамм вируса гриппа в/60/малайзия/04/898 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
Владельцы патента RU 2416639:
Учреждение Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН (НИИЭМ СЗО РАМН) (RU)
Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии. Штамм В/60/Малайзия/04/898 активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32-33°С. Характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагтлютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса, остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, - от донора аттенуации. Штамм В/60/Малайзия/04/898 ареактогенен для взрослых и для детей при интраназальном введении. Изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости сезонным гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа В/60/Малайзия/04/898. 4 табл.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа типа В, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus B, B/60/Малайзия/04/898.
В результате появления в циркуляции нового штамма вируса гриппа B/Малайзия/2506/04, принадлежащего к Викторианской антигенной разновидности, известный вакцинный штамм B/60/Джилин/03/1 антигенной линии Ямагата - прототип [патент РФ №2307161 от 27.09.2007 - Опубл. 2007. - БИ №27] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной B/Малайзия/2506/04 - подобными штаммами вируса гриппа.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для производства живой гриппозной вакцины для взрослых и детей актуальной антигенной разновидности на основе современного эпидемического вируса B/Малайзия/2506/04.
Целью изобретения было получение промышленно значимого и антигенно актуального реассортантного вакцинного штамма. Для его получения выбраны два родительских штамма вируса гриппа: эпидемический штамм вируса гриппа B/Малайзия/2506/04 и безвредный для человека холодоадаптированный донор аттенуации B/СССР/60/69.
Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4. - C.387-395].
Донор аттенуации B/СССР/60/69 - холодоадаптированный (ca) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С.66-83]. Донор аттенуации B/СССР/60/69, характеризующийся устаревшей антигенной структурой, был ранее получен из эпидемического вируса гриппа B/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку противовирусного иммунитета.
Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического (пандемического) штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) - от безвредного донора аттенуации. На основе донора аттенуации B/СССР/60/69 был создан вакцинный штамм B/60/Джилин/03/1 - прототип.
Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм B/60/Малайзия/04/898 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса B/Малайзия/2506/04 с донором аттенуации B/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 25°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены трехкратным клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (25°C) и оптимальной (33°C) температурах инкубации. Чистые клоны проверены по фенотипическим характеристикам (ts-, ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.
Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали следующие методы:
a) Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена - гемагглютинина (НА) одному из родительских вирусов [Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУК 3.3.2.1758-03].
б) Метод ПЦР-рестрикционного анализа ДНК копий генов, основанный на амплификации относительно коротких участков РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации, но не для эпидемических вирусов гриппа. Метод впервые был создан для анализа состава генома реассортантов эпидемических вирусов гриппа А и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J. Virol. Methods. - 1995. - Vol.52. - №1-2. - Р.41-49]. Мы разработали метод ПЦР-рестрикционного анализа реассортантов современных вирусов гриппа B Викторианской линии и донора аттенуации B/СССР/60/69. Перечень сконструированных праймеров и использованных рестриктаз приведен в табл.1. Обработку амплифицированных фрагментов ДНК производили соответствующими рестриктазами с их последующим электрофорезом в 1,7-2,0%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида. Это позволило четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к любому современному эпидемическому вирусу гриппа B Викторианской линии или донору аттенуации B/СССР/60/69.
Антигенная характеристика вакцинного штамма. Полученный нами вакцинный штамм B/60/Малайзия/04/898 в РТГА идентичен эпидемическому вирусу B/Малайзия/2506/04, антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.
ПЦР-рестрикционным методом установлено, что вакцинный штамм B/60/Малайзия/04/898 унаследовал второй из двух генов, кодирующих поверхностные белки - нейраминидазу (NA) - от эпидемического вируса B/Малайзия/2506/04.
Формула генома. Формула генома 6:2 вакцинного штамма B/60/Малайзия/04/898 подтверждена ПЦР-рестрикционным методом с помощью специфических праймеров и соответствующих рестриктаз. Вакцинный штамм B/60/Малайзия/04/898 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (PB1, PB2, PA, NP, M, NS), от донора аттенуации B/СССР/60/69.
| Таблица 1. | |||||||
| Перечень праймеров и рестриктаз, использованных для изучения состава генома реассортантного вакцинного штамма B/60/Малайзия/04/898, полученного на основе эпидемического вируса B/Малайзия/2506/04 и донора аттенуации B/СССР/60/69 | |||||||
| Ген | Рестриктаза | Длина амплифицированного участка ДНК и его фрагментов, разрезанных соответствующей рестриктазой | Название и нуклеотидная последовательность праймеров (F - прямой праймер; R - обратный праймер) | Рестрикция | |||
| ЭВ | ДО | ВШ | |||||
| PB2 | MscI | 287 (236, 51) | B-PB2-F1743 | СААТGGGATGCATТТGAAGC | нет | да | да |
| B-PB2-R2029 | GTTAGGACTTCTGTTTGTGG | ||||||
| PB1 | BspHI | 379 (200, 179) | B-PB1-F906 | AGGAGGGATСAGCATGACAG | нет | да | да |
| B-PB1-R1284 | TCCCAACACGGTAGATAGCA | ||||||
| PA | BclI | 344 (255, 89) | B-PA-F1539 | CAATCTCATCTGAGGGGAGA | нет | да | да |
| B-PA-R1882 | CCAATACTGAAAGTTTTGGG | ||||||
| NP | AvrII | 401 (263, 138) | B-NP-F1148 | AATATGGCAACACCTGTTTC | нет | да | да |
| B-NP-R1548 | TTGACATCTGCATCACGTCC | ||||||
| NA | AflII | 605 (221,384) | B-NA-F591 | GGTCCGCATGCCATGATGG | да | нет | да |
| B-NA-R1196 | CCATGGGTCTCCATCATACTT | ||||||
| M | BglII | 337 (205, 132) | B-M-F319 | GCTGAGAGAAAAATGAGAAG | да | нет | нет |
| B-M-R655 | CTCCAATGTTGCTTTGCAGC | ||||||
| NS | MaeI | 308 (230,78) | B-NS-F142 | CTTTCATGGCAAAGAGCCCT | нет | да | да |
| B-NS-R449 | GGTTCTTCTTCTATGTCATC | ||||||
| ОБОЗНАЧЕНИЯ: ЭВ - эпидемический вирус гриппа Викторианской линии B/Малайзия/2506/04; ДО - донор аттенуации B/СССР/60/69; | |||||||
| ВШ - вакцинный штамм В/60/Малайзия/04/898; «да» - амплифицированная ДНК копия фрагмента РНК режется, | |||||||
| «нет» - не режется соответствующей рестриктазой. |
Результаты анализа всех генов вакцинного штамма B/60/Малайзия/04/898 представлены в табл.2.
| Таблица 2. | |||
| Состав генома реассортантного вакцинного штамма B/60/Малайзия/04/898, полученного на основе эпидемического вируса В/Малайзия/2506/04 и донора аттенуации B/СССР/60/69 | |||
| Ген | Принадлежность гена одному из родительских вирусов | ||
| Донор аттенуации | Эпидемический вирус | Вакцинный штамм | |
| PB2 | 60 | ЭВ | 60 |
| PB1 | 60 | ЭВ | 60 |
| PA | 60 | ЭВ | 60 |
| HA | 60 | ЭВ | ЭВ |
| NP | 60 | ЭВ | 60 |
| NA | 60 | ЭВ | ЭВ |
| M | 60 | ЭВ | 60 |
| NS | 60 | ЭВ | 60 |
| ОБОЗНАЧЕНИЯ: 60 - донор аттенуации B/СССР/60/69; | |||
| ЭВ - эпидемический вирус гриппа B/Малайзия/2506/04. |
Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Малайзия/04/898 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Было показано, что вакцинный вирус является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°C и 38°C составляет 7,0 lg ЭИД50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°C и 25°C равна 2.5 lg ЭИД50/0,2 мл), что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации B/СССР/60/69.
Оценку токсичности вакцинного штамма B/60/Малайзия/04/898 определяли путем подкожного и внутрибрюшинного введения вирусного материала мышам. Для этого группе из 12 мышей (самцов линии СВА весом 18-20 г вводили соответствующим способом 0,5 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл и оценивали патогенность вируса по проценту выживших мышей в течение 7 дней после введения вируса. Вакцинный штамм B/60/Малайзия/04/898 в эксперименте на мышах оказался полностью безвредным - 100% мышей выжили в течение всего периода наблюдения.
В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины B/60/Малайзия/04/898 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса B/Малайзия/2506/04, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека. Штамм аттенуирован и безвреден для мышей.
Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа.
Штамм B/60/Малайзия/04/898 ареактогенен для взрослых и для детей при интраназальном введении.
Таким образом, вакцинный штамм B/60/Малайзия/04/898 по биологическим свойствам и показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения.
Полученный штамм B/60/Малайзия/04/898 депонирован в коллекции вирусов ФГУН «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.A.Тарасевича Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Россия RU, 119002, город Москва, Сивцев-Вражек, дом 41) под №721
и имеет характеристики, представленные в паспорте штамма.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
Инфекционная активность штамма B/60/Малайзия/04/898 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 72 часов - 8,0 lg ЭИД50/0,2 мл. Гемагглютинирующая активность - 1:1024.
Штамм проявляет генетическую стабильность аттенуирующих мутаций и биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
ПАСПОРТ ШТАММА
1. Название штамма: B/60/Малайзия/04/898.
2. Серия: №1.
3. Метод получения: генетическая реассортация; характеристика родительских вирусов:
а) эпидемический вирус - B/Малайзия/2506/04;
б) донор аттенуации - B/СССР/60/69.
4. Количество пассажей: 7 в процессе реассортации.
5. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции: 32°C, 72 часов;
б) гемагглютинирующая активность: 1:1024;
в) инфекционная активность: 8,0 lg ЭИД50/0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам: ингибитороустойчив в РТГА с нормальной (неиммунной) сывороткой крови лошади;
д) разность в показателях инфекционной активности при 32°C и 38°C (температурочувствительный фенотип): 7,0 lg ЭИД50/0,2 мл;
е) разность в показателях инфекционной активности при 32°C и 25°C (холодоустойчивый фенотип): 2,5 lg ЭИД50/0,2 мл;
ж) структура генома рекомбинанта: гены от эпидемического вируса - НА, NA; гены от донора аттенуации - PA, PB1, PB2, NP, M, NS.
6. Характеристика штамма после лиофилизации:
a) объем материала в ампуле: 1,0 мл;
б) инфекционная активность: 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл;
в) гемагглютинирующая активность: 1:512.
7. Антигенная специфичность:
а) гемагглютинина - идентичен эпидемическому вирусу B/Малайзия/2506/04 по данным РТГА с крысиной антисывороткой;
б) нейраминидазы - идентична эпидемическому вирусу B/Малайзия/2506/04 по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.
8. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении: безвреден.
9. Бактериологический контроль: стерилен.
10. Контроль на посторонние вирусы: посторонние вирусы отсутствуют.
ШТАММ B/60/МАЛАЙЗИЯ/04/898 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ
Пример 1. При вакцинации 54 взрослых человек интраназально реассортантным вакцинным штаммом B/60/Малайзия/04/898 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл слабые температурные реакции (до 37,5°C) наблюдались у одного человека (1,9%), сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°C и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°C не наблюдалось. Катаральные явления (насморк, гиперемия зева и боль в горле) были отмечены у двух человек (3,8%). Результаты обследования приведены в табл.3.
В получившей плацебо группе из 52 лиц сильных и средних температурных реакций не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°C) отмечены у 2 человек (2,8%). Катаральные явления (насморк, гиперемия зева и боль в горле) отмечены в 1,9% случаев.
Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.
Таким образом, вакцинный штамм B/60/Малайзия/04/898 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.
ШТАММ B/60/МАЛАЙЗИЯ/04/898 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ
Пример 2. Группу из 50 детей в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом B/60/Малайзия/04/898 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД50/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 33 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в табл.4.
В группе привитых детей слабые температурные реакции (до 37,5°C) наблюдались у одного ребенка (2,0%), сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°C и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°C не наблюдалось. Катаральные явления (насморк, гиперемия зева и боль в горле) были отмечены у троих (6,0%).
В получившей плацебо группе сильных и средних температурных реакций не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°C) отмечены у 2 человек (6,1%).
Катаральные явления (насморк, гиперемия зева и боль в горле) отмечены также в 6,1% случаев.
Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм B/60/Малайзия/04/898 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.
На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа B/60/Малайзия/04/898 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.
Штамм вируса гриппа В/60/Малайзия/04/898, депонированный в ФГУН «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора) под №721, используемый для получения живой гриппозной интраназальной пандемической вакцины для взрослых и для детей.
