Вакцинный штамм вируса гриппа а/17/брисбен/07/1 (h3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии. Штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С. Характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса. Остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации. Штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) ареактогенен для взрослых и для детей при интраназальном введении. Может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости сезонным гриппом среди взрослых и детей; с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А/17/Брисбен/07/1 (H3N2). 1 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа типа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus A, А/17/Брисбен/07/1 (H3N2).

В результате появления в циркуляции нового дрейфового варианта - вируса гриппа А/Брисбен/10/07 (H3N2), известный вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) - прототип [патент РФ №2319744 от 19.04.06. - Опубл. БИ 2008. - №8] - утратил антигенную актуальность. Вследствие этого он не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной штаммами вируса гриппа, подобными А/Брисбен/10/07 (H3N2).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе современного эпидемического вируса А/Брисбен/10/07 (H3N2) для производства живой гриппозной вакцины. Вакцина должна быть пригодна для взрослых и для детей, то есть соответствовать нормативным требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения.

Целью изобретения было получение промышленно значимого и антигенно актуального реассортантного вакцинного штамма. Для его получения выбраны два родительских штамма вируса гриппа: эпидемический штамм вируса гриппа А/Брисбен/10/07 (H3N2) и безвредный для человека холодоадаптированный донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4. - С.387-395].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С.66-83].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), характеризующийся устаревшей антигенной структурой, был ранее получен из эпидемического вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука.- 1994.- 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку противовирусного иммунитета.

Главным в реассортации является получение штамма с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического (пандемического) штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, PB1, PA, NP, M, NS) - от безвредного донора аттенуации.

На основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и эпидемического штамма А/Малайзия/01/04 (H3N2) был создан вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) - прототип. Работа с иным эпидемическим штаммом требует подбора оптимальных условий реассортации, иного числа пассажей при отборе клонов, оптимизации методики их отбора и оценки их фенотипических свойств.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Брисбен/10/07 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) посредством одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 25°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены трехкратным клонированным методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (25°C) и оптимальной (33°C) температурах инкубации. Чистые клоны проверены по фенотипическим характеристикам (ts-, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали следующие методы:

а) Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена - гемагглютинина (НА) одному из родительских вирусов [Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУК 3.3.2.1758-03].

б) Метод рестрикционного анализа ДНК копий генов [Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J. Virol. Methods. - 1995. - Vol.52. - №1-2. - P.41-49], основанный на амплификации относительно коротких участков РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), но не для современных эпидемических вирусов гриппа. Обработку амплифицированных фрагментов ДНК производят специфическими рестриктазами с их последующим электрофорезом в 1,7-2,0%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида. Это позволяет четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к эпидемическому вирусу или донору аттенуации.

Антигенная характеристика вакцинного штамма. Полученный нами вакцинный штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) в РТГА идентичен эпидемическому вирусу А/Брисбен/10/07 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.

Рестрикционным методом установлено, что вакцинный штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) унаследовал второй из двух генов, кодирующих поверхностные белки - нейраминидазу (NA) - от эпидемического вируса А/Брисбен/10/07 (H3N2).

Формула генома. Формула генома 6:2 вакцинного штамма А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) подтверждена методом RT-PCR с помощью специфических праймеров. Вакцинный штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) унаследовал все шесть генов, кодирующих внутренние белки (PB1, PB2, PA, NP, M, NS), от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Доказательством получения вакцинного штамма с заданной формулой генома служат результаты рестрикционного анализа. На чертеже представлена рестрикция ДНК-копии фрагмента PA гена эндонуклеазой Bam HI. Слева направо - (1) ДНК маркер молекулярного веса; (2) кандидат в вакцинные штаммы А/17/Брисбен/07/1 (H3N2); (3) эпидемический вирус А/Брисбен/10/07 (H3N2); (4) донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); (5) ДНК маркер молекулярного веса. В РА гене донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) по сравнению с современными эпидемическими штаммами в позиции нуклеотида 107 имеется замена Т→С, приведшая к аминокислотной замене лейцина эпидемических вирусов на пролин у донора аттенуации, который имеет на этом участке сайт рестрикции для экзогенной рестриктазы Bam HI. У эпидемических вирусов этот рестрикционный сайт отсутствует.

Таким образом, обработка исследуемых фрагментов ДНК данным ферментом приводит к разрезанию амплифицированного участка гена РВ2 на два более мелких фрагмента, если он происходит от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). В случае РА гена от эпидемического вируса расщепление не происходит.

Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) представлены в табл.1.

Таблица 1.
Состав генома реассортантного вакцинного штамма А/17/Брисбен/07/1 (H3N2), полученного на основе эпидемического вируса А/Брисбен/10/07 (H3N2) и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
Ген	Принадлежность гена одному из родительских вирусов
Донор аттенуации	Эпидемический вирус	Вакцинный штамм
PB2	17	BR	17
PB1	17	BR	17
PA	17	BR	17
HA	17	BR	BR
NP	17	BR	17
NA	17	BR	BR
M	17	BR	17
NS	17	BR	17
ОБОЗНАЧЕНИЯ: 17 - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); BR - эпидемический вирус А/Брисбен/10/07 (H3N2).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Было показано, что вакцинный вирус является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°C и 40°C составляет 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°C и 25°C равна 3,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл), что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Оценку токсичности вакцинного штамма А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) определяли путем подкожного и внутрибрюшинного введения вирусного материала мышам. Для этого группе из 10 мышей (самцов линии СВА весом 18-20 грамм) вводили соответствующим способом 0,5 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл и оценивали патогенность вируса по проценту выживших мышей в течение 7 дней после введения вируса. Вакцинный штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) в эксперименте на мышах оказался полностью безвредным - 100% мышей выжили в течение всего периода наблюдения.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Брисбен/10/07 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека. Штамм аттенуирован и безвреден для мышей.

Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) ареактогенен для взрослых и для детей при интраназальном введении.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) по биологическим свойствам и показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения.

Полученный штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) депонирован в коллекции вирусов ФГУН "Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича" Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Россия RU, 119002, город Москва, Сивцев-Вражек, дом 41) под №788 и имеет характеристики, представленные в паспорте штамма.

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма: А/17/Брисбен/07/1 (H3N2)

2. Серия: №1

3. Метод получения: генетическая реасортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус: А/Брисбен/10/07 (H);

б) донор аттенуации: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

4. Количество пассажей: 7 в процессе реассортации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции: 32°C, 48 часов;

б) гемагглютинирующая активность: 1:512;

в) инфекционная активность: 8,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной (неиммунной) сывороткой крови лошади;

д) разность в показателях инфекционной активности при 33°C и 40°C (температурочувствительный фенотип): 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 33°C и 25°C (холодоустойчивый фенотип); 3,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

ж) структура генома рекомбинанта: гены от эпидемического вируса - НА, NA; гены от донора аттенуации - PA, PB1, PB2, NP, M, NS.

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) объем материала в ампуле: 1,0 мл;

б) инфекционная активность: 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

в) гемагглютинирующая активность: 1:128.

7. Антигенная специфичность

а) гемагглютинина: идентичен эпидемическому вирусу А/Брисбен/10/07 (H3N2) по данным РТГА с крысиной антисывороткой;

б) нейраминидазы: идентична эпидемическому вирусу А/Брисбен/10/07 (H3N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.

8. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении: безвреден.

9. Бактериологический контроль: стерилен.

10. Контроль на посторонние вирусы: посторонние вирусы отсутствуют.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 48 часов - 8,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:512.

Штамм проявляет генетическую стабильность аттенуирующих мутаций и биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

АРЕАКТОГЕННОСТЬ ШТАММА А/17/БРИСБЕН/07/1 (H3N2) ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ

Пример 1. При вакцинации 50 взрослых человек интраназально реассортантным вакцинным штаммом А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°C, средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°C, слабых температурных реакций (до 37,5°C), а также катаральных явлений не наблюдалось. Результаты обследования приведены в табл.2.

В получившей плацебо группе из 46 лиц сильных, средних и слабых температурных реакций не наблюдалось. Катаральные явления (насморк, гиперемия и боль в горле) отмечены в 4,3% случаев.

Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

АРЕАКТОГЕННОСТЬ ШТАММА А/17/БРИСБЕН/07/1 (H3N2) ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ

До 2004 года реассортантные вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей и для взрослых готовили на двух разных донорах аттенуации. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для взрослых готовили на доноре аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.], а вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей - на более аттенуированном доноре А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.]. В 2003 году Комитет медицинских иммунобиологических препаратов счел целесообразным рекомендовать «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую для взрослых» для иммунизации детей в возрасте 3-6 лет с внесением соответствующих изменений в «Инструкцию по применению» препарата [Инструкция по применению вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой сухой. Утверждена Главным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 16.06.2004].

В этой связи нами была изучена реактогенность вакцинного штамма А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) на детях.

Пример 2. Группу из 50 детей в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД₅₀/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 20 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в табл.3.

В группе вакцинированных детей сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°C, средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°C и слабых температурных реакций (до 37,5°C), а также катаральный явлений не было отмечено.

В получившей плацебо группе детей сильных, средних и слабых температурных реакций (до 37,5°C), а также катаральных явлений не наблюдалось.

Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.

Штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/07/1 (H3N2), депонированный в ФГУН «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора) под №788, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.