Способ анализа отпечатка с использованием масс-спектрометрии

Изобретение относится к области медицины. Для определения наличия остатка в отпечатке используют технику масс-спектрометрии с использованием матрицы. На отпечаток наносят порошок, содержащий гидрофобные частицы диоксида кремния, а также металл, нитрид металла, оксид металла или углерод. Средний диаметр частиц металла, нитрида металла, оксида металла или углерода, введенных в гидрофобные частицы диоксида кремния, предпочтительно составляет от 65 до 90 мкм или от 400 до 500 нм. Исследуемый отпечаток поднимают со своего места нанесения с использованием подъемной ленты и вводят в контакт с подложкой пробы масс-спектрометра, после чего на отпечаток наносят порошок. Порошок является магнитным или парамагнитным и дополнительно содержит флуоресцентную или окрашенную молекулу красителя. Масс-спектрометрию проводят с использованием матрицы, выбранной из группы, в которую входят MALDI-TOF-MS-MS или SALDI-TOF-MS-MS и их комбинации. Остаток представляет собой эндогенный остаток, в частности, эндогенный и/или экзогенный метаболиты и контактный остаток. При этом эндогенный метаболит представляет собой сквален, экзогенный метаболит представляет собой метаболит никотина, например котинин, а контактный остаток представляет собой наркотик - кокаин. Способ позволяет провести анализ остатка отпечатка непосредственно на отпечатке человека, что исключает его замену. 20 з.п. ф-лы, 14 ил.

 

Область техники

Настоящее изобретение имеет отношение к способу определения наличия остатка в отпечатке, с использованием техники масс-спектрометрии.

Уровень техники

Латентные отпечатки содержат различные соединения, такие как натуральные телесные соединения, например, холестерин, сквален и жирные кислоты [1-3], или соединения, которые могут оставаться в латентном отпечатке за счет контакта, например, с кокаином или другими наркотиками. Для изучения таких остатков до настоящего времени использовали спектроскопию комбинационного рассеяния [4, 5]. При проведении таких анализов возникает сложность, связанная с трудностью визуальной локализации наркотиков для проведения анализа, причем такой способ имеет низкую чувствительность и является относительно неспецифическим. Наиболее распространенным способом анализа латентных отпечатков является газовая хроматография - масс-спектрометрия (GC-MS). Ранее уже было показано, что остатки из латентных отпечатков могут быть экстрагированы в растворитель и проанализированы при помощи GC-MS [2, 3]. Такие соединения включают в себя сквален и холестерин, однако их уровни в латентных отпечатках варьируют, не только между субъектами (индивидуумами), но и во времени для одного и того же субъекта [3]. GC-MS также уже используют для обнаружения контактных остатков, таких как кокаин из обогащенных отпечатков, с пределом обнаружения около 300 мкг [6], и для обнаружения наркотиков и метаболитов из серийных пятен пота, до нанограммных уровней на одно пятно пота [7], и из слюны [8]. Однако все указанные здесь выше способы требуют использования сложных процедур экстракции ранее осуществления анализа.

Лазерная десорбционная/ионизационная с использованием матрицы время - пролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF-MS) была развита в конце 1980 годов исследователями Karas и Hillenkamp, и стала использоваться как техника анализа и определения точного молекулярного веса больших макромолекул, таких как протеины, полисахариды, нуклеиновые кислоты и синтетические полимеры, с высокой точностью измерения массы и с очень высокой чувствительностью. MALDI представляет собой "мягкий" процесс ионизации, который создает минимальную фрагментацию, и в котором энергия от лазера расходуется скорее на испарение матрицы, а не на разрушение макромолекулы. Однако MALDI-TOF-MS ранее не использовали для идентификации остатков, присутствующих в латентных отпечатках. MALDI-TOF-MS проводят также с использованием поверхностной лазерной десорбции/ ионизации (SALDI), когда графит, диоксид титана или диоксид кремния используют как матрицы взвеси для MALDI [9, 11].

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением предлагаются различные материалы, которые могут быть использованы при обнаружении и/или визуализации отпечатков. Эти материалы типично также могут быть использованы в качестве матричных агентов в различных техниках масс-спектрометрии. Таким образом, эти материалы имеют особые свойства, позволяющие использовать их как материалы "двойного назначения".

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предлагается способ определения наличия остатка в отпечатке, причем указанный способ включает в себя следующие операции:

i) нанесение на отпечаток порошка, содержащего материал, который способен (1) действовать как матричный агент или материал в технике масс-спектрометрии с использованием матрицы; и (2) содействовать обнаружению и/или визуализации отпечатка, чтобы образовать отпечаток с нанесенными на него частицами; и затем

ii) проведение масс-спектрометрии материала, образующего отпечаток с нанесенными на него частицами, чтобы обнаружить наличие или отсутствие остатка.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, способ предусматривает использование таких материалов, как, например, металлы, оксиды металлов, нитриды металлов и углерод, которые могут быть использованы (1) как агенты для визуализации отпечатков, сами по себе или в комбинации с носителем или при введении в носитель, например, носитель из диоксид кремния, и (2) как матрица для анализа отпечатков при помощи техники масс-спектрометрии с использованием матрицы. Технику масс-спектрометрии используют для определения наличия или отсутствия таких веществ, как одно или несколько эндогенных соединений или метаболитов, экзогенных соединений или метаболитов и/или контактных остатков, которые содержит отпечаток. В соответствии с одним из вариантов осуществления, технику масс-спектрометрии выбирают из группы, в которую входят (1) MALDI-TOF-MS и (2) SALDI-TOF-MS и (3) их комбинации.

Отпечатком, к которому применяют предложенный способ, может быть отпечаток, поднятый с поверхности с использованием подъемной ленты.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, порошок является гидрофобным, чтобы облегчить нанесение порошка на отпечаток и контакт порошка с ним.

Следует иметь в виду, что термин "отпечаток" включает в себя и частичный отпечаток и/или отпечаток не пальца, а другой части тела, причем, например, участок отпечатка, на который был нанесен порошок, может быть подвергнут масс-спектрометрии. Типично, отпечаток поднимают с лежащей под ним поверхности ранее проведения масс-спектрометрии, причем термин "отпечаток" включает в себя такие поднятые отпечатки. В соответствии с различными вариантами осуществления, отпечаток поднимают ранее нанесения порошка. Настоящее изобретение включает в себя способы, в которых операция ii) предусматривает проведение масс-спектрометрии порошка, который имеет приобретенный аналит из отпечатка. Настоящее изобретение также включает в себя способы, в которых операция (ii) предусматривает проведение масс-спектрометрии как материала отпечатка, так и порошка.

Следует иметь в виду, что термины "проба" и/или "аналит" в контексте настоящего изобретения могут означать отпечаток, пробу, взятую из отпечатка, и/или остаток, присутствующий на отпечатке или содержащийся в отпечатке.

В соответствии с некоторыми предлагаемыми здесь способами, отпечаток поднимают с поверхности и наносят на него порошок (обрабатывающий агент), до или после подъема, и затем поднятый отпечаток (по меньшей мере материал, содержащийся в отпечатке) помещают в устройство для масс-спектрометрии. В соответствии с другими способами, отпечаток делают (наносят) непосредственно на подложке пробы, и, после нанесения обрабатывающего агента на отпечаток, подложку пробы помещают в устройство для масс-спектрометрии.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, способ дополнительно предусматривает локализацию и/или визуализацию отпечатка и анализ отпечатка с использованием описанной здесь выше техники масс-спектрометрии, например, MALDI-TOF-MS и/или SALDI-TOF-MS.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предлагается способ определения наличия остатка в отпечатке, расположенном на поверхности, причем указанный способ включает в себя следующие операции:

i) нанесение на отпечаток обрабатывающего агента, например порошка, содержащего материал, выбранный из группы, в которую входят частицы металла, оксида металла, нитрида металла, углерода и их комбинации; и

ii) проведение масс-спектрометрии отпечатка для обнаружения наличия или отсутствия указанного остатка.

Как уже было указано здесь выше, настоящее изобретение имеет отношение к обнаружению, которое возможно включает в себя количественное определение остатков в отпечатках. Термин "остаток" относится к любому материалу, который хотят обнаружить, и в частности, относится к заранее выбранным соединениям. Остаток содержится или может содержаться в отпечатке, так что материал, который образует отпечаток, содержит или может содержать остаток.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, порошок является гидрофобным. В соответствии с одним классом способов, порошок может быть использован совместно с другими матричными агентами и/или с другими агентами обнаружения отпечатка.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ, который предусматривает обнаружение (1) эндогенно произведенного вещества, например протеинов, липидов, ДНК, пептидов и/или эндогенно полученных метаболитов, которые присутствуют как остаток, содержащийся в отпечатке; (2) экзогенного соединения или метаболита, который присутствует как остаток, содержащийся в отпечатке; и/или (3) контактного остатка, который присутствует на отпечатке или в отпечатке. Примеры типов остатков обсуждаются здесь ниже, причем они включают в себя, например (1) сквален и холестерин; (2) кокаин и его метаболиты и никотин и его метаболит и (3) баллистические остатки, например, от огнестрельного оружия и/или от взрывчатых веществ, и остатки от наркотиков, например кокаин.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, способ также позволяет обнаруживать контактные остатки, которые были осаждены на поверхности совместно с эндогенно произведенными соединениями (то есть с эндогенными метаболитами и/или с экзогенными метаболитами).

Описанный здесь способ типично не требует проведения сложных процедур экстракции ранее проведения анализа, как в известных ранее методиках, а также обеспечивает более низкие пороги обнаружения.

В одном классе способов стремятся определить наличие или отсутствие заданного вещества. В этом случае, исследуют спектр масс на наличие одного или нескольких пиков, связанных с известным веществом. В другом классе способов стремятся идентифицировать одно или несколько веществ в отпечатке, путем сравнения пиков в спектре масс с базой данных или с библиотекой пиков. Оба класса способов могут быть осуществлены в сочетании друг с другом.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, способ предусматривает обнаружение и/или идентификацию остатка, содержащегося в отпечатке, который был непосредственно нанесен на подложку (пластину) пробы MALDI-TOF-MS или SALDI-TOF-MS до нанесения порошка. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления, способ предусматривает обнаружение наличия или отсутствия остатка в отпечатке, который был поднят с поверхности с использованием подъемного средства, например подъемной ленты. Поверхностью может быть место отложения отпечатка, например, на месте совершения преступления. Способ может предусматривать контактирование поднятого отпечатка с подложкой пробы MALDI-TOF-MS или SALDI-TOF-MS, ранее нанесения порошка.

Способ альтернативно может предусматривать контактирование отпечатка с порошком ранее наложения на отпечаток подъемного средства, например подъемной ленты. В соответствии с одним из вариантов осуществления, поверхность сначала посыпают порошком, чтобы локализовать латентный отпечаток. Затем поднимают посыпанный порошком отпечаток с использованием подъемной ленты. Отпечаток, локализованный на подъемной ленте, затем наносят на пластину мишени (на подложку пробы) MALDI или SALDI, после чего проводят MS (масс-спектрометрический) анализ.

Типично, подложка пробы MALDI-TOF-MS или SALDI-TOF-MS представляет собой пластину, например, пластину из нержавеющей стали, которую используют в MS системе. Пластина может иметь углубление или множество углублений, в которые вводят пробу (то есть отпечаток, например поднятый отпечаток). В соответствии с одним из вариантов осуществления, отпечатки представляют собой полутвердые отложения (осадок) на липкой поверхности подъемной ленты.

Способ может быть использован качественно для определения наличия или отсутствия остатка и/или количественно для определения количества остатка. Более того, в соответствии с одним из вариантов осуществления, способ может быть использован для визуализации или формирования изображения отпечатка. Эта визуализация или формирование изображения являются важными, так как они позволяют идентифицировать "хозяина" отпечатка. Для облегчения визуализации отпечатка, частицы преимущественно содержат краситель, например флуоресцентный или цветной (окрашенный) краситель. Соответствующие красители известны специалистам в данной области, причем красителем может быть, например, родамин 6G.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается использование порошка, который содержит металл, оксид металла и/или углерод, для обнаружения остатка или остатков на отпечатке, при помощи техники масс-спектрометрии с использованием матрицы.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предлагается использование техники масс-спектрометрии с использованием матрицы для идентификации остатков, содержащихся в отпечатке. В частности, предлагается использовать технику MALDI-TOF-MS и/или SALDI-TOF-MS для обнаружения остатка в отпечатке. Остаток может быть эндогенным остатком (например, эндогенным веществом или метаболитом, например, это может быть сквален, или экзогенным метаболитом, например лекарством или метаболитом лекарства), и/или "контактным" остатком, например, баллистическими остатками от взрывчатых веществ или огнестрельного оружия. В соответствии с одним из вариантов осуществления, техника MALDI-TOF-MS и/или техника SALDI-TOF-MS может быть использована с использованием агентов визуализации отпечатка, чтобы обнаруживать (а в особенности визуализировать) отпечатки. В качестве типичных примеров агентов (визуализации) отпечатка можно привести алюминий, Magneta Flake и торговую белую пудру. В соответствии с одним из вариантов осуществления, подходящие матричные агенты используют в технике MALDI-TOF-MS/ SALDI-TOF-MS для содействия процессу десорбции/ ионизации. В качестве типичных примеров матричных агентов можно привести 2,5-дигидрокси бензойную кислоту (DHB или DHBA) и α-циано-4-гидроксикоричную кислоту (α-СНСА).

В соответствии с альтернативным вариантом осуществления, использование MALDI-TOF-MS и/или SALDI-TOF-MS предусматривает использование порошка, который содержит материал, выбранный из группы, в которую входят (1) металл; (2) оксид металла; (3) нитрид металла; и (4) углерод, в качестве матричного агента. Порошок может иметь дополнительные описанные здесь характеристики. Порошок типично также может быть использован как агент для обнаружения и/или визуализации отпечатка.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, отпечаток имеет содержащийся в нем остаток. В соответствии с одним из вариантов осуществления, порошок может быть использован в сочетании с другими матричными агентами или материалами (которые иногда называют агентами поддержки матрицы и/или агентами усиления матрицы).

В соответствии с одним из вариантов осуществления, использование дополнительно может предусматривать идентификацию остатка.

Подробное описание изобретения

В последующем описании изобретения и в формуле изобретения, слова "включает в себя" и "содержат" и их вариации, например "содержащий" и "включающий в себя", означают "включает в себя, но без ограничения" и не служат для ограничения (и не ограничивают) использованию других долей, добавок, компонентов, целых чисел или операций.

В последующем описании изобретения и в формуле изобретения, единственное число включает в себя множественное число, если только нет специального указания на иное. В частности, когда в английском тексте использован неопределенный артикль, в описании изобретения предусмотрено использование как единственного числа, так и множественного числа, если только иное не следует из контекста.

Следует иметь в виду, что признаки, целые числа, характеристики, соединения, химические компоненты или группы, описанные в соответствии со специфическим аспектом, вариантом или примером настоящего изобретения, применимы в любом описанном здесь другом аспекте, варианте или примере, если нет несовместимости с ним.

В описании настоящего изобретения различные его аспекты изложены в определенной последовательности. Однако следует иметь в виду, что эта последовательность приведена только для удобства и не имеет ограничительного характера. Таким образом, диапазон описания включает в себя все возможные поддиапазоны и индивидуальные номера.. Например, описание в диапазоне от 1 до 6 включает в себя специфические поддиапазоны от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также индивидуальные номера в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применимо вне зависимости от ширины диапазона. Также следует иметь в виду, что диапазоны в описании включают в себя специфически раскрытую комбинацию концевых точек.

Способ

Настоящее изобретение имеет отношение к использованию масс-спектрометрии в (при) анализе остатка отпечатка. В частности, настоящее изобретение имеет отношение к использованию техники масс-спектрометрии с использованием матрицы, например, MALDI-TOF-MS и/или SALDI-TOF-MS, в анализе остатков отпечатка.

Как уже было указано здесь выше, термин "остаток" относится к любому материалу, который хотят обнаружить, а в частности, к заранее заданным соединениям. Остаток находится или может находиться внутри отпечатка, то есть материал, который образует отпечаток, содержит или может содержать остаток.

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, предлагается способ определения наличия остатка на отпечатке, причем способ предусматривает (i) нанесение порошка на отпечаток, при этом порошок имеет следующие свойства: (1) он подходит для использования как матричный агент в технике масс-спектрометрии с использованием матрицы, и (2) он подходит для использования как агент обнаружения и/или визуализации отпечатка; и (ii) проведение масс-спектрометрии отпечатка, для обнаружения наличия или отсутствия указанного остатка.

Преимущественно, порошок является гидрофобным. В соответствии с настоящим изобретением также предлагаются способы анализа гидрофобной подложки при помощи масс-спектрометрии с использованием матрицы, отличающиеся тем, что матрица является гидрофобной. В соответствии с одним из вариантов осуществления, способ предусматривает, например, ранее проведения операции (ii), приготовление по меньшей мере одного поверочного стандарта для использования при калибровке техники масс-спектрометрии. В соответствии с одним из вариантов осуществления, способ предусматривает анализ результатов операции (ii), например, чтобы определить, что специфический остаток (например, никотин) присутствует в отпечатке.

Как уже было указано здесь выше, специалисты легко поймут, что термин "отпечаток" включает в себя частичный отпечаток и/или отпечатки не пальца, а других частей тела, причем, например, участок отпечатка, на который был нанесен порошок, может быть использован для осуществления масс-спектрометрии. Типично, отпечаток поднимают с поверхности до проведения масс-спектрометрии, причем термин "отпечаток" соответственно включает в себя поднятые отпечатки. В соответствии с вариантами осуществления, отпечаток поднимают до нанесения порошка. В соответствии с настоящим изобретением предлагаются способы, в которых операция ii) предусматривает выбор порошка для масс-спектрометрии. В соответствии с настоящим изобретением также предлагаются способы, в которых операция (ii) предусматривает проведение масс-спектрометрии как отпечатка, так и порошка. В одном классе способов операция (i) предусматривает погружение объекта, на котором имеется или может иметься отпечаток, в жидкую среду, содержащую порошок. Время погружения не является критическим и может составлять ориентировочно от 15 минут до 12 часов или больше. Отпечаток затем может быть поднят с объекта с использованием подъемной ленты.

Следует иметь в виду, что термины "проба" и/или "аналит" в контексте настоящего изобретения могут означать отпечаток, и/или остаток, присутствующий на отпечатке или содержащийся в отпечатке, осажденном непосредственно или, альтернативно, поднятом с поверхности с использованием подъемного средства, например, подъемной ленты.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, технику масс-спектрометрии выбирают из группы, в которую входят MALDI-TOF-MS и SALDI-TOF-MS. Кратко, MALDI-TOF-MS требует перемешивания проб с молекулами матрицы и нанесения матричного материала на пробу. Мишень MALDI вводят в источник ионов масс-спектрометра, который находится под высоким вакуумом. Сильное электрическое поле создают между пробой и экстракционной пластиной (пластинами). Луч лазера направляют на пробу, в результате чего происходит десорбция за счет поглощения лазерной энергии молекулами матрицы.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предлагаются способы, в которых используют материал, который может быть использован как матричный материал в технике MALDI-TOF-MS и/или SALDI-TOF-MS. Не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, все же можно сказать, что порошок содержит материал, который может поглощать энергию лазера и передавать ее аналиту, который содержится в пробе. В соответствии с настоящим изобретением, аналит типично представляет собой вещество, образующее остаток или остатки в отпечатке. Передача энергии аналиту приводит к ионизации аналита и к ускорению через масс-спектрометр. Когда MALDI-TOF-MS используют указанным образом, то есть с передачей ионов пробе (аналиту), это называют положительным ионным обнаружением.

В соответствии с вариантом осуществления, может происходить передача электронов из аналита в порошок. В этом варианте, MALDI-TOF-MS (или SALDI-TOF-MS) работает в режиме отрицательной ионизации.

Если полагают, что проба (например, остаток или заподозренный остаток на или в отпечатке) имеет функциональные группы, которые легко принимают протон (Н⁺), то тогда может быть использовано положительное ионное обнаружение. Если полагают, что проба (например, остаток или заподозренный остаток на или в отпечатке) имеет функциональные группы, которые легко теряют протон, тогда может быть использовано отрицательное ионное обнаружение.

Способ позволяет определять наличие (i) эндогенных остатков, например, эндогенных метаболитов и экзогенных метаболитов и (ii) контактных остатков, содержащихся в отпечатке. Эндогенные метаболиты и "контактные" остатки могут быть совместно осаждены в отпечатке. Способ может дополнительно предусматривать идентификацию остатка.

Один класс способов может быть использован для обнаружения и/или идентификации эндогенных остатков, например, остатков, которые были получены в результате метаболизма вещества телом человека. Эндогенные остатки могут содержать эндогенные метаболиты (например, метаболиты молекул, произведенных телом человека) или экзогенные метаболиты (например, метаболиты молекул, проглоченных или перенесенных в тело и затем метаболизированных телом).

Другими примерами эндогенных остатков, которые могут быть идентифицированы при помощи предлагаемого способа, являются, например, эндогенные вещества (например, сквален, холестерин, парафины и эфиры, стероиды, например, эстрогены и тестостерон и маркеры пола и здоровья), которые могут выделяться через поры кожи и осаждаться вместе с другими химикатами в отпечатке. Способ также может быть использован для обнаружения метаболитов и конъюгатов упомянутых выше веществ. Примерами эндогенных остатков также являются экзогенные метаболиты, например лекарство и его метаболиты, и наркотик и его метаболиты, прописанные лекарства и метаболиты и соединения, производные от источников питания или продуктов их распада. Способ также может быть применен для протеомного (proteomic) или геномного анализа клеток (например, клеток кожи) или ДНК, соответственно, находящихся в проявленном отпечатке. Способ также может быть использован для обнаружения других контактных остатков, например наркотиков, взрывчатого материала, например материала, используемого при производстве бомб, и остатка от использования огнестрельного оружия.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предлагается использование техники MALDI-TOF-MS и/или SALDI-TOF-MS для обнаружения и/или идентификации остатка, который содержится в отпечатке. Остаток может быть эндогенным остатком и/или "контактным" остатком, например, баллистическими остатками, например, от взрывчатых веществ или огнестрельного оружия. В соответствии с одним из вариантов осуществления, остаток может быть "контактным" остатком, то есть остатком, который был перенесен на руку человека за счет контакта с веществом и затем перенесен на поверхность за счет отпечатка пальцев. Обнаружение таких остатков представляет особый интерес для правоохранительных органов и может служить критическим доказательством при судебном рассмотрении. В соответствии с одним из вариантов осуществления, порошок, который содержит материал, выбранный из группы, в которую входят металл, оксид металла, углерод и их комбинации, используют для контакта с отпечатком, причем он действует как матрица в MALDI-TOF-MS устройстве.

В соответствии с альтернативным вариантом осуществления, отпечаток может быть введен в контакт с агентом проявления отпечатка, который используют для обнаружения отпечатков. В качестве примеров подходящих агентов проявления отпечатка можно привести алюминий, Magneta Flake и торговую белую пудру. В способе затем типично используют MALDI-TOF-MS матричный агент, например, DHBA (2,5-дигидрокси бензойную кислоту) или α-циано-4-гидроксикоричную кислоту (α-СНСА), или другой матричный агент, которым может быть, например, описанный здесь порошок.

Способ в соответствии с настоящим изобретением может быть использован для анализа различных остатков, которые могут быть найдены на отпечатке. Так, в соответствии с одним из вариантов осуществления, способ может быть использован для проявления и анализа латентных отпечатков, оставленных курильщиками. Твердо установлено, что никотин сильно метаболизируется в котинин in vivo (в живом организме) [22], причем известно, что как никотин, так и котинин выделяются вместе с потом [8]. На фиг.11 и 12 показано, что описанный здесь порошок, а в частности, гидрофобные частицы диоксида кремния, содержащие вещество, выбранное из группы, в которую входят металл, нитриды металлов, оксиды металлов и углерод, могут быть использованы как проявители для визуализации латентных отпечатков, полученных от курильщиков, причем такие отпечатки могут быть проанализированы при помощи MALDI-TOF-MS, непосредственно на подходящей поверхности или после подъема с поверхности, чтобы обнаружить никотин и/или его метаболиты.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, описанный здесь способ может быть использован для обнаружения или определения того, что человек имел дело с наркотиками или потреблял наркотики, например кокаин. В соответствии с другими вариантами осуществления, описанный здесь способ может быть использован как часть персонального скрининга для определения того, что человек является, например, курильщиком или принимает наркотики, например кокаин.

Несмотря на то что описанный здесь способ может быть использован для идентификации наличия специфического остатка на или в отпечатке человека, эти результаты не обладают высшим уровнем точности и поэтому могут быть неприемлемыми в соответствии со стандартами, применяемыми, например, в уголовных судах. В таком случае, например, когда способ осуществляют для получения доказательства для суда, он может дополнительно предусматривать проведение тандемной масс-спектрометрии, то есть осуществление дополнительной техники масс-спектрометрии, типично, чтобы получить структурную информацию относительно соединения, присутствующего в остатке в отпечатке.

Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления, способ предусматривает проведение MALDI-TOF-MS-MS и/или SALDI-TOF-MS-MS для отпечатка и/или порошка. При проведении MALDI-TOF-MS-MS/ SALDI-TOF-MS-MS типично фрагментируют ионы специфической пробы внутри масс-спектрометра и за счет этого получают дополнительную структурную информацию относительно остатка. Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления, способ предусматривает идентификацию полученных фрагментных ионов. Эта структурная информация может быть использована в некоторых ситуациях, например, как свидетельство в суде.

Способ и виды использования, описанные здесь, могут быть использованы в различных приложениях. В соответствии с одним из вариантов осуществления, способы и виды использования могут быть использованы как часть процесса персонального скрининга для служащих, например, чтобы определить, курит ли человек или принимает наркотики. В соответствии с одним из вариантов осуществления, способы и виды использования могут быть использованы как часть процесса "проверки на наркотики", например, в области профессионального или любительского спорта.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, описанный здесь способ может быть использован для обнаружения контактных остатков или эндогенных остатков, которые содержат запрещенные вещества и/или их метаболиты. В частности, способ может быть использован для проверки спортсменов в области профессионального или любительского спорта и/или при выборочных испытаниях на наличие или отсутствие запрещенных веществ в остатке, взятом из отпечатка человека. Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с используемыми в настоящее время способами является то, что анализ проводят непосредственно на отпечатке человека и поэтому замена пробы невозможна, в отличие от используемых в настоящее время способов, в которых исследуют пробы мочи и слюны.

Устройства MALDI-TOF-MS и/или SALDI-TOF-MS ранее не применяли для обнаружения и/или идентификации остатка на отпечатке, поэтому использование этих техник для обнаружения и/или идентификации остатка на отпечатке является частью настоящего изобретения. Это использование может предусматривать контактирование порошка с отпечатком, как уже было указано здесь выше. Альтернативно, использование может предусматривать контактирование обычного агента обнаружения с отпечатком. В соответствии с этим вариантом осуществления, дополнительно может быть использован матричный агент, который обычно применяют в масс-спектрометрии.

Альтернативно, описанный здесь ранее порошок может быть использован как матричный агент при проведении масс-спектрометрии.

Способы и виды использования в соответствии с настоящим изобретением также могут быть использованы в пограничных пунктах для проверки путешественников на наличие остатков, которые могут свидетельствовать о применении наркотиков или обращении (контакте) с ними, а также о контакте с огнестрельным оружием и боеприпасами.

Как уже было указано здесь выше, предложенные способы могут быть использованы как свидетельство в суде, например, как свидетельство контакта с наркотиками или боеприпасами в уголовном суде.

Порошок

В соответствии с настоящим изобретением предлагается использовать порошок, который вводят в контакт с отпечатком, который затем может быть использован в технике масс-спектрометрии для определения наличия остатка на отпечатке.

Порошок преимущественно содержит материал, выбранный из группы, в которую входят металл, нитрид металла, оксид металла, углерод и их комбинации.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, порошок может содержать гидрофобные частицы диоксида кремния. Один класс гидрофобных частиц диоксида кремния получают в соответствии со следующим способом:

Предлагается способ (обозначенный способ А) приготовления гидрофобных частиц диоксида кремния, который предусматривает вступление в реакцию в единственной операции смеси (1) мономеров эфира силана, например, алкоксисилана, и (2) органическое замещение мономеров эфира силана, например, модифицированного фенилом силиката, агентом гидролиза, например, щелочью.

Таким образом, способ типично предусматривает использование мономеров алкоксисилана. Способ может предусматривать использование тетраалкоксисиланов (TAOS). TAOS выбирают из TEOS (тетраэтоксисилан) или TMOS (тетраметоксисилан).

В соответствии с одним из вариантов осуществления, смесь дополнительно содержит смешиваемый с водой растворитель, например этанол, а также воду. Способ может быть осуществлен при температуре окружающей среды. Длительность реакции не является критической. Реакция между мономерами TAOS и мономерами PTEOS может протекать в течение ночи или в течение эквивалентного промежутка времени, что составляет ориентировочно от 12 до 18 часов. Время реакции оказывает влияние на размер полученных частиц диоксида кремния. Можно полагать, что чем скорее будет остановлена реакция, тем мельче будут образованные частицы. Поэтому реакцию следует проводить в течение периода менее 12 часов, например, в течение периода от 6 до 12 часов. Реакция альтернативно может продолжаться более 18 часов. По желанию, температура может быть повышена (или снижена) и время реакции уменьшено (или увеличено).

Агент гидролиза, которым типично является щелочь, действует как катализатор во время реакции. Преимущественно, этот катализатор представляет собой гидроксид, например гидроксид аммония. Катализатором вместо этого может быть кислота. В качестве примеров подходящих кислот можно привести неорганические кислоты, например соляную кислоту. В этом способе реакция представляет собой возбуждаемый кислотой гидролиз.

Мономер эфира силана, например TAOS, и органически замещенный мономер эфира силана, например, PTEOS, могут быть использованы, например, при отношениях (PTEOS:TAOS) от 2:1 до 1:2, например, от 4:3 до 3:4, и, в частности, от 1.2:1 до 1:1.2. В одном классе способов, отношение составляет по меньшей мере около 1:1, например, до 1:5, например, 1:2. В одном классе способов, отношение PTEOS:TAOS преимущественно составляет 1:1 по объему. Следует иметь в виду, что при замене одного или обоих TAOS и PTEOS на другие реагенты, могут быть использованы аналогичные отношения.

Гидрофобные частицы диоксида кремния, полученные по указанному способу, преимущественно являются наночастицами, то есть имеют средний диаметр ориентировочно от 200 нм до 900 нм, а типично ориентировочно от 300 нм до 800 нм, в частности, от 400 нм до 500 нм. Эти наночастицы затем могут быть подвергнуты обработке, чтобы образовать микрочастицы, которые можно считать сросшимися наночастицами. Микрочастицы могут быть получены с использованием способа, который, например, включает в себя следующие операции:

i) центрифугирование взвеси частиц;

ii) перевод взвеси гидрофобных частиц диоксида кремния в водную фазу;

iii) экстрагирование взвеси из водной фазы в органическую фазу;

iv) испарение органической фазы; и

v) измельчение и просеивание продукта, полученного в операции (iv).

Органическая фаза преимущественно представляет собой органический растворитель, который является неполярным или имеет низкую полярность. Органической фазой может быть дихлорметан или другой органический растворитель, например алканы, такие как гексан, толуол, этилацетат, хлороформ и диэтиловый эфир.

Альтернативно, гидрофобные частицы диоксида кремния могут быть получены из продукта реакции, содержащего гидрофобные наночастицы диоксида кремния, с использованием способа, который включает в себя следующие операции:

(a) центрифугирование продукта реакции;

(b) промывка продукта реакции жидкостью.

Способ может предусматривать повтор операций (а) и (b) много раз. Преимущественно, жидкостью является смесь растворителя с водой, а типично водно-органическая смесь растворителя. Типично, органическим растворителем является этанол. Преимущественно, исходная жидкость содержит смесь воды и органического растворителя при отношении от 60 (вода):40 (растворитель) до 40:60, по объему. В соответствии с другими вариантами осуществления, растворителем может быть, например, диметилформамид, н-пропанол или изо-пропанол.

Типично, пропорцию растворителя в смеси повышают между начальной промывкой (b) и окончательной промывкой взвеси. Для получения микрочастиц, которые представляют собой сросшиеся наночастицы, готовую взвесь сушат. Затем микрочастицы могут быть просеяны. После просеивания, микрочастицы готовы для нанесения на отпечаток в качестве проявляющего агента, например, в операции (i) предложенного здесь способа, для обнаружения остатка в отпечатке.

Микрочастицы можно считать агрегатами более мелких наночастиц диоксида кремния. В соответствии с этим вариантом осуществления, микрочастицы имеют достаточно большой размер, позволяющий их эффективно захватывать с использованием лицевых масок и, следовательно, не проглатывать. Так, в соответствии с одним вариантом осуществления, микрочастицы диоксида кремния имеют средний диаметр по меньшей мере 10 мкм, а типично по меньшей мере 20 мкм. Типично, микрочастицы имеют средний диаметр около 30-90 мкм. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, микрочастицы имеют средний диаметр около 45-65 мкм или ориентировочно от 65 до 90 мкм. В частности, порошок, содержащий микрочастицы, может быть сухим порошком.

В одном классе способов, порошок содержит гидрофобные наночастицы диоксида кремния. Гидрофобные наночастицы диоксида кремния могут быть выделены с использованием способа, который предусматривает центрифугирование продукта реакции из способа А и суспендирование его в смеси воды и растворителя. Смесь воды и растворителя представляет собой первую смесь и преимущественно представляет собой смесь 50:50. Способ может дополнительно предусматривать удаление продукта реакции из первой смеси воды и растворителя, центрифугирование его и суспендирование его во второй смеси воды и растворителя. Преимущественно, вторая смесь воды и растворителя имеет аналогичную первой смеси пропорцию растворителя и воды. Растворителем в смеси воды и растворителя является, например, смешиваемый с водой растворитель, например этанол. Альтернативно, может быть использован диметилформамид, н-пропанол или изо-пропанол.

Операция суспендирования продукта реакции в смеси воды и растворителя может быть повторена много раз. Преимущественно, композицию смеси воды и растворителя изменяют для того, чтобы увеличить пропорцию растворителя в смеси в ходе повторных операций суспендирования. Преимущественно, способ предусматривает, в конечной операции, суспендирование продукта реакции в смеси воды и растворителя, которая содержит около 0% воды и 100% растворителя. Полное число операций суспендирования типично составляет от 3 до 10, например, 4, 5, 6, 7, 8 или 9. Типично, после каждой операции суспендирования, кроме конечной операции суспендирования, взвесь центрифугируют. Наночастицы могут храниться в конечной этанольной суспензии. Следует иметь в виду, что центрифугирование представляет собой только один примерный способ выделения наночастиц из смеси воды и растворителя, так что не исключено использование и других подходящих технологий выделения наночастиц.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, порошок содержит гидрофобные наночастицы диоксида кремния. Одним классом порошка является взвесь гидрофобных наночастиц диоксида кремния во флюиде. Флюидом может быть этанольная водная суспензия. Альтернативно, вместо этанола в суспензии могут быть использованы и другие органические растворители, например, диметилформамид, н-пропанол или изо-пропанол.

Физическая природа и размеры частиц, образующих порошок, могут быть определены с использованием РЭМ и ПЭМ микроскопов. Частицы имеют вид аморфных частиц диоксида кремния, которые обычно используют как антипригарную присадку для различных пищевых продуктов, а также как антипригарную присадку и как наполнитель в фармацевтике при приготовлении различных лекарств и витаминов [12].

Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, порошок, который содержит наночастицы, наносят на отпечаток или на поверхность в соответствующей жидкой среде. Типично, жидкой средой является смесь водного компонента с растворителем. Растворителем может быть смешиваемый с водой растворитель. В соответствии с одним из вариантов осуществления, водным компонентом является вода. Растворителем может быть, например, смешиваемый с водой растворитель, то есть растворитель, на 100% смешиваемый с водой при всех пропорциях. В соответствии с одним из вариантов осуществления, растворителем является этанол. Отношение воды к растворителю лежит в диапазоне ориентировочно от 99.9:0.1 до 96:4. Содержание растворителя преимущественно ориентировочно не превышает 4%, так как более высокие уровни растворителя могут приводить к растворению отпечатков или к снижению разрешающей способности. Преимущественно используют по меньшей мере следовые количества растворителя, чтобы наночастицы оставались дискретными и не слипались для образования агрегатов.

Альтернативно, порошок, содержащий гидрофобные частицы диоксида кремния, может быть получен с использованием традиционных методик (см., например, публикацию Тарес et al., NanoSci. Nanotech. 2002. Vol.2. No.3/4 pp.405-409. E.R.Menzel, S.M. Savoy, S.J.Ulvick, K.H.Cheng, R.H.Murdock and M.R.Sudduth, Photoluminescent Semiconductor Nanocrystals for Fingerprint Detection, Journal of Forensic Sciences (1999) 545-551; and E.R.Menzel, M. Takatsu, R.H.Murdock, K.Bouldin and K.H.Cheng, Photoluminescent CdS/Dendrimer Nanocomposites for Fingerprint Detection, Journal of Forensic Sciences (2000) 770-773).

В соответствии с одним из вариантов осуществления, порошок содержит гидрофобные частицы диоксида кремния, в которые введен краситель. В соответствии с одним из вариантов осуществления, красителем, который введен в частицы, является, например, цветной или флуоресцентный краситель. В качестве примеров подходящих красителей можно привести (но без ограничения) производные флуоресцеина, например, Oregon Green, Tokyo Green, SNAFL и карбоксинафто флуоресцеин, родамин (например, родамин В и родамин 6G) и их аналоги, тиазол оранж, оксазин перхлорат, метиленовый синий, базовый желтый 40, базовый красный 28, а также кристалл виолет и его аналоги. Не желая связывать себя какой-либо конкретной научной теорией, все же можно полагать, что красители, которые заряжены положительно, например, родамин, могут быть лучше введены в частицы, когда в способе используют PTEOS, чем красители, которые содержат анионную или катионную группу, такую как карбоксильные группы. В качестве примеров других красителей, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, можно привести красители, которые имеют планарную ароматическую субструктуру и положительно заряженные функциональные группы (например, этидиум бромид и другие встроенные в ДНК агенты).

Частицы преимущественно могут быть магнитными или парамагнитными. Например, намагничиваемые микрочастицы могут быть легко насыпаны на отпечатки, с использованием магнитного щупа или другого подходящего инструмента. Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, магнитные или парамагнитные субчастицы вводят в гидрофобные частицы диоксида кремния. В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, частицы являются намагничиваемыми, например, магнитными или парамагнитными. Магнитные или парамагнитные частицы могут содержать любой магнитный или парамагнитный компонент, например, металлы, нитриды металлов, оксиды металлов и углерод. В качестве примеров магнитных металлов можно привести железо, в то время как оксидами металлов могут быть магнитит и гематит.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, углерод представляет собой углеродную сажу, углеродные наночастицы, фуллереновое соединение или графит, а также их аналоги. Фуллереновое соединение содержит по меньшей мере 60 атомов углерода (например, С₆₀). Преимущественно, углерод имеет вид углеродных наночастиц. Углеродные наночастицы могут быть в виде, например, углеродных нанотрубок (производных или не производных). Углеродные нанотрубки могут быть нанотрубками с множеством стенок или с одной стенкой.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, оксид металла выбирают из группы, в которую входят диоксид титана (TiO₂), магнетит, гематит и их комбинации. В соответствии с одним из вариантов осуществления, металл выбирают из группы, в которую входят алюминий, железо и их комбинации. Однако следует иметь в виду, что в альтернативных вариантах осуществления, специалисты в данной области могут использовать другие оксиды металлов и/или нитриды металлов, которые способствуют процессу десорбции/ ионизации MALDI-TOF-MS и/или SALDI-TOF-MS. Аналогично, специалисты в данной области могут использовать в порошке другие металлы и/или формы углерода, которые способствуют процессу ионизации. Металл, оксид металла, нитрид металла или углерод могут быть введены в частицы порошка. Частицы порошка преимущественно имеют средний диаметр ≤100 мкм, например диаметр ≤1 мкм. В соответствии с одним из вариантов осуществления, частицы имеют средний диаметр ориентировочно от 10 нм до 100 мкм.

Гидрофобность частиц диоксида кремния усиливает сцепление частиц с отпечатком. Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления, металл, оксид металла и углерод вводят и/или встраивают в гидрофобные частицы диоксида кремния.

В тех способах, в которых используют отпечаток, порошок и отпечаток вводят в контакт друг с другом. Следует иметь в виду, что термин "отпечаток" в этом контексте может означать, например, отпечаток, осажденный на поверхности, или, альтернативно, "косвенный" отпечаток, который был поднят с поверхности с использованием обычного подъемного средства, например, с использованием подъемной ленты.

Нанесение порошка может быть осуществлено с использованием магнитного щупа, причем в этом варианте осуществления порошок является магнитным или парамагнитным. Это является более безопасным, так как снижает воздействие порошка на человека, который может его вдыхать. Альтернативно, объект, на котором находится отпечаток, может быть погружен в жидкую среду (то есть во взвесь наночастиц). Время погружения не является критическим и может составлять ориентировочно от 15 минут до 12 часов или больше.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, порошок содержит гидрофобные частицы диоксида кремния, которые содержат намагничиваемые частицы, как уже было указано здесь выше.

Один класс порошка содержит гидрофобные частицы диоксида кремния. Частицы могут быть наночастицами или микрочастицами, или их комбинацией. В соответствии с одним из вариантов осуществления, микрочастицы диоксида кремния имеют средний диаметр по меньшей мере 10 мкм, а типично по меньшей мере 20 мкм. Типично, микрочастицы имеют средний диаметр около 30-90 мкм. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, микрочастицы имеют средний диаметр ориентировочно от 45-65 мкм до 65-90 мкм.

Полагают, что наночастицы, которые имеют средний диаметр ориентировочно от 200 нм до 900 нм, могут быть использованы в предлагаемых способах.

Преимущественно, наночастицы имеют средний диаметр ориентировочно от 400 до 500 нм. Однако полагают, что в предложенном здесь способе может быть использован порошок, содержащий наночастицы, имеющие средний диаметр ориентировочно от 200 нм до 900 нм, например, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или 900 нм.

Термин "средний диаметр" относится к среднему диаметру частиц, типично образованных по способам в соответствии с настоящим изобретением. Термин "средний" представляет собой статистический термин, который получают делением суммы всех измеренных диаметров на число частиц, использованных в таких измерениях. Диаметры наночастиц определяют по РЭМ снимкам с использованием шкал (линеек), а диаметры микрочастиц определяют с использованием комбинации размера сит, результатов измерений гранулометрического состава и РЭМ снимков. Одним из путей определения среднего диаметра является определение с использованием прибора Malvern Mastersizer (фирма Malvern Instruments Ltd.).

В соответствии с одним из вариантов осуществления, порошок может содержать смесь (1) гидрофобных частиц диоксида кремния, описанную здесь выше, и (2) магнитных или парамагнитных частиц, например частиц железа.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, порошок содержит гидрофобные частицы диоксида кремния, которые дополнительно содержат молекулу, которая помогает при визуализации и/или формировании изображения отпечатка. В соответствии с одним из вариантов осуществления, гидрофобная частица диоксида кремния содержит молекулу красителя. В качестве примеров красителей можно привести родамин, например, родамин 6G и его производные. Операция визуализации отпечатка может быть проведена с использованием различных известных методик. Например, могут быть использованы оптические методы, в том числе сканер с УФ поисковым лучом, оптический сканер с плоскостной разверткой, флуоресцентный сканер и сканер в УФ и видимой области спектра.

Примеры

Варианты настоящего изобретения будут описаны далее в качестве примера, со ссылкой на сопроводительные чертежи.

На фиг.1 показаны результаты флуоресцентного сканирования отпечатков, нанесенных на предметное стекло и поднятых с него с использованием родамина 6G (Rh.6G) в качестве контактного агента (λех 543 нм, λеm 590 нм).

На фиг.1а показаны латентные отпечатки пальцев на предметном стекле микроскопа. Вверху и внизу отпечатки с родамином 6G, в центре пустой контроль.

На фиг.1b показаны отпечатки пальцев фиг.1а, проявленные с использованием порошка "Sunderland White" (гидрофобные частицы диоксида кремния с введенным в них TiO₂).

На фиг.1с показан остаток (следы) от отпечатков фиг.1b после их подъема с использованием имеющейся в продаже ленты для подъема отпечатков.

На фиг.1d показаны поднятые отпечатки с фиг.1b на имеющейся в продаже подъемной ленте.

На фиг.2 показаны спектры масс родамина 6G, осажденного из этанола (более высокий), и родамина 6G из поднятого отпечатка (более низкий), причем оба спектра проанализированы на ленте MALDI (внизу).

На фиг.3 показан отклик системы MALDI-TOP-MS на частицы диоксида кремния с введенной в них углеродной сажей, в присутствии и отсутствии гидрохлорида кокаина.

На фиг.4 показано сравнение матричного материала для обнаружения кокаина на обогащенных отпечатках, нанесенных непосредственно на металлическую пластину MALDI-TOF-MS с использованием 2,5-дигидрокси бензойной кислоты (DHB) при концентрации 10 мг/мл, причем верхняя кривая была получена с использованием магнитных гидрофобных частиц диоксида кремния.

На фиг.4а приведено сравнение матричного материала для обнаружения кокаина на обогащенных отпечатках, нанесенных непосредственно на металлическую пластину MALDI-TOF-MS. Нижняя кривая была получена с использованием DHB при концентрации 10 мг/мл, а верхняя кривая была получена с использованием магнитных гидрофобных частиц диоксида кремния.

На фиг.4b показаны спектральные интенсивности при m/z 304.5, для отпечатков, осажденных на металлических пластинах мишеней и посыпанных тремя порошками, в присутствии и отсутствии кокаина.

На фиг.5 показаны спектры масс поднятых латентных отпечатков, посыпанных гидрофобными частицами диоксида кремния с введенным ТiO₂, чтобы обнаружить контакт с кокаином. Положительный контакт показан на верхней кривой, а отсутствие контакта с кокаином показано на нижней кривой.

На фиг.6 приведен фотоснимок единичного углубления/ единичной ячейки на поверхности, имеющей 96 углублений пластины MALDI, расположенной в масс-спектрометре, где можно видеть деталь выступа (светлые полосы) поднятого отпечатка, предварительно посыпанного гидрофобными частицами диоксида кремния с введенным ТiO₂, до проведения анализа с использованием MALDI-TOF-MS.

На фиг.7 показаны относительные интенсивности при m/z 433.55 (молекулярный ион для сквалена плюс аддукт натрия) для поднятых отпечатков, посыпанных 10 составами гидрофобных частиц (1-10), и для контролей (11 и 12). Не наблюдали никаких пиков при m/z 386 за счет холестерина.

На фиг.8 показаны относительные интенсивности при m/z 433.55 (сквален, вес формулы 410.72, плюс аддукт натрия (22.99)) для стандартов сквалена в присутствии восьми составов гидрофобных порошков (1-8) и для двух контролей (9, 10).

На фиг.9 показаны относительные интенсивности при m/z 386.37 (вес формулы 386.65 для холестерина) для стандартов холестерина сквалена в присутствии восьми составов гидрофобных порошков (1-8) и для двух контролей (9, 10).

На фиг.10(а) показаны спектры масс MALDI-TOF-MS для стандарта сквалена.

На фиг.10(b) показаны спектры масс MALDI-TOF-MS для стандартов холестерина.

На фиг.11 показаны результаты MALDI-TOF-MS анализа латентных отпечатков для не курильщика (FR) на пластине из нержавеющей стали и латентных отпечатков, обогащенных 10 мкл раствора, содержащего 1 мкг/мл смеси никотина (RMM 163) и котинина (RRM 176). Снизу вверх:

a) - обогащенные латентные отпечатки, не посыпанные гидрофобными частицами или обработанные DHB;

b) - обогащенные латентные отпечатки, обработанные DHB;

c) - обогащенные латентные отпечатки, предварительно посыпанные гидрофобными частицами;

d) - не обогащенный латентный отпечаток, предварительно посыпанный гидрофобными частицами.

На фиг.12 показаны MALDI-TOF-MS латентные отпечатки для бывшего курильщика (24 часа после последней сигареты), на пластине из нержавеющей стали, предварительно посыпанной гидрофобными частицами:

a) m/z диапазон 155-180, b) m/z диапазон 180-205, с) m/z диапазон 205-450.

На фиг.13 показаны MALDI-TOF-MS латентные отпечатки для курильщика, посыпанные порошком. Пики на 163, 148, 133, 119, 105, 91, 84 и 79 являются характерными для никотина и служат явным доказательством его присутствия.

На фиг.14 показаны MALDI-TOF-MS латентные отпечатки для курильщика, посыпанные порошком. Пики на 177, 161, 147, 135, 119, 105, 97, 91 и 79 являются характерными для котинина и служат явным доказательством его присутствия.

Материалы и способы

В этом исследовании был использован сканер Tecan LS300 фирмы Tecan UK., Reading, Berkshire, а также система Kratos Axima-CFR MALDI-TOF-MS (фирма Shimadzu Biotech, Manchester UK) с пластинами мишени фирмы Shimadzu. В качестве серийной матрицы использовали 2,5-дигидрокси бензойную кислоту (DHB) (10 мг/мл в растворе 50:50 ацетонитрил: деионизированная вода [dH₂O]). Суспензия углеродной сажи была любезно предоставлена фирмой Cabot Corp., Cheshire UK. Все другие химикаты были закуплены на фирме Sigma-Aldrich, Dorset UK., в том числе диоксид титана в виде анатаза. Серийные опудривающие средства, щетки для отпечатков, магнитные щупы и серийная подъемная лента были получены на фирме Crime Scene Investigation Equipment Ltd., 10 (ранее известной как К9 Scenes of Crime Ltd.) Northampton, UK.

Был приготовлен раствор для калибровки системы MALDI-TOF-MS. Были приготовлены растворы гидрохлорида папаверина (10 мг/ мл в dH₂O) и резерпина (5 мг/ мл в диметилформамиде, DMF). Аликвота указанного раствора гидрохлорида папаверина (100 мкл) была перемешана с аликвотами раствора резерпина (200 мкл) и dH₂O (400 мкл) и DMF (300 мкл). Также был приготовлен раствор 2,5-дигидрокси бензойной кислоты (DHB, 10 мг/ мл) в 50:50 по объему ацетонитрил: вода. Окончательный раствор для калибровки был приготовлен за счет перемешивания 10 мкл каждого раствора DHB и смеси резерпина и папаверина. Аликвоты (1 мкл) этого раствора были использованы в каждом эксперименте, причем m/z для молекулярных ионов двух стандартов были использованы для калибровки системы.

Приготовление гидрофобных частиц диоксида кремния с введенным в них материалом

Этот способ представляет собой адаптацию приготовления пустых наночастиц на базе диоксида кремния [12] и предусматривает перемешивание 30 мл этанола, 5 мл dH₂O, 2.5 мл тетраэтоксисилана и 2.5 мл фенилтриэтоксисилана в трубе центрифуги. К полученному добавляют 2 мл раствора гидроксида аммония (28%) для инициирования образования наночастиц и раствор вращают в течение ночи. Полученную суспензию (взвесь) порошка экстрагируют повторно при помощи раствора дихлорид метилена/ вода или этанол/ вода (50:50 в том и другом случае). Суспензию центрифугируют (например, 5 минут при 3000 об/мин). Удаляют надосадочную жидкость и добавляют 10 мл dH₂O и такой же объем дихлорметана. Суспензию вращают дополнительно 10 минут и затем вновь центрифугируют. Удаляют водянистый верхний слой раствора и дополнительно добавляют аликвоты воды и дихлорметана. Этот процесс промывки и центрифугирования повторяют 4 раза, пока не потребуется дополнительная добавка воды: дихлорметана. После этого частицы осушают от дихлорметана в термостате при 40°С.

Сухие частицы измельчают в ступке пестиком и просеивают до нужного размера. Гидрофобные частицы просеивают вручную через латунные испытательные сита с бронзовой сеткой (фирма Endecot Ltd., London UK). Фракции частиц, которые используют в этом испытании, имеют размер ориентировочно ниже 63 мкм. Для определения гранулометрического состава используют анализатор типа Malvern Mastersizer (фирма Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK).

Для получения частиц, содержащих диоксид титана, 25 мг диоксид титана вводят в трубу центрифуги, после чего добавляют реагенты силанизации. Для получения частиц, содержащих углеродную сажу (СВ), добавляют 5 мл 1:2-1:100 раствора суспензии углеродной сажи в воде в раствор предшественника вместо TiO₂. Для получения магнитных частиц используют порошковый магнетит в соответствии с опубликованным способом [13, 14], а затем вводят 5 мл этой суспензии в воде в раствор предшественника вместо dH₂O.

Демонстрация того, что контактные остатки эффективно подняты из латентных отпечатков

Кончик пальца помещали в раствор родамина 6G (Rh 6G; 100 мкл/мл в ЕtOН). Пальцем двигали (помахивали) для испарения избытка ЕtOН ранее нанесения отпечатка на чистое предметное стекло. Были нанесены три отпечатка, 2 с Rh 6G и 1 пустой контроль. Отпечатки рассматривали с использованием сканера Tecan LS300 (λex 543 нм, λem 590 нм, усиление 120). Затем отпечатки посыпали гидрофобными микрочастицами диоксида кремния, которые содержат введенный в них диоксид титана, ранее визуализации при тех же условиях сканирования. После этого отпечатки были подняты с использованием серийной подъемной ленты (11.5×6.5 см), а затем сканировали как остаток на предметном стекле, так и подъемную ленту.

Эксперимент для демонстрации MALDI-TOF-MS обнаружения поднятого контактного остатка (родамин 6G)

В этом эксперименте несколько зерен порошка Rh. 6G наносили непосредственно на кончик пальца, ранее нанесения отпечатка на предметное стекло, которое производили аналогично ранее описанному, но без добавления опудривающего средства (порошка). Отпечаток пальца затем был поднят с использованием двухсторонней проводящей ленты и нанесен на металлическую мишень. Проводящая лента, подходящая для использования совместно с MALDI-TOF, была любезно предоставлена фирмой Shimadzu Biotech. Пластину мишени затем вводили в систему MALDI-TOF-MS и отпечаток исследовали на наличие Rh. 6G. Полученные MS с обнаруженными m/z для Rh 6G около 444, сравнивали со стандартом (0.1 мкл раствора 100 мкг/ мл в этаноле), эквивалентным 100 нг красителя, осажденного на плоской ленте.

Эксперимент для демонстрации эффективности частиц диоксида кремния с введенной в них углеродной сажей в качестве усиливающих агентов для SALDI-TOF-MS

Был изучен отклик инструмента на частицы диоксида кремния с введенной в них углеродной сажей, в присутствии и отсутствии кокаина, которые вводили в круговые ячейки/ области на поверхности металлической пластины мишени. Все результаты были получены при тройном повторе. Гидрохлорид кокаина (1 мкг в виде 1 мкл в 1 мг/мл растворе этанола)) вводили в 2 набора углублений на мишени. В положительном тесте, 1 мкл 10 мг/мл суспензии наночастиц с введенной в них углеродной сажей (матрица) вводили в ячейку. В другом контрольном тесте изучали отклик инструмента на кокаин без матрицы. В еще одном контрольном тесте изучали отклик инструмента на матрицу в отсутствии кокаина, используя пустые ячейки металлической мишени. Ячейки сушили в соответствии с ранее описанным, до проведения анализа.

Обнаружение контактных остатков кокаина при помощи MALDI-TOF-MS Небольшое количество (несколько крупинок) гидрохлорида кокаина были нанесены на кончик пальца, при его погружении в наркотик. После этого палец вводили в прямой контакт с чистой металлической пластиной мишени, в результате чего получали отпечаток на поверхности мишени, покрывающий множество ячеек (углублений) на поверхности. Латентные отпечатки затем посыпали гидрофобными частицами диоксида кремния с введенным в них магнетитом, или посыпали серийными опудривающими средствами, которыми были порошок алюминия, Magneta Flake™ и белый порошок, возможно содержащий диоксид титана. Серийный магнитный щуп использовали для нанесения двух магнитных порошков и использовали серийную щетку для нанесения не магнитных порошков. Для доказательства наличия кокаина на отпечатке использовали серийную DHB матрицу, перемешивали 10 мкл 10 мг/мл с 10 мкл 10 мг/мл раствора гидрохлорида кокаина, и 1 мкл этой смеси вводили в ячейки мишени MALDI. Металлическую мишень затем сушили в нагревателе (фирма Shimadzu/Kratos Instruments) и после этого вводили в систему MS.

Эксперимент для демонстрации эффективности TiO₂/PTEOS частиц для обнаружения остатков кокаина на поднятых отпечатках пальцев

Пустые и содержащие кокаин отпечатки наносили на предметные стекла в соответствии с ранее описанным. Отпечатки проявляли с использованием TiO₂/PTEOS частиц, наносимых при помощи щетки Zephyr. Отпечатки затем были подняты с использованием серийной подъемной ленты, которую переворачивали и помещали отпечатком вверх на пластину мишени системы MALDI. Отпечатки затем анализировали при помощи масс-спектрометра (MS) на наличие или отсутствие кокаина.

Обнаружение холестерина и сквалена из отпечатков при помощи системы MALDI-TOF-MS, с использованием гидрофобных частиц как усиливающей матрицы

Металлическую пластину мишени очищали и сушили. Затем 12 отпечатков указательного пальца правой руки наносили на металлическую пластину мишени. Пластину с отпечатками затем сушили в термостате при 37°С в течение времени около 1.5 часов. Каждый отпечаток посыпали затем десятью различными составами гидрофобных частиц, приготовленных в соответствии с описанным здесь выше. Агент, введенный в частицы, указан далее в скобках. Кроме того, некоторые из полученных порошков (1, 5, 6 и 8) затем тщательно перемешивали с DHB, чтобы получить 1% по весу составы. Их использовали для определения того, что наличие этой матрицы улучшает обнаружение сквалена в латентном отпечатке после посыпания, при анализе в системе MALDI-TOF-MS. Были использованы четыре состава черного порошка, которые имеют различные пропорции углеродной сажи в них, полученные за счет исходного синтеза. Цифры в скобках относятся к отношению углеродной сажи к dH₂O, использованному при исходном синтезе:

1. Белый порошок А (диоксид титана); 1.0% по весу DHB; порошок)

2. Белый порошок В (диоксид титана)

3. Фиолетовый порошок А (кристалл виолет)

4. Черный порошок А (1:10)

5. Черный порошок В (1:10, 1.0% по весу DHB; порошок)

6. Фиолетовый порошок В (кристалл виолет; 1.0% по весу DHB; порошок)

7. Красный флуоресцентный порошок А (родамин 6G)

8. Красный флуоресцентный порошок В (родамин 6G; 1.0% по весу DHB; порошок)

9. Черный порошок С (1:5)

10. Черный порошок D (1:2)

Каждый из первых десяти отпечатков индивидуально посыпали соответствующими порошками 1-10 и полученные отпечатки фотографировали при помощи цифровой камеры (фотоснимки не показаны). Затем отпечатки индивидуально анализировали в системе MALDI-TOF-MS, в том числе отпечаток, который не был обработан опудривающим средством или матрицей (отпечаток 12), и отпечаток, обработанный только дигидрокси бензойной кислотой (отпечаток 11).

Прямое обнаружение холестерина и сквалена при помощи системы MALDI-TOF-MS, с использованием гидрофобных частиц как усиливающих матриц

Растворы холестерина и сквалена (оба 2 мг/ мл) были приготовлены в 100% этаноле и 500 мкл аликвотов каждого раствора были перемешаны друг с другом. 24 капли (каждая 0.5 мкл) этого раствора были нанесены на чистую сухую металлическую мишень и оставлены для сушки на 2 часа. Затем углубления были индивидуально посыпаны каждый составом восьми гидрофобных порошков (3 капли для каждого состава). Составы были идентичными описанным в 2.8:

1. Красный флуоресцентный порошок А

2. Черный порошок А

3. Черный порошок В

4. Фиолетовый порошок А

5. Фиолетовый порошок В

6. Красный флуоресцентный порошок В

7. Черный порошок С

8. Черный порошок D

Посыпание порошком производили в соответствии с ранее описанным здесь выше, непосредственно на поверхность металлической пластины, каждым из порошков. Был также приготовлен отдельный раствор путем перемешивания 500 мкл раствора холестерина/сквалена с 500 мкл раствора 10 мг/мл DHB (матрица). Три капли (по 0.5 мкл) этого раствора также наносили на металлическую мишень и оставляли для сушки на воздухе. Каждую каплю (пятно) на металлической мишени анализировали с использованием системы MALDI-TOF-MS и регистрировали пики холестерина (m/z 386) и сквалена (m/z 410) и их металлических аддуктов.

Результаты

Демонстрация того, что контактные остатки эффективно подняты из латентных отпечатков

Изучали эффективность способа подъема отпечатка и детали выступа полученных отпечатков. Родамин 6G был использован как модельный контактный агент благодаря его высокой флуоресценции. Таким образом, получали отпечатки с высокой флуоресценцией после контакта (верхний и нижний отпечатки на фиг.1а), в то время как нормальный отпечаток (в центре на фиг.1а) не является флуоресцентным при использованных режимах сканирования.

Когда гидрофобные частицы диоксида кремния наносили на три отпечатка, они становились визуально четкими (не показано), причем теперь все три отпечатка четко видны при флуоресцентном сканировании (фиг.1b) за счет флуоресценции родамина, а также за счет рассеяния света от частиц диоксида кремния, нанесенных на отпечаток. После подъема отпечатков с использованием подъемной ленты, небольшая флуоресценция сохраняется на поверхности предметного стекла (фиг.1с), что свидетельствует об эффективности способа подъема. Сканирование поверхности ленты теперь выявляет "флуоресцентные" отпечатки, что говорит о том, что поднятые отпечатки и опудривающее средство остаются неповрежденными в ходе этого процесса (фиг.1d).

Результаты, показанные на фиг.1, подтверждают, что серийную подъемную ленту можно использовать для переноса всего объема осажденного материала латентного отпечатка с предметного стекла на ленту. Это является первой операцией при обнаружении любого материала в латентном отпечатке, проводимом с использованием системы MALDI-TOF-MS.

MALDI-TOF-MS обнаружение поднятого контактного остатка (родамин 6G)

Успешные результаты предыдущего эксперимента позволяют предположить, что родамин, поднятый с поверхности предметного стекла микроскопа, может быть обнаружен с использованием системы MALDI-TOF-MS. Полученные результаты показаны на фиг.2. Верхняя кривая соответствует поднятому отпечатку и имеет пик при m/z 443, соответствующий Rh 6G. Нижний спектр получен непосредственно от Rh 6G стандарта, нанесенного непосредственно на мишень системы MALDI. Аналогичные формы пиков подсказывают наличие одного и того же соединения. Уменьшенная масса на верхней кривой возможно вызвана легким подъемом ленты, использованным при нанесении подъемной ленты на пластину мишени, что снижает время пролета ионизированных разновидностей.

Проводящая лента должна быть хорошо приклеена к плоскости мишени MALDI, причем пробу наносят на верхнюю поверхность ленты. Эта лента является относительно хрупкой и легко растягивается, что может деформировать исходный проявленный отпечаток. Эту ленту с трудом можно использовать для подъема отпечатка с предметного стекла микроскопа и для нанесения на мишень системы MALDI наилучшим образом. Невозможно выровнять ленту по поверхности из-за ее хрупкости и липкости.

Результаты, показанные на фиг.2, говорят о том, что контактные остатки, в виде порошка, могут быть подняты с поверхности и могут быть успешно проанализированы с использованием системы MALDI-TOF-MS.

Эффективность использования частиц диоксида кремния с введенной в них углеродной сажей в качестве усиливающих агентов при обнаружении кокаина с использованием системы MALDI-TOF-MS

Для демонстрации (проверки) того, что результаты были получены за счет наличия матрицы и кокаина, а не фонового сигнала, были проведены дополнительные анализы с использованием известных количеств кокаина и матрицы. Отклики магнитных частиц диоксида кремния в присутствии и отсутствии кокаина сравнивали с откликами пустой мишени и кокаина без какой-либо матрицы.

Было проведено сравнение откликов при m/z 304 частиц диоксида кремния с введенной в них углеродной сажей, в присутствии и отсутствии кокаина, с откликами пустой мишени и кокаина без какой-либо DHB матрицы. Интенсивности MS пиков за счет кокаина показаны на фиг.3. Наличие частиц диоксида кремния приводит к 10-кратному усилению интенсивности пика по сравнению с пиком для кокаина в отсутствии указанных частиц. Наблюдается хорошая воспроизводимость (средняя интенсивность 90,275 и rsd 5.8%, n=3) по сравнению с соответствующими результатами в присутствии DHB (средняя интенсивность 56,552 и rsd 112%, n=3).

Был исследован потенциал системы SALDI с использованием частиц с введенной в них углеродной сажей, по сравнению со стандартной DHB матрицей. Гидрохлорид кокаина был использован как заданный аналит, поскольку его идентификация на отпечатках представляет интерес для правоохранительных органов, так как показывает, что оставивший отпечаток субъект имел контакт с кокаином. Спектры масс кокаина в присутствии стандартной химической матрицы (DHB) и новой порошковой матрицы показаны на фиг.4, для отпечатков, нанесенных непосредственно на металлическую мишень системы MALDI. Нижний спектр соответствует кокаину в присутствии DHB, в то время как верхний спектр соответствует кокаину в присутствии магнитных PTEOS наночастиц, нанесенных при помощи магнитного щупа. Оба спектра являются аналогичными и соответствуют спектру кокаина, однако отклик явно увеличен в присутствии магнитных частиц. Это говорит о том, что магнитные PTEOS частицы способствуют процессу десорбции кокаина аналогично стандартной матрице. Магнитные PTEOS частицы также имеют потенциал для использования в качестве порошка для визуализации отпечатка, так как виден хороший выступ на проявленных отпечатках (не показаны).

Аналогичные результаты были также получены для пиков кокаина при 304.5 m/z в случае контактных отпечатков, осажденных на металлическую пластину мишени и посыпанных гидрофобными порошками, содержащими диоксид титана, углеродную сажу (1:10), а также обработанными DHB или оставленными без обработки (детали не показаны), причем относительные интенсивности составляют соответственно 1,700, 10,000, 9,000 и 100 мВ (фиг.4b).

Эффективность частиц с введенным ТiO₂ при обнаружении остатков кокаина на поднятых отпечатках

Успешная демонстрация эффективности процесса подъема (фиг.1 и 2) и обнаружения кокаина из латентных отпечатков на мишенях системы MALDI (фиг.3-5) позволяют предположить, что кокаин может быть обнаружен на поднятых отпечатках, полученных непосредственно с серийной подъемной ленты. Полученные результаты показаны на фиг.5. Нижняя кривая получена для поднятого отпечатка, который не был в контакте с кокаином, в то время как верхняя кривая получена для отпечатка, который был в контакте с кокаином. Четкий пик виден только на верхней кривой при m/z 304, что соответствует кокаину. В том и другом случае, исходные отпечатки были посыпаны гидрофобными частицами диоксида кремния, содержащими TiO₂. На фиг.7 показана область мишени системы MALDI-TOF, содержащая отпечаток, обогащенный кокаином. Аналогичная картина наблюдается для отрицательного контроля (не показана). Диаметр углубления составляет 3.4 мм, причем наблюдается четкий выступ (ridge detail) отпечатка. Спектры на фиг.6 были получены при помощи лазерного сканирования областей внутри ячеек, причем сигналы были усреднены для получения спектров.

Обнаружение холестерина и сквалена из отпечатков при помощи системы MALDI- TOF-MS, с использованием гидрофобных частиц в качестве усиливающей матрицы

В этом эксперименте, 12 отпечатков были нанесены непосредственно на пластину мишени из нержавеющей стали масс-спектрометра (MS). После выдержки (старения), отпечатки посыпали одним из десяти различных составов гидрофобного порошка. Затем отпечатки были подняты и проанализированы с использованием системы MALDI-TOF-MS.

Ожидали, что будут обнаружены как холестерин, так и сквален, однако на практике был обнаружен только сквален. Его наблюдали при m/z 433, соответствующем молекулярному иону плюс аддукт натрия. Как это показано на фиг.7, интенсивность в отсутствии какого-либо усиливающего агента составляет около 2,000 мВ (отпечаток 12). Эта интенсивность повышается до 14,000 мВ при помощи DHB. Среди порошков, те, которые содержат самые высокие пропорции углеродной сажи, дают самые высокие отклики (отпечатки 9 и 10), причем, чем выше пропорция углеродной сажи, тем выше интенсивность пика, при этом проба с наивысшей интенсивностью около 22,000 мВ имеет отношение углеродной сажи к разбавителю 1:2.

Как правило, присутствие DHB в порошке несколько повышает интенсивность пика (отпечатки 1 и 2 - диоксид титана, и отпечатки 4 и 5 - отношение углеродной сажи к разбавителю 1:10), однако этот тренд не сохраняется для порошков, которые содержат красители кристалл виолет (crystal violet) (3 и 6) и родамин 6G (7 и 8), в случае которых получают низкие сигналы, эквивалентные отпечатку 12 без обработки или даже еще более низкие сигналы.

Прямое обнаружение холестерина и сквалена при помощи MALDI-TOF-MS, с использованием гидрофобных частиц в качестве усиливающих матриц

Так как холестерин не был обнаружен при MS отпечатков, попытались произвести обнаружение этого соединения при помощи системы MALDI-TOF-MS в присутствии DHB и новых опудривающих средств. Для этого стандарты смеси сквалена и холестерина были нанесены на поверхность металлической пластины мишени и восемь наборов этих пятен в трех экземплярах были посыпаны восемью составами гидрофобных порошков, использованных в 3.6, или были обработаны DHB, или же были оставлены без обработки.

В этом случае, пики, связанные со скваленом, вновь наблюдали при m/z 433 за счет аддукта натрия соединения, причем порошки 1, 2, 7 и 8 дают интенсивности (сигналы) существенно выше интенсивности в присутствии DHB (фиг.8). Самая высокая интенсивность была получена при использовании красного флуоресцентного порошка (родамин 6G, порошок 1, 49,000 мВ), однако порошки с углеродной сажей также дают хорошие отклики (1:10, 6000 мВ; 1:5, 36,000 мВ; 1:2, 4,000 мВ). Пик теперь наблюдали при m/z 386, однако во всех случаях величины интенсивностей были намного ниже, чем для сквалена. Самая высокая интенсивность была получена в присутствии порошка, который содержит краситель кристалл виолет (1,800 мВ, порошок 4), причем порошки с углеродной сажей также дают относительно хорошие пики (около 800 мВ для порошка 3, 1:10 плюс DHB, для порошка 7, 1:5, и для порошка 8,1:2) (фиг.9).

Действительные спектры этих двух соединений показаны на фиг.10а (сквален) и на фиг.10b (холестерин). Четко виден лучший отклик для сквалена в данных условиях эксперимента.

Прямое обнаружение при помощи MALDI-TOF-MS экзогенных метаболитов от курильщиков в посыпанных латентных отпечатках

В качестве гидрофобного порошка использовали порошок с введенной в него углеродной сажей, с исходным отношением углеродная сажа: PTEOS, равным 1:2, синтез которого описан в следующем разделе данного описания.

Эти частицы были равномерно введены в смесь мелких частиц железа (диаметр <60 мкМ) и стеариновой кислоты (1.0% по весу), так что отношение гидрофобных частиц к частицам железа составляет 2:98 по весу. Латентные отпечатки были посыпаны порошком с использованием серийного магнитного щупа и затем проанализированы на месте нахождения (in situ) отпечатков на поверхности пластин из нержавеющей стали (пластины мишени Shimadzu MALDI-TOF-MS), или были подняты с использованием серийной подъемной ленты. Поднятые отпечатки были прикреплены к пластинам мишени, стороной отпечатка вверх, с использованием серийной липкой ленты. Анализ MALDI-TOF-MS был проведен с использованием установки Kratos Axima CFR плюс MALDI-TOF-MS (Shimadzu Biotech, Manchester, UK), работающей в режиме отражения (reflectron) положительного иона. В качестве серийной матрицы была использована 2,5-дигидрокси бензойная кислота (DHB) (10 мг/мл в растворе 50:50 ацетонитрил: деионизированная вода [dH₂O]).

Полученные результаты, показанные на фиг.11, демонстрируют отсутствие обнаруженного пика никотина (FW 162) или котинина (FM 176) в отсутствии матрицы усиливающего агента, для латентного отпечатка, который был обогащен смесью никотина и котинина (10 нг каждого, фиг.11а). Когда к обогащенным указанными соединениями отпечаткам добавляют обычный матричный усиливающий агент в виде DHB, тогда наблюдают пики при 163 и 177 (фиг.11с). Когда к обогащенным латентным отпечаткам добавляют гидрофобный порошок, тогда вновь наблюдают пики при 163 и 177, что говорит о том, что этот порошок действует как усиливающий агент. Наблюдаемый теперь дополнительный пик при m/z 199 возможно вызван аддуктом натрия котинина. Пик при m/z 157 наблюдают в спектре не обогащенного отпечатка, посыпанного гидрофобным порошком, вместе с пиком при m/z 163, имеющим ориентировочно такую же интенсивность. Не наблюдают пиков при 177 и 199 в этом спектре (фиг.11d). Следует иметь в виду, что на фиг.11b пик при 163 имеет существенно более высокую интенсивность, чем пик при 157, возможно, за счет присутствия никотина.

На фиг.11 четко показано, что никотин и котинин (оба при содержании 10 нг на отпечаток), при введении в латентные отпечатки не могут быть обнаружены при помощи TOF-MS только за счет добавления такой усиливающей матрицы, как DHB (фиг.11а в сравнении с фиг.11с). На фиг.11 также показано, что гидрофобный порошок, использованный для проявления латентного отпечатка, действует также как усиливающий агент, позволяющий обнаруживать указанные соединения (фиг.11b). Главные пики были обнаружены при значениях m/z 163.3 (вес формулы для никотина 162.23) и 177.3 (вес формулы для котинина 176.22) и 199.2. Этот последний пик возможно вызван аддуктом натрия котинина (C₁₀H₁₂N₂ONa, вес формулы 199.21). Эти пики отсутствуют в предварительно посыпанном латентном отпечатке, который не был обогащен никотином и котинином (фиг.11d).

Соответствующие спектры для бывшего курильщика, который не курил последние 24 часа, показаны на фиг.2. Главные пики, не связанные с порошковой матрицей, видны при m/z 163.1 (никотин) и 199.1 (аддукт натрия котинина), причем виден также меньший пик при 177.1 (котинин).

Интересно отметить, что когда исследуют спектры при более высоких массовых числах, тогда видят пики при 307.4 и 433.4 для отпечатков, непосредственно нанесенных на пластины из нержавеющей стали. Эти пики возможно вызваны аддуктом натрия стеариновой кислоты (FW 307.47) и аддуктом натрия сквалена (FW 433.71), соответственно. Следует иметь в виду, что стеариновую кислоту используют при приготовлении опудривающего средства, а натуральный сквален выделяется как эндогенный компонент отпечатка.

Эти пики могут быть использованы для калибровки пиков, полученных с поднятых отпечатков, так как они присутствуют на поверхности подъемной ленты, которая сама прикреплена к поверхности пластины мишени из нержавеющей стали. Это поднимает поверхность, так что время пролета ионизированных разновидностей теперь становится меньше, чем в случае стальной поверхности, и видимые m/z значения пиков становятся меньше. Таким образом, для спектров отпечатков от курильщиков на поднятых лентах, пики для аддукта натрия видны при 305.1 и 431.2, вместе с пиками при 174.6 (главный) и 197.4. Более низкие массы пиков могут быть скорректированы на 2.3 m/z единицы, что дает пики при 176.9 (котинин) и 199.7 (аддукт натрия котинин).

Пики при 161, 167 и 168 постоянно видны в MS только для курильщиков. Известно, что, несмотря на то, что никотин образует около 95% алкалоидов в табачном листе, в нем имеются также различные другие алкалоиды, среди которых наиболее обильными являются норникотин (RMM 148) и анатабин (RMM 160) [22]. Пик при m/z 161 может быть вызван анатабином, так как протонированные формы никотина и котинина наблюдаются в спектрах, однако для подтверждения этого необходимо провести дополнительную работу.

Приготовление содержащего углеродную сажу агента

Основной способ приготовления пустых наночастиц предусматривает перемешивание 30 мл этанола, 5 мл dH₂O, 2.5 мл тетраэтоксилана (TEOS) и 2.5 мл фенилтриэтоксилана (PTEOS) в центрифуге. К этой смеси добавляют 2 мл раствора гидроксида аммония и раствор вращают в течение ночи. После этого производят центрифугирование суспензии (3 минуты при 3.000 об/мин).

Продукт изолируют в следующих сериях операций центрифугирования и промывки с использованием 10:90 по объему этанола в воде, а затем выдерживают в суспензии 3:97 по объему этанола в воде. После этого проводят анализ гранулометрического состава, а также РЭМ и ПЭМ микроскопию.

Для получения частиц с углеродной сажей, 5 мл раствора углеродной сажи при разбавлении 1:100 водой добавляют в раствор предшественника. Для получения магнитных частиц с покрытием TEOS:PTEOS, готовят порошок магнетита в соответствии с опубликованной методикой, и 5 мл суспензии в воде добавляют в раствор предшественника.

Источники информации

1. Способ определения наличия остатка в отпечатке техникой масс-спектрометрии с использованием матрицы, который включает в себя следующие операции:
i) нанесение на отпечаток порошка, который способен действовать как матрица в технике масс-спектрометрии с использованием матрицы; и содействовать обнаружению и/или визуализации отпечатка, чтобы образовать отпечаток с нанесенными на него частицами; и
ii) проведение масс-спектрометрии материала, образующего отпечаток с нанесенными на него частицами, выбранной из MALDI-TOF-MS или SALDI-TOF-MS, при этом используемый порошок содержит гидрофобные частицы диоксида кремния, а также металл, нитрид металла, оксид металла или углерод, чтобы обнаружить наличие или отсутствие остатка.

2. Способ по п.1, в котором оксид металла выбран из группы, в которую входят диоксид титана, оксид железа, гематит и их комбинации.

3. Способ по п.1, в котором углерод выбран из группы, в которую входят углеродная сажа, фуллереновое соединение, углеродные нанотрубки, графит и его аналог, а также их комбинации.

4. Способ по п.1, в котором металл выбран из группы, в которую входят алюминий, железо и их комбинации.

5. Способ по п.1, в котором частицы металла, нитрида металла, оксида металла или углерода, введены в гидрофобные частицы диоксида кремния.

6. Способ по п.5, в котором средний диаметр частиц составляет ≤100 мкм, возможно от 10 до 90 мкм, предпочтительно от 45 до 65 мкм, а предпочтительнее от 65 до 90 мкм.

7. Способ по п.5, в котором средний диаметр частиц составляет ≤1 мкм, возможно от 200 до 900 нм, предпочтительно от 300 до 600 нм, а предпочтительнее от 400 до 500 нм.

8. Способ по п.1, в котором порошок дополнительно содержит молекулу красителя.

9. Способ по п.8, в котором молекула красителя является флуоресцентной или окрашенной.

10. Способ по п.8 или 9, в котором молекулу красителя и/или окрашенную молекулу вводят в гидрофобную частицу диоксида кремния.

11. Способ по п.1, в котором порошок является магнитным или парамагнитным.

12. Способ по п.1, в котором отпечаток поднимают со своего места нанесения с использованием подъемной ленты и вводят в контакт с подложкой пробы масс-спектрометра, после чего на отпечаток наносят порошок.

13. Способ по п.1, в котором масс-спектрометрия с использованием матрицы выбрана из группы, в которую входят MALDI-TOF-MS-MS или SALDI-TOF-MS-MS и их комбинации.

14. Способ по п.1, который дополнительно предусматривает визуализацию и/или формирование изображения отпечатка.

15. Способ по п.1, в котором остаток представляет собой эндогенный остаток, в частности эндогенный метаболит и/или экзогенный метаболит.

16. Способ по п.15, в котором эндогенный метаболит представляет собой сквален.

17. Способ по п.15, в котором экзогенный метаболит представляет собой метаболит никотина, например котинин.

18. Способ по п.1, в котором остаток представляет собой контактный остаток.

19. Способ по п.18, в котором контактный остаток представляет собой наркотик.

20. Способ по п.19, в котором наркотик представляет собой кокаин.

21. Способ по п.1, в котором в отпечатке совместно содержатся, по меньшей мере, один эндогенный остаток и, по меньшей мере, один контактный остаток.