Полисахарид, вырабатываемый микроорганизмом, принадлежащим к роду bifidobacterium
Группа изобретений относится к биотехнологии. Полисахарид, обладающий увлажняющим и иммуностимулирующим действием, содержит галактозу, глюкозу, рамнозу в качестве моносахаридных компонентов и пировиноградную кислоту, связанную с любым из моносахаридных компонентов. Молярное содержание в полисахариде галактозы, глюкозы и рамнозы находится в соотношении 4:2:1, а пировиноградная кислота содержится в количестве от 4 до 7% по весу. Указанный полисахарид имеет структуру, представленную формулой (I):
Полисахарид получают культивированием в анаэробных условиях штамма Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82) - продуцента полисахарида. Также предложены иммуностимулятор и увлажняющее средство, представляющие собой указанный полисахарид. 5 н.п. ф-лы, 6 ил.
Область техники
Настоящее изобретение относится к новому полисахариду, вырабатываемому микроорганизмом, который принадлежит к роду Bifidobacterium, и к композиции, содержащей указанный полисахарид, например к пищевому продукту, косметическому или лекарственному средству.
Уровень техники изобретения
Микроорганизмы, принадлежащие к роду Bifidobacterium, являются одними из наиболее доминирующих бактерий в кишечной бактериальной флоре. При этом, как и молочнокислые бактерии, эти микроорганизмы можно принимать с пищей. Сообщается, что прием с пищей указанных микроорганизмов обеспечивает свойства, например, такие как воздействие на регуляцию кишечных функций путем нормализации баланса кишечной бактериальной флоры, воздействие на улучшение уровня холестерина в сыворотке и иммуностимулирующая активиоса. Также, помимо вышеописанных свойств, сообщается о веществах, усиливающих иммунные функции. Примеры таких веществ включают в себя противоопухолевое вещество, содержащее в качестве активного компонента молочно-кислые бактерии или микроорганизмы, принадлежащие к роду Bifidobacterium (Японская выложенная патентная публикация №7-82158), вещество для ускорения выработки цитокина (Японская выложенная патентная публикация №8-92112), вещество для профилактики и лечения воспалительных заболеваний кишечника, содержащее в качестве активного компонента микроорганизмы, принадлежащие к роду Lactobacillus (Японская выложенная патентная публикация №2003-73286), индуктор гранулоцитов, содержащий в качестве активного компонента клеточные оболочки и/или разрушенные клеточные оболочки микроорганизмов, принадлежащих к роду Bifidobacterium (Японская выложенная патентная публикация №7-330806) и водорастворимую иммуностимулирующую субстанцию, содержащую в качестве активного компонента микроорганизмы, принадлежащие к роду Bifidobacterium (Японская выложенная патентная публикация №9-241179). Вместе с тем, активными компонентами всех перечисленных веществ являются непосредственно бактерии или полисахаридные фракции, полученные обработкой ферментами, расщепляющими клеточные оболочки, или ультразвуковым разрушением бактерий.
С другой стороны, в отношении иммуностимулирующего действия, обеспечиваемого внеклеточным полисахаридом, имеются следующие сообщения, рассматривающие: противоопухолевое вещество, содержащее в качестве активного компонента полисахарид, вырабатываемый Streptococcus lactis или Streptococcus cremoris (Японский патент №2678673), противоопухолевое действие вязких капсульных полисахаридов из Lactococcus lactis subsp. cremoris или Lactococcus lactis subsp. lactis (Японская выложенная патентная публикация №1-277484), противовоспалительное вещество или вещество, ускоряющее рост клеток костного мозга, которое в качестве активного компонента содержит полисахарид, полученный из культуральной суспензии микроорганизмов, принадлежащих к роду Lactobacillus (Японская выложенная патентная публикация №7-70209), и профилактический эффект фосфор-содержащих полисахаридов, вырабатываемых Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus при аутоиммунных заболеваниях (Японский патент №3017493). Вместе с тем, все упомянутые сообщения относятся к вырабатываемым молочно-кислыми бактериями полисахаридам, выделенным из йогурта или сквашенного молока.
В первоначальном варианте в кишечной бактериальной флоре человека число микроорганизмов, принадлежащих к роду Bifidobacterium, больше, чем число молочно-кислых бактерий, и представляется, что полисахариды, вырабатываемые в кишечнике микроорганизмами, принадлежащими к роду Bifidobacterium, обладают некоторыми биологическими защитными функциями. Вместе с тем, согласно сообщениям, примеры полисахаридов, вырабатываемых микроорганизмами, принадлежащими к роду Bifidobacterium, ограничены полисахаридами, содержащими только глюкозу, которые вырабатываются Bifidobacterium longum (Японская выложенная патентная публикация №7-255465), и полисахаридами, содержащими глюкозу, галактозу, уроновую кислоту и другие сахара, которые вырабатываются Bifidobacterium longum (Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 43, pp 995-1000). Кроме того, их функции остаются неясными.
Раскрытие изобретения
Таким образом, существует необходимость в полисахариде, происходящем из Bifidobacterium, который обладает новым действием.
Авторы настоящего изобретения провели всестороннее исследование микроорганизмов, принадлежащих к роду Bifidobacterium, которые в кишечнике человека вырабатывают субстанции с высокой вязкостью. Авторы настоящего изобретения выявили, что Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82) вырабатывает большое количество вязкой субстанции в культуральной суспензии, что эта вязкая субстанция представляет собой новый полисахарид, и что этот новый полисахарид обладает такими функциями, как увлажняющее действие и иммуностимулирующее действие, и таким образом достигли осуществления настоящего изобретения.
Настоящее изобретение обеспечивает новый полисахарид, и указанный полисахарид содержит в качестве составляющих компонентов галактозу, глюкозу, рамнозу и пировиноградную кислоту, молярное содержание галактозы, глюкозы и рамнозы находится в соотношении 4:2:1, и пировиноградная кислота содержится в количестве от 4 до 7% веса.
В одном варианте осуществления полисахарид имеет структуру формулы (I):
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения упомянутого полисахарида, и указанный способ содержит стадии: культивирования микроорганизма, принадлежащего к роду Bifidobacterium, обладающего способностью вырабатывать полисахарид; и сбора вырабатываемого микроорганизмом полисахарида.
В одном варианте осуществления микроорганизм представляет собой Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82).
Настоящее изобретение также обеспечивает Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82).
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает композицию, которая содержит полисахарид. В одном варианте осуществления композиция представляет собой композицию пищевого продукта, косметическую композицию или композицию лекарственного средства.
В другом варианте осуществления композиция пищевого продукта или композиция лекарственного средства является иммуностимулятором, и косметическая композиция представляет собой увлажняющее вещество.
Дополнительно настоящее изобретение также обеспечивает рецептуру, которая содержит Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82).
Настоящее изобретение обеспечивает новый полисахарид, имеющий увлажняющее действие и иммуностимулирующее действие. Указанный полисахарид используют в качестве исходного материала, например, для композиций пищевых продуктов, косметических композиций или композиций лекарственных средств. Дополнительно, также приводится рецептура на основе Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82) и культуральной суспензии, содержащей упомянутый микроорганизм, и их использование, например, в качестве иммуностимулятора или пищевого продукта, обладающего иммуностимулирующим действием. Кроме того, приведены рецептуры на основе Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82) и продуктов его разрушения (суспензии или разрушенные клетки), и их использование, например, в качестве косметических композиций.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 является графиком, показывающим отношение времени культивирования Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82) и вязкости культуральной суспензии.
Фиг.2 является графиком, показывающим действие полисахарида настоящего изобретения на ускорение выработки фактора некроза опухолей TNF-α.
Фиг.3 является графиком, показывающим действие полисахарида настоящего изобретения на ускорение выработки нитритов.
Фиг.4 является графиком, показывающим действие полисахарида настоящего изобретения на ускорение выработки TNF-α.
Фиг.5 является графиком, показывающим действие полисахарида настоящего изобретения на ускорение выработки нитритов.
Фиг.6 является графиком, показывающим увлажняющий эффект полисахарида настоящего изобретения.
Лучший способ осуществления настоящего изобретения
Полисахарид настоящего изобретения содержит в качестве составляющих компонентов галактозу, глюкозу, рамнозу и пировиноградную кислоту. Галактоза, глюкоза и рамноза содержатся в молярном отношении 4:2:1 и пировиноградная кислота содержится в количестве от 4 до 7% веса. Упомянутый полисахарид имеет повторяемую структуру, представленную формулой (I) ниже.
Полисахарид, имеющий такую структуру, может вырабатываться Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82), выделенным из содержимого кишечника человека.
Микроорганизмы, используемые в настоящем изобретении, включают в себя Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82), но также можно использовать другие микроорганизмы, отличные от вышеупомянутого микроорганизма. Например, можно получать микроорганизмы путем выделения кишечных бактерий, селекцией из этих микроорганизмов штаммов, вырабатывающих капсульные полисахариды, и проведением анализа полисахаридов. Таблица 1 показывает бактериологические свойства Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82), полученного таким способом скрининга.
| Таблица 1 | |
| А. Морфологические свойства | |
| (1) Форма | от 0,6 до 0,8 × от 0,1 до 0,4 мкм, булавовидные, Y-образные и спиралевидные грамположительные бактерии |
| (2) Подвижность | отсутствует |
| (3) Спорообразование | отсутствует |
| В. Культуральные свойства*1 | |
| (1) Форма | Круглая кольцевидная, гладкая и на поверхности, и по окружности |
| (2) Размер | Диаметр от 0,5 до 2,5 мм |
| (3) Выбухание | Выбухание в форме полусферы |
| (4) Цвет | Желтовато-коричневый или молочно-белый |
| (5) Характеристика | Слегка вязкая |
| *1 Свойства колонии получены с применением агаровой среды BL (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), с последующим культивированием в течение 48 часов при 37°C в анаэробных условиях в закрытом контейнере, содержащем AnaeroPack (MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC.) | |
| C. Физиологические свойства | |
| (1) Восстановление нитрата | отсутствует |
| (2) Выработка индола | отсутствует |
| (3) Каталаза | отсутствует |
| (4) Оптимальная температура роста | 37°C |
| (5) Оптимальный уровень pH | PH от 6,5 до 7,0 |
| (6) Степень анаэробности | Облигатный анаэроб |
| (7) Газообразование | отсутствует |
| (8) Ассимиляция сахаров | |
| Арабиноза | + |
| Ксилоза | + |
| Рибоза | + |
| Глюкоза | + |
| Галактоза | + |
| Манноза | + |
| Фруктоза | + |
| Сахароза | + |
| Мальтоза | + |
| Целлобиоза | - |
| Лактоза | + |
| Трегалоза | - |
| Мелибиоза | + |
| Раффиноза | + |
| Мелезитоза | + |
| Крахмал | ± |
| Глицерин | - |
| Маннит | - |
| Сорбитол | - |
| Инозит | - |
| (+: положительный, -: отрицательный, ±: слегка положительный) |
В руководстве Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Vol. 2 (1984)) на основе таксономических характеристик фенотипа было показано, что штамм JBL05 является Bifidobacterium longum. Этот новый микроорганизм был депонирован 3 марта 2005 года (первичная дата депонирования) в Административном агентстве Национального института технологии и оценки, в Патентном депозитарии микроорганизмов (Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (NPMD) (адрес: 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken 292-0818, Japan) под названием Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82).
Полисахарид настоящего изобретения получают культивированием Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82) в подходящей среде. В качестве среды применяют, например, среду, содержащую источник углерода и источник азота, которые могут использоваться микроорганизмами, принадлежащими к роду Bifidobacterium, и, в случае необходимости, гидрохлорид цистеина, аскорбат натрия и следовое количество неорганических солей. В частности, чтобы получить большое количество полисахарида, предпочтительно используют среду, содержащую обезжиренное молоко или компоненты молока. В этом случае, предпочтительно можно использовать среду, в которой содержится ферментативно расщепленное обезжиренное молоко, культиватор (рыбный экстракт, производимый компанией Yaizu Suisankagaku Industry Co., Ltd.), лактоза, аскорбат натрия и тому подобное, при этом ферментативно расщепленное обезжиренное молоко получено расщеплением обезжиренного молока таким ферментом, как протеаза.
Когда Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82) культивируют с использованием упомянутой среды, при температуре культивирования от 20 до 40°C в анаэробных условиях, при уровне pH, отрегулированном от 4 до 7, предпочтительно от 5 до 6, в течение от 16 до 60 часов, с встряхиванием или в покое, в этом случае вязкую субстанцию получают в культуральной суспензии.
Полисахарид из полученной культуральной суспензии собирают, применяя способы, которые обычно используются специалистами в данной области техники для сбора намеченной субстанции из культуральной суспензии, и такой способ включает в себя нагревание, обработку ферментом, центрифугирование и фильтрацию. Например, культуральную суспензию, содержащую вязкую субстанцию (полисахарид) и бактерии, центрифугируют, и бактерии удаляют в виде преципитата. Если культуральная суспензия имеет высокую вязкость, можно удалять бактерии, например, разведением культуральной суспензии водой, и затем центрифугированием полученной разведенной суспензии. Затем для преципитации белков к полученному супернатанту добавляют подходящий органический растворитель, и преципитат удаляют центрифугированием или подобным способом. Затем путем дополнительного добавления органического растворителя к супернатанту осуществляют преципитацию полисахарида, и полисахарид собирают центрифугированием или подобным способом. Более конкретно, сырой полисахарид получают путем добавления этанола до конечной концентрации 20% объема к супернатанту, из которого были удалены бактерии, удалением содержащего белок преципитата посредством центрифугирования, дополнительным добавлением к нему этанола до конечной концентрации 50% объема, и затем собирают преципитат центрифугированием.
Альтернативно, также можно применять способы для сбора полисахарида путем комбинирования органического растворителя и катионов. Например, можно применять способы сбора, подобные способам, в которых используют одновалентный катион и органический растворитель, способам, в которых используют бивалентный катион и органический растворитель (Японская выложенная патентная публикация №58-5301), или способам, в которых используют трехвалентный катион и органический растворитель (Японская выложенная патентная публикация №59-196099). Катионы предпочтительно используют для повышения скорости сбора полисахарида. В качестве одновалентного катиона используют ионы натрия, ионы калия и т.п. В качестве бивалентного катиона используют ионы магния, ионы кальция и т.п. В качестве трехвалентного катиона используют ионы алюминия и т.п. Можно собрать увеличенное количество полисахаридов путем добавления упомянутых катионов вместе с органическим растворителем, таким как этанол, к вязкому раствору, содержащему полисахарид. Можно повысить скорость сбора полисахаридов путем использования бивалентных или трехвалентных катионов, по сравнению с использованием одновалентных катионов.
Из полученного сырого полисахарида можно очищать полисахарид, применяя способы, общепринято используемые специалистами в данной области техники, например, используя единственный или в комбинации способ фракционирования с ионно-обменной смолой или фракционированием путем гель-фильтрации. Не существует каких-либо конкретных ограничений для способа, в котором используют ионно-обменую смолу. Например, применяют способ, в котором полисахарид адсорбируют на анионообменной смоле (например, с продуктом под названием: DEAE Sephadex A-50 (Pharmacia Corporation) и т.д.), элюированной с градиентом натрия хлорида, и затем подвергают гель-фильтрации, например, используя продукт под названием TOYOPEARL HW65S (Tosoh Corporation). Также путем очистки гель-фильтрацией можно определять молекулярный вес.
Структуру полисахарида можно определять, используя следующий способ. Сахариды (моносахариды), составляющие полисахарид, определяют кислотным гидролизом очищенного полисахарида кислотой, такой как муравьиная кислота, разведенная соляная кислота или трихлоруксусная кислота, и затем анализом этого гидролизата высокоэффективной жидкостной хроматографией ВЭЖХ. Затем проводят определение составляющих композицию сахаридов (соотношение между сахаридами, входящими в ее состав) посредством ацетилирования кислого гидролизата, используя общепринятый способ, и затем анализируют продукт реакции газовой хроматографией (анализ ГХ). Кроме того, для полисахаридных компонентов, используя общепринятые способы, определяют условия связывания, например, посредством метилирования кислого гидролизата, и затем анализируют продукт реакции газовой хроматографией - масс-спектрометрией (ГХ-МС). Кроме того, анализ ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) выявляет характер связывания моносахарида и также обнаруживает присутствие ацетильных групп. Можно проводить качественное и количественное определение пировиноградной кислоты, присоединенной к полисахариду, посредством измерения восстановления пировиноградной кислоты до молочной кислоты с лактатдегидрогеназой в присутствии восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (NADH).
Полисахарид, вырабатываемый Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82), имеет следующие характеристики.
(1) Полисахарид содержит в качестве составляющих компонентов галактозу, глюкозу, рамнозу и пировиноградную кислоту, и содержание галактозы, глюкозы и рамнозы в полисахариде имеет молярное отношение 4:2:1.
(2) Содержание пировиноградной кислоты в полисахариде составляет от 4 до 7% веса.
(3) Молекулярный вес, определенный гель-фильтрацией с оборудованием TOYOPEARL HW65S, составляет около от 200000 до 2500000.
(4) Удельное вращение составляет около +130°.
(5) Полисахарид содержит ацетильные группы.
(6) Полисахарид имеет повторяемую структуру, представленную нижеприведенной формулой (I).
Необходимо отметить, что молекулярный вес полисахарида настоящего изобретения варьирует в зависимости от условий культивирования и условий сбора/очистки. Молекулярный вес можно регулировать посредством условий культивирования и других условий.
Получаемый полисахарид имеет превосходное иммуностимулирующее действие и увлажняющую способность. Таким образом, упомянутый полисахарид можно использовать в качестве композиций, таких как композиции пищевых продуктов, композиции лекарственных средств и косметические композиции. Примеры композиций лекарственных средств включают в себя парафармацевтические композиции и гигиенические продукты, такие как трансдермальные пластыри, средства защиты ран и лейкопластыри для первой помощи, которые содержат полисахарид настоящего изобретения.
Кроме того, также можно создавать препарат Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82) настоящего изобретения и культуральную суспензию, содержащую этот микроорганизм, и использовать его. Когда указанный препарат попадает в кишечник, микроорганизм вырабатывает полисахарид настоящего изобретения, и этот препарат таким образом можно использовать в виде, например, лекарственных средств, таких как иммуностимуляторы, или пищевых продуктов, обладающих иммуностимулирующим действием.
ПРИМЕРЫ
Далее описание настоящего изобретения приведено посредством примеров, при этом настоящее изобретение не ограничено этими примерами.
(Пример 1: Выделение микроорганизмов)
(Приготовление среды)
Для выделения Bifidobacteria в качестве среды использовали агаровую среду BL (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD) и агаровую среду BS. Агаровую среду BL стерилизовали в автоклаве при температуре 115°C в течение 20 минут, в стерильных условиях в нее добавляли 5% конской крови, получаемую смесь вливали в чашку Петри, и таким образом агаровую среду BL использовали в качестве среды для чашки Петри. Агаровую среду BS приготовляли следующим образом. Вначале приготовляли аддитивный раствор для агаровой среды BS в общем количестве 100 мл путем растворения в очищенной воде 30 г натрия пропионата, 100 мг паромомицина сульфата, 400 мг неомицина сульфата и 6 г лития хлорида. Затем 50 мл аддитивного раствора для агаровой среды BS добавляли к 1000 мл агаровой среды BL для получения агаровой среды BS. Агаровую среду BS вливали в чашку Петри и использовали в качестве среды для чашек Петри.
(Скрининг микроорганизмов)
Приготовляли суспензию человеческих фекалий в стерильной воде, полученную смесь помещали в агаровую среду BL и агаровую среду BS, и проводили культивирование в анаэробных условиях при 37°C в течение 48 часов. Наблюдали характер колоний бактерий, выращенных в чашках, и образцы формы бактерий, окрашенных по Граму, затем колонии, похожие на bifidobacteria, разделяли на две агаровые среды BL. Колонии в одной среде культивировали в анаэробных условиях при 37°C в течение 48 часов, и колонии в другой среде культивировали в аэробных условиях при 37°C в течение 48 часов. Из колоний, выращенных в анаэробных условиях, выделяли колонии (микроорганизмы), вырабатывающие вязкую субстанцию. Физиологические и морфологические характеристики полученных микроорганизмов соответствовали описанным выше, и таким образом упомянутые микроорганизмы идентифицировали как Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82).
(Пример 2: Структурный анализ полисахарида)
(Приготовление среды)
К жидкости, содержащей 9% веса снятого молока, добавляли панкреатин (Amano Enzyme Inc.) и силикон в конечных концентрациях соответственно, 0,36% веса и 0,01% веса. Затем эту жидкость добавлением 10 N NaOH регулировали до уровня pH 8, и оставляли для проведения реакции при 55°C в течение четырех часов, и таким образом получали ферментативно-расщепленное снятое молоко. К ферментативно-расщепленному снятому молоку добавляли культиватор (рыбный экстракт, произодимый компанией Yaizu Suisankagaku Industry Co., Ltd.), лактозу и аскорбат натрия при конечных концентрациях, соответственно, 3,0% веса культиватора, 2,5% веса лактозы и 0,2% веса аскорбата натрия, смесь стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 минут, и продукт реакции использовали в виде жидкой среды.
(Очистка полисахарида)
Делали посев предварительно культивированного с использованием готовой жидкой среды Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82) в концентрации 1% (объем/объем) в этой же жидкой среде, и ставили стационарную культуру в анаэробных условиях при 37°C в течение 40 часов для выработки вязкой субстанции. Из полученной культуральной суспензии центрифугированием удаляли бактерии, затем к супернатанту добавляли этанол в конечной концентрации 20%, и полученную смесь оставляли для отстаивания при 4°C в течение ночи. Затем центрифугированием удаляли преципитат, содержащий белок, к супернатанту добавляли этанол в конечной концентрации 50%, и полученную смесь оставляли для отстаивания при 4°C в течение ночи. Затем центрифугированием удаляли преципитат для получения фракций сырого полисахарида. Фракции лиофилизировали и оставляли на хранение.
Фракции сырого полисахарида дополнительно фракционировали, применяя колонку, заполненную сефадексом DEAE Sephadex A-50, и элюировали NaCl от 0,07 M до 0,5 M для получения очищенных фракций полисахарида.
(Измерение молекулярного веса)
При осуществлении гель-фильтрации очищенных фракций полисахарида с использованием колонки, заполненной TOYOPEARL HW65S, молекулярный вес полисахарида составлял около 800000. Необходимо отметить, что молекулярный вес варьирует в зависимости от условий культивирования, условий сбора и условий очистки. Неоднократным повторением этого эксперимента были получены полисахариды, имеющие значения молекулярного веса примерно от 200000 до 2500000. Соответственно, предполагается, что можно регулировать молекулярный вес посредством, например, условий культивирования, условий сбора и условий очистки.
(Измерение удельного вращения)
Удельное вращение полисахарида, измеренное с применением цифрового поляриметра DIP-360 (JASCO Corporation), составляло около +130°.
(Анализ компонентов)
Затем проводили гидролиз полученного полисахарида путем добавления муравьиной кислоты. После высушивания гидролизной жидкости при пониженном давлении осуществляли гидролиз продукта реакции путем добавления трифторуксусной кислоты для получения гидролизата. Анализом ВЭЖХ с использованием колонки ION-300 (TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD) было показано, что этот полисахарид состоял из галактозы, глюкозы, рамнозы и пировиноградной кислоты.
Реакцию восстанавления гидролизата проводили с борогидридом натрия, используя общепринятый способ. Проводили ацетилирование продукта реакции путем добавления уксусного ангидрида и пиридина, и затем анализировали ГХ анализом, используя колонку R-225 (J&W Scientific). В результате было показано, что галактоза, глюкоза и рамноза, составляющие полисахарид, находятся в молярном отношении 4:2:1.
При добавлении к гидролизату лактатдегидрогеназы в присутствии NADH вырабатывалась молочная кислота. Таким образом, подтверждали присутствие в полисахаридных фракциях пировиноградной кислоты. Кроме того, содержание пировиноградной кислоты в полисахариде составляло от 4 до 7% веса.
(Структурный анализ)
Для выяснения характера связывания компонентов полисахарида с целью анализа осуществляли метилирование. Метилирование гидролизата проводили с использованием общепринятого способа. Метилированные моносахариды анализировали ГХ-МС (масс-спектрометрией). В результате были получены метилированные сахариды, такие как:
1,5-ди-O-ацетил-2,3,4,6-тетра-О-метил-глюцитол,
1,5-ди-O-ацетил-2,3,4,6-тетра-O-метил-галацитол,
1,3,4,5-тетра-O-ацетил-2,6-ди-O-метил-рамнитол,
1,3,5-три-O-ацетил-2,4,6-три-O-метил-галацитол,
1,4,5-три-O-ацетил-2,3,6-три-O-метил-глюцитол,
1,4,5-три-O-ацетил-2,3,6-три-O-метил-галацитол и
1,4,5,6-тетра-O-ацетил-2,3-ди-O-метил-галацитол.
Характер связывания компонентов исследовали анализом ЯМР. Данные показали, что полисахарид настоящего изобретения имеет структуру формулы I, приведенную ниже (повторяемую структуру).
Ацетильные группы в этой формуле были выявлены анализом ЯМР.
(Пример 3: Получение полисахарида путем культивирования)
К ферментативно-расщепленному снятому молоку, приготовленному в Примере 2, добавляли аскорбат натрия в конечной концентрации 0,2% веса. Продукт реакции стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 минут, и таким образом подготавливали жидкую среду. В приготовленную таким способом жидкую среду делали посев культуральной суспензии Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82), предварительно культивированной в этой же жидкой среде, при концентрации 1% (об./об.), и культивирование проводили при 37°C в течение 40 часов, в анаэробных условиях, с легким взбалтыванием при уровне pH, отрегулированном до 6,0. Для регулирования уровня pH использовали 10 N NaOH. Необходимо отметить, что в качестве сравнительного примера брали случаи проведения стационарного культивирования в анаэробных условиях.
Взаимосвязь между временем культивирования и вязкостью культуральной суспензии показана в Фиг.1. Когда культивирование проводили с регулированием уровня pH, вязкость быстро повышалась через 20 часов, и наблюдалась эффективная выработка полисахарида настоящего изобретения, по сравнению с проведением постоянного культивирования в анаэробных условиях. Вязкость измеряли с использованием вискозиметра TVB-10 (TOKI SANGYO CO., LTD) и ротора THM1 при 15°C со скоростью вращения 50 оборотов в минуту.
(Пример 4. Иммуностимулирующее действие активации макрофагов сырых полисахаридных фракций)
Иммуностимулирующее действие сырых полисахаридных фракций, приготовленных в Примере 2, измеряли следующим образом. Вначале самцам мышей ddY в возрасте 12 недель (Kiwa Laboratory Animals Co., Ltd.) внутрибрюшинно вводили среду TGC (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD) в количестве 2 мл 4% (вес/объем). Через четыре дня брюшную полость промывали 12 мл холодного ФБР для сбора смывов. Смывы центрифугировали при 10000 оборотов в минуту при 4°C в течение 10 минут, и таким образом удаляли супернатант для получения клеток перитонеального эксудата. Клетки суспендировали в среде RPMI 1640 (SIGMA-ALDRICH), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки FCS (Invitrogen Japan K.K), пенициллин G и стрептомицин. Суспензию засевали на 96-луночные планшеты с плотностью 5×103 клеток/на лунку и культивировали в присутствии 5% CO2 при 37°C. Через один час после начала культивирования удаляли среду. Затем клетки вносили в 200 мкл среды RPMI 1640, содержащих, соответственно 0 мкг/мл, 3 мкг/мл, 10 мкг/мл, 30 мкг/мл и 100 мкг/мл сырых полисахаридных фракций, полученных в Примере 2, и культивировали в присутствии 5% CO2 при 37°C в течение четырех часов или 20 часов. После культивирования в течение четырех часов культуральный супернатант использовали для измерения концентрации TNF-α, описанного далее, в качестве индикатора активации макрофагов, и после культивирования в течение 20 часов культуральный супернатант использовали для измерения концентрации нитрита, описанного далее.
Концентрацию TNF-α измеряли следующим образом, используя мышиные фибробласты, чувствительные к TNF-α (клетки L929, DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD). Клетки L929 засевали в каждую лунку 96-луночного планшета с плотностью 4,0×104 клеток/на лунку и культивировали в присутствии 5% CO2 при 37°C в течение пяти часов. Среду после культивирования удаляли. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл среды RPMI 1640, содержащей 1,5 мкг/мл актиномицина D, с последующим добавлением 100 мкл культурального супернатанта после культивирования в течение четырех часов. В этом случае в стандарте с TNF-α, в отличие от культурального супернатанта, добавляли раствор в соотношении 100 мкл/на лунку, в котором TNF-α (SIGMA-ALDRICH) был разведен средой RPMI 1640 в различных концентрациях. Затем проводили культивирование клеток в присутствии 5% CO2 при 37°C в течение 20 часов и к ним добавляли 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H тетразолия бромид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в конечной концентрации 0,5 мг/мл, и полученный продукт культивировали в присутствии 5% CO2 при 37°C в течение четырех часов. После этого удаляли среду и к продукту добавляли 100 мкл изопропилового спирта, содержащего 0,04 N соляную кислоту. После растворения полученного формазана с встряхиванием в течение около десяти минут измеряли спектральную поглощательную способность при 562 нм (стандартная длина волны: 660 нм). Концентрацию TNF-α рассчитывали, используя калибровочную кривую, полученную из стандарта TNF-α. В качестве теста на существенное различие проводили тест множественного сравнения Даннетта (Dunnett's) с уровнями значений p <0,05 и p <0,01. Результаты показаны в Фиг.2.
Концентрацию нитрита измеряли путем помещения в каждую лунку 96-луночного планшета 50 мкл культурального супернатанта после культивирования в течение 20 часов, в каждую лунку добавляли 50 мкл реактива Грисса (Griess), оставляли для проведения реакции в темном месте при комнатной температуре в течение десяти минут и затем измеряли спектральную поглощательную способность при 562 нм (стандартная длина волны: 660 нм). Калибровочную кривую получали путем измерения спектральной поглощательной способности, как описано выше, за исключением того, что вместо культурального супернатанта использовали раствор, в котором нитрит натрия (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) растворяли в среде RPMI 1640 при различных концентрациях. Рассчитывали концентрацию нитрита, используя упомянутую калибровочную кривую. В качестве теста на существенное различие проводили тест множественного сравнения Даннетта с уровнем значения p <0,01. Результаты показаны в Фиг.3.
Как показано в Фиг.2 и 3, действие активации макрофагов подтверждали в сырых полисахаридных фракциях, полученных в Примере 2.
(Пример 5: Иммуностимулирующее действие активации макрофагов очищенных полисахаридных фракций)
Концентрацию TNF-α и концентрацию нитрита измеряли, как описано в примере 4, за исключением того, что вместо лиофилизированного продукта сырых полисахаридных фракций использовали лиофилизированный продукт очищенных полисахаридных фракций, которые были очищены с использованием колонки из Примера 2. В результате также подтверждали действие активации макрофага в очищенных полисахаридных фракциях. Результаты показаны в Фиг.4 и 5.
(Пример 6: Увлажняющее действие полисахарида)
Концентрацию лиофилизированных сырых полисахаридных фракций, подготовленных в Примере 2, доводили водой до 1 мг/мл, и подтверждали их способность к увлажнению на основании изменения количества потери трансэпидермальной влаги на участке внутренней стороны плеча у 10 женщин в возрасте около 20 лет. Тестовые участки отмечали метками 2×2 см с промежутками в 2 см, и измеряли потерю трансэпидермальной влаги (TEWL) перед нанесением образца. Затем стеклянной палочкой наносили каждую порцию сырых полисахаридных фракций 20 мкл и дистиллированную воду 20 мкл, служившую контролем, и измеряли TEWL через 45, 90, 150 и 210 минут. Измерение проводили с использованием оборудования (передвижной Tewameter MSC100) для измерения потери влаги. Количество потерянной влаги через 210 минут показано в Фиг.6. Потеря влаги в случае сырых полисахаридных фракций была меньше, чем потеря влаги при использовании дистиллированной воды, и таким образом подтверждали увлажняющее действие сырых полисахаридных фракций.
Промышленная применимость
Полисахарид настоящего изобретения является новым полисахаридом, имеющим увлажняющее действие и иммуностимулирующее действие. Этот полисахарид вырабатывается Bifidobacterium longum, который выделяют из микроорганизмов, обитающих в кишечнике человека. В промышленном отношении полисахарид является полезным в качестве сырьевых материалов, например, для композиций пищевых продуктов, косметических композиций и композиций лекарственных средств.
1. Полисахарид, обладающий увлажняющим и иммуностимулирующим действием, содержащий галактозу, глюкозу и рамнозу в качестве моносахаридных компонентов, и пировиноградную кислоту,
в котором молярное содержание галактозы, глюкозы и рамнозы находится в соотношении 4:2:1, и пировиноградная кислота содержится в количестве от 4 до 7% по весу,
где полисахарид имеет структуру, представленную формулой (I):
и где пировиноградная кислота связана с любым из моносахаридных компонентов.
2. Способ получения полисахарида по п.1, содержащий стадии
культивирования штамма Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82), продуцирующего полисахарид, и сбора полисахарида.
3. Штамм Bifidobacterium longum JBL05 (NITE BP-82), который продуцирует полисахарид, обладающий увлажняющим и иммуностимулирующим действием.
4. Иммуностимулятор, представляющий собой полисахарид по п.1.
5. Увлажняющее средство, представляющее собой полисахарид по п.1.
