Вакцина против вирусов папилломы человека hpv 16 и hpv 18 и по меньшей мере еще одного типа hpv, выбранного из hpv 31, 45 или 52
Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Иммуногенная композиция включает вирусоподобные частицы (VLPs) HPV 16 и 18 и по меньшей мере одного из других онкогенных типов HPV, выбранного из перечня, состоящего из типов HPV 31, 45 и 52. Описана также вакцина для создания иммунного ответа против папилломавируса человека типов HPV 16, HPV 18 и по меньшей мере одного из типов HPV 31, HPV 45 и HPV 52, где доза VLP по меньшей мере одного из других онкогенных типов снижена относительно дозы HPV 16 или 18. Изобретение может быть использовано в медицине. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 табл.
Настоящее изобретение относится к вакцинам против вирусов папилломы человека.
Предшествующий уровень техники
Вирусы папилломы представляют собой небольшие ДНК-содержащие опухолевые вирусы, которые являются высоко видоспецифичными. К настоящему времени описано свыше 100 индивидуальных генотипов вируса папилломы человека (HPV). HPV как правило специфичны либо в отношении кожи (например, HPV-1 и -2), либо поверхностей слизистых оболочек (например, HPV-6 и -11) и обычно вызывают доброкачественные опухоли (бородавки), которые персистируют в течение нескольких месяцев или лет. Такие доброкачественные опухоли могут беспокоить индивидов, но не представляют собой угрозу для жизни, за редким исключением.
Некоторые HPV также ассоциированы с раком и известны как онкогенные типы HPV. Наиболее сильной положительной взаимосвязью между HPV и раком у человека является та, которая существует между HPV-16 и HPV-18 и раком шейки матки. Рак шейки матки представляет собой наиболее распространенную злокачественную опухоль в развивающихся странах, с возникновением ежегодно примерно 500000 новых случаев в мире.
Другие HPV, представляющие особый интерес в отношении рака, представляют типы 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82, 26, 53 и 66.
Предположили, что вирусоподобные частицы (VLPs) HPV представляют собой потенциальные вакцины для лечения HPV. Показано, что бивалентная вакцина, в которой используют VLPs, эффективна в профилактике инфицирования типами HPV 16 и 18 у молодых женщин (Lancet, vol 364, issue 9447, November 2004, pp.1757-1765).
Все еще сохраняется потребность в вакцине, которая защищает от множества (например, больше 2) типов HPV.
Настоящее изобретение направлено на эту потребность.
Краткое изложение сущности изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей VLPs HPV 16 и 18 и по меньшей мере одного из других онкогенных типов HPV, выбранного из перечня, состоящего из типов HPV 31, 45 и 52, где доза VLP по меньшей мере одного из других онкогенных типов снижена относительно дозы HPV 16 или 18.
В родственном аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей VLPs HPV 16 и по меньшей мере одного из других онкогенных типов HPV, выбранного из перечня, состоящего из типов HPV 31 и 52, где доза VLP по меньшей мере одного из других онкогенных типов снижена относительно дозы HPV 16.
В родственном аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей VLPs HPV 18 и HPV 45, где доза VLP HPV 45 снижена относительно дозы HPV 18.
Изобретение также относится к иммуногенной композиции, как она определена выше, в комбинации с адъювантом и/или носителем.
Изобретение также относится к вакцине, включающей иммуногенную композицию, как она определена выше, с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
Изобретение также относится к способу профилактики инфекции и/или заболевания HPV, включающему введение индивидууму, нуждающемуся в этом, композиции или вакцины, как они определены выше.
Изобретение также относится к способу изготовления иммуногенной композиции, как она определена выше, включающему смешивание VLPs HPV 16 и 18 с по меньшей мере одним из других онкогенных типов HPV, выбранным из перечня, состоящего из типов HPV 31, 45 и 52, где доза VLP по меньшей мере одного из других онкогенных типов снижена относительно дозы HPV 16 или 18.
В приведенных выше аспектах изобретения также могут быть использованы капсомеры HPV, нежели чем VLPs.
Подробное описание изобретения
Авторы изобретения неожиданно определили, что VLPs HPV 16 и 18 могут обеспечить перекрестный иммунитет от инфекции и/или заболевания, вызываемого некоторыми другими онкогенными типами HPV, то есть HPV 31, HPV 45 и HPV 52. Данные представлены в этом описании в разделе примеров.
Перекрестный иммунитет можно рассматривать как иммунитет, обеспечиваемый вакциной, содержащей один из типов HPV, от инфекции (эпизодической или персистентной) и/или заболевания, вызываемого иным типом HPV. Эпизодическая и персистентная инфекции представляют собой инфекции, как они определены в статье Lancet Harper et al. Vol 364, issue 9447, November 2004, pp.1757-1765. Перекрестный иммунитет можно оценить, учитывая эффективность вакцины (ЭВ), где ЭВ представляет собой % улучшения защиты от инфекции с использованием вакцины по сравнению с группой плацебо для данного типа.
Соответственно, вакцины HPV, включающие VLPs HPV 16 и 18, могут быть изготовлены в виде препарата с использованием более низкой дозы других (отличных от HPV 16/18) VLPs онкогенных типов (31, 45 или 52), по сравнению с дозой, которая иначе может потребоваться при отсутствии VLPs HPV 16 и 18, в то же время все еще достигая того же самого защитного ответа против эпизодической и/или персистентной инфекции HPV для указанного другого типа. Снижение дозы VLPs другого онкогенного типа в варианте мультивалентной вакцины без существенного влияния на иммунитет, вызываемый этими другими типами, может быть благоприятно в том случае, когда может быть ограничено общее количество антигена; например, вследствие физических, химических или регуляторных ограничений. Кроме того, это дает возможность для приготовления большего числа доз вакцины, которую нужно приготовить для данного количества антигена, и может потенциально снизить общую стоимость вакцины.
Доза VLP здесь соответственно представляет собой количество VLP, измеренное по массе.
Другими словами, для достижения того же самого защитного ответа против эпизодической и/или персистентной инфекции, и/или заболевания доза VLPs «другого онкогенного типа» (отличного от HPV 16/HPV 18), которую необходимо использовать в комбинации с VLPs HPV 16 и/или HPV 18, может быть снижена по сравнению с уровнем, который требуется в отсутствие VLPs такого типа 16 и/или 18.
Таким образом, изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей VLPs HPV 16 и 18 и по меньшей мере одного из других онкогенных типов HPV, выбранного из перечня, состоящего из типов HPV 31, 45 и 52, где доза VLP по меньшей мере одного из других онкогенных типов снижена по сравнению с дозой HPV 16 или 18.
В альтернативном аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей VLPs HPV 16 и 18 и по меньшей мере одного из других онкогенных типов HPV, выбранного из перечня, состоящего из типов HPV 31, 45 и 52, где доза VLP по меньшей мере одного из других онкогенных типов снижена по сравнению с дозой, которая иначе бы потребовалась в отсутствие VLPs HPV 16 и 18, для создания такого же иммунитета против эпизодической и/или персистентной инфекции HPV этим другим онкогенным типом.
В одном из аспектов доза VLP другого онкогенного типа (отличного от HPV 16, 18) является достаточной для обеспечения защиты от эпизодической и/или персистентной инфекции этим типом и в одном из аспектов изобретения защиты по меньшей мере от эпизодической инфекции.
В одном из аспектов изобретения композиция по изобретению подходит для защиты от инфекции и/или заболевания у людей.
Подходящая доза может быть определена, например, в клинических исследованиях на людях, таких как описанные в примерах в данном описании.
Защита от эпизодической и/или персистентной инфекции данным типом HPV, таким как например HPV 16, 18, 31, 45 или 52, соответственно представляет собой защиту у 50% вакцинированной популяции против инфекции этим типом, и в одном из аспектов изобретения 60% защиту, в еще одном аспекте 70% защиту, в еще одном аспекте 80% защиту, в еще одном аспекте 90% защиту, в еще одном аспекте 95% защиту, в еще одном аспекте 96% защиту, в еще одном аспекте 97% защиту, в еще одном аспекте 98% защиту, в еще одном аспекте 99% защиту и в еще одном аспекте 100% защиту.
Подходящим образом эту защиту оценивают в течение периода по меньшей мере 6 месяцев, такого как период по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 1 год, по меньшей мере 18 месяцев, подходящим образом в течение 2 лет или более 2 лет.
В одном из аспектов изобретения наблюдают защиту от инфекции или заболевания, вызванного HPV 16 и/или HPV 18, и в одном из аспектов - от инфекции или заболевания, вызванного как HPV 16, так и HPV 18.
Профилактику инфекции можно оценить с помощью анализа видов HPV, присутствующих у вакцинированных индивидов, например с помощью анализа путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или способов гибридизации, таких как способы, описанные в WO 03014402 и WO 9914377, которые включены в данное описание путем ссылки.
Когда иммуногенная композиция по изобретению включает VLPs как HPV 16, так и 18, то VLPs онкогенного типа, отличного от HPV 16/18, представляет собой тип 31, или тип 45, или тип 52, или их комбинацию. В одном из аспектов иммуногенная композиция по изобретению включает VLPs HPV 16, 18, 31 и 45. В одном из аспектов иммуногенная композиция по изобретению включает VLPs HPV 16, 18, 31 и 52. В одном из аспектов иммуногенная композиция по изобретению включает VLPs HPV 16, 18, 45 и 52. В одном из аспектов иммуногенная композиция по изобретению включает VLPs HPV 16, 18, 31, 52 и 45. Когда имеются 2 или более VLPs других онкогенных типов (например, 31 и 45, 31 и 52, 45 и 52), то по меньшей мере один из этих других онкогенных типов присутствует в дозе, которая снижена относительно дозы HPV 16 или HPV 18.
В одном из аспектов доза HPV 31 снижена относительно дозы HPV 16.
В одном из аспектов доза HPV 52 снижена относительно дозы HPV 16.
В одном из аспектов доза HPV 45 снижена относительно дозы HPV 18.
Подходящим образом иммуногенные композиции, как они определены выше, обеспечивают защиту от эпизодической инфекции и/или персистентной инфекции, и/или заболевания, вызванного HPV 16, HPV 18 и одним или более чем одним из других типов HPV (31, 45 или 52), присутствующих в перечисленных выше группах, такой как эпизодическая инфекция.
Когда иммуногенная композиция по изобретению включает VLPs HPV 16, но не VLPs HPV 18, то подходящим образом VLP онкогенного типа, отличного от HPV 16/18, представляет собой тип 31 и/или тип 52.
Когда иммуногенная композиция по изобретению включает VLPs HPV 18, но не VLPs HPV 16, то подходящим образом VLP онкогенного типа, отличного от HPV 16/18, представляет собой тип 45.
В одном из аспектов изобретения композиция включает VLPs HPV 16 и 18 в комбинации с любыми из VLPs HPV 31 и HPV 45 или обоими.
В одном из аспектов изобретения композиция включает по меньшей мере VLPs HPV 16 в комбинации с VLPs HPV 31.
Композиция по изобретению может включать, в дополнение к VLPs в сниженной дозе, VLPs других HPV в любой подходящей дозе. Например, композиция по изобретению может включать дополнительные онкогенные типы "высокого риска", такие как один или более чем один из HPV 33, 35, 39, 51, 56, 58, 59, 66 или 68.
В одном из аспектов композиция может включать дополнительные так называемые типы "остроконечных бородавок", такие как HPV 6 и/или 11, или так называемые "кожные" типы, такие как HPV 5 и/или 8. В одном из аспектов дополнительные VLPs присутствуют в той же самой дозе или выше чем доза HPV 16 и/или HPV 18.
В одном из аспектов изобретения композиция включает VLPs HPV 39 и/или HPV 51, и доза по меньшей мере одного из них снижена по сравнению с HPV 16 и/или HPV 18.
В одном из аспектов количество любой дополнительной VLP выбрано так, чтобы обеспечить некоторую степень защиты от инфекции или заболевания по сравнению с этим(и) дополнительным(и) типом(ами).
Некоторые композиции по изобретению, конкретизированные ниже, включают следующую дозу VLPs:
| Номер композиций | VLP HPV 16 (мкг) |
VLP HPV 18 (мкг) |
VLP HPV 31 (мкг) |
VLP HPV 45 (мкг) |
| 1 | 20 | 20 | 10 | 10 |
| 2 | 20 | 30 | 10 | 10 |
| 3 | 20 | 30 | 20 | 20 |
| 4 | 30 | 20 | 10 | 10 |
| 5 | 30 | 20 | 20 | 20 |
Соответственно, нет значительного или биологически значимого взаимодействия между VLPs HPV в композиции по изобретению, так что комбинированная вакцина VLP по изобретению способна обеспечить эффективную защиту от инфекции каждым типом VLP HPV, присутствующих в вакцине. Соответственно, иммунный ответ против данного типа VLP в комбинации составляет по меньшей мере 50% от иммунного ответа для того же типа VLP, измеренного индивидуально, предпочтительно 100% или по существу 100%. В отношении ответов на компоненты VLP HPV 16 и HPV 18 комбинированная вакцина по изобретению предпочтительно стимулирует иммунный ответ, который составляет по меньшей мере 50% от вызываемого комбинированной вакциной VLP HPV 16/HPV 18. Соответственно, иммунный ответ, вырабатываемый вакциной по изобретению, находится на уровне, при котором все еще обнаруживается защитный эффект каждого типа VLP. Иммунный ответ может быть измерен подходящим образом, например, по образованию антител, с использованием стандартных способов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), и клинических исследований, как они описаны здесь.
В одном из аспектов композиция по изобретению не включает белок теплового шока или его фрагмент.
В одном из аспектов композиция по изобретению не включает белок или пептид L2 HPV. В еще одном аспекте композиция по изобретению не включает белок или пептид L2 HPV.
VLPs HPV и способы получения VLPs хорошо известны в данной области техники. Как правило, VLPs конструируют из структурных белков вируса L1 и возможно L2, см., например WO 9420137, WO 9629413 и WO 9405792. Любая подходящая VLP HPV может быть использована в настоящем изобретении, такая как VLP L1 или L1+L2.
Образование VLP можно оценить стандартными способами, такими как например электронная микроскопия и динамическое рассеяние лазерного излучения.
В одном из аспектов изобретения VLP представляет собой VLP только из L1.
VLP может включать полноразмерный белок L1.
В одном из аспектов изобретения белок L1, используемый для образования VLP, представляет собой усеченный белок L1. Усеченные белки L1 HPV раскрыты, например, в US 6361778, включенной в данное описание путем ссылки. В одном из аспектов усечением удаляют сигнал ядерной локализации. В еще одном аспекте усечение представляет собой усечение С-конца. В еще одном аспекте усечением С-конца удаляют менее чем 50 аминокислот, соответственно предпочтительно менее чем 40 аминокислот. Соответственно, последовательность L1 HPV 16 начинается со второго метионинового кодона, например как показано в приведенной ниже последовательности, или аналогичных положений в других типах HPV. Когда VLP представляет собой VLP HPV 16, то в одном из аспектов усечением С-конца удаляют 34 аминокислоты из последовательности L1 HPV 16. Когда VLP представляет собой VLP HPV 18, то в одном из аспектов усечением С-конца удаляют 35 аминокислот из последовательности L1 HPV 18.
В одном из аспектов последовательность HPV 16 представляет собой следующую последовательность:
| MSLWLPSEATWLPPVPVSKWSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKI | 60 |
| LVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGH | 120 |
| PLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAV | 180 |
| NPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSE | 240 |
| PYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMV | 300 |
| TSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTWDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNF | 360 |
| KEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRF | 420 |
| VTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQ | 471 |
Последовательность HPV 16 также может представлять собой последовательность, раскрытую в WO 9405792 или US 6649167, например усеченную подходящим образом. Подходящие усечения представляют собой усечения в положении, эквивалентном тому как показано выше, как оценивают путем сравнения последовательностей.
В одном из аспектов последовательность HPV 18 представляет собой следующую последовательность:
| MALWRPSDNTVYLPPPSVARWNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQ | 60 |
| DIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDNSIYNPETQRLVWACVGVEIGRGQPLGVGLSGH | 120 |
| PFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPL | 180 |
| SQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSAD | 240 |
| PYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPPSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIV | 300 |
| TSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTWDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATK | 360 |
| FKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYR | 420 |
| FVQSVAITCQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQ | 472 |
Альтернативная последовательность HPV 18, раскрытая в WO 9629413, может быть усечена подходящим образом. Подходящие усечения представляют собой усечения в положении, эквивалентном тому как показано выше, что оценивают путем сравнения последовательностей.
Другие последовательности HPV 16 и HPV 18 хорошо известны в данной области техники и могут быть подходящими для применения по настоящему изобретению.
Также могут быть получены подходящие усечения HPV 31, HPV 45 и HPV 52 соответственно путем удаления С-концевых фрагментов белка L1, эквивалентных описанным выше, что оценивают путем совмещения последовательностей.
Усеченные белки L1 раскрыты, например, в WO 9611272 и US 6066324, включенных в данное описание путем ссылки.
В одном из аспектов усеченные белки L1 представляют собой подходящие функциональные производные белка L1, способные усиливать иммунный ответ (если необходимо, при усилении подходящим адъювантом), причем указанный иммунный ответ способен распознавать VLP, состоящую из полноразмерного белка L1 и/или типа HPV, из которого белок L1 происходит.
VLPs по изобретению может также включать другие типы функциональных белковых производных, включая мутанты полноразмерных или усеченных белков L1 HPV, таких как мутанты по делеции, замене или вставке. Белок L1 или производное также может представлять собой слитый белок, такой как слияние белка L1 с L2 или ранним белком. Белок L1 или функциональное белковое производное способно образовывать VLP, и образование VLP можно оценить стандартными способами, такими как например электронная микроскопия и динамическое рассеяние лазерного излучения.
VLPs могут быть получены в любом подходящем клеточном субстрате, таком как клетки дрожжей или клетки насекомых, например клетки бакуловируса, и способы получения VLPs хорошо известны в данной области техники, например WO 9913056 и US 6245568 и приведенных в них источниках информации, полное содержание которых включено в данное описание путем ссылки.
В одном из аспектов VLPs получают способами разборки и вторичной сборки, которые могут привести к получению более стабильных и/или гомогенных VLPs вируса папилломы. Например, в McCarthy et al, 1998 "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Viruslike Particles in Vitro" J. Virology 72(1):33-41 описана разборка и вторичная сборка рекомбинантных L1 VLPs HPV 11, очищенных из клеток насекомых для получения гомогенного препарата VLPs. В WO 9913056 и US 6245568 также описаны способы разборки/вторичной сборки для получения VLPs HPV.
В одном из аспектов VLPs HPV по изобретению получают, как описано в WO 9913056 или US 6245568.
VLPs по изобретению можно объединять с адъювантом или иммуностимулятором, таким как детоксицированный липид А из любого источника и нетоксичные производные липида А, сапонины и другие реагенты, способные стимулировать ответ ТЖ-типа, но не ограниченным ими.
Давно известно, что энтеробактериальный липополисахарид (ЛПС) представляет собой сильный стимулятор иммунной системы, хотя его применение в адъювантах ограничено его токсическими действиями. Нетоксичное производное ЛПС, представляющее собой монофосфориллипид А (МФЛ), получаемое путем удаления коровой углеводной группы и фосфата из глюкозамина с редуцирующим концом, описано Ribi et al (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p 407-419) и имеет следующую структуру:
Еще один детоксицированный вариант МФЛ является результатом удаления ацильной цепи из положения 3 дисахаридной цепи и назван 3-O-деацилированным монофосфориллипидом А (3Д-МФЛ). Он может быть очищен и получен способами, описанными в GB 2122204 В, в котором также раскрыт препарат дифосфориллипида А и его 3-O-деацилированные варианты. В одном из аспектов 3Д-МФЛ находится в форме эмульсии, имеющей небольшой размер частиц, составляющий в диаметре менее чем 0,2 мкм, и способ ее приготовления раскрыт в WO 94/21292. Водные препараты, включающие монофосфориллипид А и поверхностно-активное вещество, описаны в WO 9843670 A2.
Адъюванты на основе бактериального липополисахарида, которые готовят в композициях по настоящему изобретению, могут быть очищены и получены из бактериальных источников, или альтернативно они могут быть синтетическими. Например, очищенный монофосфориллипид А описан Ribi et al 1986 (выше), и 3-O-деацилированный монофосфорил- или дифосфориллипид А, полученный из Salmonella sp., описан в GB 2220211 и US 4912094. Описаны другие очищенные и синтетические липополисахариды (Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol, 79(4):392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6; и EP 0549074 B1). В одном из аспектов адъювант на основе бактериального липополисахарида представляет собой 3Д-МФЛ.
Соответственно, производные ЛПС, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, представляют собой такие иммуностимуляторы, которые по структуре подобны структуре ЛПС или МФЛ либо 3Д-МФЛ. В еще одном аспекте настоящего изобретения производные ЛПС могут представлять собой ацилированный моносахарид, представляющий собой субфрагмент вышеописанной структуры МФЛ.
Сапонины упомянуты в: Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386). Сапонины представляют собой стероидные или тритерпеновые гликозиды, широко распространенные в царствах растений и морских животных. Сапонины замечательны тем, что образуют коллоидные растворы в воде, которые пенятся при встряхивании, и что осаждают холестерин. Когда сапонины находятся около клеточных мембран, они создают порообразные структуры в мембране, что приводит к взрыву мембраны. Гемолиз эритроцитов представляет собой пример этого явления, которое является свойством некоторых, но не всех сапонинов.
Сапонины известны в качестве адъювантов в вакцинах для системного введения. Адъювантная и гемолитическая активность индивидуальных сапонинов широко исследованы в данной области техники (Lacaille-Dubois and Wagner, выше). Например, Quil А (полученный из коры Североамериканского дерева Quillaja Saponaria Molina) и его фракции описаны в US 5057540 и "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; и ЕР 0362279 B1. Структуры частиц, названных иммуностимулирующими комплексами (ИСК), включающих фракции Quil А, являются гемолитическими и используются в приготовлении вакцин (Morein, В., ЕР 0109942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). Гемолитические сапонины QS21 и QS17 (Фракции Quil А, очищенные путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)), описаны в качестве сильных системных адъювантов, и способ их получения раскрыт в патенте США 5057540 и ЕР 0362279 B1. Другие сапонины, которые используют в исследованиях системной вакцинации, включают сапонины, полученные из других видов растений, таких как Gypsophila и Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).
Усиленная система включает комбинацию нетоксичного производного липида А и сапонинового производного, в частности комбинацию QS21 и 3Д-МФЛ, раскрытую в WO 94/00153, или менее реактивную композицию, в которой QS21 гасят холестерином, как раскрыто в WO 96/33739.
В одном из аспектов адъювант представляет собой особенно сильный адъювантный препарат, включающий QS21 и 3Д-МФЛ в эмульсии масло-в-воде, описанный в WO 95/17210.
Соответственно, в одном из аспектов настоящего изобретения предложена композиция, усиленная детоксицированным липидом А или нетоксичным производным липида А, более предпочтительно усиленная монофосфориллипидом А или его производным.
В одном из аспектов композиция дополнительно включает сапонин, более предпочтительно QS21.
В одном из аспектов адъювантный препарат дополнительно включает эмульсию масло-в-воде. В настоящем изобретении также предложен способ изготовления вакцинного препарата, включающий смешивание VLP по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым эксципиентом, таким как 3Д-МФЛ.
Дополнительные компоненты, которые предпочтительно присутствуют в адъювантной композиции по изобретению, включают нетоксичные детергенты, такие как октоксинолы и полиоксиэтиленовые эфиры, как описано здесь, в частности трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Тритон Х-100) и сорбитанмоноолеат полиоксиэтилена (Твин 80); и соли желчных кислот или производные холиновой кислоты, как описано здесь, в частности дезоксихолат натрия или тауродезоксихолат.В одном из аспектов адъювантный препарат включает 3Д-МФЛ, Тритон Х-100, Твин 80 и дезоксихолат натрия, которые могут быть объединены с VLP HPV с получением подходящей вакцины.
В одном из воплощений настоящего изобретения композиция включает везикулярный адъювантный препарат, содержащий холестерин, сапонин и производное ЛПС. В этой связи адъювантный препарат может включать моноламеллярную везикулу, содержащую холестерин, имеющую липидный бислой, подходящим образом включающий диолеоилфосфатидилхолин, где сапонин и производное ЛПС ассоциированы с липидным бислоем или внедрены в липидный бислой. Более предпочтительно эти адъювантные препараты включают QS21 в качестве сапонина и 3Д-МФЛ в качестве производного ЛПС, где отношение QS21:холестерин составляет от 1:1 до 1:100 мас./мас. и, наиболее предпочтительно, 1:5 мас./мас. Такие адъювантные препараты описаны в ЕР 0822831 В, который включен в данное описание путем ссылки.
В одном из аспектов композиции по изобретению используют в комбинации с алюминием и они подходящим образом адсорбированы или частично адсорбированы на алюминиевых адъювантах. Соответственно, адъювант представляет собой соль алюминия, которая в одном из аспектов находится в комбинации с 3Д-МФЛ, такой как фосфат алюминия и 3Д-МФЛ. В еще одном аспекте адъювант представляет собой гидроксид алюминия, возможно в комбинации с 3Д-МФЛ.
Еще один из аспектов композиции представляет собой комбинацию VLPs с солью алюминия или с солью алюминия + 3Д-МФЛ. В одном из аспектов изобретения соль алюминия представляет собой гидроксид алюминия.
Композиция по изобретению также может включать алюминий или соединение алюминия в качестве стабилизатора.
Настоящее изобретение в общем относится к комбинациям VLPs. Однако целесообразно, когда важным компонентом VLP является белок L1. Белки L1 ассоциируются с образованием пентамеров (капсомеров), которые затем укладываются в мозаичную структуру (собираются) с образованием VLPs. По существу, настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям, как они описаны выше, включающим белки L1, или капсомерам, включающим белки L1, вместо VLPs, как описано здесь. Подходящим образом белки L1 способны стимулировать защитный иммунный ответ. Подходящим образом белки L1 конформационно правильные.
Для того чтобы избежать неопределенности, изобретение, таким образом, также относится к применению функциональных производных L1, как описано выше, таких как усеченные L1, мутанты с делецией, заменой или вставкой и слитые белки соответственно белков, способных вызывать иммунный ответ, способный распознавать вирус HPV. Капсомеры, включающие такие белки, также включены в настоящее изобретение. Капсомеры в качестве иммуногенных агентов описаны, например, в WO 0204007. В WO 9901557 также раскрыт капсомер HPV, содержащий композиции. Белки, производные и капсомеры L1 могут быть использованы тем же самым образом, как описано выше для VLPs.
Таким образом, можно видеть, что изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей белок L1 или его функциональное производное из HPV 16 и 18 и по меньшей мере одного из других онкогенных типов HPV, выбранных из перечня, состоящего из типов HPV 31, 45 и 52, где доза белка L1 или его производного из по меньшей мере одного из других онкогенных типов снижена относительно дозы HPV 16 или 18.
Таким образом, можно видеть, что изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей капсомер HPV из HPV 16 и 18 и по меньшей мере одного из других онкогенных типов HPV, выбранных из перечня, состоящего из типов HPV 31, 45 и 52, где доза капсомера из по меньшей мере одного из других онкогенных типов снижена относительно дозы HPV 16 или 18.
В одном из аспектов изобретение относится к иммуногенной композиции, как обсуждалось выше, в комбинации с фармацевтически приемлемым эксципиентом. Подходящие эксципиенты хорошо известны в данной области техники и включают, например, буферы и воду.
Композиции и вакцины по изобретению могут быть предложены и доставлены любым из множества путей, таких как пероральный, местный, подкожный путь, введение в слизистые оболочки (как правило, внутривагинально), внутривенный, внутримышечный, интраназальный, подъязычный, внутрикожный путь и посредством суппозитория.
В одном из аспектов изобретения композиция или вакцина может быть приготовлена или введена вместе с ранним антигеном HPV, например антигеном, выбранным из перечня, состоящего из Е1, Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7 и Е8 HPV. В альтернативном аспекте вакцина может не содержать ранний антиген HPV, например антиген, выбранный из перечня, состоящего из Е1, Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7 и Е8 HPV.
Возможно, композиция или вакцина также может быть приготовлена или введена вместе с антигенами, отличными от HPV. Соответственно, эти антигены, отличные от HPV, могут обеспечивать защиту против других заболеваний, наиболее предпочтительно, заболеваний, передающихся половым путем, таких как вирус простого герпеса, вирус Эпштейна-Барра (EBV), хламидии и вирус иммунодефицита человека (HIV). Авторы изобретения в частности предпочитают, чтобы композиция или вакцина включала gD или его усеченный вариант из вируса простого герпеса (HSV), подходящим образом вариант с усеченным С-концом из HSV-2, известный как gD2t. В таком случае композиция или вакцина обеспечивает защиту против HPV и HSV.
Дозировка компонентов композиции или вакцины варьирует в зависимости от состояния, пола, возраста и массы индивидуума, пути введения и HPV вакцины. Количество также может варьировать в зависимости от количества типов VLP. Подходящим образом доставляют количество вакцины, подходящее для того, чтобы вызвать иммунологически защитный ответ. Подходящим образом каждая доза вакцины включает 1-100 мкг каждой VLP, в одном из аспектов 5-80 мкг, в еще одном аспекте 5-30 мкг каждой VLP, в еще одном аспекте 5-20 мкг каждой VLP, где другие аспекты конкретно составляют 5 мкг, 6 мкг, 10 мкг, 15 мкг или 20 мкг.
Дозы, подходящие для применения людям, как правило включают 20-40 мкг VLPs HPV 16 и HPV 18, со сниженными дозами других онкогенных типов HPV (31, 45, 52), как описано здесь, соответственно при уровне менее чем 20 мкг на VLP, соответственно при уровне, способном вызывать защитный иммунный ответ по меньшей мере у некоторых вакцинированных индивидуумов.
Другие дозы, подходящие для применения людям, могут включать более низкие количества HPV 16 и/или 18, при условии, что такие дозы являются защитными для людей, что можно оценить с использованием приведенных здесь исследований. Такие дозы могут подходить, когда VLPs по изобретению объединяют, например, с сильными адъювантами.
В одном из аспектов композиция по изобретению включает 20 мкг HPV 16, 20 мкг HPV 18 и 5-18 мкг каждой из VLP другого онкогенного типа (31, 45 или 52), например 5-15 мкг, и в еще одном аспекте конкретно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14 или 15 мкг VLP каждого онкогенного типа, отличного от HPV 16/18.
В одном из аспектов композиция по изобретению включает 10-15 мкг HPV 16, 10-15 мкг HPV 18 и 5-9 мкг каждой из VLP другого онкогенного типа (31, 45 или 52), и в одном из аспектов конкретно 5, 6, 7, 8 или 9 мкг VLP каждого онкогенного типа, отличного от HPV 16/18.
В одном из аспектов отношение по массе VLP HPV 16 к массе VLP другого онкогенного типа (31, 45 или 52) находится в диапазоне от 1:0,9 до 1:0,1 (HPV 16:другой тип), подходящим образом в диапазоне от 1:0,9 до 1:0,3, подходящим образом от 1:0,8 до 1:0,4.
В одном из аспектов отношение по массе VLP HPV 18 к массе VLP другого онкогенного типа (31, 45 или 52) находится в диапазоне от 1:0,9 до 1:0,1 (HPV 18:другой тип), подходящим образом в диапазоне от 1:0,9 до 1:0,3, подходящим образом от 1:0,8 до 1:0,4.
Другими словами, сниженная доза подходящим образом составляет 10-90% дозы VLPs HPV 16 или HPV 18 и в одном из аспектов составляет 20-80% от дозы VLPs HPV 16 или HPV 18, в еще одном аспекте 30-70%, в еще одном аспекте 30-60% и конкретно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% дозы HPV 16 или HPV 18.
В одном из аспектов композицию подходящим образом используют для профилактики одной или более чем одной инфекции из HPV-16 и/или HPV-18, персистентной инфекции HPV-16 и/или HPV-18 и рака шейки матки, ассоциированного с HPV-16 и/или HPV-18.
Подходящим образом, иммуногенную композицию по изобретению применяют для профилактики рака шейки матки и/или эпизодической и/или персистентной инфекции, ассоциированной с инфекцией другими онкогенными типами (отличными от HPV 16, 18).
Подходящим образом иммуногенную композицию по изобретению применяют при активной иммунизации взрослых женщин и женщин-подростков в возрасте от 10 лет. Для всех композиций и вакцин по изобретению композицию или вакцину подходящим образом используют для вакцинации девушек-подростков в возрасте 10-15, предпочтительно 10-13 лет. Композиция или вакцина также может быть введена более пожилой взрослой женщине в случае аномального мазка Папаниколау или после хирургического вмешательства по удалению повреждения, вызванного HPV, или тем, кто являются серонегативными и ДНК-негативными в отношении онкогенных типов HPV. Женщины в возрасте 10-55 лет представляют еще одну подходящую целевую группу. В еще одном аспекте вакцину можно применять девочкам и женщинам всех возрастов, начиная с младенцев, и в еще одном аспекте вакцина может быть введена мальчикам или мужчинам. В еще одном аспекте вакцину можно терапевтически применять женщинам, являющимся серопозитивными в отношении вируса HPV.
В одном из аспектов композицию по изобретению применяют для профилактики или лечения рака шейки матки или болезненных состояний цервикальной интраэпителиальной неоплазии CIN I, CIN II или CIN III, вызванных инфекцией HPV.
В одном из аспектов вакцину вводят по схеме приема в 2 или 3 дозы, например по схеме приема в 0, 1 месяц, или 0, 2 месяц, или 0, 2, 6 месяцы или 0, 1 и 6 месяцы соответственно. Подходящим образом схема приема вакцины включает бустер-инъекцию через 3-10 лет или 5-10 лет, а именно предпочтительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет.
В одном из аспектов композиция или вакцина по изобретению представляет собой жидкий вакцинный препарат, хотя вакцина может быть лиофилизирована и разведена перед введением. Также могут быть использованы, например, препараты для местного введения, такие как интравагинальные кремы.
Все публикации в настоящей заявке на изобретение, включая заявки на патенты и выданные патенты, включены в данное описание путем ссылки.
Композиции и вакцины по изобретению включают определенные компоненты HPV, как изложено выше. В еще одном аспекте изобретения вакцина состоит по существу из указанных компонентов, или состоит из них.
Настоящее изобретение, таким образом, проиллюстрировано путем ссылки на следующие не ограничивающие примеры, относящиеся к перекрестному иммунитету посредством VLPs HPV 16 и HPV 18, и демонстрирующие получение VLPs HPV.
Пример 1
Здоровых женщин в возрасте от 15 до 25 лет иммунизировали смесью L1 VLPs HPV 16 и HPV 18. При регистрации женщины были: 1) серонегативными в отношении HPV-16 и HPV-18; 2) негативными в отношении инфекции шейки матки HPV с высоким риском (обнаруживаемой путем ПЦР HPV); 3) в течение жизни имели 6 или меньшее количество сексуальных партнеров и 4) имели нормальные мазки Папаниколау.
Смесь содержала на дозу 0,5 мл 20 мкг L1 VLP HPV-16, 20 мкг L1 VLP HPV-18 и в качестве адъюванта 500 мкг гидроксида алюминия и 50 мкг 3Д-МФЛ. Группе плацебо инъецировали только 500 мкг гидроксида алюминия.
Оценивали эффективность вакцины (ЭВ) против онкогенных типов HPV с высоким риском, где ЭВ представляет собой % улучшения защиты от инфекции с помощью вакцины по сравнению с группой плацебо.
Перекрестный иммунитет оценивали путем обнаружения наличия нуклеиновой кислоты, специфичной в отношении различных онкогенных типов в вакцинах и контрольной группе. Обнаружение осуществляли с использованием способов, описанных в WO 03014402 и ссылок в ней, в частности путем неспецифической амплификации ДНК HPV и последующего обнаружения типов ДНК с использованием системы LiPA, как описано в WO 99/14377 и в Kleter et al, [Journal of Clinical Microbiology (1999), 37 (8): 2508-2517], которые включены в данное описание изобретения путем ссылки.
Тем не менее, для обнаружения ДНК HPV в образце может быть использован любой подходящий способ, такой как ПЦР, специфичная в отношении типа, с использованием праймеров, специфичных в отношении каждого интересующего типа HPV. Подходящие праймеры известны специалисту в данной области техники или легко могут быть сконструированы, принимая во внимание, что последовательности онкогенных типов HPV известны.
Эффективность вакцины оценивали в отношении инфекций для всех из 12 онкогенных типов с высоким риском, типов, филогенетически родственных HPV-16 (группы 31, 35, и 58; 31, 33, 35, 52 и 58) и типов, филогенетически родственных HPV-18 (45 и 59).
Исходный анализ осуществляли на группе "ITT" (intention To Treat, "все включенные в исследование", представляющую собой всех индивидуумов, получивших по меньшей мере одну дозу вакцины). Эти данные представлены в Таблице 1.
Результаты, представленные в Таблицах 2 и 3, относятся к группе "АТР" (According To Protocol, "в соответствии с протоколом") для пациентов, удовлетворяющих всем критериям исследования. Таблица 2 представляет собой срединный анализ данных, полученных у всех пациентов в момент времени, в который по меньшей мере у 50% группы прошло 18 месяцев после первой вакцинации. Таблица 3 представляет окончательные результаты, причем все данные получены у субъектов, для которых прошло 18 месяцев после первой вакцинации (месяц 0). В группе АТР все пациенты получали 3 дозы вакцины в 0, 1 и 6 месяцы и были серонегативными на 6 месяц.
Как продемонстрировано данными, представленными в Таблице 1, иммунизация смесью VLPs HPV 16 и HPV 18 обеспечивала явную перекрестную иммунизацию против других типов HPV. В этот момент размеры образца слишком малы для того, чтобы обеспечить точный статистический анализ, тем не менее, данные демонстрируют положительную тенденцию и свидетельствуют о том, что иммунизация VLPs HPV 16 и HPV 18 эффективна против инфекции другими типами HPV.
Этот факт был подтвержден в процессе проведения исследования. Подробности протокола дополнительно описаны в Примере 3. В Таблице 2 продемонстрировано, что HPV 16 и HPV 18 обеспечивают статистически значимый перекрестный иммунитет против группы онкогенных типов с высоким риском 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68.
В Таблице 3 продемонстрировано, что за исключением типов, родственных HPV-18 (которые демонстрируют очень сильную тенденцию), существует статистически значимый перекрестный иммунитет против групп: HPV 31, 35, 58; HPV 31, 33, 35, 52, 58; и 12 оцениваемых типов с высоким риском (отличных от HPV-16/18).
Более поздний анализ данных исследований указывает на то, что комбинированная вакцина HPV 16 и 18, использованная в Примере 1, обеспечивает статистически значимый перекрестный иммунитет против статистической эпизодической инфекции HPV 31 (эффективность вакцины 75,1%, р=0,007). Хотя размер образца не дает возможности для статистически значимых заключений, которые можно было бы распространить на другие типы, данные по другим типам, таким как 39, 45, 51 и 52, демонстрируют положительную тенденцию и свидетельствуют о том, что иммунизация VLPs HPV 16 и HPV 18 будет эффективной против инфекции другими типами HPV.
Результаты, представленные в Примере 3 демонстрируют дополнительные данные, полученные в том же самом исследовании, и фокусируются на перекрестном иммунитете, обеспечиваемом против некоторых специфических типов.
нижний предел = 1-exp(log(arv/arp)+1,96*sqrt(1/nv-1/Nv+1/np-1/Np))
верхний предел = 1-exp(log(arv/arp)-1,96*sqrt(1/nv-1/Nv+1/np-1/Np))
когда количество случаев в вакцине = 0:
нижний предел* = 1-exp(log(arv*/arp*)+1,96*sqrt(1/(nv+0,5)-1/(Nv+0,5)+1/(np+0,5)-1/(Np+0,5)))
верхний предел* = 1-exp(log(arv*/arp*)-1,96*sqrt(1/(nv+0,5)-1/(Nv+0,5)+1/(np+0,5)-1/(Np+0,5)))
где:
arv = пораженная доля у вакцинированных реципиентов
arp = пораженная доля у реципиентов плацебо
nv = количество случаев у вакцинированных реципиентов
Nv = количество случаев и отсутствия случаев у вакцинированных реципиентов
np = количество случаев у реципиентов плацебо
Np = количество случаев и отсутствия случаев у реципиентов плацебо
Родственный HPV-16:
типы 35, 31, 58, филогенетически родственные HPV-16, без учета других типов HPV
Родственный HPV-16*:
типы 35, 31, 58, 33, 52, филогенетически родственные HPV-16, без учета других типов HPV
Родственный HPV-18:
типы 45, 59, филогенетически родственные HPV-18, без учета других типов HPV
Родственный HPV-16 и/или HPV-18: типы 35, 31, 58, 45, 59, филогенетически родственные HPV-16 и/или HPV-18, без учета других типов HPV
Родственный HPV-16 и/или HPV-18*: типы 35, 31, 58, 33, 52, 45, 59, филогенетически родственные HPV-16 и/или HPV-18, без учета других типов HPV
** = Типы с высоким риском за исключением HPV-16 и HPV-18
Пример 2
VLPs HPV 16 и HPV 18 могут быть получены следующим образом.
Пример 1
Комбинация L1 VLPs HPV 16 и HPV 18 подробно описана здесь. Белки L1 из других генотипов HPV могут быть легко получены способами, аналогичными уже известным в данной области техники.
А Получение L1 VLPs HPV 16/18
Получение VLPs HPV 16 и HPV 18 осуществляли с использованием стандартных протоколов - например, смотри W09913056. Белки HPV 16/18 экспрессировали в клетках Trichoplusia ni (High Five™) (при плотности приблизительно 350000 клеток/мл), инфицированных рекомбинантным бакуловирусом (MOI 0,3), кодирующим ген L1 HPV 16 или 18. Клетки собирали в течение приблизительно 72 часов после инфекции.
4.1Б Сбор клеток/экстракция антигена
Антиген (L1-16/18) экстрагировали из клеток Hi5 в трехстадийном процессе концентрирования, экстракции, очистки. На стадии концентрирования удаляют до 90% культуральной среды и стадию осуществляют путем тангенциальной проточной фильтрации. Стадию экстракции осуществляли с использованием гипотонического буфера (Tris 20 мМ, рН 8,5). Для осуществления экстракции использовали объем, равный объему культуры. Использовали время контакта, составляющее минимум полчаса при слабом встряхивании. Очистку осуществляли путем тангенциальной проточной фильтрации.
В Очистка
Способ очистки осуществляли при комнатной температуре. К экстракту добавляли β-меркаптоэтанол (4% мас./мас.) для разборки VLPs на капсомеры для обоих антигенов, L1-16/18. Глицерин добавляли до концентрации 10% мас./мас. непосредственно перед удалением β-меркаптоэтанола.
Все используемые буферы фильтровали через фильтры 0,22 мкм перед хранением при 2°С-8°С. Перед началом каждой очистки гелеобразные матрицы дезинфицировали и уравновешивали подходящим буфером перед загрузкой образца.
Режимы очистки приведены для раздельной очистки L1 HPV 16 и 18. Эти схемы во многом похожи и включают стадии:
анионообменной хроматографии (Диметиламиноэтил-ДМАЭ),
анионообменной хроматографии (Триметиламиноэтил-ТМАЭ),
хроматографии на гидроксиапатитах,
нанофильтрации (Planova),
ультрафильтрации,
хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий (с использованием октилсефарозы) для HPV 18 или анионообменной хроматографии (диэтиламиноэтил (ДЭАЭ)) для HPV 16; и стерильной фильтрации.
4.1.1 Конкретно:
4.1.2 В1 Очистка антигена L1-18
4.1.2.1 Анионообменная хроматография ДМАЭ
Очищенный экстракт (белок в концентрации приблизительно 1 г/мл, с белком L1 приблизительно при 150 мг/мл) наносят на анионообменную колонку (диметиламиноэтил). Элюирование осуществляют буфером (Трис 20 мМ/ NaCl 200 мМ/ 4% β-меркаптоэтанол (ВМЕ)), рН 7,9±0,2. Антиген элюируют приблизительно в 5 объемах колонки и профиль элюции регистрируют при 280 нм.
4.1.2.2 Анионообменная хроматография ТМАЭ
Элюат с первой стадии разбавляют 1 объемом H2O/BME 4%. Разбавленный элюат затем наносят на вторую анионообменную колонку (триметиламиноэтил). Элюирование осуществляют буфером (Трис 20 мМ/ NaCl 200 мМ/ 4% ВМЕ), рН 7,9±0,2. Антиген элюируют приблизительно в 4 объемах колонки и профиль элюции регистрируют при 280 нм.
4.1.2.3 Хроматография на гидроксиапатитах
Элюат со стадии ТМАЭ наносят на колонку из гидроксиапатита (ГА). После нанесения образца гель элюируют буфером (приблизительно 2,5 объема колонки) (NaH2PO4 100 мМ/ NaCl 30 мМ/4%ВМЕ), рН 6,0±0,2.
4.1.2.4 Нанофильтрация (Planova)
Элюат после ГА разбавляют для достижения следующих условий: буфер (NaH2PO4 25 мМ/ NaCl 10 мМ/4% ВМЕ), рН 7,5±0,2. Затем его последовательно фильтруют на 0,2 мкм префильтре и на фильтре Planova 15N площадью 0,12 м2. Фильтрацию осуществляют при постоянном давлении 20 кПа±2 кПа (200 мбар±20 мбар).
4.1.2.5 Ультрафильтрация
Ультрафильтрацию осуществляют с использованием системы тангенциальной проточной ультрафильтрации, оборудованной полиэфирсульфоновыми мембранами (кассета Centramate 0,1 м2, 100 кДа). Элюат Planova обрабатывают для достижения следующих условий: (NaH2PO4 100 мМ/ NaCl 20 мМ/ 4% ВМЕ), рН 6,0±0,2; затем его вводят в систему, концентрируют в пять раз и подвергают диафильтрации путем непрерывной инъекции приблизительно 10 исходных объемов буфера (NaH2PO4 20 мМ/NaCl 500 мМ), рН 6,0±0,2.
4.1.2.6 Хроматография на основе гидрофобных взаимодействий (октилсефароза)
Ультрафильтрат наносят на колонку из октилсефарозы. Эту стадию хроматографии проводят в негативном режиме в буфере (приблизительно в 5 объемах колонки) (Na3РO4 20 мМ/ NaCl 500 мМ), рН 6,0±0,2.
4.1.2.7 Стерильная фильтрация
Очищенный раствор антигена L1-18 стерилизуют путем фильтрации на мембране 0,22 мкм.
4.1.3
4.1.4 В2 Очистка антигена L1-16
4.1.4.1 Анионообменная хроматография ДМАЭ
Очищенный экстракт наносят на анионообменную колонку (диметиламиноэтил). Элюирование осуществляют буфером (Трис 20 мМ/ NaCl 180 мМ/ 4% ВМЕ), рН 7,9±0,2. Антиген элюируют приблизительно в 4 объемах колонки и профиль элюции регистрируют при 280 нм.
4.1.4.2 Анионообменная хроматография ТМАЭ
Элюат с первой стадии разбавляют 1 объемом H2O/BME 4%. Разбавленный элюат затем наносят на вторую анионообменную колонку (триметиламиноэтил). Элюирование осуществляют буфером (Трис 20 мМ/ NaCl 180 мМ/4% ВМЕ), рН 7,9±0,2. Антиген элюируют приблизительно в 5 объемах колонки и профиль элюции регистрируют при 280 нм.
4.1.4.3 Хроматография на гидроксиапатитах
Элюат со стадии ТМАЭ наносят на колонку из ГА. После нанесения образца гель элюируют буфером (приблизительно 3 объема колонки) (NaH2PO4 100 мМ/ NaCl 30 мМ/4% ВМЕ), рН 6,0±0,2.
4.1.4.4 Нанофильтрация (Planova)
Элюат после ГА разбавляют для достижения следующих условий: буфер (NaH2PO4 25 мМ/NaCl 10 мМ/4% ВМЕ), рН 7,5±0,2. Затем его последовательно фильтруют на 0,2 мкм префильтре и на фильтре Planova 15N площадью 0,12 м2. Фильтрацию осуществляют при постоянном давлении 20 кПа±2 кПа (200 мбар±20 мбар).
4.1.4.5 Ультрафильтрация
Ультрафильтрацию осуществляют с использованием системы тангенциальной проточной ультрафильтрации, оборудованной полиэфирсульфоновыми мембранами (кассета Centramate 0,1 м2, 100 кДа). Элюат Planova обрабатывают для достижения следующих условий: (NaH2PO4 100 мМ/NaCl 30 мМ/4% ВМЕ), рН 6,0±0,2; затем его вводят в систему, концентрируют в пять раз и подвергают диафильтрации путем непрерывной инъекции приблизительно 10 исходных объемов буфера (NaH2PO4 20 мМ/NaCl 500 мМ), рН 6,0±0,2.
4.1.4.6 Анионообменная хроматография ДЭАЭ
Элюат после ультрафильтрации доводят до проводимости уравновешивающего буфера (Na3PO4 20 мМ/ NaCl 250 мМ), рН 6,0±0,2 и наносят на анионообменную колонку (диэтиламиноэтил). Осуществляют элюцию с использованием буфера (NaH2PO4 20 мМ/NaCl 500 мМ), рН 6,0±0,2. Антиген элюируют приблизительно в 3 объемах колонки и профиль элюции регистрируют при 280 нм.
4.1.4.7 Стерильная фильтрация
Очищенный раствор антигена L1-16 стерилизуют путем фильтрации на мембране 0,22 мкм.
В3
Каждый тип VLP независимо адсорбируют с получением концентрированного адсорбированного моновалента.
Приготовление концентрированного адсорбированного моновалента VLP16:
60 мкг очищенных VLPs HPV 16 адсорбируют на 150 мкг Al3+ из Аl(ОН)3 при рН 6,0±0,2 в течение одного часа при комнатной температуре при слабом встряхивании. Этот концентрированный адсорбированный моновалент хранят при +4°С. Адсорбцию проверяют путем центрифугирования препарата и количественной оценки VLPs в супернатанте.
Приготовление концентрированного адсорбированного моновалента VLP18:
60 мкг очищенных VLPs HPV 18 адсорбируют на 150 мкг Al3+ из Аl(ОН)3 при рН 6,0±0,2 в течение одного часа при комнатной температуре при слабом встряхивании. Этот концентрированный адсорбированный моновалент хранят при +4°С. Адсорбцию проверяют путем центрифугирования препарата и количественной оценки VLPs в супернатанте.
Г Приготовление конечной вакцины:
Концентрированные адсорбированные моноваленты, приготовленные описанным выше способом, могут быть объединены с образованием суспензии, содержащей 20 мкг каждого VLP на дозу. Конечную вакцину хранят при +4°С.
При необходимости могут быть добавлены дополнительные VLPs других онкогенных типов в подходящей концентрации в соответствии с изобретением. Последовательности таких типов хорошо известны в данной области техники, и VLPs, включающие такие белки, легко могут быть экспрессированы специалистом в данной области техники.
Комбинированные адсорбированные партии или индивидуальные адсорбированные партии дополнительно могут быть смешаны с адъювантами, такими как 3Д-МФЛ.
Пример 3
Точное подробное описание проводимого эксперимента приведено в Harper et al, the Lancet. 2004 Nov 13; 364 (9447): 1757-65.
В общем, здоровых женщин в возрасте от 15 до 25 лет иммунизировали смесью L1 VLPs HPV 16 и HPV 18. При регистрации женщины были: 1) серонегативными в отношении HPV-16 и HPV-18; 2) негативными в отношении инфекции шейки матки HPV с высоким риском (обнаруживаемой путем ПЦР HPV ); 3) в течение жизни имели 6 или меньшее количество сексуальных партнеров и 4) имели нормальные мазки Папаниколау.
Смесь содержала на дозу 0,5 мл 20 мкг L1 VLP HPV-16, 20 мкг L1 VLP HPV-18 и в качестве адъюванта 500 мкг гидроксида алюминия и 50 мкг 3Д-МФЛ. Группе плацебо инъецировали 500 мкг одного гидроксида алюминия.
VLPs HPV 16 состоят из белка L1 HPV (471 аминокислота) с усеченным С-концом, с делецией 34 аминокислот. VLPs HPV 18 состоят из белка L1 HPV (472 аминокислоты) с усеченным С-концом, с делецией 35 аминокислот.
Оценивали эффективность вакцины (ЭВ) против некоторых онкогенных типов HPV, где ЭВ представляет собой % улучшения защиты от инфекции при помощи вакцины по сравнению с группой плацебо.
Перекрестный иммунитет оценивали путем обнаружения наличия нуклеиновой кислоты, специфичной в отношении различных онкогенных типов в вакцинах и контрольной группе. Обнаружение осуществляли с использованием способов, описанных в WO 03014402, и ссылок в ней, в частности путем неспецифической амплификации ДНК HPV и последующего обнаружения типов ДНК с использованием системы LiPA, как описано в WO 99/14377 и в Kleter et al, [Journal of Clinical Microbiology (1999), 37 (8): 2508-2517], полное содержание которых включено в данное описание путем ссылки.
Тем не менее, для обнаружения ДНК HPV в образце может быть использован любой подходящий способ, такой как ПЦР, специфичная в отношении типа, с использованием праймеров, специфичных в отношении каждого интересующего типа HPV. Подходящие праймеры известны специалисту в данной области техники или могут быть легко сконструированы, принимая во внимание, что последовательности онкогенных типов HPV известны.
Подробно раздел, описывающий способы из статьи Lancet, для полноты воспроизведен ниже.
Harper et al, the Lancet. 2004 Nov 13; 364 (9447):1757-65 - подробное описание экспериментов
Первичная задача этого исследования заключалась в том, чтобы оценить эффективность вакцины в профилактике инфекции при использовании HPV-16, HPV-18 или обоих (HPV-16/18) у участников в период 6-18 месяцев, которые, как было показано исходно с помощью ELISA, являются серонегативными в отношении HPV-16/18 и в соответствии с ПЦР негативными в отношении ДНК HPV-16/18. Вторичные задачи включали оценку эффективности вакцины в профилактике персистентной инфекции HPV-16/18 и оценку эффективности вакцины в профилактике цитологически подтверждаемых плоскоклеточных интраэпителиальных поражений низкой степени (LSIL), плоскоклеточных интраэпителиальных поражений высокой степени (HSIL) и гистологически подтверждаемого LSIL (CIN 1), HSIL (CIN 2 или 3) плоскоклеточного рака, или аденокарциномы, ассоциированной с инфекцией HPV-16/18 в течение периода 6-18 месяцев и 6-27 месяцев. Профилактика цитологии атипичных плоских клеток невыясненного значения (ASCUS), ассоциированной с инфекцией HPV-16/18, была добавлена позже к итоговым анализам.
Кроме того, авторы провели пробный анализ гистопатологических конечных результатов CIN 1 и 2, ассоциированных с ДНК HPV-16/18, обнаруживаемой посредством ПЦР в пораженной ткани. Другие задачи включали оценку иммуногенности, безопасности и иммунности вакцины.
Исследователи в Северной Америке (Канада и США) и Бразилии приглашали женщин для этого исследования эффективности с помощью рекламы или на основе предыдущего участия в перекрестном эпидемиологическом исследовании HPV, которое проводили с июля по декабрь 2000 года.
Для каждого из 32 исследуемых областей получено разрешение в узаконенной комиссии относительно протокола, форм согласия и дополнений. Женщины дали отдельные письменные согласия на участие в исследовании и кольпоскопии. Для женщин, не достигших 18 лет, обязательным было согласие родителей и самого участника.
Было проведено две фазы исследования: исходная фаза для вакцинации и последующего наблюдения, завершившаяся на 18 месяц; и слепая длительная фаза наблюдения, завершившаяся на 27 месяц.
Женщины, подходящие для исходной фазы (месяцы 0-18), включали здоровых женщин в возрасте 15-25 лет, которые имели не более шести сексуальных партнеров, не имели аномальных мазков Папаниколау или аблативного или хирургического лечения шейки матки и не лечились от наружных кондилом; и которые были цитологически негативными, серонегативными в отношении антител к HPV-16 и HPV-18 в соответствии с ELISA и HPV-ДНК-негативными в соответствии с ПЦР для 14 типов HPV с высоким риском (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) не более чем за 90 дней до начала исследования.
Женщины, завершившие исходную фазу самого раннего исследования и не перенесшие аблативного или хирургического лечения шейки матки, или удаления матки после регистрации, были допущены к участию в расширенной фазе исследования (месяцы 18-27).
Процедуры
Каждая доза бивалентной вакцины из вирусоподобных частиц HPV-16/18 (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Belgium) содержала 20 мкг вирусоподобных частиц L1 HPV-16 и 20 мкг вирусоподобных частиц L1 HPV-18. Каждый тип вирусоподобных частиц получали на клеточном субстрате Spodoptera frugiperda Sf-9 и Trichoplusia ni Hi-5 с адъювантом AS04, содержащим 500 мкг гидроксида алюминия и 50 мкг 3-деацилированного монофосфориллипида А (МФЛ, Corixa, Montana, USA), содержащегося в однодозовом флаконе. Плацебо содержала 500 мкг гидроксида алюминия на дозу и по внешнему виду была идентична вакцине HPV-16/18. Каждый участник исследования получал дозу вакцины или плацебо 0-5 мл на 0 месяц, в 1 месяц и 6 месяц.
Специалисты, обеспечивающие медицинское обслуживание, получали образцы из шейки матки при помощи цервикальной кисточки и шпателя (промытого в PreservCyt, Cytyc Corporation, Boxborough, MA, USA) на цитологию и тестирование ДНК HPV при отборе и на 6, 12 и 18 месяцы. На 0 и 6 месяцы и затем каждые 3 месяца женщины сами получали цервико-вагинальные образцы при помощи двух последовательных тампонов на стержне (помещаемых в PreservCyt) для тестирования ДНК HPV. [DM Harper, WW Noll, DR Belloni и BF. Cole, Randomized clinical trial of PCR-determined human papillomavirus detection methods: self-sampling versus clinician-directed - biologic concordance and women's preferences. Am J Obstet Gynecol 186 (2002), pp.365-373]. Центральная лаборатория (Quest Diagnostics, Teterboro, NJ, USA) сообщала о цитологических результатах (ThinPrep, Cytyc Corporation) путем применения системы классификации 1991 Bethesda.
В руководствах по протоколу рекомендовалась кольпоскопия после двух результатов ASCUS, или одного результата атипичных гландулоцитов невыясненного значения, LSIL или HSIL, плоскоклеточного рака, аденокарциномы in situ или аденокарциномы. В этих руководствах также рекомендовали биопсию при каждом подозрении на поражение.
Центральная гистологическая лаборатория ставила исходный диагноз на основе фиксированных в формалине образцов ткани для клинической оценки. Группа из трех патологов ставила последующий согласованный диагноз в отношении поражений, ассоциированных с HPV-16 и HPV-18 при помощи системы CIN. Этот согласованный диагноз также включал обзор срезов, полученных в момент микропрепарирования для обнаружения путем ПЦР патологической ДНК HPV.
ДНК HPV, выделенную из цитологического образца (MagNaPure Total Nucleic Acid system, Roche Diagnostics, Almere, Netherlands) и из образца цервикальной биопсии (экстракция протеиназой K), амплифицировали из аликвоты очищенной тотальной ДНК при помощи SPF 10 праймеров широкого спектра, амплифицирующих область гена L1 в 65 п.о. [В Kleter, LJ van Doom, J ter Schegget et al, Novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital human papillomaviruses. Am J Pathol 153 (1998), pp.1731-1739: LJ van Doom, W Quint, В Kleter et al, Genotyping of human papillomavirus in liquid cytology cervical specimens by the PGMY line blot assay and the SPF(10) line probe assay. J Clin Microbiol 40 (2002), pp.979-983 и WG Quint, G Scholte, LJ van Doom, В Kleter, PH Smits and J. Lindeman, Comparative analysis of human papillomavirus infections in cervical scrapes and biopsy specimens by general SPF(10) PCR and HPV genotyping. J Pathol 194 (2001), pp.51-58]. Продукты амплификации обнаруживали путем ДНК-ферментного иммуноанализа. Анализ при помощи линейных зондов (LiPA Kit HPV INNO LiPA HPV генотипирование, система SPF-10 версия 1, Inno genetics, Gent, Belgium, произведенный Labo Bio-medical Products, Rijswijk, Netherlands) позволил обнаружить 25 генотипов HPV (6, 11, 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70 и 74). [B Kleter, LJ van Doom, L Schrauwen et al, Development and clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of anogenital human papillomavirus. J Clin Microbiol 37 (1999), pp.2508-2517]. Любой образец, который был положительным по ДНК-ферментному иммуноанализу, тестировали путем ПЦР, типоспецифичной в отношении HPV-16 и HPV-18. Праймеры для ПЦР, типоспецифичной в отношении HPV-16, амплифицировали сегмент гена Е6/Е7 длиной 92 п.о., а праймеры для ПЦР, типоспецифичной в отношении HPV-18, амплифицировали сегмент гена L1 длиной 126 п.о. [MF Baay, WG Quint, J Koudstaal et al., Comprehensive study of several general and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus DNA by PCR in paraffin-embedded cervical carcinomas. J Clin Microbiol 34 (1996), pp.745-747].
Авторы определяли эпизодическую инфекцию шейки матки HPV-16/18 по меньшей мере по одному положительному результату ПЦР для HPV-16 или HPV-18 в течение исследования и персистентную инфекцию HPV-16/18 по меньшей мере по двум положительным результатам анализов ПЦР HPV-ДНК для того же самого вирусного генотипа, с периодом времени между тестами по меньшей мере 6 месяцев. [Н Richardson, G Kelsall, P Tellier et al, The natural history of type-specific human papillomavirus infections in female university students, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 12 (2003), pp.485-490 и AB Moscicki, JH Ellenberg, S Farhat и J. Xu, Persistence of human papillomavirus infection in HIV-infected and - uninfected adolescent girls: risk factors and differences, by phylogenetic type. J Infect Dis 190 (2004), pp.37-45]. Результаты HPV-ДНК теста скрыты от исследователей в процессе исследования и цитологические и гистологические диагнозы раскрывали только с целью клинического лечения. Анализы включали результаты ДНК HPV-16/18 для образцов из шейки матки и комбинированных образцов из шейки матки и полученных самостоятельно цервиковагинальных образцов.
Авторы собирали сыворотку крови у участников исследования на 0, 1, 6, 7, 12 и 18 месяцы для оценки иммуногенности. Серологическое тестирование антител к вирусоподобным частицам HPV-16 и HPV-18 осуществляли путем ELISA. Рекомбинантные вирусоподобные частицы HPV-16 или HPV-18 использовали в качестве антигенов вирусной оболочки для обнаружения антител (см. webappendix http://image.thelancet.com/extras/04 art 10103 webappendix.pdf). Серопозитивность определяли как титр, превышающий или равный отсекающему титру для анализа, установленному на уровне 8 единиц ELISA/мл для HPV-16 и 7 единиц ELISA/мл для HPV-18. Типичные природные титры определяли путем использования образцов крови, полученных у женщин в предшествующем эпидемиологическом исследовании, которые, как было обнаружено, являются серопозитивными в отношении HPV-16 или HPV-18 согласно ELISA.
Женщины записывали симптомы, которые испытывали в течение первых 7 суток после вакцинации, в ежедневных картах по трехуровневой шкале интенсивности симптомов. Дополнительно, путем интервью они сообщали персоналу, проводящему исследования, все негативные явления в течение первых 30 суток после вакцинации. В течение исследования собирали информацию о серьезных негативных явлениях и беременности.
Статистические методы
Исходя из 6% кумулятивного коэффициента заболеваемости для инфекций типов HPV-16 и HPV-18 в течение 12 месяцев, авторы оценили, что 500 женщин на исследуемую группу обеспечивали 80% возможность оценить нижний предел 95% ДИ эффективности вакцины выше нуля. Авторы предположили 80% уровень сохранения в течение 18 месяцев. Предварительные анализы эффективности, безопасности и иммуногенности осуществляли исключительно с целью планирования будущих исследований; Способ O'Brien и Fleming использовали для приведения значения для конечного анализа после проведения предварительных анализов (в общем α=0,05; двухстадийный тест). [PC O'Brien and TR. Fleming, A multiple testing procedure for clinical trials. Biometrics 35 (1979), pp.549-556].
Стратифицированную блочную рандомизацию в соответствии с принятыми алгоритмами централизовали при помощи системы рандомизации в Интернете. Стратификацию осуществляли в соответствии с возрастом (15-17, 18-21 и 22-25 лет) и регионом (Северная Америка и Бразилия). Каждой дозе вакцины присваивали случайно выбранный номер, основываясь на специфической информации об участнике, введенной в компьютерную систему рандомизации персоналом, проводящим исследования. Распределение обработки остается скрытым от исследователей и женщин, участвующих в длительном исследовании.
Группы "всех включенных в исследование" и "в соответствии с протоколом" представлены на схеме, в которой причины исключения из анализов перечислены в порядке ранжирования; женщин, удовлетворяющих более чем одному исключающему критерию, только подсчитывали в соответствии с самым высоким ранжирующим критерием. Авторы ссылаются на множества участников, входящих в анализ в соответствии с анализами "всех включенных в исследование" и "в соответствии с протоколом", как на группы, хотя информация, используемая для ограничения включения субъекта в группу "в соответствии с протоколом", стала известна только после выполнения.
Авторы провели анализы эффективности групп "всех включенных в исследование" и "в соответствии с протоколом". Расчет эффективности вакцины в 18-месячном анализе группы "в соответствии с протоколом" основан на доле участников с инфекцией HPV-16/18 в вакцинированной группе по сравнению с плацебо. Эффективность вакцины определяли как 1 минус отношение между этими двумя долями; 95% ДИ измерял точность оценки эффективности, р-значения рассчитывали при помощи двустороннего точного критерия Фишера. Соответствующие уровни выражали как количества случаев с исходами, деленные на количества участников в группе риска. 18-месячная группа "в соответствии с протоколом" включала зарегистрированных женщин, которые получили три дозы в соответствии с режимом введения вакцины и следовали протоколу, как описано на схеме.
Расчет эффективности вакцины в 27-месячных анализах групп "всех включенных в исследование" и "в соответствии с протоколом" основан на Сох пропорциональной модели рисков с использованием проявления по времени случаев инфекции HPV-16/18 в вакцинированных группах по сравнению с плацебо. Это позволило контролировать нарастающие данные для индивидуума по времени в каждой группе. Эффективность вакцины рассчитывали, используя 1 минус относительный риск, и р-значения рассчитывали с использованием логарифмического рангового критерия. Соответствующие значения выражали в виде количества случаев, деленного на общее время для индивидуума. Все зарегистрированные женщины, которые получали по меньшей мере одну дозу вакцины или плацебо, были негативными в отношении HPV-ДНК с высоким риском в 0 месяц, и имели какие-либо данные, доступные для итогового измерения, были включены в группу "всех включенных в исследование". 27-Месячная группа "в соответствии с протоколом" включала результаты исходов из 18-месячной группы "в соответствии с протоколом" и результаты, полученные в течение длительной фазы (от 18 до 27 месяцев).
Расчет р-значений для анализа безопасности осуществляли с использованием сравнений в соответствии с точным критерием Фишера. Группа для анализа безопасности включала всех зарегистрированных женщин, которые получали по меньшей мере одну дозу вакцины или плацебо и удовлетворяли установленным минимальным требованиям протокола (см. схему ниже).
Иммуногенность оценивали в подмножестве группы оценки безопасности "в соответствии с протоколом", которая включала женщин с серологическими результатами на 0, 7 и 18 месяцы, получивших все три дозы исследуемой вакцины или плацебо в соответствии со схемой, удовлетворяющих схеме отбора образцов крови, и не становились позитивными в отношении HPV-16/18-ДНК во время исследования. Уровни серопозитивности в вакцинированной группе и группе плацебо сравнивали с использованием точного критерия Фишера (р < 0,001 считалась значимой). Геометрические средние титров сравнивали с использованием теста ANOVA и Крускала-Уоллиса.
Блочную рандомизацию и статистические анализы проводили с использованием SAS, версия 8.2 (SAS Institute, Cary, North Carolina).
Результаты
Результаты исходных анализов по перекрестному иммунитету представлены в заявке на патент WO 2004/056389, которая включена в данное описание путем ссылки.
Дальнейший анализ
Анализ осуществляли в группе "АТР" ("в соответствии с протоколом") на пациентах, удовлетворяющих всем критериям исследования. В группе АТР все пациенты получали 3 дозы вакцины в 0, 1 и 6 месяцы и были серонегативными на 6 месяц.
Как продемонстрировано данными, представленными в Таблице 4, иммунизация смесью VLPs HPV 16 и HPV 18 обеспечивала статистически значимый перекрестный иммунитет против эпизодической инфекции HPV типов 31, 52 и 45 по сравнению с контролем.
Статистически значимый перекрестный иммунитет против эпизодической инфекции также наблюдали против группы типов, родственных HPV 16 (HPV-31, 33, 35, 52 и 58) и группы всех типов с высоким риском, за исключением 16 и 18 (HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68).
Статистически значимый перекрестный иммунитет против персистентной инфекции также наблюдали против типов 31 и 52 (см. Таблицу 5) и также наблюдали против группы всех типов, родственных HPV 16 (см. Таблицу 5).
Статистически значимый перекрестный иммунитет также наблюдали против цитологических аномальностей, ассоциированных с HPV 52, см. Таблицу 6. Статистически значимую защиту также наблюдали против цитологических аномальностей, ассоциированных с группой всех типов, родственных HPV 16 (HPV-31, 33, 35, 52 и 58), и группой всех типов с высоким риском, за исключением 16 и 18 (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68).
| Таблица 4 | |
| Эффективность против эпизодических инфекций типами, родственными 16/18* | |
|
| Таблица 5 | |
| Эффективность против персистентных инфекций типами, родственными 16/18* | |
|
|
| Таблица 6 | |
| Эффективность против цитологических аномальностей с использованием типов, родственных 16/18* | |
|
В Таблицах 4, 5 и 6
N = количество субъектов в конкретной группе;
ПД = пораженная доля = n (количество субъектов с эпизодической инфекцией HPV, персистентной инфекцией HPV или цитологическими аномалиями, в зависимости от таблицы)/N;
% эффективности вакцины составляет 1-(А/В)х100, приведенный к относительному размеру вакцинированной группы и группы плацебо,
где А = % женщин в вакцинированной группе с эпизодической инфекцией, персистентной инфекцией или цитологическими аномалиями, в зависимости от таблицы;
В = % женщин в группе плацебо с эпизодической инфекцией, персистентной инфекцией или цитологическими аномалиями, в зависимости от таблицы.
1. Иммуногенная композиция для создания иммунного ответа против папилломавируса человека типов HPV 16, HPV 18 и по меньшей мере одного из типов HPV 31, HPV 45 и HPV 52, включающая вирусоподобные частицы (VLPs) или капсомеры вирусов папилломы человека (HPV) 16 и 18 и по меньшей мере одного из других онкогенных типов HPV, выбранного из перечня, состоящего из типов HPV 31, 45 и 52, где доза VLP или капсомера по меньшей мере одного из других онкогенных типов снижена относительно дозы HPV 16 или 18.
2. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что другой онкогенный тип представляет собой HPV 31.
3. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что другой онкогенный тип представляет собой HPV 45.
4. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что другой онкогенный тип представляет собой HPV 52.
5. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что другие онкогенные типы представляют собой HPV 31 и HPV 45.
6. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что другие онкогенные типы представляют собой HPV 31 и HPV 52.
7. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что другие онкогенные типы представляют собой HPV 52 и HPV 45.
8. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что другие онкогенные типы представляют собой HPV 31, HPV 45 и HPV 52.
9. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что композиция содержит 10 мкг или более VLPs или капсомера HPV 16 и/или HPV 18 и от 2-9 мкг VLP, или капсомера другого онкогенного типа.
10. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что композиция содержит 20 мкг или более VLPs или капсомера HPV 16 и/или HPV 18 и от 5-15 мкг VLP, или капсомера другого онкогенного типа.
11. Иммуногенная композиция по п.10, отличающаяся тем, что композиция содержит 10 мкг VLP или капсомера другого онкогенного типа.
12. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что находится комбинации с адъювантом.
13. Иммуногенная композиция по п.12, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой соль алюминия.
14. Иммуногенная композиция по п.13, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой гидроксид алюминия.
15. Иммуногенная композиция по п.12, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой производное липида А.
16. Иммуногенная композиция по п.15, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой 3-O-деацилированный монофосфориллипид А (3Д-МФЛ).
17. Иммуногенная композиция по п.16, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой 3Д-МФЛ и гидроксид алюминия.
18. Вакцина для создания иммунного ответа против папилломавируса человека типов HPV 16, HPV 18 и по меньшей мере одного из типов HPV 31, HPV 45 и HPV 52, включающая иммуногенную композицию по любому из пп.1-17 с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
19. Способ профилактики инфекции и/или заболевания HPV, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, композиции по любому из пп.1-17 или вакцины по п.18 в эффективном количестве.
