Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к реагенту для определения аденозин-5'-трифосфата. Данный реагент содержит мутантную люциферазу светляков Luciola mingrelica (SEQ ID No:2), выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, трансформированных плазмидой pETL7, люциферин, сульфат магния, трис-(оксиметил)-аминометан, уксусную кислоту, этиленаминотетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин, сахарозу и воду. Предложенное изобретение позволяет повысить чувствительность определения АТФ, а также снизить расход фермента. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

 

Настоящее изобретение относится к области биохимии, а именно к составу реагента для количественного определения аденозин-5'-трифосфата (АТФ) на основе фермента - люциферазы светляков.

Интенсивность биолюминесценции, которая возникает в реакции люциферина, кислорода и АТФ, катализируемой люциферазой светляков, пропорциональна концентрации АТФ. При работе с растворами АТФ в широком интервале концентраций (нескольких порядков) градуировочную зависимость представляют в логарифмических координатах. Зависимость логарифма интенсивности биолюминесценции от логарифма концентрации АТФ описывается линейным уравнением:

lg(I, усл.ед.)=α+b·lg[AТФ, моль/л],

где [АТФ, моль/л] - концентрация АТФ в кювете люминометра,

(I, усл.ед.) - интенсивность биолюминесценции в условных единицах, регистрируемая на люминометре,

α и b - коэффициенты уравнения (1).

Данная реакция широко используется в аналитических целях для определения АТФ, а именно в медицинской диагностике, в контроле микробных загрязнений различных продуктов и окружающей среды. На основе этого метода разработаны методики «быстрой микробиологии» для контроля микробиологической чистоты продуктов питания, пищевого сырья, лекарств, косметических товаров, технологических материалов, воды и других напитков, для оценки стерильности оборудования и материалов в особо чистых помещениях (Угарова Н.Н., 1993, Прикладная биохимия и микробиология, т.29, №2, с.180-191).

Наиболее близким к заявляемому является Патент РФ №2268944, 2004 (Угарова Н.Н., Малошенок Л.Г. «Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата»), принятый за прототип, в котором предложен реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий растворимую люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду pLR с нативным геном люциферазы светляков Luciola mingrelica с удельной активностью 20-100 Е/мл (10-50 Е/мг белка), сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия, дитиотреитола, бычьего сывороточного альбумина и трегалозы в качестве стабилизаторов и воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза	0,001-0,01
Люциферин	0,014-0,028
Сульфат магния	0,5-0,75
Трис-(оксиметил)-аминометан	2,4-4,8
Уксусная кислота	0,1-0,2
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,15-0,22
Дитиотреитол	0,04-0,08
Бычий сывороточный альбумин	2-5
D-(+)-трегалоза	10-20
Вода	Остальное

Недостатком прототипа является недостаточно высокая каталитическая активность нативной рекомбинантной люциферазы светляков L. mingrelica, которая используется для получения АТФ-реагента. Недостатком прототипа является также невысокий выход активного фермента при наращивании биомассы в штамме Е. coli LE392, трансформированном плазмидой pLR, кодирующей нативную люциферазу светляков Luciola mingrelica, - 40-60 мг люциферазы с 1 л культуральной среды. Существенным недостатком прототипа является длительность процесса многостадийной очистки фермента с помощью ионо-обменной и распределительной хроматографии, которая составляет более трех суток и позволяет получать разбавленные растворы фермента с концентрацией не выше 1-2 мг/мл и удельной активностью 20-100 Е/мл (10-50 Е/мг белка). Существенным недостатком прототипа является невысокая термостабильность нативной рекомбинантной люциферазы, что приводит к заметному уменьшению активности люциферазы в процессе выделения и длительной очистки фермента. Кроме того, использование в качестве одного из стабилизаторов трегалозы значительно увеличивает стоимость целевого продукта.

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности определения АТФ, снижение расхода фермента за счет увеличения удельной активности реагента и повышения термостабильности люциферазы. Задачей настоящего изобретения является также снижение себестоимости реагента за счет использования вместо трегалозы более доступного стабилизатора - сахарозы, а также за счет повышения производительности процесса получения реагента путем увеличения выхода активного фермента при наращивании биомассы и повышения концентрации люциферазы в получаемом препарате фермента и, наконец, за счет снижения трудоемкости и длительности процесса очистки фермента.

Для решения поставленной задачи предлагается реагент для определения АТФ, включающий мутантную термостабильную люциферазу светляков Luciola mingrelica с удельной активностью 3000-6000 Е/мл (200 Е/мг белка), выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, трансформированных плазмидой pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков Luciola mingrelica, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия, дитиотреитола, бычьего сывороточного альбумина и сахарозы в качестве стабилизатора и воду.

В отличие от состава, принятого за прототип, предлагаемый реагент содержит менее концентрированный буферный раствор и меньшую концентрацию ряда других компонентов (этилендиаминтетраацетат натрия, дитиотреитол и бычий сывороточный альбумин), а также вместо трегалозы содержит сахарозу. Использование менее концентрированного раствора и сахарозы для приготовления реагента существенно снижает себестоимость реагента, что является дополнительным преимуществом предлагаемого изобретения.

В отличие от состава, принятого за прототип, предлагаемый реагент включает мутантную люциферазу светляков Luciola mingrelica (SEQ ID No:2), выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, трансформированных плазмидой pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков Luciola mingrelica, кодирующим (по сравнению с исходным ферментом, SEQ ID No:1) аминокислотную последовательность фермента с восемью заменами (Сер118Цис, Цис146Сер, Лиз156Арг, Арг211Лей, Тре213Сер, Ала217 Вал, Глу356Лиз, Сер364Цис), дополнительной последовательностью Мет-Ала-Сер-Лиз на N-конце и дополнительной последовательностью Сер-Глу-Про-Вал-Глу-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис на С-конце вместо последовательности Ала-Лиз-Мет. Получение плазмиды pETL7 проводят методом случайного мутагенеза плазмиды pLR3 (Кокшаров М.И., Угарова Н.Н., 2008, Биохимия, т.73, с, 1071-1080) с помощью полимгразной цепной реакции пониженной точности (Cirino Р.С., Мауеr К., Umeno D., 2003, Methods Mol Biol, v.231, p.3-9), как описано в примере 1. Получение штамма E.coli, трасформированного плазмидой pETL7, наращивание биомассы клеток, выделение и очистку люциферазы методом металло-хелатной хроматографии проводят, как описано в примере 2. В результате получают раствор высокоочищенной мутантной люциферазы светляков Luciola mingrelica с концентрацией активного фермента 15-30 мг/мл, удельной активностью 3000-6000 Е/мл (200 Е/мг белка), термостабильность которого превышает термостабильность исходного фермента в 65 раз при 42°С. Данный препарат люциферазы используют для приготовления реагента.

Согласно изобретению реагент для определения аденозин-5'-трифосфата (АТФ) содержит растворимую рекомбинантную мутантную, высокоочищенную, высокоактивную и высокостабильную люциферазу Luciola mingrelica, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с мутантным геном люциферазы светляков, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этиленаминотетраацетата натрия, дитиотреитола, бычьего сывороточного альбумина и сахарозы в качестве стабилизаторов и воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза	0,003-0,006
Люциферин	0,014-0,028
Трис-(оксиметил)-аминометан	0,605-1,210
Сульфат магния	0,246-0,492
Уксусная кислота	0,10-0,20
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,038-0,076
Дитиотреитол	0,008-0,016
Бычий сывороточный альбумин	0,5-1,0
Сахароза	9,0-18,0
Вода	Остальное

Повышение активности реагента для определения АТФ с помощью предлагаемого реагента достигается за счет увеличения удельной активности мутантной люциферазы, используемой для получения реагента. В случае прототипа удельная активность люциферазы составляет 10-50 Е/мг белка, а активность реагента составляет 0,5-5,0 Е/мл. С использованием по данному изобретению мутантной люциферазы с удельной активностью 200 Е/мг получают реагент с активностью 6,0-12,0 Е/мл. Для реагента по данному изобретению чувствительность определения АТФ повышается в ~ 10 раз: предел определения снижается от ~10^-12 М АТФ (по прототипу) до ~10^-13 М АТФ (по данному изобретению). При этом сокращается расход фермента: по прототипу реагент содержит до 0.01 мас.% люциферазы, а предлагаемый реагент содержит до 0,006 мас.% люциферазы. Повышение термостабильности люциферазы достигается за счет использования плазмиды pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков Luciola mingrelica, кодирующим восемь замен в аминокислотной последовательности фермента, введение которых приводит к повышению стабильности люциферазы при 42°С в 65 раз.

Увеличение выхода активного фермента достигается за счет использования плазмиды pETL7 и клеток Е. coli BL21(DE3)CodonPlus для наращивания биомассы, что позволяет получать до 230 мг активной люциферазы с 1 л культуральной среды, в то время как по прототипу выход активной люциферазы не превышает 60 мг/л. Снижение трудоемкости и сокращение длительности процесса очистки фермента достигается за счет использования плазмиды pETL7, кодирующей фермент с шестигистидиновой последовательностью на С-конце. Это позволяет проводить быструю очистку фермента с помощью металло-хелатной хроматографии и тем самым сокращать длительность очистки с трех суток (по прототипу) до 4-х часов по данному изобретению и получать раствор фермента с концентрацией 15-30 мг/мл (3000-6000 Е/мл).

Реагент для определения АТФ получают добавлением концентрированного раствора высокоочищенной мутантной люциферазы к трис-ацетатному буферному раствору, рН 7,8, содержащему люциферин, сульфат магния, этилендиаминтетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и сахарозу. После тщательного перемешивания раствор фильтруют через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют определенный объем деионизованной стерильной воды, получая реагент для измерения концентрации АТФ с активностью фермента 6,0-12,0 Е/мл.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение плазмиды pETL7

Плазмиду pETL7, содержащую ген мутантной термостабильной люциферазы светляков Luciola mingrelica, получают случайным мутагенезом гена люциферазы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) пониженной точности. В качестве исходной используют плазмиду pLR3 (фиг.1), содержащую ген люциферазы светляков L. mingrelica с точечной заменой Сер118Цис. Плазмида pLR3 была описана ранее (Кокшаров М.И., Угарова Н.Н., 2008, Биохимия, т.73, с.1071-1080). Затем мутантный ген люциферазы из мутантной плазмиды pLR3 (фиг.2) клонируют в плазмиду рЕТ23b (фиг.3).

1а. Получение плазмиды pLR3 с мутантным геном термостабильной люциферазы светляков L. mingrelica. Плазмиду pLR3 (фиг.1) выделяют из клеток Е. coli (штамм XL1-blue) с помощью набора реактивов фирмы Кайджен и используют в экспериментах по случайному мутагенезу участков гена NheI-Bg1II (1-1180 пар оснований) и XhoI-Bg1II (395-1180 пар оснований), который проводят в четыре цикла.

В первом цикле проводят амплификацию участка гена люциферазы между сайтами рестрикции NheI-AatII (~1800 пар оснований), используя прямой праймер NheI (ATTATAGGAGGCTAGCAAAATGG) и обратный праймер AatII (TGCCACCTGACGTCTAA). При проведении ПЦР 50 мкл реакционной смеси содержат 10 мМ Tris-HCl, рН 8.3, 50 мМ КСl, 7 мМ MgCl₂, 0,15 мМ MnCl₂, 0,2 мМ dATP, 0,2 мМ dGTP, 1 мМ dCTP, 1 мМ dTTP, 20 пмоль каждого праймера, ~2 фмоль плазмиды pLR3, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы. ПЦР проводят на амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия) при следующем температурном режиме: инкубирование 1 мин при 95°С, далее 25 циклов инкубирования смеси: 1 мин при 94°С, 1 мин при 53°С и 1 мин при 72°С и, наконец, инкубирование 10 мин при 72°С. Продукт амплификации выделяют из геля с помощью набора реактивов фирмы Кайджен, вырезают фрагмент по сайтам NheI-Bg1II, выделяют его из геля и лигируют в порезанную по этим же сайтам плазмиду pLR3, получая смесь плазмид, содержащих мутантные гены люциферазы. Штамм Е. coli XL1blue трансформируют полученной смесью плазмид, и клетки рассеивают на чашки со средой LB с ампициллином. Чашки с колониями трансформированных клеток инкубируют в течение ночи при 37°С и регистрируют биолюминесценцию колоний in vivo по методу, описанному в работе (Wood K.V., DeLuca M., 1987, Anal. Biochem.. v.16, p.501-507); чашки заливают раствором 1 мМ люциферина в 0,1 М Na-цитратном буфере (рН 5,0), встряхивают в темноте и фотографируют. Отбирают наиболее яркую колонию, экспрессирующую наиболее стабильный мутантный фермент 1ТМ1, которую используют в следующем цикле мутагенеза.

Во втором-четвертом циклах проводят случайный мутагенез участка гена XhoI-Bg1II. С помощью ПЦР амплифицируют участок XhoI-Af1II (-1240 пар оснований), используя в качестве прямого праймера XhoI (GTATTCAGCTCGAGAAAAGGCTTACC) и в качестве обратного праймера Af1 II (GCTTGTGGTTTCTTAAGAATTTCTCTAATTAC). Реакционная смесь имеет тот же состав, что указан для первого цикла мутагенеза, за исключением концентрации Мn²⁺, которая составляет 0,25 мМ. Из амплифицированного фрагмента вырезают участок XhoI-Bg1II (395-1180 пар оснований) и клонируют его в плазмиду pLR3 (фиг.2).

Чашки с колониями трансформированных клеток инкубируют в течение ночи при 37°С, затем в течение 40 мин - при повышенной температуре для инактивации in vivo недостаточно стабильных форм люциферазы (во втором и третьем цикле - при 50°С, в четвертом - при 55°С). В каждом последующем цикле в качестве исходной матрицы используют наиболее стабильный мутант, полученный в предыдущем цикле. После 4-го цикла получают мутант 4TS, колонии которого сохраняют заметное свечение даже после инкубирования в течение 20 мин при 60°С. Секвенированием полученного мутантного гена 4TS устанавливают наличие восьми мутаций, кодирующих следующие аминокислотные замены: Сер118Цис, Цис146Сер, Лиз156Арг, Арг211Лей, Тре213Сер, Ала217Вал, Глу356Лиз, Сер364Цис.

1б. Конструирование плазмиды pETL7 (фиг.3). С помощью ПЦР получают фрагмент ДНК, в котором изменены три последние аминокислотные остатки люциферазы и без разрыва рамки считывания добавлен сайт рестриктазы SaiI. Реакционная смесь в ПЦР (50 мкл) содержит 60 мМ Tris-HCl, рН 8.5, 1,5 мМ MgCb, 25 мМ КСl, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1% Тритон Х-100, 0,1 мМ dATP, 0.1 мМ dGTP, 0,1 мМ dCTP, 0,1 мМ dTTP, 20 пмоль обратного мутагенного праймера CtermHT (GTGGTCGACTGGGCCCGFTTGTGGTTTCTTFFGAATTTC) и 20 пмоль прямого праймера XhoI (GTATTCAGCTCGAGAAAAGGCTTACC), ~50 нг плазмиды pLR3, содержащей мутантный ген 4TS, 1,25 ед. TaqSE ДНК-полимеразы. Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия) при следующем температурном режиме: инкубирование 1 мин при 95°С, далее 25 циклов инкубирования смеси: 1 мин при 94°С, 1 мин при 47°С и 2 мин при 72°С и, наконец, инкубирование 10 мин при 72°С.

Полученный фрагмент гена люциферазы XhoI-SalI, кодирующий последовательность СерГлиПроВалГлуГисГисГисГисГисГис на С-конце фермента, очищают с помощью электрофореза и выделяют из геля. Рестрикцией фрагмента гена XhoI-SalI по сайту BamHI получают фрагмент BamHI-SalI, который кодирует люциферазу с 225-го аминокислотного остатка до конца. Полученный фрагмент очищают с помощью электрофореза и затем выделяют из геля. В вектор рЕТ23b, разрезанный по сайтам NheI и XhoI, лигируют фрагмент NheI-BamHI, вырезанный из плазмиды pLR3, который кодирует 1-225 аминокислотные остатки люциферазы, и фрагмент BamHI-SalI, описанный выше. Липкие концы сайтов SaiI и XhoI совместимы, и после лигирования оба сайта исчезают.

Получение компетентных клеток Е. coli BL21(DE3)CodonPlus и трансформацию клеток Е. coli BL21(DE3)CodonPlus плазмидой pETL7, проводят по известным методикам. описанным в (Д.Гловер. Клонирование ДНК. Методы. 1988, М., Мир).

Пример 2. Приготовление высокоочищенной термостабильной мутантной люциферазы L.mingrelica

Термостабильную мутантную люциферазу получают культивированием клеток Е. coli BL21(DE3)CodonPlus, содержащих плазмиду pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков L mingrelica. Клетки выращивают в 200 мл среды, содержащей 1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, рН 7.0, 0,5% глицерин, 0,05% глюкозу, 0,2% моногидрат лактозы, 0,1 мг/мл ампициллин, при инкубировании на качалке ~2 ч при 37°С, 180 об/мин до А₆₀₀=0,2-0,8, затем 14-16 ч при 23°С до А₆₀₀=5÷8. Клетки осаждают центрифугированием (5500 g, 10 мин, 4°С). Осадок ресуспендируют в 20 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5% Тритон Х-100. Клетки разрушают на ультразвуковом диспергаторе. Клеточные стенки и ДНК осаждают центрифугированием (39100 g, 30 мин, 4°) и отбрасывают. Надосадочный раствор (~20 мл) при 4°С наносят на Ni-IDA колонку объемом 1 мл («Амершам», США), промывают 20-40 мл 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора, содержащего 0,5 М NaCl, рН 7,5 и 20 мМ имидазол. Фермент элюируют тем же буферным раствором, содержащим 300 мМ имидазол. В полученный раствор люциферазы (2-4 мл) добавляют 0,5 М этилендиаминтетраацетат натрия, рН 8,0, до концентрации 2 мМ, 1 М дитиотреитол в 10 мМ Na-ацетатном буфере, рН 5,2 до концентрации 1 мМ. В результате получают раствор высокоочищенной термостабильной рекомбинантной люциферазы в 20 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, содержащем 0,5 М NaCl, рН 7,5, 0,3 М имидазол, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, с активностью 3000-6000 Е/мл (200 Е/мг белка). Выход активного фермента составляет около 230 мг на 1 л культуральной среды. Концентрация люциферазы в полученном растворе составляет 15-30 мг/мл.

Пример 3. Приготовление реагента для определения АТФ на основе высокоочищенной термостабильной мутантной люциферазы

а. 0,1 мл концентрированного раствора люциферазы, полученной, как описано в примере 2, в 20 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, содержащем 0,5 М NaCl. рН 7,5, 0,3 М имидазол, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол с активностью 3000 Е/мл, добавляют к 49,9 мл 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 10 мМ сульфат магния, 1 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 0,5 мМ дитиотреитол, 5 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 90 мг/мл сахарозу, тщательно перемешивают, фильтруют в стерильных условиях (под ламинаром) через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы по 2,0 мл, замораживают лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют 2,0 мл деионизованной стерильной воды и получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 6 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза	0,003
Люциферин	0,014
Трис-(оксиметил)-аминометан	0,605
Сульфат магния	0,246
Уксусная кислота	0,10
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,038
Дитиотреитол	0,008
Бычий сывороточный альбумин	0,5
Сахароза	9,0
Вода	Остальное

б. Все операции проводят, как описано в примере 3а, но используют концентрированный раствор люциферазы с активностью 6000 Е/мл и 49,9 мл 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 1,0 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 180 мг/мл сахарозы. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 12,0 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза	0,006
Люциферин	0,028
Трис-(оксиметил)-аминометан	1,210
Сульфат магния	0,492
Уксусная кислота	0,20
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,076
Дитиотреитол	0,016
Бычий сывороточный альбумин	1,0
Сахароза	18,0
Вода	Остальное

Пример 4. Методика определения АТФ

0,05 мл реагента, полученного, как описано в примере 3, вводят в цилиндрическую микрокювету объемом 0,2 мл и диаметром 7 мм. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра ЛЮМ-1 и регистрируют фоновый сигнал, который, как правило, равен или менее 50 усл.ед. Затем вводят 0,05 мл раствора АТФ с известной концентрацией. Раствор быстро перемешивают и регистрируют интенсивность биолюминесценции (I). Разность между измеренной интенсивностью биолюминесценции (I) и фоновым сигналом является величиной, которая характеризует интенсивность биолюминесценции измеряемого раствФора АТФ и пропорциональна концентрации АТФ в кювете люминометра. Процедуру повторяют для растворов с различными концентрациями АТФ. Результаты измерений с использованием реагентов, полученных по примеру 3а-3б, показаны в таблице.

Зависимость логарифма интенсивности биолюминесценции от логарифма концентрации АТФ описывается уравнением (1). Для реагента, получаемого по примеру 3а, эта зависимость описывается уравнением:

Igf[I, усл.ед.]=13,494+0,9307·lg[AТФ, моль/л]

с величиной R²=0,9946.

Для реагента, получаемого по примеру 3б, эта зависимость описывается уравнением:

Ig[I, усл.ед.]=13,259+0,8983·lg[ATФ, моль/л]

с величиной R²=0,9943.

Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по интенсивности биолюминесценции, регистрируемой для неизвестного образца, как описано выше. Численное значение концентрации АТФ находят, используя уравнение (1). Сравнение уравнений (1), полученных для реагентов, приготовленных по примеру 3а и 3б, показывает, что величины коэффициентов в обоих уравнениях в пределах ошибки измерений совпадают. Предел обнаружения АТФ с использованием реагента, полученного по примеру 3а, составляет 9,6·10^-14 М, а при работе с использованием реагента, полученного по примеру 3б, составляет 8,2·10^-14 М. Следовательно, несмотря на различие в составе реагентов и в активности люциферазы, используемой для их получения, оба реагента позволяют определять концентрацию АТФ в интервале от 10^-13 до 5×10^-9 моль/л.

Таблица 1
Результаты измерения концентрации АТФ с использованием реагента, полученного по примерам 3а-3б
Концентрация АТФ в кювете, моль/л	Интенсивность биолюминесценции, (I), усл.ед. (с вычетом фона)
Реагент по примеру 3а	Реагент по примеру 3б
5×10-9	694988	846484
2,5×10-9	359988	369984
5×10-10	75388	84984
2,5×10-10	35788	38384
5×10-11	6028	8584
2,5×10-11	3688	4084
5×10-12	1088	1684
2,5×10-12	430	547
5×10-13	202	230
2,5×10-13	61	122
Фоновый сигнал	12	16

1. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, люциферин, сульфат магния, трис-(оксиметил)-аминометан, уксусную кислоту, этилендиаминтетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и воду, отличающийся тем, что он содержит сахарозу в качестве стабилизатора и мутантную люциферазу светляков Luciola mingrelica (SEQ ID No:2), выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, трансформированных плазмидой pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков Luciola mingrelica, кодирующим (по сравнению с исходным ферментом, SEQ ID No:1) аминокислотную последовательность фермента с восемью заменами (Сер118Цис, Цис146Сер, Лиз156Арг, Арг211Лей, Тре213Сер, Ала217Вал, Глу356Лиз, Сер364Цис), дополнительной последовательностью Мет-Ала-Сер-Лиз на N-конце и дополнительной последовательностью Сер-Глу-Про-Вал-Глу-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис на С-конце вместо последовательности Ала-Лиз-Мет при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза	0,003-0,006
Люциферин	0,014-0,028
Трис-(оксиметил)-аминометан	0,605-1,210
Сульфат магния	0,246-0,492
Уксусная кислота	0,10-0,20
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,038-0,076
Дитиотреитол	0,008-0,016
Бычий сывороточный альбумин	0,5-1,0
Сахароза	9,0-18,0
Вода	Остальное

2. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата по п.1, отличающийся тем, что он содержит мутантную люциферазу светляков Luciola mingrelica с удельной активностью 3000-6000 Е/мл (200 Е/мл белка).