Способ количественного анализа количества клеток представляющей интерес бактерии в живом состоянии с применением ррнк в качестве мишени

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу количественного анализа количества клеток представляющей интерес бактерии в живом состоянии, праймеру для применения в данном способе и к набору для осуществления данного способа. Предложенное изобретение может быть использовано для количественного определения бактерий в живом состоянии. Предложенный способ включает амплификацию продукта посредством ПЦР, выполненной с применением праймеров, способных к специфической гибридизации с рРНК представляющей интерес бактерии. После чего осуществляют анализ количества клеток представляющей интерес бактерии в живом состоянии с учетом количества циклов ПЦР. Предложенное изобретение позволяет точно определять количество клеток представляющей интерес бактерии в живом состоянии в пробе для тестирования. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл.

 

Область техники

Изобретение относится к способу количественного анализа или обнаружения микроорганизма, особенно в живом состоянии, с применением рРНК в качестве мишени.

Предпосылки создания изобретения

В качестве способа количественного определения микроорганизма традиционно применялся главным образом способ, включающий получение культуры микроорганизма в предварительно подвергнутой оценке селективной среде и измерение количества микробных клеток, и способ, включающий культивирование микроорганизмов в жидкой селективной среде и измерение оптической плотности или поглощения. Следующие способы также применялись для процедуры идентификации микроорганизма, необходимой для обнаружения микроорганизма в пробе: например, способ, включающий идентификацию его посредством морфологического изучения, окрашивания по Грамму и микробиологических характеристик, таких как потребность в кислороде, способность ассимилировать сахара и условия для роста в среде; способ, включающий определение микроорганизма при помощи теста ДНК-ДНК гомологии; и способ определения с применением моноклонального антитела к поверхностному антигену микробной клетки. Однако эти способы требуют времени и квалификации и, следовательно, представляли собой проблему с точки зрения быстроты и простоты.

В последние годы способы амплификации генов, включающие способ ПЦР, применялись в широком диапазоне областей в качестве методов для определения следовых количеств нуклеиновых кислот. Эти способы имеют преимущества, способные приводить к ускорению и упрощению, включая отсутствие обязательных требований для культивирования микроорганизма, содержащегося в пробе, и возможность непосредственного использования пробы в качестве образца. Таким образом, способы исследовались на предмет применения в количественном анализе и обнаружении микроорганизма.

В качестве примера, в котором способ ПЦР применялся для анализа микроорганизма, известен способ для количественного определения бактерий посредством способа ПЦР, в котором используется препарат суммарной ДНК в качестве последовательности-мишени и универсальные праймеры (Патентный документ 1). Также были получены способы с применением 16S рДНК в качестве мишени. Известные их примеры включают способ количественного анализа при помощи ПЦР с применением 16S рДНК в качестве последовательности-мишени (Патентный документ 2), способ определения кишечных бактерий посредством способа ПЦР с применением 16S рДНК в качестве последовательности-мишени (Патентный документ 3) и способ обнаружения бактерии бактериального штамма рода Lactobacillus, вызывающей помутнение пива (Патентный документ 4). Однако эти способы были проблематичны тем, что они не могут применяться в качестве альтернативы общепринятому способу, который традиционно применялся, поскольку чувствительность детекции не достигнет той величины, которую получают при применении культурального способа. В качестве примера, осуществление способа количественного анализа, как он раскрыт в Патентном документе 2, требует большого количества матрицы ДНК, соответствующего микробному числу 10⁵/мкл или более, что делает способ практически нецелесообразным. Низкая чувствительность определения связана, вероятно, с низким числом копий (количеством матрицы) суммарной ДНК или 16S рДНК, предоставленной в качестве матрицы для ПЦР в микроорганизме. Поскольку известно, что ДНК сохраняется даже после смерти микроорганизма, эти способы позволяют только выполнить количественный анализ и обнаружить мертвых и живых бактерий вместе, что также вызывает проблему, которая заключается в том, что они сложны для точного количественного анализа и обнаружения живых микроорганизмов (Непатентный документ 1).

В качестве примеров применения способа ПЦР для анализа микроорганизмов также осуществлялись попытки использовать способы с применением мРНК в качестве последовательности-мишени; известные примеры этих способов включают количественный анализ лактобактерий в фекалиях, с использованием мРНК в качестве последовательности-мишени (Непатентный документ 2). Известны также способы определения раковых клеток, которые используют в качестве последовательностей-мишеней мРНК, специфичные для раковых клеток в пробах (Патентные документы 5 и 6). Однако даже эти способы не обеспечивают чувствительность определения в пределах, которые могут сравниться с традиционным способом в качестве способов количественного анализа. В частности, предел обнаружения для количественного анализа, как показано в Патентном документе 2, составляет только 10^3,5 или более клеток/г фекалий; способ анализа не мог применяться в качестве альтернативы общепринятому культуральному способу в связи с чувствительностью обнаружения. Кроме того, эти способы нацелены на мРНК генов, уникальных для микроорганизмов, и были непригодны для обнаружения микроорганизмов в тестируемой пробе, содержащей множество микроорганизмов, в связи с такими проблемами, как сложность конструирования праймеров и сниженная специфичность.

Соответственно, ожидалась разработка способа, который обеспечивает чувствительность определения в такой же степени, что и общепринятые способы определения, будучи быстрым способом, использующим метод ПЦР или тому подобные, и который дополнительно позволяет точно провести количественный анализ и обнаружить наличие живых микроорганизмов.

Для повышения чувствительности возможно изменение строения мишени таким образом, чтобы мишень могла быть представлена в более стабильном состоянии или в большем относительном количестве в клетках. Однако такая стабильная мишень является, возможно, нежелательной для обнаружения только живого микроорганизма, учитывая, что ожидается ее длительное сохранение также и в мертвых клетках. Таким образом, нелегко одновременно достичь определения только живых клеток и достаточно высокой чувствительности определения.

Также известно, что рРНК составляет приблизительно 85% от всего содержания РНК в клетке в виде многих копий и что рРНК является стабильной по сравнению с мРНК, поскольку она образует комплекс с белком. Также сообщается, что рРНК определяется в течение периода времени порядка 48 часов после микробной смерти (Непатентный документ 3) и, следовательно, обычно считается непригодной для обнаружения живых микроорганизмов (Непатентный документ 1).

Патентный документ 1: Опубликованный патент Японии № 2002-238585

Патентный документ 2: Опубликованный патент Японии № 2003-259879

Патентный документ 3: Опубликованный патент Японии № 2001-112485

Патентный документ 4: Опубликованный патент Японии № 10-210980

Патентный документ 5: Опубликованный патент Японии № 10-248600

Патентный документ 6: Международная публикация WO 00/17395 каталог

Непатентный документ 1: J Food Prot, vol. 67, No. 4: 823-832 (2004)

Непатентный документ 2: FEMS Microbiology Letters, vol. 231: 125-130 (2004)

Непатентный документ 3: Appl. Environ. Microbiol., vol. 64, No. 11: 4264-4268 (1998)

Целью настоящего изобретения является предоставить способ количественного анализа микроорганизмов, который позволяет достигать чувствительности определения в таких пределах, которые позволяют заменить общепринятый культуральный способ, и более точного обнаружения живых микроорганизмов.

Раскрытие изобретения

В результате интенсивных исследований, авторы настоящего изобретения обнаружили, что рРНК (т.е. 5S, 16S и 23S у бактерий и 5S, 18S, 26S или 28S в эукариотических клетках), которая, как считалось, является непригодной для определения живых микроорганизмов с точки зрения стабильности, может неожиданно быть использована в качестве мишени для точного количественного анализа и определения количества живых микробных клеток без включения мертвых клеток и, более того, что применение способа ПЦР в количественном анализе и определении может достигать такой чувствительности определения, которая позволяет заменить общепринятый способ, и таким образом, настоящее изобретение достигло своей цели.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ количественного анализа представляющих интерес микроорганизмов с применением в качестве показателя количества рРНК микроорганизма в тестируемой пробе.

Настоящее изобретение также предоставляет способ определения представляющих интерес микроорганизмов с применением в качестве показателя присутствия рРНК микроорганизма в тестируемой пробе.

Настоящее изобретение также предоставляет фрагмент нуклеиновой кислоты, используемый в вышеописанном способе, где фрагмент представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в одной из SEQ ID NO: 2, 3 и 5-28, или комплементарную ей последовательность оснований, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную или функционально эквивалентную ей.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет набор для осуществления вышеописанного способа.

Способ определения с использованием в качестве мишени рРНК в соответствии с настоящим изобретением может применяться для достижения высокой чувствительности определения по сравнению со способом, использующим общепринятую мишень, вследствие присутствия мишени в большом количестве, при также более точном определении и количественном анализе живых микроорганизмов. Способ ПЦР может также применяться при определении для достижения такой чувствительности определения, которая позволяет заменить общепринятый культуральный способ. Кроме того, способ с применением способа ПЦР может обеспечивать заметную быстроту и простоту по сравнению с общепринятыми способами, такими как культуральный способ. Другими словами, способ по настоящему изобретению может применяться для одновременного обеспечения высокой чувствительности определения, более точного количественного анализа и/или определения живых организмов и быстроты и простоты. Таким образом, способ по настоящему изобретению может применяться на практике, когда требуется обнаружить и/или оценить количественно микроорганизм, так как это делается при исследовании кишечной флоры, и определение и/или количественный анализ микроорганизмов, живущих в пробе, взятой из пищевого продукта или организма.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой ряд графиков, показывающих корреляцию между ростом различных микроорганизмов и значением транскрипции рРНК.

Фигура 2 представляет собой ряд графиков, каждый из которых показывает стандартную кривую, полученную посредством количественного способа RT-ПЦР, и сравнения по диапазону определения этого способа и способа количественной ПЦР.

Фигура 3 представляет собой график, показывающий предел определения P. aeruginosa из фекалий человека.

Фигура 4 представляет собой график, показывающий сопоставление количественных значений для энтеробактерий в фекалиях человека при определении способом количественной RT-ПЦР и культуральным способом.

Фигура 5 представляет собой ряд графиков, показывающих чувствительность определения E. coli, S. aureus и B. cereus в коровьем молоке.

Фигура 6 представляет собой ряд графиков, показывающих чувствительность определения P. aeruginosa и S. aureus в крови.

Фигура 7 представляет собой график, показывающий чувствительность определения E. coli в ферментированном молочном продукте.

Лучшие варианты осуществления изобретения

Способ количественного анализа или определения представляющих интерес микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением характеризуется применением показателя численности или наличия рРНК микроорганизма в тестируемой пробе.

Под рРНК представляющего интерес микроорганизма подразумевается рРНК, которую может иметь микроорганизм, который должен быть подвергнут количественному анализу и определению. Примеры рРНК включают прокариотические 5S, 16S и 23S рРНК и эукариотические 5S, 5.8S, 18S, 26S и 28S рРНК; 16S, 23S, 18S и 26S рРНК являются особенно предпочтительными тем, что они в основном применяются в качестве надежных показателей в современной классификации микроорганизмов. Под представляющим интерес микроорганизмом подразумевается микроорганизм, который должен быть обнаружен и подвергнут количественному анализу, и не является ограниченным каким-либо образом. Примеры таких микроорганизмов включают микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae и родов Enterococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Veillonella, Pseudomonas, Clostridium, Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Prevotella, Ruminococcus, Fusobacterim, Propionibacterium, Peptostreptococcus, Vibrio, Bacillus, Campylobacter, Acinetobacter, Lactococcus, Pediococcus, Weissella, Leuconostoc, Oenococcus, Helicobacter, Neisseria, Listeria, Haemophillus, Mycobacterium, Gardnerella, Legionella, Aeromonas, Moraxella и Candida, и микроорганизмы, как описано в Таблицах 2 и 3, которые будут упоминаться далее. Представляющий интерес микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением представляет собой понятие, включающее не только микроорганизм одного штамма, но также и одной группы, рода и семейства, которые состоят из популяции 2 штаммов или более, обладающих определенными свойствами.

Тестируемая проба относится к объекту, который должен быть исследован на предмет наличия, численности микроорганизма или тому подобного. Примеры тестируемых проб включают пробы из биологического источника, такого как мазок из конъюнктивы глаза, зубной камень, зубной налет, мокрота, мазок из зева, слюна, выделения из носа, бронхоальвеолярный смыв, плевральный выпот, желудочный сок, смыв из желудка, моча, цервикальная слизь, влагалищные выделения, участки повреждения кожи, фекалии, кровь, асцитическая жидкость, ткань, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость и смыв с участка повреждения; и объекты, потенциально содержащие микроорганизмы, такие как пища, лекарственные препараты, косметические средства, полупереработанные пищевые продукты (полуфабрикаты), лекарственные препараты и косметические средства, микробный бульон, растения, почва, активированный ил и дренажная вода. Образец пробы для тестирования относится к образцу, взятому или полученному из пробы для тестирования, и конкретно никак не ограничен, при условии, что образец способен отражать наличие или численность микроорганизма в пробе. Примеры образцов включают смеси, содержащие нуклеотиды, и смеси, содержащие РНК, содержащиеся в пробе для тестирования; предпочтительной с точки зрения применения способа ПЦР является смесь, содержащая РНК, присутствующие в пробе для тестирования.

Образец пробы для тестирования может быть подходящим образом получен, например, из целой или части пробы для тестирования при помощи известного способа, при необходимости, после предварительной обработки с применением способов экстракции, сепарации и очистки. В качестве примера, смесь, содержащая РНК, может быть получена, например, посредством экстракции с применением универсального способа, такого как “способ ультрацентрифугирования в среде, содержащей хлорид гуанидин-цезия”, “способ, включающий обработку кислой смесью гуанидин-фенол хлороформ (AGPC)”, “способ магнитных бус” и “способ кремниевой колонки”, при необходимости, после предварительной обработки, включающей известный способ, такой как фильтрация, центрифугирование и хроматография; также для этого может применяться коммерческий набор (например, QIAGEN RNeasy Kit, TRIZOL).

Применяемый образец пробы для тестирования предпочтительно представляет собой РНК в стабилизированном состоянии в микроорганизме, с целью предотвращения его распада для сохранения высокой чувствительности определения. Стабилизация может выполняться с применением, например, коммерческих стабилизирующих агентов (например, RNAprotect Bacterial Reagent, RNAlater). Стабилизация предпочтительно осуществляется непосредственно после взятия пробы, для того, чтобы избежать изменения количества РНК в микроорганизме.

В количественном анализе представляющего интерес микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением используется в качестве показателя количество РНК микроорганизма в пробе для тестирования. Здесь количество РНК представляющего интерес микроорганизма в пробе для тестирования может быть определено, например, посредством (1) получения количества продукта, амплифицированного при помощи ПЦР с применением фрагментов нуклеиновой кислоты, способных к специфической гибридизации с рРНК представляющего интерес микроорганизма, и образца пробы, (2) осуществления эффективной гибридизации между фрагментами нуклеиновой кислоты, способными к специфической гибридизации с рРНК представляющего интерес микроорганизма, и образца пробы или (3) применения количественного способа с применением другого известного способа.

Здесь, в случае (1) применения способа ПЦР, “фрагменты нуклеиновой кислоты, способные к специфической гибридизации с рРНК представляющего интерес микроорганизма” могут быть сконструированы посредством сравнения последовательности оснований микроорганизма с последовательностями оснований других микроорганизмов для выбора последовательностей, специфичных для рРНК, которые может иметь представляющий интерес микроорганизм. В данном описании последовательность рРНК, которую может иметь микроорганизм, может быть получена, например, посредством проверки на соответствие с базой данных (DDBJ, GenBank и так далее). Также последовательности оснований могут быть выровнены с применением программного обеспечения (например, Clustal X) для обнаружения специфических последовательностей визуальным или любым другим способом. Последовательности, специфичные для представляющего интерес микроорганизма, предпочтительно выбирают с учетом ширины границ, в которые попадает микроорганизм(ы), подвергающийся количественному анализу. В частности, например, если штамм должен быть точно определен количественно, предпочтительно выбирают последовательности, специфичные для штамма; если должен быть проведен количественный анализ рода, предпочтительно выбирают последовательности, специфичные для рода. Выбор может соответствующим образом осуществляться с применением известного способа.

В дополнение к последовательностям, сконструированным таким образом, фрагменты нуклеиновой кислоты, способные к гибридизации с рРНК представляющего интерес микроорганизма, могут быть каждый должным образом установлены на основании общеизвестных принципов в данной области; последовательность оснований, комплементарная описанной выше последовательности оснований, последовательность оснований, гомологичная ей, так же пригодна для количественного анализа представляющего интерес микроорганизма, и подобные последовательности также могут быть применены. Примеры гомологичной последовательности оснований включают фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий (а) описанную выше последовательность оснований, которая дополнительно содержит замену, вставку или делецию одного или нескольких, предпочтительно от 1 до 10 оснований, (b) последовательность оснований, идентичная описанной выше последовательности оснований на 90% или более, предпочтительно 95% или более, более предпочтительно, 99% или более, или (с) последовательность оснований, способную к гибридизации при строгих условиях с ДНК-содержащей последовательностью оснований, комплементарной описанной выше последовательности оснований.

Фрагмент нуклеиновой кислоты может также представлять собой часть фрагмента нуклеиновой кислоты, к которой с одного или обоих концов, предпочтительно, с 5'-конца, добавлены предпочтительно 100 оснований, более предпочтительно, 20 оснований, еще более предпочтительно, 10 оснований или менее.

Длина фрагмента нуклеиновой кислоты не является конкретно ограниченной; однако, фрагмент предпочтительно содержит от 5 до 50, более предпочтительно, от 12 до 35 оснований.

Фрагмент нуклеиновой кислоты, сконструированный таким образом, может быть синтезирован искусственно, например, на синтезаторе ДНК в соответствии с его последовательностью оснований. Фрагмент предпочтительно является таким, чтобы его специфичность была проверена. Здесь специфичность может быть проверена, например, посредством подтверждения того, что применение представляющей интерес рРНК в качестве матрицы обеспечивает получение определенного амплифицированного при помощи ПЦР продукта, при сравнении с подходящим контролем.

Примеры фрагмента нуклеиновой кислоты включают фрагменты нуклеиновой кислоты, содержащие последовательности оснований, описанные в SEQ ID NO: 1-30, или последовательности оснований, комплементарные им, или фрагменты нуклеиновых кислот, содержащие последовательности оснований, гомологичные или функционально эквивалентные им. В данном описании, примеры фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащих последовательности оснований, гомологичные или функционально эквивалентные им, включают фрагменты нуклеиновой кислоты, как показано в пунктах (а)-(с) ниже, которые могут применяться для количественного анализа и определения рРНК представляющего интерес микроорганизма.

(а) Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, представленную одной из SEQ ID NO: 1-30 или последовательностью оснований, комплементарной ей, где фрагмент содержит делецию, замену или вставку одного или нескольких оснований.

(b) Фрагмент нуклеиновой кислоты, последовательность которого на 90% или более, предпочтительно, 95% или более, более предпочтительно, 99% или более, идентична последовательности оснований, представленной одной из SEQ ID NO: 1-30, или последовательности оснований, комплементарной ей.

(c) Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, способную к гибридизации в жестких условиях с ДНК, содержащей последовательность оснований, представленную одной из SEQ ID NO: 1-30, или последовательность оснований, комплементарную ей.

В данном документе идентичность последовательностей оснований рассчитывается с применением программы поиска гомологии GENETYX (R).

“Жесткие условия” включают, например, проведение гибридизации при 42°С в течение от 16 до 24 часов в растворе, содержащем 50% формамид, 5×SSC, 5×раствор Дэнхарда и 250 мг/мл ДНК спермы лосося.

Фрагмент нуклеиновой кислоты, пригодный для количественного анализа и обнаружения рРНК представляющего интерес микроорганизма, может быть получен, например, посредством осуществления метода ПЦР для отбора фрагмента нуклеиновой кислоты, который обеспечивает получение продукта амплификации, если в качестве матрицы применяется рРНК данного микроорганизма, но не дает продукта при использовании в качестве матрицы другой мишени, например, рРНК другого микроорганизма или мРНК.

Затем, (1) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 1 или 2, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения Bacillus cereus; (2) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 3 или 4, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может применяться для специфического количественного анализа и обнаружения Clostridium perfringens; (3) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO:5 или 6, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может применяться для специфического количественного анализа и обнаружения Enterobacteriaceae; (4) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 7 или 8, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения Staphylococcus; (5) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 9 или 10, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения рода Pseudomonas; (6) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 11 или 12, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения рода Enterococcus; (7) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 13 или 14, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения подгруппы Lactobacillus acidophilus; (8) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 15 или 16, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения подгруппы Lactobacillus ruminis; (9) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 17 или 18, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения подгруппы Lactobacillus plantarum; (10) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 19 или 20, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения подгруппы Lactobacillus reuteri; (11) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 21 или 22, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения подгруппы Lactobacillus sakei; (12) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 23 или 24, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения подгруппы Lactobacillus casei; (13) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 25 или 26, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения Lactobacillus brevis; (14) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 27 или 28, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения Lactobacillus fructivorans; и (15) фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в SEQ ID NO: 29 или 30, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, гомологичную ей и функционально ей эквивалентную, может быть применен для специфического количественного анализа и обнаружения Lactobacillus fermentum.

В данном описании фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований в SEQ ID NO: 1, является известным фрагментом нуклеиновой кислоты, как описано в FEMS Microbiology Letters, vol. 202: 209-213 (2001). Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований в SEQ ID NO: 4, является известным фрагментом нуклеиновой кислоты, как описано в Microbiol. Immunol., vol. 46, No. 5: 353-358 (2002). Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований в SEQ ID NO: 29 или 30, является известным фрагментом нуклеиновой кислоты, как описано в Опубликованном патенте Японии № 11-151097. В отличие от этого, фрагменты нуклеиновой кислоты, содержащие последовательности оснований, описанные в SEQ ID NO: 2, 3 и 5-28, являются фрагментами нуклеиновой кислоты, найденными авторами настоящего изобретения.

Способ ПЦР с применением фрагментов нуклеиновой кислоты, полученных таким образом, и образца пробы для тестирования может осуществляться посредством “ПЦР в реакционной системе, содержащей образец, с применением фрагментов нуклеиновой кислоты в качестве праймеров и рРНК представляющего интерес микроорганизма в качестве матрицы”. Способ ПЦР не является конкретно ограниченным, при условии, что в реакции специфически амплифицируется нуклеотидный фрагмент, производный из рРНК представляющего интерес микроорганизма. Предпочтительным является способ, включающий этап использования рРНК представляющего интерес микроорганизма в качестве матрицы для получения кДНК с применением фермента, предпочтительно, обратной транскриптазы или тому подобного. Более предпочтительным является способ, включающий, в дополнение к этапу, описанному выше, стадию использования кДНК, полученной таким образом, в качестве матрицы для амплификации нуклеотидного фрагмента. Способ ПЦР может выполняться с применением, например, известной RT-ПЦР. В данном описании RT-ПЦР может проводиться с применением известного способа, такого как двухэтапный RT-ПЦР и одноэтапный RT-ПЦР; однако одноэтапный RT-ПЦР является предпочтительным, поскольку он является особенно простым и предотвращает перекрестное загрязнение.

Способ одноэтапного RT-ПЦР может выполняться с применением, например, коммерческого набора (например, набор QIAGEN One-Step RT-PCR). Фермент, имеющий транскрипционную активность, который может применяться в RT-реакции, может представлять собой любую из различных обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза M-MHV. ДНК-полимераза, применяемая в амплификации ДНК при помощи ПЦР, предпочтительно, является термостабильной при температуре 90°С и выше.

ПЦР может проводиться посредством осуществления от одного до нескольких циклов реакции температурной денатурации для преобразования двуспиральной ДНК в односпиральную ДНК, реакции отжига для гибридизации праймеров на матрице кДНК и реакции достройки (удлинения) для предоставления возможности действовать ДНК-полимеразе при температуре от 90 до 98°С, от 37 до 72°С и от 50 до 75°С, соответственно. Предпочтительный пример условий реакции является термическая денатурация при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 60°С в течение 30 секунд и достройка (удлинение) при 72°С в течение 60 секунд.

Для ПЦР два типа праймеров, предпочтительно, применяются как комплект. В данном описании необходимо составить два праймера для образования комбинации лидирующей цепи и запаздывающей цепи. Фрагменты нуклеиновой кислоты, предоставленные настоящим изобретением, составлены каждый таким образом, чтобы иметь приблизительно постоянную температуру отжига в RT-ПЦР, которая позволяет фрагментам нуклеиновой кислоты множества микроорганизмов исследоваться одновременно. Фрагмент нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может также применяться в качестве зонда и может также быть использован в комбинации с другим известным универсальным праймером, олигонуклеотидом или тому подобным.

Образец пробы для тестирования, содержащий рРНК, обеспечивающую матрицу для RT-ПЦР, предпочтительно, имеет общее содержание РНК от 1 пг до 1 мкг, более предпочтительно, от 10 пг до 0,1 мкг.

Когда ПЦР проводится должным образом, обычно существует корреляция между “количеством продукта, амплифицированного при помощи ПЦР”, “количеством циклов ПЦР” и “количеством матрицы для ПЦР”. Так, количество рРНК представляющего интерес микроорганизма может быть определено, если подсчет осуществляется должным образом с учетом количества амплифицированного продукта, образовавшегося в результате проведенной таким образом ПЦР и количества циклов ПЦР.

Как показано на Фигуре 1 Примера, который будет описан, было показано, что существует также четкая корреляция между “количеством рРНК представляющего интерес микроорганизма”, определенным таким образом, и “количеством клеток представляющего интерес микроорганизма”. Количество клеток представляющего интерес микроорганизма может, следовательно, быть определено, если подсчет осуществляется с учетом “количества рРНК представляющего интерес микроорганизма”, определенного таким образом. Даже без процесса вычисления “количества рРНК представляющего интерес микроорганизма”, количество клеток микроорганизма может быть определено посредством соответствующего расчета с учетом “количества амплифицированного продукта, образовавшегося в результате ПЦР” и “количества циклов ПЦР”, полученных описанным выше образом.

Количество амплифицированного в результате ПЦР продукта и количество циклов ПЦР можно узнать при помощи любого способа без какого-либо определенного ограничения, например, посредством определения количества циклов ПЦР, при котором количество ДНК достигает произвольно выбранного уровня. Определение может осуществляться, например, посредством применения “способа ПЦР, включающего мечение продукта ПЦР, в сочетании со способом ПЦР, включающим измерение количества метки во времени” для определения количества циклов ПЦР до достижения некой выбранной интенсивности флуоресценции. В данном описании определенная интенсивность флуоресценции предпочтительно выбирается “в диапазоне значений, которых интенсивность может достигать, когда количество продукта амплификации логарифмически возрастает”, как отражение соответствующей корреляции между ними. Диапазон значений можно должным образом понять с применением известного способа. В данном описании примеры мечения включают мечение флуоресцентным красителем; примеры измерения количества метки включают измерение интенсивности флуоресценции. Здесь примеры мечения флуоресцентным красителем включают мечение интеркалирующим флуоресцентным красителем. Примеры интеркалирующих флуоресцентных красителей включают SYBR(R) Green I. Интеркалирующий краситель имеет свойство, согласно которому интенсивность флуоресценции повышается при его включении в двуспиральную нуклеиновую кислоту, приводя, таким образом, к испусканию флуоресценции, имеющей интенсивность, которая отражает количество амплифицированного в результате ПЦР продукта. Мечение флуоресцентным красителем может также осуществляться с применением пробы TaqMan, Молекулярного маяка или тому подобного, меченными флуоресцентным красителем. Проба TaqMan или Молекулярный маяк являются пробами, в которых флуоресцентный краситель и гаситель связаны с олигонуклеотидом, гомологичным внутренней последовательности участка, амплифицированного при помощи ПЦР, и применяются благодаря возможности сосуществования в системе ПЦР. Взаимодействие флуоресцентного красителя и гасителя, связанных с пробой, делает возможным испускание флуоресценции в ответ на реакцию амплификации при ПЦР, позволяя, таким образом, наблюдение количества продукта амплификации при ПЦР по мере измерения интенсивности флуоресценции на каждом этапе ПЦР. Однако проба TaqMan, Молекулярный маяк или тому подобное делают необходимым подбор специфической для микроба комплементарной последовательности, пригодной для проведения пробы, что может являться затруднительным, в зависимости от объекта.

Количество рРНК может определяется посредством учета “количества амплифицированного в результате ПЦР продукта и количества циклов ПЦР”, исследованных таким образом, и результатов подходящего сравнительного эксперимента. В частности, количество рРНК представляющего интерес микроорганизма может быть подсчитано с применением известного способа, например, посредством учета “результатов сравнительного эксперимента, проведенного с использованием рРНК, количество которой известно” для надлежащего сопоставления с помощью этого “количества амплифицированного при ПЦР продукта и количества циклов ПЦР”, определенных, как описано выше.

Затем количество клеток представляющего интерес микроорганизма может быть определено посредством учета “количества рРНК микроорганизма”, рассчитанного таким образом, и результатов подходящего сравнительного эксперимента. В частности, количество клеток представляющего интерес микроорганизма может быть подсчитано с применением известного способа, например, посредством учета “результатов сравнительного эксперимента, осуществленного с применением образца пробы для тестирования, в котором количество клеток соответствующего микроорганизма известно” для надлежащего сопоставления с “количеством рРНК представляющего интерес микроорганизма”, подсчитанного таким образом. Напротив, для простоты, предпочтительно, применяется стандартная кривая, которая показывает корреляцию между “количеством клеток представляющего интерес микроорганизма”, примененного в качестве матрицы для ПЦР, и “количества циклов ПЦР”, когда достигается определенное количество амплифицированного в результате ПЦР продукта (далее здесь иногда называемое значение CT). Стандартную кривую, как правило, получают посредством построения графика зависимости значения CT от количества клеток микроорганизма-мишени (смотри Фигуру 2). Микроорганизм, применяемый для получения стандартной кривой, может представлять собой известный штамм, такой как его типичный штамм.

Без осуществления процесса конкретного подсчета количества рРНК, количество клеток представляющего интерес микроорганизма может также быть непосредственно подсчитано посредством надлежащего сопоставления “результатов сравнительного эксперимента, проведенного с применением образца пробы для тестирования, в котором известно количество клеток соответствующего микроорганизма” с “количеством амплифицированного при ПЦР продукта и количеством циклов ПЦР”, исследованных, как описано выше. В частности, значение CT, полученное из образца пробы для тестирования, может применяться для вышеописанной стандартной кривой.

Как описано выше, количество рРНК представляющего интерес микроорганизма в пробе для тестирования может также быть определено, например, посредством (2) определения эффективности гибридизации между фрагментом нуклеиновой кислоты, способным к специфической гибридизации с рРНК представляющего интерес микроорганизма, и образцом тестируемой пробы.

В данном описании фрагмент нуклеиновой кислоты, способный к специфической гибридизации с рРНК представляющего интерес микроорганизма, который может применяться, представляет собой, например, фрагмент, составленный и полученный, как описано выше. Фрагмент нуклеиновой кислоты, предпочтительно, является меченым фрагментом нуклеиновой кислоты. В настоящем описании примеры метки включают фермент, парамагнитный ион, биотин, флуоресцентный краситель, хромофор, тяжелый метал и радиоизотоп; более предпочтительные примеры метки включают фермент. В данном описании примеры фермента включают пероксидазу хрена и щелочную фосфатазу. Мечение может осуществляться посредством известного способа.

Количество рРНК представляющего интерес микроорганизма в тестируемой пробе и/или количество клеток микроорганизма может быть исследовано с применением известного способа преобразования посредством измерения степени гибридизации между образцом пробы для тестирования и фрагментом нуклеиновой кислоты. Способ измерения степени гибридизации не является определенно ограниченным и может выполняться в соответствии с известным способом; например, он может осуществляться посредством измерения количества метки, добавленной к фрагменту нуклеиновой кислоты. В частности, например, способ может выполняться посредством измерения интенсивности флуоресценции при использовании фрагмента нуклеиновой кислоты, меченной флуоресцентным красителем. Измерение, предпочтительно, выполняется параллельно с измерением с применением подходящего контроля. В данном описании примеры подходящего контроля включают “образец, о котором известно, что он не гибридизуется с применяемым фрагментом нуклеиновой кислоты”, “образец, производный от тестируемой пробы, в котором проба содержит уже известное количество клеток представляющего интерес микроорганизма” и “образец, взятый или полученный из пробы для тестирования, где проба содержит уже известное количество рРНК представляющего интерес микроорганизма”. При сравнении с контролем количество рРНК или число клеток представляющего интерес микроорганизма может быть получено с применением известного способа преобразования. Количество клеток представляющего интерес микроорганизма может также быть исследовано с применением известного способа с учетом количества рРНК представляющего интерес микроорганизма, рассчитанного таким образом, и результатов подходящего сравнительного эксперимента.

Способ обнаружения представляющего интерес микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением использует в качестве показателя наличия рРНК микроорганизма в образце пробы для тестирования. В данном описании термин “обнаружение микроорганизма” включает идентификацию микроорганизма. Термин также включает определение наличия детектируемого микроорганизма в пробе или отсутствие детектируемого микроорганизма в пробе.

Для определения наличия рРНК представляющего интерес микроорганизма в образце для тестирования с применением способа обнаружения настоящего изобретения, например, может применяться способ обнаружения, описанный ниже в (1), (2) или (3).

(1) Обнаружение продукта, амплифицированного посредством ПЦР с применением фрагмента нуклеиновой кислоты, способного к специфической гибридизации с рРНК представляющего интерес микроорганизма, и образца пробы для тестирования.

(2) Обнаружение гибридизации между фрагментом нуклеиновой кислоты и образцом.

(3) Обнаружение рРНК микроорганизма с применением другого известного способа.

Способы (1)-(3) могут с легкостью осуществляться с учетом ранее описанных способов. Наличие рРНК представляющего интерес микроорганизма указывает на то, что микроорганизм присутствовал в тестируемой пробе, что делает возможным обнаружение микроорганизма. Однако обнаружение, предпочтительно, выполняется путем сравнения с подходящим контролем, поскольку может происходить неспецифическая амплификация продукта ПЦР и неспецифическая гибридизация.

Как показано в описанных далее Примерах, было продемонстрировано, что высокая чувствительность определения может быть достигнута при помощи способа количественного анализа с применением количества рРНК в качестве показателя и способа обнаружения с использованием наличия рРНК в качестве показателя для сравнения с показателем общепринятых способов, применяющих в качестве показателя количество рДНК. Как показано в примерах, которые будут описаны, было также продемонстрировано, что способ с применением количества рРНК в качестве показателя может точно определить количественно микроорганизмы в живом виде, не учитывая присутствующие мертвые клетки.

Таким образом, применение способа количественного анализа или обнаружения по настоящему изобретению (далее здесь также называемый “способ по настоящему изобретению”) делает возможным выполнение специфического количественного анализа и обнаружения микроорганизма с более высокой чувствительностью определения, чем чувствительность определения в общепринятых способах, и даже в живом состоянии. Следовательно, способ по настоящему изобретению может использоваться, например, в вариантах применения, описанных в пунктах (1)-(4) ниже.

(1) Применение, в котором представляющий интерес микроорганизм, содержащийся в пробе для тестирования, подвергается количественному анализу и обнаружению в живом состоянии с более высокой чувствительностью определения, чем при общепринятых способах.

(2) Применение, в котором количество мертвых клеток микроорганизма, содержащихся в пробе для тестирования, количественно определяется и обнаруживается с более высокой чувствительностью определения, чем при общепринятых способах.

(3) Применение, в котором отношение количеств мертвых и живых клеток микроорганизма измеряется с более высокой чувствительностью определения, чем при общепринятых способах.

(4) Применение, в котором присутствие или численность живых микроорганизмов “определяются” с более высокой чувствительностью, чем при общепринятых способах.

В данном описании определение включает, например, (а) количественный анализ и обнаружение для установления наличия или численности живых микроорганизмов, когда количество клеток живых микроорганизмов должно быть установлено более аккуратно и точно, и (b) если “количество клеток живого микроорганизма” было рассчитано в другой экспериментальной системе, определение для исследования правильности эксперимента и точности рассчитанных цифровых значений. В связи с этим, когда определено количество мертвых клеток, измерение общего количества мертвых клеток и живых клеток, предпочтительно, выполняется с учетом этого, например, известным способом для обнаружения мертвых клеток вместе с живыми клетками. Количество мертвых клеток может быть определено посредством вычитания количества живых клеток, рассчитанного при помощи способа по настоящему изобретению, из общего количества клеток.

Способ по настоящему изобретению может также применяться в качестве способа для количественного анализа или обнаружения микроорганизма, который сложно измерить при помощи общепринятых способов, такой как микроорганизм, неспособный к образованию колоний, и микроорганизм, неспособный к росту в жидкой среде.

Как показано в описанных далее Примерах, было продемонстрировано, что применение способа ПЦР для количественного анализа и обнаружения может достигать такой же чувствительности определения, что и при культуральном способе. Таким образом, способ по настоящему изобретению может также применяться в качестве способа количественного анализа или определения микроорганизма с такой же или превышающей чувствительностью определения, как и при культуральном способе, т.е., при чувствительности определения 10⁰ клеток или более на грамм пробы или 10⁰ клеток или более на мл пробы.

С применением способа ПЦР количественный анализ или обнаружение микроорганизма может также проводиться очень быстро и просто, по сравнению с культуральным способом. В дополнение к этому, в соответствии со способом с применением способа ПЦР, процесс от экстракции РНК из образца до количественного анализа и определения микроорганизма может быть завершен в течение приблизительно 6 часов. Таким образом, способ по настоящему изобретению также может быть применен в качестве способа, пригодного для определения микроорганизма в течение короткого периода времени (в течение 6 часов).

Применение способа с использованием способа ПЦР, в соответствии с настоящим изобретением, может обеспечивать одновременно высокую чувствительность определения, более точный количественный анализ и обнаружение живого микроорганизма, и быстроту и простоту. Таким образом, способ по настоящему изобретению может быть использован, например, в применении “исследования заразных и опасных бактерий, патогенных микроорганизмов или тому подобного” в области медицины и пищевой промышленности, где быстрый чувствительный количественный анализ или обнаружение требуются в особенности.

Способ по настоящему изобретению может также выполняться с применением набора для выполнения способа. В данном описании примеры набора для выполнения способа включают набор, содержащий (1) фрагменты нуклеиновой кислоты, способные к специфической гибридизации с рРНК представляющего интерес микроорганизма, (2) протокол, в котором описан способ осуществления, и/или (3) реагент, применяемый для экстракции РНК, стабилизации РНК и/или ПЦР. Однако набор по настоящему изобретению не ограничен этим и относится к совокупности целого или частей необходимых элементов для осуществления полностью или частично этапов способа. В данном описании “необходимые элементы для осуществления этапов” могут соответственно пониматься с учетом изложенного описания в этой спецификации.

ПРИМЕРЫ

Содержание настоящего изобретения описано ниже более конкретно с помощью Примеров. Однако не предполагается ограничить изобретение этими примерами.

Пример 1: Получение праймеров

Для различных бактериальных штаммов, последовательности ДНК рРНК 16S и 23S получали из DNA Data Bank of Japan (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html). Эти последовательности выравнивали с применением программы Clustal W с последующим получением филогенетического древа. Штаммы классифицировали по семействам, родам и подгруппам на основании филогенетического древа; последовательности праймеров конструировали для каждой классификации. Полученные последовательности праймеров и представляющие интерес виды рРНК показаны в Таблице 1. Ссылки, в которых описаны последовательности, показаны в колонке “ссылки” в Таблице 1. Если колонка не заполнена, это показывает, что последовательность представляет собой новую последовательность, обнаруженную авторами настоящего изобретения. В связи с этим, Непатентный документ 4 представляет Microbiol. Immunol., vol. 46, No. 5: 353-358 (2002); Непатентный документ 5 представляет FEMS Microbiology Letters, vol. 202, 209-213 (2001); и Патентный документ 7 представляет Опубликованный Патент Японии № 11-151097.

Пример 2: Определение специфичности праймеров

Для определения, действительно ли праймеры Примера 1 имеют специфичность или нет, их исследовали на специфичность в отношении различных бактерий. В частности, по 50 мкл каждой из различных бактериальных культур, как показано в таблице 2 (57 видов из 28 родов) и Таблице 3 (60 видов из 18 родов), добавляли к 2-кратному объему RNAprotect Bacterial Reagent (QIAGEN) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Суспензию затем центрифугировали при 5000 g в течение 10 минут и удаляли супернатант. Туда добавляли 450 мкл бактериолитического буфера (346,5 мкл буфера RLT (QIAGEN), 3,5 мкл β-меркаптоэтанола, 100 мкл буфера TE) и 300 мг стеклянных бусин (0,1 мм в диаметре), который затем сильно перемешивали с помощью FastPrep FP120 (Bio 101) при 5000 оборотов в минуту в течение одной минуты для разрушения бактериальных клеток. К полученному раствору добавляли 500 мкл водонасыщенного фенола и затем инкубировали при 60°С в течение 10 минут. Туда же добавляли 100 мкл хлороформ/изоамилового спирта (CIA), перемешивали и затем подвергали центрифугированию по 12000 оборотов в минуту в течение 5 минут при 4°C. К извлеченному супернатанту добавляли равный объем водонасыщенного фенола/хлороформа, затем перемешивали и снова центрифугировали в тех же условиях. К извлеченному супернатанту добавляли равный объем CIA, затем встряхивали и снова подвергали центрифугированию в тех же условиях. К 400 мкл извлеченного супернатанта добавляли равный объем изопропилового спирта и 1/10 объема 3М ацетата натрия, затем перемешивали посредством перевертывания и центрифугировали при 15000 оборотов в минуту в течение 10 минут при 4°C. Супернатант удаляли, к осадку добавляли 500 мкл 75%-ного этанола, перемешивали перевертыванием и центрифугировали смесь при 15000 оборотов в минуту в течение 2 минут при 4°C. После удаления супернатанта и высушивания на воздухе содержимого пробирки, преципитат растворяли в 50 мкл воды, свободной от рибонуклеаз, для получения общего экстракта РНК. Количественный RT-ПЦР выполняли с применением набора QIAGEN One-Step RT-PCR Kit (QIAGEN). Состав реакционной смеси (общий объем: 25 мкл) был таков: 2 мкл раствора суммарной РНК (эквивалентно 2×10⁵ КОЕ); и однократный буфер QIAGEN One-Step RT-PCR Buffer, 0,5 мM смесь dNTP, 1/25 объема QIAGEN One-Step RT-PCR Enzyme Mix, 1/100000 объема SYBR(R) Green I (из Molecular Probes) и 0,75 мкM (каждого) праймеров (описанных в Tаблице 1), которая была скорректирована так, что соответствующие количества образовывали конечные концентрации. Количество РНК, эквивалентное 2×10⁵ КОЕ, применяли в качестве матрицы в RT-ПЦР. Раствор для реакции сначала подвергали реакции обратной транскрипции при 50°С в течение 30 минут и затем прогревали при 95°C в течение 15 минут для инактивации обратной транскриптазы. Вслед за этим проводили от 40 до 45 циклов 94°C в течение 20 секунд, 55°C или 60°C в течение 20 секунд и 72°C в течение 50 секунд, для измерения количества продукта амплификации по интенсивности флуоресценции SYBR(R) Green I на каждом цикле. Эти серии реакций проводили с применением системы ABI PRISM(R) 7900HT system (от Applied Biosystems).

В результате, как показано в Таблице 2, было показано, что только представляющий интерес бактериальный род или штамм может быть специфически определен при помощи праймера En-lsu 3F/3'R (Enterobacteriaceae), g-Staph-F/R (род Staphylococcus), PSD7F/R (род Pseudomonas), s-Clper-F/ClPER-R (Clostridium perfringens), S-S-Bc-200-a-S-18/Bc2R (Bacillus cereus) или g-Encoc F/R (род Enterococcus). К тому же, как изложено в Таблице 3, было показано, что только представляющая интерес подгруппа или штамм могут быть специфически определены праймером sg-Laci-F/R (подгруппа Lactobacills acidophilus), sg-Lsak-F/R (подгруппа Lactobacillus sakei), sg-Lcas-F/R (подгруппа Lactobacillus casei), sg-Lrum-F/R (подгруппа Lactobacillus ruminis), sg-Lreu-F/R (подгруппа Lactobacillus reuteri), sg-Lpla-F/R (подгруппа Lactobacillus plantarum), s-Lbre-F/R (Lactobacillus brevis), s-Lfru-F/R (Lactobacillus fructivorans) или LFer-1/2 (Lactobacillus fermentum). В таблицах 2 и 3, + показывает, что специфическое обнаружение может быть достигнуто (значение C_T от 1 до 30); - показывает, что значение C_T составляет 31 или более и что продукт амплификации не был получен.

Пример 3: Исследование соотношения между статусом роста различных микроорганизмов и уровнем транскрипции рРНК

С применением клеток Escherichia coli, S. aureus и P. aeruginosa в различных фазах роста культуры исследовали отношение количества живых бактериальных клеток, измеренное с применением культурального способа, к количеству бактериальных клеток, способных к образованию колоний, выведенное из уровня транскрипции рРНК, измеренного при помощи количественного способа RT-ПЦР. В частности, после начала аэробного выращивания культуры каждой бактерии со встряхиванием при 37°C в среде BHI, бактериальные культуры отбирали с течением времени, с последующим применением культур для измерения количества бактериальных клеток посредством культурального способа с использованием агарной среды BHI (37°C, 24 часа). С другой стороны, из так же отобранных образцов экстрагировали РНК и подвергали ее анализу количественным RT-ПЦР. Количество бактериальных клеток в каждом образце рассчитывали на основании стандартной кривой, полученной так, как описано в Примере 4, с применением РНК, экстрагированной из бактериального штамма в поздней логарифмической фазе роста, количество клеток в которой известно. В связи с этим, экстракцию суммарной РНК и количественный RT-ПЦР выполняли, как описано в Примере 2. Результаты показаны на Фигуре 1. На Фигуре 1 черный кружок (•) показывает число бактериальных клеток, рассчитанное по уровню транскрипции РНК, а белый кружок (○) показывает количество бактериальных клеток, определенное культуральным способом. Для всех бактериальных штаммов, подвергшихся анализу, от логарифмической фазы роста до фазы смерти, наблюдалось строгое соотношение между вариантами кривых количества живых бактериальных клеток, определенного культуральным способом в растворе, содержащем бактерии, и количеством бактериальных клеток, рассчитанным на основании уровня транскрипции рРНК. Это показало, что количество клеток живых микроорганизмов может быть определено при любых условиях посредством измерения уровня транскрипции рРНК.

Пример 4: Получение стандартных кривых и сравнение с количественным способом ПЦР

Стандартные кривые получали посредством способа по настоящему изобретению (количественный способ RT-ПЦР) с применением выращенных в культуре клеток P. aeruginosa YIT6108^T (типичный штамм) и S. aureus YIT6075^T (типичный штамм), в логарифмической фазе роста. Стандартные кривые получали также посредством количественного способа ПЦР для сравнения со стандартными кривыми, полученными посредством способа по настоящему изобретению. Аксенические клетки каждого штамма, выращенные в среде BHI, разделяли таким образом, чтобы обеспечить количество клеток 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹ и 10⁰, и подвергали экстракции РНК, как описано в Примере 2. Каждый экстракт подвергали количественному RT-ПЦР в соответствии с Примером 2, с применением праймеров, как описано в Таблице 1. Исследовали корреляцию между полученным значением CT и количеством клеток, определенным культуральным способом, описанным в Примере 3. С применением способа, описанного ниже, каждую из ДНК, полученных из тех же образцов, также исследовали для количественного анализа способом ПЦР с использованием рДНК в качестве последовательности-мишени. В частности, 1 мл PBS добавляли к каждому из бактериальных растворов, разделенных таким образом, чтобы обеспечить количество клеток, равное 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹ и 10⁰, каждый из них перемешивали и затем центрифугировали при 15000 оборотов в минуту в течение 5 минут при 4°C, с последующим удалением супернатанта. Процедуру повторяют дважды, при этом по 1 мл PBS добавляли к преципитату, затем перемешивали, центрифугировали и удаляли супернатант. К полученному осадку добавляли 300 мкл бактериолитического буфера (100 мM Tris-HCl, 40 мM EDTA, 1% SDS, pH: 9,0), 500 мкл TE-насыщенного фенола и 300 мг стеклянных бус (0,1 мм в диаметре), которые затем сильно встряхивали с помощью FastPrep FP120 при 5000 оборотов в течение 30 секунд для разрушения бактериальных клеток. Раствор с разрушенными бактериальными клетками центрифугировали при 15000 оборотов в минуту, при 4°C в течение 5 минут, с последующим сохранением супернатанта. К супернатанту добавляли фенол (ТЕ-насыщенный)/хлороформ/изоамиловый спирт, сильно встряхивали на FastPrep FP120 при 4000 оборотов минуту в течение 45 секунд и затем подвергали процедуре центрифугирования при 15000 оборотах в минуту, 4°C в течение 5 минут. Преципитация спиртом осуществлялась из отделенного и сохраненного супернатанта, с последующим растворением преципитата в 50 мкл буфера ТЕ для получения раствора ДНК. Впоследствии проводили ПЦР с применением полученного раствора ДНК в качестве матрицы. ПЦР проводили в реакционной смеси общим объемом 25 мкл, содержащей 2 мкл раствора ДНК и 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 50 мM KCl, 2,5 мM MgCl₂, 0,45% Triton X-100, 200 мкM смеси dNTP, 1/100000 объема SYBR(R) Green I, 11 нг/мкл антитела TaqStart(R) (от ClonTech), 0,05 Ед/мкл ДНК-полимеразы Taq (от Takara) и 0,25 мкM (каждого) праймера (PSD7F/R или g-Staph-F/R) в виде конечных концентраций. Реакционный раствор прогревали при 94°C в течение 5 минут, затем подвергали 40 циклам 94°C в течение 20 секунд, 60°C в течение 20 секунд и 72°C в течение 50 секунд, и затем выдерживали при 72°C в течение 10 минут. Количество продукта амплификации измеряли на каждом цикле по интенсивности флуоресценции SYBR(R) Green I. Эти серии реакции выполняли с применением ABI PRISM(R) 7900HT. Для этого реакции подвергали 1/25 экстрагированного количества каждой РНК и ДНК.

В результате, как показано на Фигуре 2, оба способа показали в высшей степени хорошую корреляцию между логарифмическим числом бактериальных клеток и значением C_T. На Фигуре 2 значение C_T отображает зависимость числа клеток/экстракта, измеренного посредством культурального способа для каждого бактериального штамма, служащего в качестве образца. Черный кружок (•) показывает данные количественной RT-ПЦР, а белый кружок (○) показывает данные количественной ПЦР. На аппроксимированной кривой, полученной с помощью количественного способа RT-ПЦР, коэффициент корреляции (величина R²) составляет 0,9955 для P. aeruginosa и 0,9961 для S. aureus. Это показывает, что стандартные кривые позволяют рассчитывать количество бактериальных клеток на основании величин C_T. Кроме того, количественный способ RT-ПЦР может определять 10⁰ бактериальных клеток в образцах, показывая, что способ имеет чувствительность определения, сравнимую с общепринятым культуральным способом. Это демонстрирует, что способ может применяться для количественного анализа и обнаружения микроорганизма в качестве альтернативы культуральному способу. Способ по настоящему изобретению имеет чувствительность обнаружения приблизительно в 1000 раз большую, чем способ ПЦР с применением рРНК в качестве последовательности-мишени, демонстрируя, что он имеет заметную чувствительность обнаружения по сравнению с предшествующими средствами количественного анализа микроорганизма с применением способа амплификации генов.

Пример 5: Количественное определение бактерий в фекалиях

Различные концентрации P. aeruginosa добавляли в фекалии человека для сравнения пределов обнаружения способа количественной ПЦР со способом по настоящему изобретению. Образцы фекалий с добавлением P. aeruginosa получали с количеством клеток в каждом из них, равным 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ или 10⁸ клеток на 20 мг фекалий человека. Суммарная РНК экстрагировалась из каждого образца фекалий с добавлением P. aeruginosa и применялась в качестве матрицы для осуществления количественной RT-ПЦР настоящего изобретения. Из каждого такого образца экстрагировали также ДНК и применяли в качестве матрицы для выполнения количественной ПЦР. Кроме того, в тех же образцах измеряли количество бактериальных клеток с применением культурального способа. Экстракцию суммарной РНК и способ количественной RT-ПЦР выполняли, как описано в Примере 2; культуральный способ - так, как в Примере 3; а экстракцию ДНК и способ количественной ПЦР - так, как в Примере 4. В этом смысле, 1/2500 количеств полученных суммарной РНК и суммарной ДНК подвергали количественной RT-ПЦР и количественной ПЦР, соответственно.

В результате, как показано на Фигуре 3, способ по настоящему изобретению показал линейность аппроксимированной кривой, полученной при помощи измерений в диапазоне 10^2,9-10¹⁰ клеток на г фекалий в образцах фекалий с добавлением P. aeruginosa. На Фигуре 3 уровень C_T отражает зависимость количества клеток на г фекалий, измеренного культуральным способом для P. aeruginosa, служащей в качестве образца. Черный кружок (•) показывает данные количественной RT-ПЦР и белый кружок (○) показывает данные количественной ПЦР. В фекалиях человека количественный предел способа по настоящему изобретению составил 10^2,9 клеток или более на г фекалий и являлся приблизительно сравнимым с пределом для культурального способа, который составляет 10² клеток или более на г фекалий. Культуральный способ занимает один день, в то время как способ по настоящему изобретению выполняется, от стабилизации РНК до количественного анализа, за время, равное приблизительно 6 часам. С другой стороны, при анализе способом количественной ПЦР, наблюдалась линейность аппроксимированной кривой, полученной в результате измерений в диапазоне 10^5,8-10¹⁰ клеток на г фекалий, и предел обнаружения приблизительно в 1000 раз ниже, чем предел обнаружения способом количественной RT-ПЦР.

Пример 6: Исследование энтеробактерий в фекалиях человека при помощи количественной RT-ПЦР и культуральным способом

Флору в фекалиях человека исследовали посредством количественной RT-ПЦР с применением специфических для энтеробактерий праймеров En-lsu 3F/3'R. Собрали свежие фекалии у 38 взрослых и разбавляли в отношении 1/10 при анаэробных условиях транспортной средой (10% глицерин, 5% цистеин, 1% lab lemco powder, 0,045% NaCl, 0,0225% KH₂PO₄, 0,0225% K₂HPO₄, 0,0225% (NH₄)₂SO₄, 0,00225% CaCl₂, 0,00225% MgSO₄). 200 мкл аликвоты (20 мг фекалий) забирали из раствора и подвергали экстракции суммарной РНК с применением способа количественной RT-ПЦР. Количественная RT-ПЦР выполнялась с применением 1/2500 количества суммарной РНК в качестве матрицы. Аликвота такого же раствора также повергалась количественному анализу КОЕ посредством культурального способа (селективная среда DHL). Стабилизация РНК, экстракция суммарной РНК и количественная RT-ПЦР соответствовала Примеру 2, а культуральный способ проводился в соответствии с общепринятым способом. Суммарная РНК, экстрагированная из E. coli YIT 6044^T (тип штамма), применялась для получения стандартной кривой для расчета количества бактериальных клеток посредством количественной RT-ПЦР.

В результате, как показано на Фигуре 4, было продемонстрировано, что способ количественной RT-ПЦР с применением в качестве мишени рРНК в соответствии с настоящим изобретением и культуральный способ показывают исключительно сильную корреляцию (коэффициент корреляции 0,9255). На Фигуре 4 ордината представляет результаты количественного анализа, проведенного культуральным способом, и абсцисса представляет результаты количественного анализа, полученные способом настоящего изобретения. Для культурального способа требуется 2 дня на выполнение всех операций, в то время как для способа настоящего изобретения все операции завершают в течение приблизительно 6 часов.

Пример 7: Исследование микроорганизмов в коровьем молоке

Различные концентрации E. coli, S. aureus и B. cereus добавляли в заводское коровье молоко для сравнения количественной оценки способа культивирования в слое агара на чашках со способом по настоящему изобретению. E. coli или S. aureus добавляют в заводское коровье молоко таким образом, чтобы обеспечить микробное число, равное 10⁰, 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵ и 10⁶ на мл, для получения образцов. 1 мл каждого образца подвергали экстракции суммарной РНК и 1 мл подвергали способу культивирования в агаре на чашках (E. coli: среда с дезоксихолевым агаром, S. aureus и B. cereus: традиционная агарная среда, 37°C, 20±2 часов). Вся экстрагированная РНК исследовалась посредством способа количественной RT-ПЦР с применением праймеров, как описано в Таблице 1, для обнаружения корреляции между полученным значением CT и количеством микробных клеток, полученным при помощи способа культивирования в агаре на чашках. В связи с этим, экстракцию суммарной РНК и способ количественной RT-ПЦР осуществляли способом, описанным в Примере 2; 1/25 количества всей экстрагированной РНК подвергали количественной RT-ПЦР.

В результате, как показано на Фигуре 5, величина C_T коррелировала с числом микробных клеток в диапазоне 10⁰-10⁶ клеток на мл молока для любого штамма. На Фигуре 5 величина C_T зависит от числа клеток на мл молока, измеренного посредством способа культивирования в агаре на чашках для количественного анализа E. coli (вверху слева на Фигуре 5), S. aureus (вверху справа на Фигуре 5) и B. cereus (внизу слева на Фигуре 5), служащих в качестве образца. Количественный предел способа по настоящему изобретению составляет 10⁰ клеток или более на мл молока и сравним с количественным пределом способа культивирования в агаре на чашках. Это показывает, что способ по настоящему изобретению может предоставить альтернативу способу культивирования в агаре на чашках с применением общепринятой среды для культивирования (среда с дезоксихолевым агаром или общепринятая агарная среда), как описано в Правительственном законе, касающемся стандарта состава и т.д. для молока и молочных продуктов. Кроме того, способ культивирования в агаре на чашках занимает один день, тогда как способ по настоящему изобретению выполняется, от стабилизации РНК пробы до количественного анализа, в течение приблизительно 6 часов.

Пример 8: Определение бактерий в крови

Различные концентрации S. aureus или P. aeruginosa добавляли в человеческую кровь для сравнения количественного значения способа культивирования в агаре на чашках (способа культивирования крови) с количественным значением способа по настоящему изобретению. S. aureus или P. aeruginosa добавляли, чтобы обеспечить бактериальное число 10⁰, 10¹, 10², 10³, 10⁴ и 10⁵ на мл, к человеческой крови, к которой в качестве антикоагулянта добавлена 1/10 объема 3,8% раствора цитрата натрия, для получения образцов. 0,5 мл каждого образца подвергали экстракции суммарной РНК, и 0,5 мл подвергали способу культивирования в агаре на чашках (в агаровой среде BHI). Выделенная суммарная РНК исследовалась способом количественной RT-ПЦР для определения корреляции между полученной величиной CT и числом бактериальных клеток, полученным при помощи способа культивирования в агаре на чашках. Экстракция суммарной РНК и способ количественной RT-ПЦР выполняли посредством способа, описанного в Примере 2. В связи с этим, 1/25 количества всей экстрагированной РНК подвергалась количественной RT-ПЦР.

В результате, как показано на Фигуре 6, число бактериальных клеток коррелировала со значением C_T в диапазоне 10⁰-10⁵ клеток на 0,5 мл для каждого штамма. На Фигуре 6 значение C_T зависит от количества клеток на 0,5 мл крови, измеренного посредством способа культивирования в агаре на чашках для количественного анализа P. aeruginosa (слева на Фигуре 6) или S. aureus (справа на Фигуре 6), служащей в качестве образца. Количественный предел способа по настоящему изобретению составляет 10⁰ клеток или более на 0,5 мл крови и сравним с количественным пределом способа культивирования в агаре на чашках. Это показывает, что способ по настоящему изобретению мог бы предоставить альтернативу способу культивирования в агаре на чашках. Кроме того, способ культивирования в агаре на чашках занимает один день, тогда как способ по настоящему изобретению выполняется, от стабилизации РНК пробы до количественного анализа, в течение приблизительно 6 часов.

Пример 9: Определение E. coli в ферментированном молочном продукте

E. coli добавляли к заводскому продукту Yakult (из Yakult Honsha Co., Ltd.) таким образом, чтобы обеспечить бактериальное число 10⁰, 10¹, 10², 10³, 10⁴ и 10⁵ на мл для получения образцов. 1 мл каждого образца подвергался экстракции суммарной РНК, и 1 мл подвергался способу культивирования в агаре на чашках с применением дезоксихолатной агарной среды (37°C, 20±2 часов). Суммарная экстрагированная РНК исследовалась посредством способа количественной RT-ПЦР с применением специфических для энтеробактерий праймеров En-lsu 3F/3'R для определения корреляции между полученной величиной C_T и числом микробных клеток, полученным при помощи способа культивирования в агаре на чашках. Экстракция суммарной РНК выполнялась, как описано в Примере 2, за исключением разрушения бактериальных клеток посредством добавления стеклянных бус, и способ количественной RT-ПЦР выполнялся, как описано в Примере 2. В связи с этим, 1/25 количества всей выделенной РНК подвергалась количественной RT-ПЦР.

В результате, как показано на Фигуре 7, значение C_T коррелировало с числом бактериальных клеток в диапазоне 10⁰-10⁵ клеток на мл. На Фигуре 7 значение C_T зависит от log₁₀ клеток на мл Yakult, измеренного посредством способа культивирования в агаре на чашках для количественного анализа E. coli, служащего в качестве образца. Количественный предел способа по настоящему изобретению составляет 10⁰ клеток или более на мл Yakult и сравним с количественным пределом способа культивирования в агаре на чашках. Это показывает, что способ по настоящему изобретению мог бы предоставить альтернативу способу культивирования в агаре на чашках с применением общепринятой среды для культивирования (среда с дезоксихолевым агаром), как описано в Правительственном законе, касающемся стандарта состава и т.д. для молока и молочных продуктов. Кроме того, способ культивирования в агаре на чашках занимает один день, тогда как способ по настоящему изобретению выполняется, от стабилизации РНК пробы до количественного анализа, в течение приблизительно 6 часов.

Пример 10: Определение лактобактерий и энтерококков в фекалиях человека посредством количественной RT-ПЦР и культуральным способом

Количество клеток бактерий родов Lactobacillus и Enterococcus в фекалиях человека сравнивали посредством способа количественной RT-ПЦР с применением праймеров, как описано в Таблице 1 и посредством культурального способа. Собирали свежие фекалии у 48 здоровых взрослых, обрабатывали с применением способа, описанного в Примере 6, и подвергали стабилизации РНК, экстракции суммарной РНК и количественной RT-ПЦР посредством способов, описанных в Примере 2. В связи с этим, от 1/2000 до 1/200000 количества всей полученной РНК подвергали количественной RT-ПЦР. Аликвоту такого же раствора фекалий также подвергали количественному анализу КОЕ посредством культурального способа (род Lactobacillus: среда LBS, род Enterococcus: среда COBA, при 37°C в течение 48 часов в обоих случаях). Культуральный способ выполняли в соответствии с общепринятым способом; появляющиеся колонии подвергали идентификации видов бактерий посредством тестов на биохимические свойства (окрашивание по Грамму, каталожный тест, API Strep). Число клеток бактерий рода Lactobacillus посредством способа количественной RT-ПЦР рассчитывали путем сложения количества клеток бактерий, полученных посредством способов количественной RT-ПЦР с применением праймеров sg-Laci-F/R (подгруппа Lactobacills acidophilus), sg-Lsak-F/R (подгруппа Lactobacillus sakei), sg-Lcas-F/R (подгруппа Lactobacillus casei), sg-Lrum-F/R (подгруппа Lactobacillus ruminis), sg-Lreu-F/R (подгруппа Lactobacillus reuteri), sg-Lpla-F/R (подгруппа Lactobacillus plantarum), s-Lbre-F/R (Lactobacillus brevis), s-Lfru-F/R (Lactobacillus fructivorans) и LFer-1/2 (Lactobacillus fermentum).

В результате, как показано в Таблице 4, число клеток бактерий рода Lactobacills и рода Enterococcus в фекалиях человека приблизительно сравнимы для способа по настоящему изобретению и культурального способа. В отличие от этого, частота обнаружения является высокой для обоих родов для способа настоящего изобретения по сравнению с культуральным способом. По-видимому, это обусловлено следующими причинами: (а) присутствовали бактерии, принадлежащие к роду Lactobacills или Enterococcus и являющиеся мишенями, но не растущие, поскольку селективная среда имеет селективность выше, чем это необходимо; или (b) слабая селективность применяемой селективной среды привела к росту в среде родов бактерий, представленных в большем количестве, чем мишень, которые делают невозможным определение бактериальных родов, являющихся мишенями. Описанные выше результаты дают возможность предположить, что способ по настоящему изобретению не только позволяет получать количество клеток бактерий, сравнимое с культуральным способом, но также и позволяет обнаруживать или количественно определяет бактерии, которые раньше было невозможно обнаружить культуральным способом. К тому же завершение всех операций, включая индентификацию бактериальных видов, для культурального способа занимает 7 дней, в то время как для способа настоящего изобретения все операции завершаются в течение приблизительно 20 часов.

Таблица 4
Род	Способ количественной RT-ПЦР	Культуральный способ
log10 клетка/г·фекалий	Частота (%)	log10 КОЕ/г·фекалий	Частота (%)
Lactobacillus	5,2±1,2	44/46 (96)	5,5±1,4	37/46 (80)
Enterococcus	6,2±1,0	46/46 (100)	6,2±1,9	23/46 (50)

1. Способ количественного анализа количества клеток представляющей интерес бактерии в живом состоянии с применением в качестве показателя количества рРНК представляющей интерес бактерии в пробе для тестирования, включающий измерение количества продукта, амплифицированного посредством ПЦР, выполненной с применением праймеров, способных к специфической гибридизации с рРНК представляющей интерес бактерии, и образца пробы для тестирования, и
в котором количество клеток представляющей интерес бактерии в живом состоянии определяют с учетом количества циклов ПЦР.

2. Способ по п.1, в котором измерение количества амплифицированного продукта включает определение количества циклов ПЦР, в результате которых достигается определенное количество амплифицированного продукта.

3. Способ по п.1 или 2, включающий измерение количества амплифицированного продукта во времени.

4. Способ по п.1, в котором пробу для тестирования получают из фекалий, пищи или организма.

5. Способ по п.1, в котором рРНК представляющей интерес бактерии в образце пробы для тестирования стабилизируют в бактерии.

6. Способ по п.1, в котором праймеры, способные к специфической гибридизации с рРНК представляющей интерес бактерии, представляют собой фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий каждый последовательность оснований, описанную в одной из SEQ ID NO: 2, 3 и 5-28, или последовательность оснований, комплементарную ей, или фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, способную к гибридизации в жестких условиях с ДНК, содержащей последовательность оснований, представленную одной из SEQ ID NO: 2, 3 и 5-28, или последовательность оснований, комплементарную ей.

7. Праймер, применяемый в способе по любому из пп.1-6, где праймер представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность оснований, описанную в одной из SEQ ID NO: 2, 3 и 5-28, или последовательность оснований, комплементарную ей; или
праймер содержит последовательность оснований, способную к гибридизации в жестких условиях с ДНК, содержащей последовательность оснований, представленную одной из SEQ ID NO: 2, 3 и 5-28, или последовательность оснований, комплементарную ей.

8. Набор для осуществления способа по любому из пп.1-6, включающий
(1) праймеры, способные к специфической гибридизации с рРНК представляющей интерес бактерии,
(2) dNTP,
(3) ДНК-полимеразу,
(4) реакционный буфер и/или
(5) реагент, применяемый для экстракции РНК и/или стабилизации РНК.