Применение однократной дозы cd20-специфических связывающих молекул

Изобретение относится к медицине, а именно к артрологии, ревматологии, и может быть использовано для лечения ревматоидного артрита. Для этого пациенту вводят человеческий CD20-специфический малый модульный иммунофармацевтический (SMIP) белок в терапевтически эффективном количестве. Введение осуществляют однократно, причем поддерживающие лечение не проводят в течение примерно от трех месяцев до двух лет после введения первоначальной однократной дозы. Однократное введение обеспечивает почти полную элиминацию В-клеток и значительное снижение уровня ревматоидного фактора на протяжении длительного времени у данной категории пациентов. 22 з.п.ф-лы, 4 табл., 5 ил.

 

По данной заявке испрашивается приоритет предварительных патентных заявок США № 60/702498 от 25 июля 2005 и № 60/702875 от 27 июля 2006, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к материалам и способам для лечения заболеваний, при которых имеет место аберрантная В-клеточная активность, с использованием однократной дозы CD20-специфической связывающей молекулы.

Уровень техники

В своей обычной роли иммунная система человека защищает организм от повреждения чужеродными субстанциями и патогенами. Одним из способов, которым иммунная система защищает организм, является продукция специализированных клеток, называемых В-лимфоцитами или В-клетками. В-клетки продуцируют антитела, которые связываются и в некоторых случаях опосредуют уничтожение чужеродной субстанции или патогена.

Хотя в ряде случаев иммунная система человека, и особенно В-лимфоциты иммунной системы человека, действуют аномально, приводя к заболеванию. Существуют многочисленные виды рака, при которых имеет место неконтролируемая пролиферация В-клеток. Также существуют многочисленные аутоиммунные заболевания, при которых наблюдается В-клеточная продукция антител, которые вместо связывания чужеродных субстанций и патогенов связываются с частями организма. Кроме того, существуют многочисленные аутоиммунные и воспалительные заболевания, в патологии которых задействованы В-клетки, например, посредством неадекватного представления В-клетками антигена Т-клеткам или другими путями с участием В-клеток. Например, у склонных к аутоиммунным заболеваниям мышей, дефицитных по В-клеткам, не развивается аутоиммунное заболевание почек, васкулит и не вырабатываются аутоантитела (Shlomchik et al., J. Exp. Med. 1994, 180:1295-306). Интересно, что у этих склонных к аутоиммунным заболеваниям мышей, которые имеют В-клетки, но являются дефицитными по продукции иммуноглобулина, развиваются экспериментально вызванные аутоиммунные заболевания (Chan et al., J. Exp. Med. 1999, 189:1639-48), показывающие, что В-клетки выполняют интегральную роль в развитии аутоиммунного заболевания.

В-клетки могут быть идентифицированы по молекулам на их клеточной поверхности. CD20 была первой человеческой В-клеточной линейно-специфической поверхностной молекулой, идентифицированной моноклональным антителом. CD20 представляет собой негликозилированный гидрофобный 35 кДа В-клеточный трансмембранный белок, оба конца которого, амино и карбокси, расположены внутри клетки. Einfeld et al., EMSO J. 1988, 7:711-17. СD20 экспрессируется всеми нормальными зрелыми B-клетками, но не экспрессируется В-клетками-предшественниками или плазматическими клетками. Природные лиганды для СD20 не идентифицированы, и функция СD20 в биологии В-клеток еще не изучена полностью.

Анти-СD20 моноклональные антитела влияют на жизнеспособность и рост В-клеток (Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83:4494-98). Обширное перекрестное связывание СD20 может вызвать апоптоз в В-клеточных лимфомных линиях (Shan et al., Blood 1998, 91:1644-52), и сообщалось, что перекрестное связывание СD20 на клеточной поверхности увеличивает величину и усиливает кинетику передачи сигнала, например, обнаруживаемую измерением фосфорилирования тирозина клеточных поверхностей (Deans et al., J. Immunol. 1993, 146:846-53). Поэтому, в дополнение к клеточной элиминации механизмами комплемента и ADCC, связывание Fc-рецептора СD20 моноклональными антителами in vivo может ускорять апоптоз злокачественных В-клеток с помощью СD20 перекрестного связывания, в соответствии с теорией, согласно которой эффективность CD20 терапии лимфомы человека в SCID мышиной модели может зависеть от связывания Fc-рецептора СD20 моноклональными антителами (Funakoshi et al., J. Immunotherapy 1996, 19:93-101). Присутствие множественных перекрывающих мембрану доменов в СD20 полипептиде (Einfeld et al., EMBO J. 1988, 7:711-17; Stamenkovic et al., J. Exp. Med. 1988, 167:1975-80; Tedder et al., J. Immunol. 1988, 141:4388-4394) предотвращает интернализацию CD20 после связывания антитела, и это было признано важной особенностью терапии В-клеточных злокачественных опухолей, при которой мышиное СD20 моноклональное антитело, 1F5, инъецировали пациентам с В-клеточной лимфомой, что приводило к значительному уменьшению числа злокачественных клеток и к частичным клиническим ответам (Press et al., Blood 1987, 69:584-91).

Поскольку нормальные зрелые В-клетки также экспрессируют СD20, нормальные В-клетки элиминируются при терапии анти-CD20 антителами (Reff et al., Blood 1994, 83:435-445). Однако после завершения лечения нормальные В-клетки могут быть восстановлены из СD20-негативных предшественников B-клеток; поэтому пациенты, получавшие анти-CD20 терапию, не испытывают значительной иммуносупрессии.

CD20 экспрессируется злокачественными клетками В-клеточного происхождения, включая В-клеточную лимфому и хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL). CD20 не экспрессируется злокачественными опухолями пре-В-клеток, такими как острый лимфобластный лейкоз. Следовательно, CD20 является хорошей мишенью для терапии В-клеточной лимфомы, CLL и других заболеваний, при которых В-клетки вовлечены в этиологию заболевания. Другие В-клеточные заболевания включают аутоиммунные заболевания, при которых продуцируются аутоантитела при дифференцировке В-клеток в плазматические клетки.

Многие научные группы исследовали применение анти-CD20 антител для лечения заболеваний, связанных с В-клетками. Одно лечение включает анти-CD20 антитела, полученные в форме радионуклидов для обработки В-клеточной лимфомы (например, ¹³¹I-меченое анти-CD антитело), а также ⁸⁹Sr-меченую форму для уменьшения костной боли, вызванной метастазами рака предстательной железы и рака молочной железы (Endo, Gan To Kagaku Ryoho 1999, 26:744-748).

Патенты и патентные публикации, касающиеся CD20 антител, включают патенты США №№ 5776456, 5736137, 6399061 и 5843439, а также патентные заявки США №№ US 2002/0197255A1 и US 2003/0021781A1 (Anderson et al.); патент США № 6455043B1 и международные заявки WO 00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 00/27428 (Grillo-Lopez and White); WO 00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); WO 00/44788 (Braslawsky et al.); WO 01/10462 (Rastetter, W.); WO 01/10461 (Rastetter and White); WO 01/10460 (White and Grillo-Lopez); патентную заявку США № US2002/0006404 и международную заявку WO 02/04021 (Hanna and Hariharan); патентную заявку США № US2002/0012665 A1 и международную заявку WO 01/74388 (Hanna, N.); патентную заявку США № US2002/0009444A1 и международную заявку WO 01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 01/97858 (White, C); патентную заявку США № US2002/0128488A1 и международные заявки WO 02/34790 (Reff, M.); WO 02/060955 (Braslawsky et al.); WO 02/096948 (Braslawsky et al.); WO 02/079255 (Reff and Davies); патент США № 6171586B1 и международные заявки WO 98/56418 (Lam et al.); WO 98/58964 (Raju, S.); WO 99/22764 (Raju, S.); WO 99/51642, патент США № 6194551B1 , патент США № 6242195B1, патент США № 6528624B1 и патент США № 6538124 (Idusogie et al.); международные заявки WO 00/42072 (Presta, L.); WO 00/67796 (Curd et al.); WO 01/03734 (Grillo-Lopez et al.); патентную заявку США № US2002/0004587A1 и международную заявку WO 01/77342 (Miller and Presta); патентную заявку США № US2002/0197256 (Grewal, I.); патенты США №№ 6090365B1, 6287537B1, 6015542, 5843398 и 5595721 (Kaminski et al.); патенты США №№ 5500362, 5677180, 5721108 и 6120767 (Robinson et al.); патент США № 6410391B1 (Raubitschek et al.); патент США № 6224866B1 и международные заявки WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO 00/67795 (Goldenberg); WO 00/74718 (Goldenberg and Hansen); WO 00/76542 (Golay et al.); WO 01/72333 (Wolin and Rosenblatt); патент США № 6368596B1 (Ghetie et al.); патентую заявку США № US2002/0041847A1 (Goldenberg, D.); патентую заявку США № US2003/0026801A1 (Weiner and Hartmann); международную заявку WO 02/102312 (Engleman, E.), см. также патент США № 5849898 и европейскую патентую заявку EP 330191 (Seed et al.); патент США № 4861579 и EP332865A2 (Meyer and Weiss); и международную заявку WO 95/03770 (Bhat et al.), которые полностью включены в настоящее описание путем ссылки.

Химерное моноклональное антитело, специфичное к CD20, состоящее из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мыши, соединенных с тяжелой цепью IgG1 человека и константными областями человеческой легкой цепи каппа, по имеющимся данным сохраняет связывание с CD20 и способность опосредовать ADCC и фиксировать комплемент (Liu et al., J. Immunol. 1987, 139:3521-26). Другое химерное анти-CD20 антитело было создано из IDEC гибридомы C2B8 и названо ритуксимаб. Механизм противоопухолевой активности ритуксимаба, описанный выше, считается комбинацией нескольких активностей, включая антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), фиксацию комплемента и запускание сигналов, которые активизируют апоптоз в злокачественных В-клетках. ADCC представляет собой клеточноопосредованную реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcRs) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное на клетке-мишени антитело и затем вызывают лизис клетки-мишени. Фиксация комплемента или комплементзависимая цитотоксичность (CDC) представляет собой способность молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), связанной с узнаваемым антигеном. Большой размер ритуксимаба препятствуют оптимальной диффузии молекулы в лимфоидные ткани, которые содержат злокачественные В-клетки, что ограничивает указанные противоопухолевые активности.

Ритуксимаб, обычно вводимый в 4 дозах в виде 4-недельных инфузий антитела (1 доза/неделя × 4), в настоящее время используют для лечения высокодифференцированных или фолликулярных В-клеточных неходжкинских лимфом ((McLaughlin et al., Oncology 1998, 12: 1763-1777; Leget et al., Curr. Opin. Oncol. 1998, 10:548-551) и рецидивной стадии III/IV фолликулярной лимфомы (White et al., Pharm. Sci Technol. Today 1999, 2:95-101). Другие заболевания, поддающиеся лечению ритуксимабом, включают лимфому из клеток центра фолликула (FCC), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), диффузную крупноклеточную лимфому (DLCL) и лимфому из малых лимфоцитов (SLL) (Nguyen et al., Eur J. Haematol. 1999, 62:76-82)). Ритуксимаб, вводимый в недельных инфузиях, также используют для лечения CLL (Lin et al., Sem Oncol. 2003, 30:483-92).

Анти-CD20 антитела также широко используют для лечения пациентов с аутоиммунными заболеваниями, связанными с В-клеточной продукцией аутоантител. Например, ритуксимаб продемонстрировал выраженный клинический эффект уничтожения CD20+ В-клеток у пациентов с многочисленными аутоиммунными/воспалительными заболеваниями, включая RA (Edwards, N. Engl J. Med. 2004, 350:2546-8; Cambridge et al., Arthritis Rheum. 2003, 48:2146-54). Пациенты с RA получали продолжительные дозы метотрексата (MTX) и курс из 2 доз ритуксимаба (Edwards et al., выше). Эти пациенты демонстрировали улучшенные ответные реакции (ACR, American College of Rheumatology) по сравнению с контрольными группами.

В испытании по лечению системной красной волчанки (SLE) (Leandro et al., Arthritis Rheum. 2002, 46:2673-7) у пациентов, которым проводили две инфузии высоких доз ритуксимаба, наблюдали В-клеточную элиминацию и улучшение состояния. Во втором исследовании В-клеточной элиминации при SLE (Looney et al., Arthritis Rheum. 2004, 50:2580-9) пациентам проводили однократную инфузию 100 мг/м² (низкая доза), однократную инфузию 375 мг/м² (средняя доза) или в 4 инфузиях (1 неделя отдельно) 375 мг/м² (высокая доза). Эти пациенты демонстрировали В-клеточную элиминацию и улучшенные показатели состояния, но лечение не изменяло уровень аутоантител. Испытания ритуксимаба также проводили при макроглобулинемии Вальденстрема (Treon et al., Immunother. 2001, 24:272-9), где у пациентов обнаружен повышенный гематокрит (HCT) и повышенное количество тромбоцитов (PLT) после 4 инфузий ритуксимаба.

Недавние публикации о лечении ритуксимабом пациентов с рассеянным склерозом, аутоиммунным заболеванием, поражающим центральную нервную систему, показали, что курс лечения ритуксимабом уменьшает количество периферических В-клеток, но дает небольшой эффект на В-клетках цереброспинальной жидкости (Monson et al., Arch Neurol. 2005, 62:258-64).

Дополнительные публикации, касающиеся применения ритуксимаба, включают: Stashi et al. "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura" Blood 2001, 98:952-957; Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 Apr., 20001); Leandro et al. "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with В lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 2002, 61:833-888; Leandro et al. "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 2001, 44:S370; Leandro et al. "An open study of В lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis Rheum. 2002, 46:2673-2677; Edwards et al., "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete В lymphocytes" Rheumatology 2001, 40:205-211; Edwards et al. "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans. 2002, 30:824-828; Edwards et al. "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2002,46:S197; Levine et al., "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 1999, 52:1701-1704; DeVita et al. "Efficacy of selective B-cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis Rheum. 2002, 46:2029-2033; Hidashida et al. "Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab. " Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; October 24-29; New Orleans, La. 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; October 24-29; New Orleans, La. 2002.

Остаются проблемы, связанные с терапией ритуксимабом. Например, большинство раковых пациентов, лечившихся ритуксимабом, переносили рецидив, обычно в течение примерно 6-12 месяцев, и сообщалось о фатальных реакциях на инфузию ритуксимаба в течение 24 часов. Эти фатальные реакции наступали после комплекса инфузионной реакции, который включал гипоксию, легочные инфильтраты, острый респираторный дистресс-синдром, инфаркт миокарда, фибрилляцию желудочков или кардиогенный шок. Также сообщалось об острой почечной недостаточности, требующей диализа, со случаями фатального исхода при синдроме лизиса опухоли после лечения ритуксимабом, также имели место тяжелые кожно-слизистые реакции, некоторые с фатальным исходом. Кроме того, высокие дозы ритуксимаба требуют внутривенной инъекции, поскольку молекула является большой, приблизительно 150 кДа, и, как отмечалось выше, ограничена ее диффузия в лимфоидные ткани, где находится много опухолевых клеток. Другим недостатком лечения ритуксимабом являются многократные дозы ритуксимаба, обычно вводимые пациентам, получающим терапию, обычно высокая доза каждую неделю в течение четырех недель (Maloney et al., Blood 1997, 90:2188-2195), но исследование «доза-ответ» у лиц, принимающих однократную дозу антитела ритуксимаба, приводило к небольшой элиминации B-клеток у пациентов, получающих высокие дозы антитела (Maloney et al. Blood 1994, 84:2457-2466).

Технология моноклональных антител и методы генной инженерии привели к быстрому развитию иммуноглобулиновых молекул для диагностики и лечения заболеваний человека. Белковая инженерия была применена для увеличения аффинности антитела к узнаваемому им антигену, чтобы уменьшить проблемы, связанные с иммуногенностью, и чтобы изменить эффекторные функции антител. Доменная структура иммуноглобулинов пригодна для инженерии, при которой антигенсвязывающие домены и домены, придающие эффекторные функции, могут обмениваться между иммуноглобулиновыми классами и подклассами. Структура и функции иммуноглобулинов изложены, например, в Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988). Обширное введение и подробную информацию обо всех аспектах технологии рекомбинантых антител можно найти в руководстве "Recombinant Antibodies" (John Wiley & Sons, NY, 1999). Полную коллекцию подробных лабораторных протоколов по инженерии антител можно найти в R. Kontermann and S. Dubel (eds.), "The Antibody Engineering Lab Manual" (Springer Verlag, Heidelberg/New York, 2000).

Недавно были сконструированы небольшие иммуноглобулиновые молекулы для преодоления проблем, связанных с терапией целыми иммуноглобулинами. Одиночная цепь Fv (scFv) включает вариабельный домен тяжелой цепи антитела, соединенный через короткий линкерный пептид с вариабельным доменом легкой цепи антитела (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 5879-83). В дополнение к вариабельным областям, каждая из цепей антитела имеет одну или более константных областей. Легкие цепи имеют один константный домен. Таким образом, легкие цепи имеют одну вариабельную область и одну константную область. Тяжелые цепи имеют несколько константных доменов. Тяжелые цепи в IgG, IgA и IgD антителах имеют три константных домена, которые обозначены CH1, CH2 и CH3, и тяжелые цепи в антителах IgМ и IgЕ имеют четыре константных домена, CH1, CH2, CH3 и CH4. Таким образом, тяжелые цепи имеют одну вариабельную область и три или четыре константных области.

Тяжелые цепи иммуноглобулинов также можно разделить на три функциональных области: область Fd (фрагмент, включающий V_H и CH1, т.е. 2 N-терминальных домена тяжелой цепи), шарнирная область и область Fc (область «кристаллизуемого фрагмента», происходящая из константных областей и образующаяся после расщепления пепсином). Область Fd в комбинации с легкой цепью образует Fab («антигенсвязывающий фрагмент»). Поскольку антиген будет стереохимически реагировать с антигенсвязывающей областью на аминоконце каждого Fab, молекула IgG является двухвалентной, т.е. она может связывать две молекулы антигена. Fc содержит домены, которые взаимодействуют с иммуноглобулиновыми рецепторами на клетках и с начальными элементами каскада комплемента. Таким образом, Fc-фрагмент обычно считают ответственным за эффекторные функции иммуноглобулина, такие как фиксация комплемента и связывание с Fc-рецепторами.

Благодаря малому размеру scFv-молекул они характеризуются очень быстрым клиренсом из плазмы и тканей и более эффективным проникновением в ткани, чем целый иммуноглобулин. Противоопухолевый scFv показал более быстрое проникновение в опухоль и даже большее распределение в опухолевой массе, чем соответствующее химерное антитело (Yokota et al., Cancer Res. 1992, 52:3402-08). Слияние scFv с другой молекулой, такой как токсин, дает преимущество специфической антигенсвязывающей активности и малого размера scFv для доставки токсина в ткани-мишени (Chaudary et al., Nature 1989, 339:394); Batra et al., Mol. Cell. Biol. 1991, 11:2200).

Несмотря на преимущества, которые scFv-молекулы привносят в серотерапию, существует несколько недостатков этого терапевтического подхода. В то время как быстрый клиренс scFv может уменьшить токсические воздействия на нормальные клетки, такой быстрый клиренс может препятствовать доставке минимальной эффективной дозы к ткани-мишени.

Производство достаточных количеств scFv для введения пациентам вызывает сомнения из-за сложностей экспрессии и выделения scFv, которые неблагоприятно влияют на производственный выход. В процессе экспрессии scFv-молекулы нестабильны и часто агрегируют в результате спаривания вариабельных областей разных молекул. Кроме того, уровни продукции scFv-молекул в системах экспрессии млекопитающих являются низкими, ограничивая потенциал для эффективного производства scFv-молекул для терапии (Davis et al, J. Biol. Chem. 1990, 265:10410-18); Traunecker et al., EMBO J. 1991, 10:3655-59). Были исследованы стратегии улучшения продукции, включая добавление сайтов гликозилирования к вариабельным областям (Jost, C. R. U.S. Pat. No. 5888773, Jost et al, J. Biol. Chem. 1994, 69:26267-73).

Другим недостатком использования scFv для терапии является недостаток эффекторной функции. scFv без цитолитических функций, ADCC и комплементзависимой цитотоксичности (CDC), связанных с константной областью иммуноглобулина, может быть неэффективен для лечения заболевания. Несмотря на то, что развитие scFv-технологии началось 20 лет назад, в настоящее время нет scFv-продуктов, утвержденных для терапии.

В качестве альтернативы прогнозируют, что слияние scFv с другой молекулой, такой как токсин, могло бы дать преимущество специфической антигенсвязывающей активности и малых размеров scFv для доставки токсинов к тканям-мишеням. Chaudary et al., Nature 1989, 339:394; Batra et al., Mol. Cell. Biol. 1991, 11:2200. Таким образом, конъюгирование или слияние токсинов с scFv было предложено в качестве альтернативной стратегии для создания сильнодействующих антигенспецифических молекул, но дозирование таких конъюгатов или химер может быть ограничено избыточной и/или неспецифической токсичностью, обусловленной токсичным фрагментом таких препаратов. Токсические эффекты могут включать возрастание ферментов печени выше физиологических значений, синдром повышенной проницаемости сосудов и другие нежелательные эффекты. Кроме того, иммунотоксины сами по себе являются высокоиммуногенными при введении хозяину, и антитела хозяина, вырабатываемые против иммунотоксина, ограничивают потенциальную применимость для повторного терапевтического лечения индивидуума.

Другие рекомбинантные слитые белки, названные малыми, модульными иммунофармацевтическими (SMIP™) продуктами, описаны в совместных патентах США 2003/133939, 2003/0118592 и 2005/0136049 и в совместных международных патентных публикациях WO 02/056910, WO 2005/037989 и WO 2005/017148, которые полностью включены в настоящее описание путем ссылки. SMIP продукты являются новыми слитыми белками связывающий домен-иммуноглобулин, отличительным признаком которых является связывающий домен для узнаваемой структуры, такой как антиген, контррецептор или т.п.; полипептид шарнирной области IgG, IgA или IgE дикого типа или мутантный полипептид шарнирной области IgG1, не имеющий цистеиновых остатков или имеющий один или два цистеиновых остатка; и домены СН2 и СН3 иммуноглобулина. SMIP-продукты способны к ADCC и/или CDC.

Хотя были проведены обширные исследования по терапии на основе антител, в данной области техники остается необходимость в улучшенных способах лечения заболеваний, связанных с аберрантной В-клеточной активностью. Способы по настоящему изобретению, описанные и заявленные в настоящей заявке, предоставляют такие улучшенные способы и другие преимущества.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам изменения уровней В-клеточной популяции при заболевании, связанном с аберрантной В-клеточной активностью.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего или предположительно имеющего заболевание, связанное с аберрантной В-клеточной активностью, включающий введение пациенту однократной дозы терапевтически эффективного количества CD20-специфической связывающей молекулы. В одном варианте осуществления CD20-специфическая связывающая молекула является CD20-специфической малой модульной иммунофармацевтической (SMIP).

«Аберрантная В-клеточная активность» относится к клеточной активности, которая отклоняется от нормального, правильного или ожидаемого направления. Например, аберрантная клеточная активность может включать неадекватную пролиферацию клеток, чьи ДНК или другие клеточные компоненты повредились или стали дефектными. Аберрантная В-клеточная активность может включать клеточную пролиферацию, свойства которой связаны с заболеванием, вызванным, опосредованным или приводящим к неадекватно высоким уровням деления, неадекватно низким уровням апоптоза или с ними обоими. Эти заболевания могут быть классифицированы, например, по единичным или множественным локальным аномальным пролиферациям клеток, групп клеток или ткани (тканей), как раковых, так и нераковых, доброкачественных или злокачественных, описанных более подробно ниже. Аберрантная В-клеточная активность может также включать аберрантную продукцию антител, такую как продукция аутоантител или избыточная продукция антител, обычно нужных в нормальных количествах. Предполагается, что аберрантную В-клеточную активность можно наблюдать в определенных субпопуляциях В-клеток, но не в других субпопуляциях. Аберрантная В-клеточная активность может также включать неадекватную стимуляцию Т-клеток, такую как при неадекватной В-клеточной презентации антигена Т-клеткам или другие каскады реакций с участием В-клеток.

«Однократная доза» CD20-специфической связывающей молекулы относится к введению однократной продолжительной инфузии одной дозы CD20-специфической SMIP в начале лечения, в отличие от терапий многократными дозами, которые требуют введения CD20-специфической связывающей молекулы раз в неделю или раз в две недели. В одном варианте осуществления однократная продолжительная инфузия может быть пролонгированной подкожной инфузией, внутривенной инфузией или т.п. Однократная продолжительная инфузия может быть введена в течение периода времени, например, от примерно 15 минут до примерно 1 часа, в течение примерно 2 часов, примерно 3 часов, примерно 4 часов, примерно 5 часов, примерно 6 часов, примерно 7 часов, примерно 8 часов, примерно 9 часов, примерно 10 часов, примерно 11 часов, примерно 12 часов, примерно 24 часов, или одного или нескольких дней или недель (например, поддерживаемое высвобождение из имплантированного устройства или гелевого депо). Однократная доза может быть введена в сочетании с другими терапевтическими средствами или вторыми агентами и может быть введена одновременно, до или после введения второго терапевтического средства, как описано в настоящем описании. Согласно настоящему изобретению однократная продолжительная инфузия может включать короткие перерывы в инфузии, требуемые по практическим соображениям.

«Пациент, имеющий или предположительно имеющий заболевание, связанное с аберрантной В-клеточной активностью», представляет собой пациента, у которого заболевание или симптом заболевания могут быть вызваны аберрантной В-клеточной активностью, могут быть отягощены аберрантной В-клеточной активностью или смогут быть ослаблены регуляцией В-клеточной активности. Примерами этих заболеваний являются виды В-клеточного рака (такие как В-клеточная лимфома, В-клеточный лейкоз, В-клеточная миелома), заболевание, характеризующееся продукцией аутоантител или заболевание, характеризующееся неадекватной Т-клеточной стимуляцией, такое как при неадекватной В-клеточной презентации антигена Т-клеткам или вовлекающее В-клетки другими путями.

В одном аспекте лицо, получающее лечение способами по изобретению, демонстрирует улучшенный ответ на лечение CD20-связывающей молекулой, описанной в настоящей заявке, который лучше, чем ответ на лечение ритуксимабом без другой CD20-связывающей молекулы. Ответ, который лучше, чем при лечении ритуксимабом без другой CD20-связывающей молекулы, означает клинический ответ, при котором лечение способом по изобретению дает в результате клинический ответ у пациента, который лучше, чем клинический ответ у пациента, получающего лечение ритуксимабом, такое, как только один ритуксимаб или ритуксимаб в комбинации с другими агентами, где другие агенты не являются CD20-связывающими молекулами. Улучшенный ответ оценивают сравнением клинических критериев, хорошо известных в данной области и описанных в настоящей заявке. Типичные примеры критериев включают, но не ограничиваются ими, длительность В-клеточной элиминации, уменьшение количеств В-клеток в целом, уменьшение количеств В-клеток в биологическом образце, уменьшение размера опухоли, уменьшение числа опухолей, существующих и/или возникающих после лечения, и, в целом, улучшенный ответ по оценкам пациентов и врачей, например, с использованием международного прогностического индекса. Улучшение может быть по одному или более чем по одному из клинических критериев. Улучшение ответа на способ лечения по изобретению может быть вследствие неадекватного ответа на проведенное ранее или текущее лечение ритуксимабом, например, по причине токсичности и/или неадекватной эффективности лечения ритуксимабом.

В родственном аспекте лицу, получающему лечение способами по изобретению, также вводят ритуксимаб. В одном варианте осуществления ритуксимаб вводят в качестве первой линии лечения, и он остается, когда начинают лечение способом по изобретению. В другом варианте осуществления лечение ритуксимабом прекращают после начала лечения способом по изобретению.

«Пациент, имеющий или предположительно имеющий ревматическое заболевание», является пациентом или лицом, страдающим заболеванием или нарушением суставного происхождения или скелетно-мышечной системы, поражающим такие участки, как суставы, хрящи, мышцы, нервы и сухожилия. Далее предполагают, что пациент, имеющий или предположительно имеющий ревматическое заболевание, мог ранее получать терапию для лечения ревматического заболевания. В одном варианте осуществления ревматическое заболевание включает, но не ограничивается ими, ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, дерматомиозит, болезнь Шенлейн-Геноха, ювенильный ревматоидный артрит, псориатический артрит, синдром Рейно, синдром Рейтера, саркоидоз, спондилоартропатии, прогрессирующий системный склероз и миозит.

«Пациент, имеющий или предположительно имеющий определенное аутоиммунное заболевание центральной нервной системы», является пациентом или лицом, страдающим заболеванием или нарушением, поражающим центральную нервную систему, включая головной и спинной мозг, или такие участки, как глазной нерв. Далее предполагают, что пациент, имеющий или предположительно имеющий нарушение центральной нервной системы, мог ранее получать терапию для лечения нарушения центральной нервной системы. В одном варианте осуществления аутоиммунное заболевание центральной нервной системы включает, но не ограничивается ими, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, оптикомиелит, волчаночный миелит и волчаночный энцефалит.

«Васкулит» относится к заболеванию или нарушению, связанному с воспалением кровеносного сосуда. Примеры васкулитных поражений включают, но не ограничиваются ими, болезнь Бехчета, васкулит центральной нервной системы, синдром Черджа-Строса, криоглобулинемию, гигантоклеточный артериит, болезнь Шенлейн-Геноха, аллергические васкулиты/ангииты, болезнь Кавасаки, лейкоцитокластный васкулит, полиангиит, нодозный полиартериит, полимиалгию, полихондрит, ревматоидный васкулит, (артериит) болезнь Такаясу, (гранулематоз) болезнь Вегенера, васкулит вследствие гепатита, семейную средиземноморскую лихорадку, микроскопический полиангиит, синдром Когана, синдром Вискотта-Олдрича и облитерирующий тромбоангиит.

«Лечение» или «обработка» относится к терапевтическому лечению или к профилактической или предупредительной обработке. Терапевтическое лечение может уменьшить интенсивность по меньшей мере одного симптома заболевания у лица, получающего лечение, или может отсрочить ухудшение прогрессирующего заболевания у этого лица, или может предотвратить начало дополнительных ассоциированных заболеваний.

«Терапевтически эффективная доза» или «эффективная доза» CD20-специфической связывающей молекулы относится к количеству соединения, достаточному, чтобы получить уменьшение интенсивности одного или нескольких симптомов заболевания, которое начали лечить. Когда используемый индивидуальный активный ингредиент вводят отдельно, то терапевтически эффективная доза относится только к одному этому ингредиенту. При использовании в комбинации терапевтически эффективная доза относится к общим количествам активных ингредиентов, которые дают в результате терапевтический эффект, вводятся ли они в комбинации, последовательно или одновременно. Изобретение определенно предполагает, что одна или несколько CD20-специфических связывающих молекул могут быть введены согласно способам по изобретению, каждая в эффективной дозе.

Предлагаемые способы по изобретению полезны для лечения таких заболеваний, как виды В-клеточного рака (например, В-клеточные лимфомы, В-клеточные лейкозы), заболеваний, характеризующихся продукцией аутоантител, или заболеваний, характеризующихся неадекватной В-клеточной стимуляцией Т-клеток, такой как при неадекватной В-клеточной презентации антигена Т-клеткам или при вовлечении В-клеток другими путями.

В-клеточныый рак включает В-клеточные лимфомы [такие как различные формы болезни Ходжкина, неходжкинская лимфома (NHL) или лимфомы центральной нервной системы], лейкозы [такие как острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоидный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз и хронический миобластный лейкоз] и миеломы (такие как множественная миелома). Дополнительно виды В-клеточного рака включают лимфомы из малых лимфоцитов, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазматическую лимфому, селезеночную лимфому маргинальной зоны, плазмоклеточную миелому, солитарную плазмоцитому кости, экстраоссальную плазмоцитому, экстронодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны лимфоидной ткани слизистой (MALT), нодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны, фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, диффузную В-крупноклеточную лимфому, медиастинальную (тимусную) В-крупноклеточную лимфому, интраваскулярную В-крупноклеточную лимфому, первичную экссудативную лимфому, лимфому/лейкоз Беркитта, В-клеточные пролиферации неясного злокачественного потенциала, лимфоматоидный гранулематоз, посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение.

Нарушения, характеризующиеся продукцией аутоантител, часто рассматривают как аутоиммунные заболевания. Аутоиммунные заболевания включают, но не ограничиваются ими, артрит, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, полихондрит, псориатический артрит, псориаз, дерматит, полимиозит/дерматомиозит, миозит с включенными тельцами, воспалительный миозит, токсический эпидермальный некролиз, системную склеродерму и склероз, CREST-синдром, ответы, связанные с воспалительным заболеванием кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), менингит, энцефалит, увеит, колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзему, астму, состояния, вовлекающие инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные ответы, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, нарушение адгезии лейкоцитов, системную красную волчанку (SLE), подострую кожную системную волчанку, дискоидную волчанку, волчаночный миелит, волчаночный энцефалит, ювенильный диабет, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, оптикомиелит, ревматическую лихорадку, хорею Сиденгама, иммунные ответы, связанные с острой и отложенной гиперчувствительностью, опосредованные цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, включая гранулематоз Вегенера и болезнь Черджа-Строса, агранулоцитоз, васкулит (включая аллергический васкулит/ангиит, ANCA и ревматоидный васкулит), апластическую анемию Диамонда-Блэкфана, иммунную гемолитическую анемию, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию, истинную эритроцитарную аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, заболевания, вовлекающие диапедез лейкоцитов, воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС), синдром множественного повреждения органов, миастению гравис, заболевания, вызванные комплексами антиген-антитело, заболевание базальной мембраны клубочков, антифосфолипидный синдром, аллергический неврит, болезнь Бехчета, синдром Кастлемена, синдром Гудпасчера, миастенический синдром Итона-Ламберта, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, отторжение трансплантата паренхиматозного органа, реакцию "трансплантат против хозяина" (GVHD), буллезный пемфигоид, пемфигоид, аутоиммунные полиэндокринопатии, сероотрицательные спондилоартропатии, болезнь Рейтера, синдром «застывшего человека» (stiff-man syndrome), гигантоклеточный артериит, иммунокомплексный нефрит, IgA нефропатии, IgM полинейропатии или IgM вызванную нейропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (TTP), болезнь Шенлейн-Геноха, аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание яичка и яичника, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотериоз; аутоиммунные эндокринные заболевания, включая аутоиммунный тиреоидит, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), подострый тиреоидит, идиопатический гипотериоз, болезнь Аддисона, болезнь Грейва, аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), диабет I типа, также называемый инсулинзависимым сахарным диабетом (IDDM), и синдром Шихана; аутоиммунный гепатит, лимфоидую интерстициальную пневмонию (HIV), облитерирующий бронхиолит (нетрансплантационный) в противоположность NSIP, синдром Гийена-Баре, васкулит крупных сосудов (включая ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный (Такаяши) артериит), васкулит средних сосудов (включая болезнь Кавасаки и нодозный полиартериит), нодозный полиартериит (PAN), анкилозирующий спондилит, болезнь Бергера (IgA нефропатия), быстро прогрессирующий гломерулонефрит, первичный билиарный цирроз, кишечную спру (глютеновую энтеропатию), криоглобулинемию, криоглобулинемию, ассоциированную с гепатитом, боковой амиотрофический склероз (ALS), заболевание коронарной артерии, семейную средиземноморскую лихорадку, микроскопический полиангиит, синдром Когана, синдром Вискотта-Олдрича и облитерирующий тромбоангиит.

Ревматоидный артрит (RA) представляет собой хроническое заболевание, характеризующееся воспалением суставов, приводящее к опуханию, боли и потери функции. Пациенты с RA в течение продолжительного периода времени обычно обнаруживают прогрессирующую деструкцию суставов, деформацию, нетрудоспособность и даже преждевременную смерть.

Системная красная волчанка (SLE) представляет собой аутоиммунное заболевание, вызываемое повторяющимся повреждением кровеносных сосудов во многих органах, включая почки, кожу и суставы. У пациентов с SLE неправильное взаимодействие между Т-клетками и В-клетками приводит к продукции аутоантител, которые атакуют клеточные ядра. Существует общее соглашение о том, что аутоантитела ответственны по меньшей мере за некоторые аспекты SLE. Предполагается, что новые виды терапии, которые истощают В-клеточные линии, позволяя иммунной системе восстановиться, в то время как новые В-клетки генерируются из предшественников, могут дать надежду на долговременное улучшение у пациентов с SLE.

Рассеянный склероз (MS) также представляет собой аутоиммунное заболевание. Оно характеризуется воспалением центральной нервной системы и разрушением миелина, который изолирует волокна нервных клеток в головном мозге, спинном мозге и в теле. Хотя причина MS остается неизвестной, широко утверждается, что аутоиммунные Т-клетки вносят первичный вклад в патогенез заболевания. Однако в цереброспинальной жидкости пациентов с MS присутствуют высокие уровни антител, и некоторые теории предполагают, что В-клеточный ответ, приводящий к продукции антител, является важным для опосредования заболевания.

Болезнь Крона и родственное заболевание, язвенный колит, являются двумя главными категориями, которые принадлежат к группе заболеваний, называемых воспалительными заболеваниями кишечника (IBD). Болезнь Крона является хроническим нарушением, которое вызывает воспаление пищеварительного или желудочно-кишечного (GI) тракта. Хотя оно может иметь место в других областях GI, ото рта до заднего прохода, оно обычно поражает тонкую кишку и/или толстую кишку. При язвенном колите поражается только толстая кишка.

Болезнь Крона может быть охарактеризована антителами против нейтрофильных антигенов, т.е. «перинуклеарным антинейтрофильным антителом» (pANCA), и Saccharomyces cervisiae, т.е. «анти-Saccharomyces cervisiae антителом» (ASCA). Многие пациенты с язвенным колитом имеют в крови pANCA антитела, но не имеют ASCA антител, в то время как пациенты с болезнью Крона обнаруживают ASCA антитела и не обнаруживают pANCA антител. Одним из способов оценки болезни Крона является использование индекса активности болезни Крона (CDAI), который основан на 18 прогностических количественных показателях, собранных врачами. Значения CDAI от 150 и ниже связаны с латентным заболеванием; значения выше этих значений указывают на активное заболевание, и значения около 450 наблюдаются при очень тяжелом заболевании (Best, et al., "Development of a Crohn's disease activity index." Gastroenterology 70:439-444, 1976. Однако со времени первоначального исследования некоторые исследователи стали использовать «субъективную величину» от 200 до 250 как значение для здоровых.

Аутоиммунное заболевание щитовидной железы является результатом продукции аутоантител, которые либо стимулируют щитовидную железу, вызывая гипертиреоидизм (болезнь Грейва), либо разрушают щитовидную железу, вызывая гипотиреоидизм (тиреоидит Хашимото). Стимуляция щитовидной железы вызывается аутоантителами, которые связываются и активируют рецептор тиреоид-стимулирующего гормона (TSH). Разрушение щитовидной железы вызывается аутоантителами, которые реагируют с другими тиреоидными антигенами.

Синдром Шегрена представляет собой аутоиммунное заболевание, характеризуемое разрушением желез, продуцирующих влагу в организме.

Иммунная тромбоцитопеническая пурпура (ITP) вызывается аутоантителами, которые связываются с тромбоцитами крови и вызывают их разрушение.

Миастения гравис (MG) представляет собой хроническое аутоиммунное нейромышечное нарушение, характеризуемое аутоантителами, которые связываются с ацетилхолиновыми рецепторами, экспрессированными на нейромышечных соединениях, приводя к слабости произвольных мышечных групп.

Псориаз характеризуется аутоиммунным воспалением кожи и также связан с артритом в 30% случаев.

Также рассматривается лечение идиопатической воспалительной миопатии (IIM), включая дерматомиозит (DM) и полимиозит (PM). Воспалительные миопатии были классифицированы с использованием ряда схем классификации. По системе классификации Миллера (Miller, Rheum Dis Clin North Am. 1994, 20:811-826) идентифицируют 2 идиопатические воспалительные миопатии (IIM), полимиозит (PM) и дерматомиозит (DM).

Полимиозит и дерматомиозит представляют собой хронические, ослабляющие воспалительные заболевания, которые поражают мышцы и, в случае DM, кожу. Эти заболевания являются редкими, по годовым отчетам примерно от 5 до 10 случаев на миллион взрослых и от 0,6 до 3,2 случаев на миллион детей в год в США (Targoff, Curr Probl Dermatol. 1991, 3:131-180). Идиопатическую воспалительную миопатию ассоциируют со значительной распространенностью и смертностью, отмечая, что до половины заболевших взрослых страдают от значительного поражения заболеванием (Gottdiener et al., Am. J. Cardiol. 1978, 41:1141-49). Miller (Rheum Dis Clin North Am. 1994, 20:811-826 and Arthritis and Allied Conditions, Ch. 75, Eds. Koopman and Moreland, Lippincott Williams and Wilkins, 2005) представляет пять групп критериев, используемых для диагностики IIM, т.е. критерии оценки идиопатической воспалительной миопатии (IIMC), включающие мышечную слабость, признаки дегенерации в мышечной биопсии, оценку сывороточных уровней мышечных ферментов, электромагнитную триаду миопатии, выраженность высыпаний при дерматомиозите, а также включает доказательство антител в качестве вторичного критерия.

Факторы, связанные с IIM, включая мышечные ферменты и аутоантитела, охватывают, но не ограничиваются ими, креатинкиназу (КК), лактатдегидрогеназу, альдолазу, С-реактивный белок, аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT) и антинуклеарные аутоантитела (ANA), миозитспецифические антитела (MSA) и антитела к выделяемым нуклеарным антигенам.

«Связывающая молекула» согласно изобретению может быть, например, белком («белок» может быть полипептидом или пептидом), нуклеиновой кислотой, углеводом или небольшим молекулярным соединением, которое связывается с мишенью. Тип белковоподобной связывающей молекулы, рассматриваемой в изобретении, представляет собой антитело или фрагмент антитела, который сохраняет связывающую активность. Связывающая молекула может быть модифицирована согласно стандартным способам в данной области техники для улучшения ее связывающей аффинности, уменьшения иммуногенности, изменения ее эффекторных функций и/или увеличения ее доступности в организме индивидуума. Такие модификации могут включать, например, модификации аминокислотной последовательности или экспрессию в виде слитого белка. Эти слитые белки также являются связывающими молекулами согласно изобретению. Примером связывающей молекулы по изобретению является малый модульный иммунофармацевтический (SMIP™) продукт.

Связывающая молекула, которая является «специфической» для мишени, связывается с этой мишенью с большей аффинностью, чем с любой другой мишенью. Например, CD20-специфическая связывающая молекула связывается с CD20 с большей аффинностью, чем с любой другой мишенью. Связывающие молекулы по изобретению могут иметь аффинности для своих мишеней с Ка больше или равной примерно 10⁴ М^-1, предпочтительно больше или равной примерно 10⁵ М^-1, более предпочтительно больше или равной примерно 10⁶ М^-1 и еще более предпочтительно больше или равной примерно 10⁷ М^-1. Еще более предпочтительны аффинности более чем 10⁷ М^-1, такие как аффинности, равные или больше, чем примерно 10⁷ М^-1, примерно 10⁸ М^-1, примерно 10⁹ М^-1 и примерно 10¹⁰ М^-1. Аффинности связывающих молекул согласно настоящему изобретению могут быть легко определены с использованием общепринятых способов, описанных, например, Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1949). В одном варианте осуществления CD20-специфическая связывающая молекула имеет аффинность к CD-20 в диапазоне от 1 нМ до 30 нМ.

В дополнительном аспекте CD20-специфическая связывающая молекула имеет период полужизни от 7 до 30 дней in vivo.

Способы создания малых модульных иммунофармацевтических препаратов (SMIP) описаны ранее в совместной заявке США № 10/627556 и в патентных публикациях США 2003/133939, 2003/0118592 и 2005/0136049, которые полностью включены в настоящее описание путем ссылки. SMIP представляют собой новые слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, отличительным признаком которых является связывающий домен для узнаваемой структуры, такой как антиген, контррецептор и т.п.; полипептид шарнирной области IgG1, IgA или IgE, или мутантный полипептид шарнирной области IgG1, не имеющий или имеющий один или два цистеиновых остатка; и домены СН2 и СН3 иммуноглобулина. В одном варианте осуществления молекула связывающего домена имеет один или два цистеиновых остатка. В родственном варианте осуществления рассматривается, что если молекула связывающего домена содержит два цистеиновых остатка, то первый цистеин, который обычно участвует в связывании вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, не удаляется или замещается аминокислотой.

Связывающий домен молекул, пригодных для способов по изобретению, рассматривают в качестве имеющего одну или более связывающих областей, таких как вариабельные связывающие области легкой цепи и тяжелой цепи, происходящие из одного или нескольких членов надсемейства иммуноглобулинов, таких как иммуноглобулин. Эти области, кроме того, обычно разделены линкерными пептидами, которые могут представлять собой любой линкерный пептид, известный в данной области как сочетаемый с доменом или областью присоединения в связывающей молекуле. Примерами линкеров являются линкеры, основанные на линкерном мотиве Gly₄Ser, таком как (Gly₄Ser)_n, где n=3-5. Молекулы для использования в способах по изобретению также содержат достаточную аминокислотную последовательность из константной области иммуноглобулина для обеспечения эффекторной функции, предпочтительно ADCC и/или CDC. Таким образом, молекулы будут иметь последовательность, происходящую из СН2 домена иммуноглобулина, или СН2 и СН3 домены, происходящие из одного или более иммуноглобулинов. SMIP способны к ADCC и/или CDC, но не способны образовывать дисульфид-связанные мультимеры.

Примеры CD20-специфических SMIP включают SMIP, образованные из анти-СD20 моноклонального антитела 2Н7, описанного в патентах США №№ 2003133939 и 20030118592. SMIP включают 2H7scFv-lg или производные вышеуказанного. Производные включают CytoxB-MHWTG1C, который имеет человеческий IgG1 Fc домен и мутантный IgG1 шарнирный домен; CytoxB-MHMG1C, который включает мутантный Fc домен; MG1H/MG1C, который включает Fc рецептор с мутантным лейциновым остатком 234; CytoxB-IgAHWTHG1C, включающий шарнирный элемент человеческого IgA, слитый с человеческим Fc доменом; 2H7 scFv-llama IgGI, включающий llama IgGI шарнирную часть и области CH2CH3, 2H7 scFv-llama IgG2, включающий llama lgG2 шаринирную часть и области CH2CH3; 2H7 scFv-llama lgG3, включающий llama lgG3 шарнирную часть и области CH2CH3.

Производные 2H7scFv-Ig также включают 2H7 scFv мутанты с точечными мутациями в шарнирной области. 2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3, в которых все три цистеиновых остатка в соединении или шарнирные области мутируют в сериновые остатки, и домены дикого типа CH2 и CH3; 2H7 scFv MTH (SSC), в которых первые два цистеиновых остатка замещены сериновыми остатками; 2H7 scFv MTH (SCS), в которых первый и третий цистеины замещены сериновыми остатками; 2H7 scFv MTH (CSS) WTCH2CH3, в которых цистеиновые остатки во втором и третьем положении замещены серином; 2H7 scFv VH11SER IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, в которых лейцин в положении 11 вариабельной области тяжелой цепи замещен серином; 2H7 scFv IgA шарнирная часть-IgG1 CH2-CH3, включающий шарнирную область IgA и WT IgGI домены; 2H7 scFv IgA шарнирная часть-CH2-CH3, включающий шарнирную область IgA, области CH2-CH3; 2H7 IgAWH IgACH2-T4CH3, включающий шарнирную часть IgA, CH2 IgA дикого типа и усеченный CH3 домен IgA, лишенный 4 карбоксиаминокислот GTCY.

Производные с мутациями в области СН3 IgG включают 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405, в котором остаток фенилаланина в положении 405 (нумерация согласно Kabat et al. выше) был замещен тирозином; 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405, в котором фенилаланин в положении 405 был замещен аланином; scFv MTH WTCH2 MTCH3 A407, в котором остаток тирозина в положении 407 был замещен аланином; scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405A407, включающий две мутации; и scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405A407 включающий две мутации.

2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3 представляет собой конструкцию, в которой третий цистеиновый остаток в шарнирной области IgG1 замещен остатком серина. 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 SMIP включает мутантную шарнирную часть (MT (SSS)) и мутантный CH2 домен, в котором остаток пролина в положении 238 (согласно Ward et al.) был замещен серином.

2H7scFv-Ig производные также включают 2H7 scFv мутанты с точечными мутациями в вариабельной области тяжелой цепи. Все следующие конструкции включают мутации, в которых лейцин в положении 11 в вариабельной области тяжелой цепи замещен серином: 2H7 scFv VH11SER IgG MTH (SSS-S) WTCH2CH3, 2H7scFv VHL11S (CSS-S)H WCH2 WCH3, включающий мутантную шарнирную область в комплексе с вышеуказанным; 2H7scFv VHL11S (CSC-S)H WCH2 WCH3, включающий мутантную шарнирную область в комплексе с вышеуказанным; 2H7 scFv VHL11S IgAH IgACH2 T4CH3 содержит шарнирную часть IgA, WT IgA CH2 и укороченный CH3 IgA; 2H7 scFv VHL11S IgECH2 CH3 CH4, включающий области IgE CH2-4; 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) IgECH3CH4, включающий мутантную шарнирную область в комплексе с вышеуказанным и области CH3 и CH4 IgE; 2H7 scFv VH L11S mIgE CH2 CH3 CH4 включает области IgE мыши; 2H7 scFv VH L11S mIgAH WIGACH2 T4CH3 включает описанные выше мутации и мышиную IgA константную область, состоящую из области CH2 дикого типа и мутантной области CH3; 2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H K322S CH2 WCH3 включает мутацию в человеческой области IgGI CH2 в остатке 322, где лизин был заменен на серин; 2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H K322S CH2 WCH3 содержит мутантную шарнирную область, как описано выше, и мутантную область CH2, описанную ранее; 2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H P331S CH2 WCH3 содержит описанную выше мутантную шарнирную область и мутантную область CH2, в которой остаток пролина 331 был заменен на серин; 2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H P331S CH2 WCH3 включает мутантную шарнирную область и замену остатка пролина 331 на серин в области CH2; 2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H T256N CH2 WCH3 включает мутантную шарнирную область и замену треонина на аспарагин в положении 256 в области CH2; 2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H RTPE/QNAK (255-258) CH2 WCH3 включает мутантную шарнирную область и серию мутаций, в которых остатки 255-258 аргинина, треонина, пролина, глутаминовой кислоты заменяют на глутамин, аспарагин, аланин и лизин, соответственно; 2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H K290Q CH2 WCH3 включает мутантные шарнирные области и замену лизина на глутамин в положении 290; 2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H A339P CH2 WCH3 включает мутантную шарнирную область и замену аланина на пролин в положении 339.

SMIP 2H7 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3 включает мутантную шарнирную область и замену пролина на серин в положении 238 в CH2, который является таким же, как 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3. 2H7 scFv IgAH IGAHCH2 T18CH3 включает шарнирную часть IgA дикого типа и область CH2 и область CH3 с удалением 18 аминокислот на карбоксиконце.

Предполагают, что связывающая молекула по изобретению может содержать природный или рекомбинантный внеклеточный домен из другого белка, который увеличивает активность связывающей молекулы. В одном варианте осуществления внеклеточный домен выбран из группы, состоящей из CD154 и CTLA4.

В одном аспекте изобретения CD20-специфическую связывающую молекулу вводят в виде фармацевтической композиции. Для введения CD20-специфической связывающей молекулы людям или экспериментальным животным предпочтительно составлять связывающую молекулу в композицию, содержащую один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Фраза «фармацевтически или фармакологически приемлемый» относится к молекулярным объектам и композициям, которые не вызывают аллергических или других нежелательных реакций при введении известными в данной области путями, описанными ниже. «Фармацевтически приемлемые носители» включают любые и все клинически применимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и т.п.

Кроме того, соединения могут образовывать сольваты с водой или обычными органическими растворителями. Эти сольваты также входят в рамки изобретения.

Композиции CD20-специфической связывающей молекулы могут быть введены перорально, топически, чрескожно, парентерально, с помощью ингаляционного спрея, вагинально, ректально или путем интракраниальной инъекции. Термин «парентеральный» в рамках изобретения включает подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, интрацистернальную инъекцию или инфузионные техники. Также рассматривают введение путем внутривенной, интрадермальной, внутримышечной, внутригрудной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургическую имплантацию в определенном участке. Как правило, композиции являются, главным образом, свободными от пирогенов, а также от других примесей, которые могут быть вредными для реципиента. Инъекция, особенно внутривенная, является предпочтительной.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие CD20-специфическую связывающую молекулу, используемые в способе по изобретению, могут содержать фармацевтически приемлемые носители или добавки, в зависимости от пути введения. Примеры таких носителей или добавок включают воду, фармацевтически приемлемый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивиниловый полимер, карбоксиметилцеллюлозу натрия, полиакрилат натрия, альгинат натрия, водорастворимый декстран, карбоксиметилкрахмал натрия, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, ксантановую камедь, аравийскую камедь, казеин, желатин, агар, диглицерин, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, парафин, стеариловый спирт, стеариновую кислоту, человеческий сывороточный альбумин (HSA), маннит, сорбит, лактозу, фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество (сурфактант) и т.п. Используемые добавки выбирают, но не ограничиваются ими, из вышеуказанного или их комбинаций, в качестве подходящих, в зависимости от лекарственной формы по настоящему изобретению.

Состав фармацевтической композиции может варьировать в соответствии с выбранным путем введения (например, раствор, эмульсия). Подходящая композиция, содержащая антитело для введения, может быть приготовлена в физиологически приемлемой среде или носителе. Для растворов или эмульсий подходящие носители включают, например, водные или водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, включающие физиологический раствор и буферные среды. Парентеральные среды для лекарственных средств могут включать раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу и хлорид натрия, лактатный раствор Рингера или жирные масла. Внутривенные среды могут включать различные добавки, консерванты или жидкое питательное вещество, или электролитные компенсаторы.

Ряд водных носителей, например, вода, забуференная вода, 0,4% физиологический раствор, 0,3% глицин или водные суспензии, могут содержать активное соединение в смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных суспензий. Такие эксципиенты являются суспендирующими агентами, например, карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакант и аравийская камедь; диспергирующие или смачивающие агенты могут быть натуральным фосфолипидом, например, лецитин, или продуктами конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, стеарат полиоксиэтилена, или продуктами конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксицетанол, или продуктами конденсации этиленоксида с неполными эфирами жирных кислот и гексита, такими как моноолеат полиоксиэтиленсорбита, или продуктами конденсации эленоксида с неполными эфирами жирных кислот и ангидридами гексита, например, моноолеат полиэтиленсорбитана. Водные суспензии могут также содержать один или несколько консервантов, например, этил, н-пропил, п-гидроксибензоат.

Композиция CD20-специфической связывающей молекулы может быть лиофилизирована для хранения и восстановлена в подходящем носителе перед использованием. Эффективность этой техники показана на обычных иммуноглобулинах. Могут быть использованы любые подходящие техники лиофилизации и восстановления. Специалисты в данной области понимают, что лиофилизация и восстановление могут приводить к потерям активности антител в различной степени и что дозировки могут быть изменены для компенсации.

Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для приготовления водной суспензии путем добавления воды, предоставляют активное соединение в смеси с диспергирующим или смачивающим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Подходящие диспергирующие или смачивающие агенты и суспендирующие агенты уже упоминались выше в качестве примеров.

Концентрация CD20-специфической связывающей молекулы в этих композициях может широко варьировать, например, от менее чем 0,5%, обычно по меньшей мере примерно от 1% вплоть до 15 или 20 мас.%, и может быть выбрана предварительно на основании объемов жидкостей, вязкостей и т.д., в соответствии с конкретной выбранной лекарственной формой. Таким образом, типичная фармацевтическая композиция для парентеральной инъекции может быть доведена до содержания 1 мл стерильной забуференной воды и 50 мг антитела. Типичная композиция для внутривенной инъекции может быть доведена до содержания 250 мл стерильного раствора Рингера и 150 мг антитела. Фактические способы приготовления парентерально вводимых композиций будут известны или очевидны специалистам и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980). Эффективная доза антител находится в диапазоне от 0,01 мг до 1000 мг на кг массы тела в среднем на введение.

Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильной инъекционной водной, масляной суспензии, дисперсий или стерильных порошков для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Суспензия может быть получена в соответствии с применением известных в данной области диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов, которые упоминались выше. Стерильный инъекционный препарат также может быть стерильным инъекционным раствором или суспензией в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), подходящие смеси вышеуказанного, растительные масла, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла традиционно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может быть использовано любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, нашли применение в приготовлении препаратов для инъекций.

Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой при тех объемах, при которых ее легко набирать в шприц. Должна быть сохранена подходящая текучесть, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем обеспечения требуемого размера частиц, в случае дисперсии, и путем использования сурфактантов. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от инфицирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях желательно включать изотонические агенты, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть осуществлена использованием в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Композиции, используемые для введения, могут быть составлены с усилителями усвоения или абсорбции для повышения их эффективности. Этот усилитель включает, например, салицилат, гликохолат/линолеат, гликохолат, апротинин, бацитрацин, SDS, капрат и т.п. См., например, Fix (J. Pharm. Sci., 85:1282-1285, 1996) и Oliyai and Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521-544, 1993).

Кроме того, гидрофильные и гидрофобные свойства композиций, которые могут быть использованы в изобретении, являются хорошо сбалансированными, при этом увеличивается их полезность для in vitro и особенно in vivo применений, в то время как другие композиции, не имеющие такого баланса, по существу менее применимы. В частности, композиции, которые могут быть использованы в изобретении, имеют подходящую степень растворимости в водной среде, которая обеспечивает абсорбцию и биодоступность в организме, в то же время имея степень растворимости в липидах, которая позволяет соединениям пересекать клеточную мембрану в предполагаемом участке действия. Таким образом, рассматриваемые композиции антител являются максимально эффективными, когда они могут быть доставлены к участку активности антигена-мишени.

В одном аспекте способы по изобретению включают стадию введения фармацевтической композиции.

Способы по изобретению выполняют, используя любые приемлемые медицинские средства для введения лекарственного средства прямо или косвенно в организм млекопитающего, включая, без ограничения, инъекции, пероральный прием внутрь, интраназальное, топическое, трансдермальное, парентеральное введение, ингаляционный спрей, вагинальное или ректальное введение. Термин «парентеральный» в настоящем описании включает подкожные, внутривенные, внутримышечные и интрацистернальные инъекции, а также катетерные или инфузионные техники. Также рассматривается введение внутрикожной, интрамаммарной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекцией и/или хирургическая имплантация в определенном участке.

В одном варианте осуществления введение производят в участке рака или пораженной ткани, нуждающейся в лечении, прямой инъекцией в участок или путем пролонгированной доставки, или используя механизм пролонгированного высвобождения, который может доставлять соединение изнутри. Например, биодеградируемые микросферы или капсулы, или другие биодеградируемые полимерные формы, способные к пролонгированной доставке композиции (например, растворимый полипептид, антитело или малая молекула), могут быть включены в композиции по изобретению, имплантированные рядом со злокачественной опухолью.

Терапевтические композиции также могут быть доставлены пациенту во многих участках. Множественные введения могут быть выполнены одновременно или могут быть выполнены в течение продолжительного периода времени.

Также в настоящем изобретении рассматривается введение композиции связывающей молекулы в сочетании со вторым агентом. Вторые агенты, которые могут быть использованы в изобретении, перечислены в нижеприведенных параграфах.

Второй агент может быть молекулой, ассоциированной с В-клеткой. Другие ассоциированные с В-клеткой молекулы, рассматриваемые в изобретении, включают связывающие молекулы, которые связываются с поверхностными молекулами В-клеток, которые не являются CD20. Молекулы, ассоциированные с В-клеткой, включают, но не ограничиваются ими, CD19 (В-лимфоцитарный антиген CD19, также обозначаемый как В-лимфоцитарный поверхностный антиген В4 или Leu-12), CD21, CD22 (B-клеточный рецептор CD22, также обозначаемый как Leu-14, молекула клеточной адгезии B-лимфоцитов или BL-CAM), CD23, CD37, CD40 (B-клеточный поверхностный антиген CD40, также обозначаемый как член 5 надсемейства рецепторов фактора некроза опухоли, CD40L рецептор или Bp50), CD80 (антиген активации T-лимфоцитов CD80, также обозначаемый как активационный B7-1 антиген, B7, B7-1 или BB1), CD86 (антиген активации T-лимфоцитов CD86, также обозначаемый как активационный B7-2 антиген, B70, FUN-1 или BU63), CD137 (также обозначаемый как член 9 надсемейства рецепторов фактора некроза опухоли), CD152 (также обозначаемый как цитотоксический T-лимфоцитарный белок 4 или CTLA-4), L6 (опухоль-ассоциированный антиген L6, также обозначаемый как член 1 трансмембранного надсемейства 4, маркер 1 мембранного компонента поверхности или M3S1), CD30 (антиген активации лимфоцитов CD30, также обозначаемый как член 8 надсемейства рецепторов фактора некроза опухоли, CD30L рецептор или Ki-1), CD50 (также обозначаемый как молекула-3 межклеточной адгезии (ICAM3) или ICAM-R), CD54 (также обозначаемый как молекула-1 межклеточной адгезии (ICAM1), или рецептор основной группы риновирусов), B7-H1 (лиганд для иммуноингибиторного рецептора, экспрессируемый активированными T-клетками, B-клетками и миелоидными клетками, также обозначаемый как PD-L1; см. Dong, et al., "B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion," Nat. Med. 1999, 5:1365-1369), CD134 (также обозначаемый как член 4 надсемейства рецепторов фактора некроза опухоли, OX40, OX40L рецептор, ACT35 антиген или рецептор TAX-транскрипционно активируемого гликопротеина 1), 41BB (рецептор лиганда 4-1BB, T-клеточный антиген 4-1BB или T-клеточный антиген ILA), CD153 (также обозначаемый как член 8 надсемейства лигандов фактора некроза опухоли, CD30 лиганд или CD30-L), CD154 (также обозначаемый как член 5 надсемейства лигандов фактора некроза опухоли, TNF-связанный белок активации, TRAP или T-клеточный антиген Gp39) и Toll рецепторы. Представленный выше список структурных мишеней и/или антигенов-мишеней представляет собой только пример и не является исчерпывающим.

Цитокины и факторы роста, рассматриваемые в изобретении в качестве вторых агентов, включают, без ограничения, один или несколько из TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, тромбопоэтина, фактора стволовых клеток эритропоэтина. Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением могут также включать другие известные ангиопоэтины, например, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, и/или человеческий ангиопоэтиноподобный полипептид и/или сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Факторы роста для использования в фармацевтических композициях по изобретению включают ангиогенин, костный морфогенетический белок-1, костный морфогенетический белок-2, костный морфогенетический белок-3, костный морфогенетический белок-4, костный морфогенетический белок-5, костный морфогенетический белок-6, костный морфогенетический белок-7, костный морфогенетический белок-8, костный морфогенетический белок-9, костный морфогенетический белок-10, костный морфогенетический белок-11, костный морфогенетический белок-12, костный морфогенетический белок-13, костный морфогенетический белок-14, костный морфогенетический белок-15, костный морфогенетический белковый рецептор IA, костный морфогенетический белковый рецептор IB, нейротрофический фактор головного мозга, цилиарный нейротрофический фактор, α-рецептор цилиарного нейротрофического фактора, цитокининдуцированный фактор-1 хемотаксиса нейтрофилов, цитокининдуцированный фактор-2α хемотаксиса нейтрофилов, цитокининдуцированный фактор-2β хемотаксиса нейтрофилов, β-фактор роста эндотелиальных клеток, эндотелин 1, эпидермальный фактор роста, эпителиальный аттрактант нейтрофилов, фактор роста фибробластов-4, фактор роста фибробластов-5, фактор роста фибробластов-6, фактор роста фибробластов-7, фактор роста фибробластов-8, фактор роста фибробластов-8b, фактор роста фибробластов-8c, фактор роста фибробластов-9, фактор роста фибробластов-10, кислый фактор роста фибробластов, основной фактор роста фибробластов, α1-рецептор глиального нейротрофического фактора, α2-рецептор глиального нейротрофического фактора, связанный с ростом белок, связанный с ростом белок α, связанный с ростом белок β, связанный с ростом белок γ, гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, рецептор фактора роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор роста I, рецептор инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобный фактор роста II, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста, фактор роста кератиноцитов, лейкемический ингибиторный фактор, α-рецептор лейкемического ингибиторного фактора, фактор роста нервов, рецептор фактора роста нервов, нейротрофин-3, нейротрофин-4, плацентарный фактор роста, плацентарный фактор роста 2, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарный фактор роста, цепь А тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарный фактор роста АА, тромбоцитарный фактор роста АВ, цепь В тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарный фактор роста ВВ, α-рецептор тромбоцитарного фактора роста, β-рецептор тромбоцитарного фактора роста, фактор, стимулирующий рост пре-В-клеток, фактор стволовых клеток, рецептор фактора стволовых клеток, трансформирующий фактор роста α, трансформирующий фактор роста β, трансформирующий фактор роста β1, трансформирующий фактор роста β1.2, трансформирующий фактор роста β2, трансформирующий фактор роста β3, трансформирующий фактор роста β5, латентный трансформирующий фактор роста β1, белок I, связывающий трансформирующий фактор роста β, белок II, связывающий трансформирующий фактор роста β, белок III, связывающий трансформирующий фактор роста β, рецептор типа I фактора некроза опухоли, рецептор типа II фактора некроза опухоли, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, сосудистый эндотелиальный фактор роста и химерные белки и их биологически или иммунологически активные фрагменты.

Примеры химиотерапевтических агентов, рассматриваемых в качестве вторых агентов, включают, но не ограничиваются ими, алкилирующие агенты, такие как производные азотистого иприта (например, мехлорэтамин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан и хлорамбуцил); нитрозомочевины (например, кармустин (BCNU), ломустин (CCNU) и семустин (метил-CCNU)); этиленимины и метилмеламины (например, триэтиленмеламин (ТЕМ), триэтилентиофосфорамид (тиотепа) и гексаметилмеламин (HMM, алтретамин)); алкилсульфонаты (например, бусулфан); и триазины (например, дакабазин (DTIC)); антиметаболиты, такие как аналоги фолиевой кислоты (например, метотрексат, триметрексат и пеметрескед (многоцелевой антифолат)); аналоги пиримидина (такие как 5-фторурацил (5-FU), фтордезоксиуридин, гемцитабин, арабинозид цитозина (AraC, цитарабин), 5-азацитидин и 2,2'-дифтордезоксицитидин); и аналоги пурина (например, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, азатиоприн, 2'-дезоксикоформицин (пентостатин), эритрогидроксинониладенин (EHNA), фосфат флударабина, 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин, 2-CdA)); ингибиторы топоизомеразы типа I, такие как камптотесин (СРТ), топотекан и иринотекан; определенные природные продукты, такие как эпиподофилотоксины (например, этопозид и тенипозид); и алкалоиды барвинка (например, винбластин, винкристин и винорелбин); противоопухолевые антибиотики, такие как актиномицин D, доксорубицин и блеомицин; определенные радиосенсибилизаторы, такие как 5-бромдезоксиуридин, 5-йоддезоксиуридин и бромдезоксицитидин; платиновые координационные комплексы, такие как цисплатин, карбоплатин и оксаплатин; производные мочевины, такие как гидроксимочевина; и производные метилгидразина, такие как N-метилгидразин (MIH) и прокарбазин.

Неограничивающие примеры химиотерапевтических агентов, радиотерапевтических агентов и других активных и вспомогательных агентов также представлены в таблице 1.

Таблица 1
Алкилирующие агенты	Натуральные продукты
Производные азотистого иприта	Антимитотические лекарственные средства
мехлорэтамин
циклофосфамид	Таксаны
ифосфамид	паклитаксел
мелфалан	алкалоиды барвинка
хлорамбуцил	винбластин (VLB)
	винкристин
Нитрозомочевины	винорелбин
кармустин (BCNU)	Таксотере® (доцетаксел)
ломустин (CCNU)	эстрамустин
семустин (метил-CCNU)	фосфат эстрамустина
Этиленимин/метилмеламин	Эпиподофилотоксины
триэтиленмеламин (ТЕМ)	этопозид
триэтилентиофосфорамид (тиотепа) гексаметилмеламин (HMM, алтретамин)	тенипозид
	Антибиотики
Алкилсульфонаты	актиномицин D
бусулфан	дауномицин (рибидомицин)
	доксорубицин (адриамицин)
Триазины	митоксантронидарубицин
дакарбазин (DTIC)	блеомицин
	спликамицин (митрамицин)
Антиметаболиты	митомицинС
Аналоги фолиевой кислоты	дактиномицин
метотрексат	афидиколин
триметрексат
пеметрексед (многоцелевой антифолат)	Ферменты
	L-аспарагиназа
Аналоги пиримидина	L-аргиназа
5-фторурацил
фтордезоксиуридин	Радиосенсибилизаторы
гемцитабин	метронидазол
арабинозид цитозина (AraC, цитарабин)	мизонидазол десметилмизонидазол
5-азацитидин	пимонидазол
2,2'-дифтордезоксицитидин	этанидазол ниморазол
Аналоги пурина	RSU 1069
6-меркаптопурин	EO9
6-тиогуанин	RB 6145
азатиоприн	SR4233
2'-дезоксикоформицин (пентостатин)	никотинамид
эритрогидроксинониладенин (EHNA)	5-бромдезоксиуридин
фосфат флударабина	5-йоддезоксиуридин
2-хлордезоксиаденозин (кладрибин, 2-CdA)	бромдезоксицитидин
	Различные агенты
Ингибиторы топоизомеразы типа I	Платиновые координационные комплексы
камптотесин	цисплатин
топотекан иринотекан	карбоплатин оксалиплатин
	антрацендион
Модификаторы биологического ответа	митоксантрон
G-CSF
GM-CSF	Производные мочевины
	гидроксимочевина
Дифференцировочные агенты
производные ретиноевой кислоты	Производные метилгидразина
	N-метилгидразин (MIH)
Гормоны и антагонисты	прокарбазин
адренокортикостероиды/антагонисты
преднизолон и эквиваленты дексаметазон	Адренокортикоидные супрессанты
аминоглутетимид	митотан (о,р'-DDD)
	аминоглутетимид
Прогестины
капроат гидроксипрогестерона ацетат медроксипрогестерона
ацетат мегестрола	Цитокины
	интерферон (α, β, γ)
Эстрогены	интерлейкин-2
диэтилстилбестрол
этинилэстрадиол/эквиваленты	Фотосенсибилизаторы
	производные гематопорфирина
Антиэстроген	Фотофрин®
тамоксифен	производные бензопорфирина
	Npe6
Андрогены	комплекс этиопорфирина с оловом (SnET2)
пропионат тестостерона флуоксиместерон/эквиваленты	феоборид-а бактериохлорофилл-а
	нафталоцианины
Антиандрогены	фталоцианины
флутамид	фталоцианины цинка
аналог гонадотропин-высвобождающего гормона
	Облучение
Нестероидные антиандрогены	рентгеновское облучение ультрафиолетовый свет гамма-излучение видимый свет инфракрасное облучение микроволновое облучение
флутамид

Вторые агенты, которые могут быть использованы в изобретении для лечения аутоиммунных заболеваний, относятся к иммуносупрессивным агентам, которые подавляют или маскируют действие иммунной системы индивидуума, получающего лечение. Иммуносупрессивные агенты включают, например, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), болеутоляющие средства, глюкокортикоиды, заболевание-модифицирующие противоревматические лекарственные средства (DMARD) для лечения артрита или модификаторы биологического ответа. Композиции в описании NSAID также применимы для лечения многих других аутоиммунных заболеваний, кроме RA.

Типичные NSAID выбирают из группы, состоящей из ибупрофена, напроксена, напроксена натрия, ингибиторов Cox-2, таких как Vioxx и селебрекс, и сиалилатов. Типичные болеутоляющие средства выбирают из группы, состоящей из ацетаминофена, оксикодона, трамадола пропорксифена гидрохлорида. Типичные глюкокортикоиды выбирают из группы, состоящей из кортизона, дексаметозона, гидрокортизона, метилпреднизолона, преднизолона или преднизона. Типичные модификаторы биологического ответа включают, но не ограничиваются ими, молекулы, направленные против маркеров клеточной поверхности (например, CD4, CD5, CTLA4 и т.д.) абатасепт, ингибиторы цитокинов, такие как антагонисты TNF (например, этанерсепт (Энбрел), адалимумаб (Хумира) и инфликсимаб (Ремикейд)), ингибиторы хемокинов и ингибиторы молекул адгезии. Модификаторы биологического ответа включают моноклональные антитела, а также рекомбинантные формы молекул. Примеры DMARD включают, но не ограничиваются ими, азатиоприн, циклофосфамид, циклоспорин, метотрексат, пеницилламин, лефлуномид, сульфасалазин, гидроксихлороквин, золото [орально (ауранофин) и внутримышечно] и миноциклин.

Композиция CD20-специфической связывающей молекулы и второй агент могут вводиться совместно в одной лекарственной форме. Альтернативно, агенты вводят в отдельных лекарственных формах и вводят одновременно, в отношении агентов, введенных в пределах 30 минут друг от друга.

В другом аспекте второй агент вводят перед введением композиции CD20-специфической связывающей молекулы. Предварительное введение относится к введению второго агента в пределах от одной недели перед лечением антителом вплоть до 30 минут перед введением антитела. Второй агент вводят вслед за введением композиции SMIP. Последующее введение означает введение от 30 минут после лечения антителом вплоть до одной недели после введения антитела.

Предполагают, что если CD20-специфическую связывающую молекулу используют в комбинации со вторым агентом, где второй агент представляет собой цитокин или фактор роста, или химиотерапевтический агент, то применение также включает использование радиотерапевтического агента или лучевой терапии. Лучевую терапию, используемую в комбинации с композицией антитела, назначают по решению лечащего врача и в дозах, обычно назначаемых пациентам при лечении рака.

Количества композиции CD20-специфической связывающей молекулы в назначенной дозе варьирует в зависимости от размера тела человека, которому проводят терапию, и особенностей заболевания. При типичном лечении может быть необходимо вводить примерно 1 мг/день, примерно 5 мг/день, примерно 10 мг/день, примерно 20 мг/день, примерно 50 мг/день, примерно 75 мг/день, примерно 100 мг/день, примерно 150 мг/день, примерно 200 мг/день, примерно 250 мг/день, примерно 400 мг/день, примерно 500 мг/день, примерно 800 мг/день, примерно 1000 мг/день, примерно 1600 мг/день или примерно 2000 мг/день. Также могут быть введены дозы, исходя из массы тела пациента, в дозе от 0,01 до 50 мг/кг. В родственном варианте осуществления CD20-специфическую связывающую молекулу используют в диапазоне доз от 0,015 до 30 мг/кг. В другом варианте осуществления CD20-специфическую связывающую молекулу используют в дозе примерно 0,015, примерно 0,05, примерно 0,15, примерно 0,5, примерно 1,5, примерно 5, примерно 15 или примерно 30 мг/кг.

Стандартные исследования доза-ответ, сначала на животных моделях, а затем в клиническом испытании, показывают оптимальные дозы для конкретных заболеваний и популяций пациентов.

Введение композиции CD20-специфической связывающей молекулы уменьшает или ослабляет В-клеточную популяцию по меньшей мере примерно на 20% после лечения однократной дозой. В одном варианте осуществления В-клеточная популяция уменьшается или ослабляется по меньшей мере примерно на 20, примерно на 30, примерно на 40, примерно на 50, примерно на 60, примерно на 70, примерно на 80, примерно на 90 или примерно на 100%. B-клеточную элиминацию определяют как уменьшение абсолютного числа B-клеток ниже нижней границы нормального значения. B-клеточное восстановление определяют как возвращение абсолютного числа B-клеток к одному из следующих значений: 1) 70% величины исходного уровня у пациента или 2) нормальный диапазон.

Введение CD20-специфических связывающих молекул также приводит к усиленному апоптозу в определенных субпопуляциях В-клеток. Апоптозом называют индукцию программированной гибели клетки, которую обнаруживают и оценивают по фрагментации ДНК, сжатию клетки, фрагментации клетки, образованию мембранных везикулов или изменению липидного состава мембран, определяемому окраской аннексином V.

Кроме того, введение CD20-специфических связывающих молекул приводит к желаемым клиническим эффектам в заболевании или нарушении, подвергаемом лечению. Например, у пациентов, пораженных ревматоидным артритом, введение молекул CD20 вызывает клинически значимое улучшение состояния [например, по результатам теста на предварительное выявление улучшений ACR20 Американского ревматологического колледжа (the American College of Rheumatology Preliminary Detection of Improvement)], и/или 20% улучшение состояния болезненного и опухшего сустава и 20% улучшение в 3 из 5 остальных измерений ACR (Felson et al., Arthritis Rheum. 1995, 38:727-35). Биологические измерения улучшения у пациента с RA после введения CD20-специфической связывающей молекулы включают измерение титров цитокина, измеренных по уровню белка или РНК. Представляющие интерес цитокины включают, но не ограничиваются ими, TNF-α, IL-1, интерфероны, Blys и APRIL. Изменения цитокинов могут быть вызваны снижением количества В-клеток или уменьшением активированных Т-клеток. У пациентов с RA маркеры, относящиеся к костному метаболизму (костная резорбция или эрозия), измеряют до и после введения CD20-специфических связывающих молекул. Соответствующие маркеры включают, но не ограничиваются ими, щелочную фосфатазу, остеокальцин, фрагменты разрушенного коллагена, гидроксипролин, тартрат-устойчивую кислую фосфатазу, и RANK лиганд (RANKL). Другие регистрируемые параметры, связанные с улучшением при RA, включают измерение титров С-реактивного белка (CRP), скорость оседания эритроцитов (ESR), ревматоидный фактор, антитела к ССР (циклический цитруллиновый пептид) и оценку общих В-клеточных титров и подсчет лимфоцитов с помощью проточной цитометрии. Специфические факторы также могут быть измерены в синовиальной оболочке RA пациентов, включая определение В-клеточных титров в синовиальной оболочке из синовиальной биопсии, уровни RANKL и других костных факторов и указанный выше набор цитокинов.

В родственном аспекте эффекты введения CD20-специфической связывающей молекулы при других заболеваниях измеряют согласно стандартам, известным в данной области. Например, предполагают, что пациенты с болезнью Крона, получающие CD20-специфические связывающие молекулы, достигают улучшения по индексу активности болезни Крона (CDAI) в диапазоне примерно от 50 до 70 единиц, в то время как 150 единиц считают ремиссией (Simonis et al, Scand. J Gastroent. 1998, 33:283-8). Оценка в баллах 150 или 200 считается нормальной, в то время как оценка 450 считается показателем тяжелого заболевания. Кроме того, желательно, чтобы введение CD20-специфической связывающей молекулы приводило к уменьшению перинуклеарных антинейтрофильных антител (pANCA) и анти-Saccharomyces cervisiae антител (ASCA) у лиц с воспалительным кишечным заболеванием.

Также считается, что у взрослых и молодых пациентов с миозитом, получающих CD20-специфические связывающие молекулы, достигают улучшения по оценкам основного набора, например, 3 из 6 оценок основного набора улучшаются примерно на 20% и не более 2 основных оценок ухудшаются примерно на 25%. (см. Rider et al., Arthritis Rheum. 2004, 50:2281-90).

Пациенты с SLE, получающие CD20-специфические связывающие молекулы, достигают улучшения по шкале измерения активности системной волчанки (SLAM) или по шкале индекса активности заболевания SLE (SLEDAI) по меньшей мере на 1 пункт (Gladman et al., J. Rheumatol 1994, 21:1468-71) (Tan et al., Arthritis Rheum. 1982, 25:1271-7). Оценку SLAM >5, или оценку SLEDAI >2, рассматривают как клинически активное заболевание. Ответ на лечение может расцениваться как улучшение или стабилизация по 2 системам измерения активности (шкала индекса активности заболевания SLE [SLEDAI] и шкала измерения активности системной волчанки) и по 2 критериям качества жизни пациента (общее обследование пациента и шкала степени утомляемости по Круппу, the Krupp Fatigue Severity Scale) (Petri et al., Arthritis Rheum. 2004, 50:2858-68.) Желательно, чтобы введение CD20-специфической связывающей молекулы у пациентов с SLE приводило к уменьшению антител в двухцепочечной ДНК. Альтернативно, улучшение может быть измерено с помощью британской группы критериев для оценки волчанки (BILAG, the British Isles Lupus Assessment Group Criteria).

Пациенты с рассеянным склерозом, получающие CD20-специфические связывающие молекулы, достигают улучшения в клинической оценке по расширенной шкале инвалидизации Куртцке (EDSS) (Kurtzke, F., Neurology 1983, 33:1444-52) по меньшей мере на 0,5, или имеют задержку ухудшения клиники заболевания по меньшей мере на 1,0 по шкале Куртцке (Rudick et al., Neurology 1997, 49:358-63).

Пациенты с IIM, получающие CD20-специфические связывающие молекулы, достигают уменьшения по меньшей мере одного из пяти критериев, изложенных в оценке критериев идиопатической воспалительной миопатии (IIMC) (Miller, F., выше). Введение CD20-специфической связывающей молекулы пациентам с IIM приводит к уменьшению IIM-связанных факторов, выбираемых из группы, состоящей из креатинкиназы (СК), лактатдегидрогеназы, альдолазы, С-реактивного белка, аспартатаминотрансферазы (AST), аланинаминотрансферазы (ALT) и антинуклеарного аутоантитела (ANA), миозитспецифических аутоантител (MSA) и антитела к выделяемым нуклеарным антигенам. Альтернативно, пациенты, соответствующие 3 из 6 критериев, установленных Rider et al., Arthritis Rheum. 2004, 50:2281-90, могут быть пациентами лечения согласно изобретению, в случае ухудшения не более чем по 2 критериям.

В другом варианте осуществления пациенты, страдающие В-клеточным раком, принимают CD20-специфическую связывающую молекулу и демонстрируют в целом благоприятный ответ на CD20-специфическую связывающую молекулу на основании клинических критериев, хорошо известных и обычно применяемых в данной области, и описанных ниже, таких как уменьшение размера опухоли, снижение числа и/или улучшение симптомов заболевания.

Например, Национальным институтом рака США (NCI) проведено разделение некоторых классов рака на клинические категории «индолентные» и «агрессивные» лимфомы. Индолентные лимфомы включают фолликулярные клеточные лимфомы, разделенные по цитологическим «стадиям», диффузную лимфому из малых лимфоцитов/хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), макроглобулинемию лимфоплазмоцитарную/Вальденстрема, лимфому маргинальной зоны и волосатоклеточный лейкоз. Агрессивные лимфомы включают лимфому диффузную смешанную и крупноклеточную, лимфому Беркитта/лимфому мелкоклеточную с нерасщепленными ядрами, лимфобластную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны и AIDS-связанную лимфому. Иногда используют интернациональный прогностический индекс (IPI) в случаях агрессивной и фолликулярной лимфомы. Факторы, рассматриваемые в IPI, включают возраст (<60 лет против >60 лет), сывороточную лактатдегидрогеназу (нормальные значения против увеличенных), общесоматический статус (0 или 1 против 2-4) (см. определение ниже), стадию заболевания (I или II против III или IV) и вовлечение в патологический процесс экстранодальной зоны (0 или 1 против 2-4). Пациенты с 2 или более факторами риска имеют шанс менее 50% свободной от рецидива и общей выживаемости в течение 5 лет.

Общесоматический статус при агрессивной IPI определяют следующим образом: описание степени: 0 - совершенно активен, способен продолжать всю деятельность, как до заболевания, без ограничения; 1 - ограничен в напряженной физической активности, но передвигается и способен выполнять легкую работу или сидячую работу, например, легкая работа по дому, офисная работа; 2 - передвигается и способен полностью обслуживать себя, но не способен к любой рабочей активности более чем 50% времени бодрствования 3 - способен только на ограниченное самообслуживание, ограниченное кроватью или стулом более чем 50% времени бодрствования; 4 - полностью нетрудоспособен, не способен к самообслуживанию, полностью ограничен кроватью или стулом; и 5 мертв. (см. The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project. A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma. N. Engl. J. Med. 329:987-94, 1993).

Обычно стадию лимфомы клинически оценивают, используя способ оценки, который представляет лимфому низкой степени злокачественности как узловое заболевание, часто вялотекущее или медленно растущее. Заболевание средней и высокой степени злокачественности обычно представляется как значительно более агрессивное заболевание с большими экстранодальными генерализованными опухолями.

Систему классификации по Энн Эрбор также используют для оценки прогрессирования опухолей, особенно неходжкинских лимфом. В данной системе стадии I, II, III и IV при NHL у взрослых могут быть классифицированы как А и В категории, в зависимости от того, имеет ли пациент хорошо выраженные генерализованные симптомы (А) или нет (В). Обозначение "В" дают пациентам со следующими симптомами: необъяснимая потеря более чем 10% массы тела в течение 6 месяцев до постановки диагноза, необъяснимая лихорадка с температурой выше 38°C и проливной ночной пот. Определения стадий представляют собой следующее: стадия I - поражение одиночного регионарного лимфатического узла или одиночная локализация процесса за пределами лимфатического узла. Стадия II - поражение двух или более регионарных лимфатических узлов, расположенных по одну сторону диафрагмы или ограниченное поражение одного связанного нелимфоцитарного органа или участка и его регионарных лимфатических узлов с поражением или без поражения других регионарных лимфатических узлов по одну сторону диафрагмы. Стадия III - поражение регионарных лимфатических узлов по обе стороны диафрагмы, возможно сопутствующее ограниченному поражению органа или участка, поражению селезенки или их обоих. Стадия IV - диссеминированное (многоочаговое) поражение одного или более органов, расположенных за пределами лимфатического региона, с наличием или отсутствием поражения лимфатического узла, или поражение изолированного нелимфатического органа с поражением отдаленных (нерегионарных) узлов. Подробно см. The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project: A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma, New England J. Med. (1993) 329:987-994.

В одном аспекте терапевтический эффект CD20-специфической связывающей молекулы определяют по уровню ответа, например частичный ответ определяют как уменьшение опухоли менее чем на половину от ее исходного размера. Полную ремиссию определяют как полное устранение заболевания, подтвержденное клиническим или радиологическим определением. В одном варианте осуществления лицо, получающее однократную дозу CD20-специфической связывающей молекулы, демонстрирует по меньшей мере частичный ответ на лечение.

Согласно критерию Cheson для оценки NHL, разработанному совместно с Национальным институтом рака (Cheson et al., J Clin Oncol. 1999, 17:1244; Grillo-Lopez et al., Ann Oncol. 2000, 11:399-408), полная ремиссия достигается при полном исчезновении всех определяемых клинических и радиологических доказательств заболевания и связанных с ним симптомов, все лимфоузлы возвращаются к нормальным размерам, селезенка уменьшается в размере и костный мозг свободен от лимфомы.

Неподтвержденная полная ремиссия достигается, когда у пациента наблюдается полное исчезновение заболевания и уменьшение размера селезенки, но лимфоузлы уменьшаются на 75% и костный мозг является неясным. Неподтвержденная полная ремиссия соответствует критериям частичного ответа и превосходит их. Превосходящий ответ определяют как уменьшение опухолевой массы в целом по меньшей мере на 50%.

Специалистам доступны аналогичные критерии оценок, разработанные для различных других форм рака и гиперпролиферативных заболеваний. См., например, Cheson et al., Clin Adv Hematol Oncol. 2006, 4:4-5, где описаны критерии оценки CLL; Cheson et al., J Clin Oncol. 2003, 21:4642-9, где описаны критерии для AML; Cheson et al., Blood 2000, 96:3671-4, где описаны критерии миелодиспластических синдромов.

В другом аспекте лечебная ответная реакция на CD20-связывающую молекулу у пациентов с В-клеточным раком проявляется в виде замедления прогрессирования заболевания, по сравнению с пациентами, не получавшими этой терапии. Количественное определение замедления заболевания или любого из указанных выше факторов может быть проведено с помощью хорошо известных в данной области техник, включая сканирование костей, КТ сканирование, сканирование с галлием, лимфоангиограмму, ЯМР, ПЭТ сканирование, ультразвуковое исследование и т.п.

В родственном аспекте для определения эффективности лечения CD20-связывающей молекулой измеряют число В-клеток в биологическом образце индивидуума. В этом варианте осуществления биологический образец выбирают из крови, биопсии опухоли, лимфатических узлов, миндалин, костного мозга, тимуса и других обогащенных лимфоцитами тканей. Обогащенная лимфоцитами ткань представляет собой ткань, особенно богатую лимфоцитными клетками, включая, без ограничения, лимфоузлы и связанные с ними органы (селезенка, костный мозг, миндалины, тимус лимфоидная ткань слизистой), опухоли и участки воспаления.

Также очевидно, что дозировку можно изменить при введении традиционных лекарственных средств в комбинации с лекарственными средствами по изобретению.

В одном аспекте у пациента, который получает лечение способом по изобретению, наблюдается улучшение ответа на лечение CD20-связывающей молекулой, описанной в настоящей заявке, который лучше, чем ответ на лечение ритуксимабом и другой не CD20-связывающей молекулой. Улучшение ответа оценивают путем сравнения клинических критериев, хорошо известных специалистам и описанных в настоящей заявке. Типичные критерии включают, но не ограничиваются ими, продолжительность В-клеточной элиминации, уменьшение количеств В-клеток в целом, уменьшение количеств В-клеток в биологическом образце, уменьшение размеров опухоли, уменьшение числа опухолей, существующих и/или возникающих после лечения, и улучшение ответа в целом по оценкам самих пациентов и врачей, например, по международному прогностическому индексу.

Пациент, получающий лечение способом по изобретению, может получать повторное лечение, например, если симптомы заболевания появляются вновь или если фармакокинетика и/или фармакодинамика лекарственного средства делают такое повторное лечение целесообразным. В одном варианте осуществления пациенту, который получил однократную дозу CD20-связывающей молекулы, вводят другую однократную дозу CD20-связывающей молекулы. Клиницист, обладающий обычными навыками, в состоянии определить, когда показано повторное лечение, на основании, например, повторного возникновения симптомов заболевания или восстановления В-клеток у пациента до уровня, требующего повторного лечения. Примеры других показателей или маркеров клинических критериев и итог описаны далее в настоящем описании. Пациент, получивший лечение, может быть поставлен в график для поддерживающего лечения, при котором пациент получает повторное лечение однократной дозой CD20-специфической связывающей молекулы на основании фармакокинетических и фармакодинамических свойств CD20-специфической связывающей молекулы. Такое поддерживающее лечение обычно проводят в период от трех месяцев до двух лет после первоначальной однократной дозы. Типичные фармакодинамические данные включают, но не ограничиваются ими, биологические измерения улучшения заболевания, как описано в настоящей заявке, такие как титры CD20-специфической связывающей молекулы в сыворотке крови, улучшение в оценке заболевания (например, с помощью ACR, SLAM или IPI), изменение в экспрессии цитокинов или поверхностных маркеров, титрах аутоантител и изменение размеров опухоли. Специалистам в данной области следует понимать, что различия в индивидуальных ответных реакциях на лечение способами по изобретению может потребовать различий в выборе времени повторного лечения однократной дозой CD20-специфической связывающей молекулы.

В качестве дополнительного аспекта изобретение включает наборы, которые содержат один или несколько компонентов или композиций, упакованных таким образом, который облегчает их применение для осуществления на практике способов по изобретению. В одном варианте осуществления такой набор включает соединение CD20-специфической связывающей молекулы или композицию, описанную в настоящей заявке (например, композиция, содержащая только CD20-специфическую связывающую молекулу или в комбинации со вторым агентом), упакованную в контейнер, такой как запечатанный флакон или сосуд, с этикеткой, прикрепленной к контейнеру или вложенной в упаковку, которая описывает применение соединения или композиции на практике. Предпочтительно, соединение или композиция упакованы в стандартной лекарственной форме. Набор может включать устройство, подходящее для введения композиции в соответствии с конкретным путем введения или для проведения скринингового анализа. Предпочтительно, набор содержит этикетку, на которой описано использование композиции антитела.

Настоящее изобретение также включает промышленные изделия. Эти изделия содержат по меньшей мере одну CD20-специфическую связывающую молекулу, необязательно вместе с фармацевтическим носителем или разбавителем, и по меньшей мере одну этикетку, на которой описан способ применения CD20-специфической SMIP согласно изобретению. Эти промышленные изделия могут также необязательно содержать по меньшей мере один второй агент для введения в сочетании с CD20-специфической SMIP.

Настоящее изобретение также относится к применению композиции, содержащей по меньшей мере одну CD20-специфическую связывающую молекулу для получения лекарственного средства для ингибирования или предотвращения аберрантной В-клеточной активности, или для лечения или профилактики у пациента заболевания, состояния или нарушения, характеризующегося или опосредованного абберантной В-клеточной активностью.

Краткое описание фигур

Фигура 1А иллюстрирует оценку В-клеточной элиминации в исследовании диапазона доз на приматах, не относящихся к человеку, получающих однократную дозу CD20-специфической связывающей молекулы TRU-015. На фигуре 1В представлен дальнейший анализ В-клеточной элиминации в аналогичном эксперименте, измеренной на протяжении продолжительного периода времени и представленной в виде процента В-клеточной элиминации.

Фигура 2 иллюстрирует оценку В-клеточной элиминации у пациентов в результате введения однократной дозы CD20-специфической связывающей молекулы TRU-015.

На фигуре 3 показано сравнение TRU-015 и других CD20-связывающих молекулярных конструкций в ADCC и CDC экспериментах.

На фигуре 4 показана продолжительность В-клеточной элиминации, измеренной по количеству CD19+ В-клеток у пациентов с RA, получающих TRU-015, в исследовании диапазона доз.

На фигуре 5 показана В-клеточная элиминация у пациентов с RA, получающих однократную дозу 15 мг/кг TRU-015 или 2×7,5 мг/кг дозу TRU-015.

ПРИМЕРЫ

Дополнительные аспекты и детали изобретения станут очевидными из следующих примеров, которые предназначены скорее для иллюстрации, чем для ограничения. В примере 1 описана рекомбинантная продукция CD20-специфической SMIP. В примере 2 описана активность СD20-специфической SMIP in vitro. В примере 3 описаны действия CD20-специфической связывающей молекулы на линию В-клеточной опухоли in vivo. В примере 4 описано введение однократной дозы СD20-специфической SMIP приматам, не относящимся к человеку. В примере 5 описано введение СD20-специфической SMIP пациентам-людям. В примере 6 описано введение СD20-специфической SMIP для лечения идиопатической воспалительной миопатии. В примере 7 описано введение СD20-специфической SMIP для лечения пациентов с ревматоидным артритом. В примере 8 описаны клинические результаты введения СD20-специфической SMIP у пациентов с ревматоидным артритом.

ПРИМЕР 1

РЕКОМБИНАТНТАЯ ПРОДУКЦИЯ СD20-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ МОЛЕКУЛЫ

СD20-специфические SMIP описаны в совместных патентных публикациях США 2003/133939, 2003/0118592 и 2005/0136049. Типичная SMIP, TRU-015, была выбрана для дополнительного исследования, как описано ниже.

TRU-015 представляет собой рекомбинантный (мышь/человек) одноцепочечный белок, который связывается с CD20 антигеном. Связывающий домен основан на находящейся в открытом доступе последовательности CD20 антитела человека. Связывающий домен соединяется с эффекторным доменом, СН2 и СН3 доменами IgG1 человека через модифицированную CSS шарнирную область. TRU-015 существует в виде димера в растворе и этот димер имеет теоретическую молекулярную массу приблизительно 106000 Дальтон.

TRU-015 содержит последовательность клонирования лидерного пептида 2е12, состоящего из аминокислот 1-23 SEQ ID NO:2; 2H7 вариабельную область мышиной анти-человеческой CD20 легкой цепи с аминокислотным замещением в остатке 11 лизина на серин (VHL11S) в вариабельной области, которая отражается в позиции 34 в SEQ ID NO:2; asp-gly₃-ser-(gly₄ser)₂ линкер, начинающийся с остатка 129 в SEQ ID NO:2; 2H7 вариабельная область мышиной анти-человеческой CD20 тяжелой цепи, которая не имеет остатка серина в конце области тяжелой цепи, т.е. с заменой VTVSS на VTVS; Fc домен IgGI человека, включающий модифицированную шарнирную область, содержащую (CSS) последовательность, и CH2 и CH3 домены дикого типа. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности TRU-015 вставлены в SEQ ID NO:1 и 2, соответственно.

Клетки CHO, которые продуцируют TRU-015, культивировали в биореакторе с использованием собственной среды. TRU-015 очищали, используя серию стадий хроматографии и фильтрования с использованием противовирусного фильтра. Затем материал концентрировали и составляли смесь с 20 мM фосфата натрия и 240 мM сахарозы, с конечным pH 6,0. Композицию фильтровали перед заполнением в стеклянные пузырьки в концентрации 10 мг/мл. Каждый стеклянный пузырек содержит 5 мл TRU-015 (50 мг/пузырек).

Лекарственная форма и введение

TRU-015 поставляют в одноразовых стеклянных флаконах, содержащих 50 мг TRU-015 (5 мл [10 мг/мл]) в стерильной, без консервантов, жидкой лекарственной форме, содержащей 20 мM фосфата натрия и 240 мM сахарозы, с pH 6,0. TRU-015 вводят в виде внутривенной (IV) инфузии. Дозирование производят по массе тела (мг/кг). Флаконы с TRU-015 хранят замороженными при -20°C до применения. После размораживания флаконы немедленно используют или хранят при 2-8°C.

ПРИМЕР 2

АКТИВНОСТЬ CD20-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ МОЛЕКУЛЫ IN VITRO

Для оценки эффективности CD20-специфической SMIP in vivo сначала измеряли in vitro действия ее применения на клеточно-специфическую активность, такую как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), комплементзависимая цитотоксичность (CDC) и апоптотическая активность.

Антителозависимая клеточная цитотоксическая (ADCC) активность

ADCC активность TRU-015 оценивали на В-клеточной мишени (клеточная линия BJAB B лимфомы), используя различные дозы TRU-015 или ритуксимаба. Также измеряли действие TRU-015 на свежие мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC, которые включают NK-клетки, но не нейтрофилы). Эффекторные клетки от 2 разных доноров демонстрировали примерно 30% лизис в обеих дозах 0,5 и 2,5 мкг/мл (фигура 3). В этом эксперименте TRU-015 был сравним с ритуксимабом по своей способности вызывать лизис CD20+ клеток-мишеней посредством ADCC. CD20-связывающая молекула, сходная с TRU-015, но с заменой пролина на серин в остатке 331 (Pro331Ser) в эффекторной области, проявляла ADCC активность, в то время как конструкция с заменой пролина на серин в остатке 238 (Pro238Ser) проявляла нулевую ADCC активность.

Комплементзависимая цитотоксическая (СDC) активность TRU-015

Сообщалось, что активация комплемента связана с реакциями на инфузию ритуксимаба (van der Kolk, Sr. J Haematol. 2001, 115:807-11). Кроме того, активность заболевания при хронических воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, может быть связана с активацией комплемента. Поэтому СDC активность в TRU-015 уменьшена для направления в эти ткани. Чтобы оценить уровень уменьшения СDC TRU-015, измеряли СDC активность и сравнивали с СDC активностью ритуксимаба.

Комплементзависимая цитотоксичность инициируется связыванием C1q элемента первого компонента пути активации комплемента с CH2 доменом TRU-015, когда TRU-015 связывается с CD20 антигена-мишени. Для оценки CDC активности, TRU-015 инкубируют с клетками WIL2-S в присутствии комплемента кролика [Dynal Biotech (Invitrogen), Brown Deer, WI] (Gazzano-Santoro, et al., J Immunol. Meth. 1997, 202:163-71). Этот эксперимент также может быть проведен с использованием сыворотки крови человека и комплемента человека (C1q) (Quidel Corporation, San Diego, CA).

TRU-015-опосредованное уничтожение клеток WIL2-S дозозависимым образом показывало приблизительно 30% лизис при 1 мкг/мл, 50% лизис при 10 мкг/мл и приблизительно 65% лизис при 1 мкг/мл, в то время как контрольный белок (IgG человека) не вызывал CDC в этих клетках. Цитотоксический эффект TRU-015 на клетках WIL2-S был комплементзависимым, поскольку в отсутствие комплемента (только среда) TRU-015 не проявлял цитотоксической активности. Эти результаты показывают, что привлечение пути активации комплемента является еще одним механизмом, с помощью которого TRU-015 проявляет цитотоксичность. Однако, по сравнению с ритуксимабом, TRU-015 был от 10- до 100-кратно менее активным в его относительной элиминации CD20+ клеток-мишеней посредством CDC, показывая успешное снижение способности TRU-015 лизировать клетки с помощью CDC. Напротив, CD20-связывающая молекула, сходная с TRU-015, но с заменой пролина на серин в остатке 331 (P331S) в эффекторной области, не проявляет CDC активности, в то время как конструкция с заменой пролина на серин в остатке 238 (P238S) демонстрирует CDC активность, сравнимую с конструкцией TRU-015 (фигура 3).

Эти эксперименты показывают, что эффекторные функции SMIP молекул можно регулировать путем изменения последовательности в молекуле для улучшения, поддержания или уничтожения определенных эффекторных функций.

Апоптотическая активность TRU-015

Проверяли способность TRU-015 и ритуксимаба вызывать апоптоз в клетках линии CD20+ B-клеточной лимфомы (Ramos B-cells). Индукцию апоптоза определяли количественно по связыванию аннексина V/йодида пропидия, поставляемого в коммерческом наборе для исследования (BD/Pharmingen), с использованием метода проточной цитометрии, следуя инструкции производителя. TRU-015 и ритуксимаб были похожи по своей апоптотической активности, демонстрируя примерно 60% лизис клеток при обеих концентрациях 10 и 20 мкг/мл.

Специфичность связывания

Специфичность связывания TRU-015 со спленоцитами крысы, спленоцитами мыши, с клетками периферической крови обезьяны и с клетками линии WIL2-S CD20 экспрессирующей человеческой В-клеточной лимфомы оценивали на FACS измерительном проточном цитометре (BD/Pharmingen). Высокую связывающую аффинность наблюдали с TRU-015 на человеческих WIL2-S клетках и клетках периферической крови обезьяны, в то время как специфическое связывание TRU-015 не обнаруживали в случае спленоцитов крысы или мыши. В качестве контролей в этом эксперименте использовали антитела, конъюгированные непосредственно с FITC, к B-клеточным маркерам человека, мыши и крысы. Специфическое В-клеточное связывание наблюдали во всех 3 клеточных препаратах при окрашивании с коммерчески приобретенными антителами к молекулам B-клеточной поверхности. Результаты представлены в таблице 1 ниже и выражены как процент положительно окрашенных клеток.

Таблица 1
	Контроль	CD3	CD19	CD45R	TRU-015	Ритуксимаб
селезенка крысы	9,0	52,2	н.о.	30,3	5,0	н.о.
селезенка мыши	0,14	31	40,5	н.о.	0,98	н.о.
периферическая кровь обезьяны (N=3,среднее значение [SD]	0,2 (0,1)	н.о.	н.о.	н.о.	23,5 (3,9)	21,5 (3,3)
человеческие WIL2-S	0,43	н.о.	97	н.о.	66	н.о.
н.о. - не определено

Эти результаты показывают, что TRU-015 демонстрировал значительную эффекторную функцию in vitro, которая является по меньшей мере равноценной его способности вызывать лизис CD20+ клеток-мишеней посредством ADCC, по сравнению с CD20-направленным моноклональным антителом, ритуксимабом. Напротив, TRU-015 был от 10- до 100-кратно менее активен в его относительной элиминации CD20+ клеток-мишеней посредством CDC, по сравнению с ритуксимабом. В анализе методом проточной цитометрии TRU-015 и ритуксимаб были похожи по своей апоптотической активности.

ПРИМЕР 3

ВЛИЯНИЕ CD20-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ МОЛЕКУЛЫ НА В-КЛЕТОЧНУЮ ОПУХОЛЕВУЮ ЛИНИЮ IN VIVO

По сравнению с ритуксимабом TRU-015 демонстрирует значительную эффекторную функцию in vitro, которая является по меньшей мере равноценной его способности вызывать лизис CD20+ клеток-мишеней посредством ADCC. TRU-015 является менее действенным, чем ритуксимаб в киллинге CD20+ клеток-мишеней посредством CDC и похожим на ритуксимаб по апоптотической активности. TRU-015 не связывается с CD20 крысы или мыши; таким образом, активность TRU-015 можно исследовать на мышах с использованием клеточных линий человека.

Для дальнейшего доказательства активности TRU-015 против человеческих клеток проверяли способность TRU-015 ингибировать рост прижившихся человеческих CD20-экспрессирующих опухолей, используя клеточную линию Ramos (человеческая В-лимфобластоидная клеточная линия, происходящая из лимфомы Беркетта).

Самкам бестимусных лысых мышей имплантировали человеческие CD20-экспрессирующие опухоли Ramos. Через восемь дней после имплантации мышей разделяли по группам (n=6-8 на группу) с одинаковыми объемами опухолей и вводили внутривенно в дни 0, 2, 4, 6 и 8 IgG человека, в качестве контроля (100 мкг), или TRU-015 или ритуксимаб (100 мкг). Средний объем опухоли в группе составлял 370 мм³. Опухоли измеряли 3 раза/неделю и рассчитывали объемы опухолей.

Введение TRU-015 мышам с прижившимися ксенотрансплантатами опухоли Ramos приводило к уменьшению объемов опухоли и увеличению времени выживания по сравнению с животными, получавшими ритуксимаб, и с животными контрольной группы. Из мышей, принимавших TRU-015, 50% достигали полной регрессии опухолей с выживаемостью ≥90 дней. Ни у одной из мышей в группе ритуксимаба не наблюдали полного устранения опухоли. Среднее время выживаемости у животных, получавших TRU-015, составляло 64,5 дней, по сравнению с 11 днями и 8 днями у животных, получавших ритуксимаб, и у контрольных животных, соответственно.

Дополнительные эксперименты с использованием увеличенного количества тестируемых животных предоставили дополнительные статистически достоверные результаты. Общее число мышей в группе было увеличено до n=40-44 животных и были рассчитаны средняя величина времени выживаемости и изменение размера опухоли. Выживаемость для увеличенных наборов данных возросла до 90 дней у животных, получавших TRU-015, и приблизительно до 50 дней у животных, получавших ритуксимаб. Средний начальный размер опухоли составлял 231 мм³. Анализ на присутствие опухоли у этих животных показал, что приблизительно 50% TRU-015 мышей оставались свободными от опухоли в течение 90 дней, в то время как у мышей, получавших ритуксимаб, или у контрольных мышей опухоли оставались.

Были проведены другие эксперименты по имплантированию мышам В-клеточных линий, которые продемонстрировали устойчивость к киллингу ритуксимабом. Бестимусным голым мышам имплантировали 5×10⁶ опухолевых клеток Daudi, которые устойчивы к киллингу ритуксимабом, и давали развиться опухоли у мышей. Через семь дней после имплантации мыши были распределены по группам, и они получали лечение в дни 0, 2, 4, 6 и 8 TRU-015 (100 мкг), ритуксимабом (100 мкг), контрольным человеческим IgG (100 мкг) или PBS. Исследования доз также были проведены с использованием доз 30, 300 и 1000 мкг/доза. Опухоли измеряли 3 раза/неделю и рассчитывали размеры опухоли.

Введение TRU-015 мышам с прижившимися ксенотрансплантатами опухоли Daudi приводило к уменьшению объемов опухоли и увеличению времени выживания, по сравнению с животными, получавшими ритуксимаб, и с животными контрольной группы. Мыши, получавшие TRU-015 в дозе 1000 мг/доза, демонстрировали примерно 85% выживаемость через 30 дней после имплантации, снижавшуюся до приблизительно 65% к 40 дню. Мыши, получавшие TRU-015 в дозе 300 мкг/доза, демонстрировали примерно 85% выживаемость на 40 день, тогда как животные, получавшие 100 мкг/доза TRU-015, имели выживаемость приблизительно 65% к 25 дню, снижавшуюся до 50% в день 40, и показывали среднее время выживаемости (MST) приблизительно 36 дней. MST не может быть рассчитано для групп, получавших 1000 и 300 мкг TRU-015, поскольку более 50% членов группы выживало дольше, чем проводился эксперимент. Мыши, получавшие 30 мкг TRU-015, демонстрировали приблизительно 25% выживаемость на 25 день, показывая MST 23 дня.

Животные, получавшие ритуксимаб, демонстрировали более низкую выживаемость, по сравнению с животными, получавшими TRU-015. Животные, получавшие 1000 мкг/доза ритуксимаба, имели выживаемость приблизительно 65% в день 20, снижавшуюся до 25% в день 40, с MST 24 дня. Мыши, получавшие 300 мкг/доза ритуксимаба, показывали 50% выживаемость в день 20, снижавшуюся до 25% в день 40, с MST 24 дня. Мыши, получавшие либо 100 мкг ритуксимаба, либо 30 мкг/доза, демонстрировали 25% выживаемость в день 20, которая снижалась приблизительно до 10% выживаемости к 40 дню, показывая среднее время выживаемости 17 и 16 дней, соответственно.

Таким образом, TRU-015 анти-CD20 SMIP является эффективной в уничтожении В-клеточных опухолей, которые устойчивы к киллингу анти-CD20 химерным антителом ритуксимабом, и при этом значительно продлевается время выживаемости у животных, получавших TRU-015.

Для определения механизма, с помощью которого CD20 может производить данный эффект, выполняли эксперименты по элиминации натуральных киллеров (NK) на мышах с привитой опухолью линии Ramos. Мышам имплантировали линии опухоли Ramos, как описано выше, и в дни 0, 4, 8 и 12 все мыши получали анти-Asialo GM1 IV антитело (WAKO, Dallas, TX) для элиминации NK клеток. Затем мышам давали либо TRU-015, ритуксимаб, либо HuIgGIV в дни 1, 3, 5, 7 и 9.

Мыши, которым давали только TRU-015, демонстрировали 50% выживаемость в день 15, снижавшуюся приблизительно до 30% в день 35, в то время как мыши, получавшие TRU-015 и антитело, элиминирующее NK клетки, демонстрировали выживаемость приблизительно 40% в день 15, снижавшуюся до приблизительно 20% к 25 дню.

Животные, получавшие только ритуксимаб, демонстрировали выживаемость приблизительно 50% в день 15, снижавшуюся до 10% к 27 дню, в то время как мыши, получавшие ритуксимаб и антитело, элиминирующее NK клетки, показывали выживаемость приблизительно 30% в день 15, снижавшуюся до 10% к 20 дню.

Эти результаты показывают, что NK клетки могут играть некоторую роль в механизме действия как TRU-015, так и ритуксимаба, поскольку удаление NK клеток снижает эффективность В-клеточного элиминирующего лечения.

ПРИМЕР 4

ВВЕДЕНИЕ ОДНОКРАТНОЙ ДОЗЫ CD20-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ МОЛЕКУЛЫ ПРИМАТАМ, НЕ ОТНОСЯЩИМСЯ К ЧЕЛОВЕКУ

Результаты, описанные выше, показывают, что TRU-015 является эффективным в элиминации В-клеток in vitro. Чтобы определить эффективность В-клеточной элиминации in vivo, яванским макакам проводили инфузию CD20-специфической SMIP и измеряли фармакокинетику и фармакодинамику агента.

В начальной схеме обработки яванские макаки (n=2/группа) получали однократную IV дозу 10 мг/кг TRU-015 или дозы 2 других преклинических вариантов TRU-015. Процентное содержание В-клеток в периферической крови определяли, используя неоптимизированный протокол проточной цитометрии для регистрации CD20+ и CD40+ клеток. Все 6 животных демонстрировали значительную элиминацию периферических В-клеток и последующее их восстановление к 35 дню.

Для измерения фармакокинетики (РК) и фармакодинамики (PD) TRU-015 in vivo обезьянам инъецировали IV либо однократную дозу 10 мг/кг TRU-015, дозу другого преклинического CD20-направленного кандидата, дозу ритуксимаба, либо PBS (n=3/группа). Образец периферической крови брали на исходном уровне, затем после введения дозы в 1 и 3 дни, еженедельно в течение 12 недель, и каждые 2 недели в течение дополнительных 12 недель, для анализа методом проточной цитометрии. В этом исследовании быстрая элиминация В-лимфоцитарных субпопуляций из периферической крови наблюдали с TRU-015 и ритуксимабом. В-клеточное восстановление, измеренное по возвращению CD20+ и CD40+ клеток, в группах, получавших TRU-015 и ритуксимаб, было сопоставимым. Однако восстановившиеся клетки имели меньшую экспрессию CD20. Во время обработки не происходило неблагоприятных побочных явлений, связанных с введением TRU-015.

Затем проводили исследование диапазона доз, при котором 18 яванским макакам (n=3/группа) инъецировали IV однократную дозу TRU-015 (0,01, 0,1, 1,0 или 10 мг/кг) или ритуксимаб (10 мг/кг), или PBS. Образцы периферической крови брали в различные моменты времени и анализировали методом проточной цитометрии. CD19 и CD20 были среди маркеров, определяемых для оценки ответной реакции и восстановления.

После однократного IV введения группа ритуксикаба и группы, получавшие высокие дозы TRU-015 (1,0 и 10 мг/кг), имели тенденцию к сходному начальному ответу по элиминации циркулирующих В-клеток. Как правило, В-лимфоцитарные популяции CD19+ и CD20+ в периферической крови эффективно элиминировались во всех трех группах обработки. Результаты исследования показаны на фигуре 1А.

Дополнительный анализ течения В-клеточной элиминации продемонстрировал, что пациенты, получающие TRU-015, показывали В-клеточные титры примерно 30% от исходных титров до дня 100 после инфузии. Элиминация сохранялась приблизительно на 55% исходного уровня к 200 дню, в то время как группы, обработанные ритуксимабом, показывали В-клеточную элиминацию приблизительно 60% исходного уровня в день 200 (фигура 1В).

Результаты этого испытания по определению диапазона доз показывают, что ответ на TRU-015 является дозозависимым. В группе, получающей ритуксимаб, и в группе, получающей 10 мг/кг TRU-015, наблюдаются сходные ответы по циркулирующим В-клеткам, причем элиминация В-клеток в группе, получающей 10 мг/кг, совпадает с наблюдаемой в предыдущем опыте. В целом, оба препарата были одинаково эффективны по элиминации В-лимфоцитных популяций в периферической крови. Более низкие дозы TRU-015 вызывали ответную реакцию, причем доза 1 мг/кг приводила к элиминации В-клеток, но с более быстрым восстановлением, чем после высокой дозы, доза 0,1 мг/кг приводила только к частичной элиминации, и доза 0,01 мг/кг не имела очевидного эффекта.

Для РК и PD анализов, при обработках различными дозами, образцы сывороток от яванских макак анализировали методом проточной цитометрии для определения концентрации в плазме после однократной IV инъекции (медленное болюсное введение свыше 5 минут) 10 мг/кг ритуксимаба или TRU-015 в 10, 1, 0,1 миллионов галлонов, представленных относительно или 0,001 мг/кг. Образцы сыворотки собирали перед введением доз, через 5 и 30 минут после введения дозы, через 4, 2472 и 168 часов после введения дозы и в дни исследования 10, 14, 21 и 28. Концентрации в плазме TRU-015 в дозах 10 мг/кг и 1 мг/кг в зависимости от времени сравнивали с ритуксимабом в дозе 10 мг/кг. TRU-015 и ритуксимаб демонстрировали сходные уровни концентраций в плазме с наивысшим уровнем TRU-015 приблизительно 400 мг/мл в момент времени 0, в то время как ритуксимаб составлял приблизительно 450 мг/мл. Концентрация в плазме двух соединений снижалась сходным образом до примерно 100 мг/мл через 72 часа после введения. Как ритуксимаб, так и TRU-015 все еще определялись в плазме через 168 часов после введения. При более низкой дозе TRU-015 соединение определялось в плазме ограниченно. В таблице 2 показаны РК параметры, полученные при данной схеме обработки.

Таблица 2
Доза группа		Сmax (мкг/мл)	AUC0-28 (мкг-час/мл)	AUC0-Inf мкг-час/мл)	CL (мл/час/кг)	T1/2 (час)
ритуксимаб 10 мг/кг	среднее	466	28,126	28,134	0,390	57
SD	139	9,824	9,826	0,151	1
TRU-015 10 мг/кг	среднее	409	27,096	27,596	0,365	114
SD	26	2,338	2,782	0,038	41
AUC - площадь под кривой концентрация-время, (мкг-час/мл); Сmax=максимальная концентрация; SD=стандартное отклонение; T1/2=время полужизни

Таким образом, это исследование показывает, что эффекты TRU-015 являются дозозависимыми, обратимыми и воспроизводимыми.

ПРИМЕР 5

ВВЕДЕНИЕ TRU-015 ПАЦИЕНТАМ

Для оценки PK и PD TRU-015 у человека сорок человек с ревматоидным артритом лечили однократной дозой TRU-015, варьирующей в диапазоне от 0,015 до 15 мг/кг. TRU-015 вводили пациентам в однократной внутривенной дозе в течение периода времени, варьирующего от 15 минут до 12 часов. Пациенты получали дозы следующим образом: группа 1 - 0,015 мг/кг, группа 2 - 0,05 мг/кг, группа 3 - 0,15 мг/кг, группа 4 - 0,5 мг/кг, группа 5 - 1,5 мг/кг, группа 6 - 5 мг/кг, группа 7 - 15 мг/кг и группа 8 - 5 мг/кг. Влияние на циркулирующие В-клетки определяли измерением CD19+ клеток в периферической крови методом проточной цитометрии в различные моменты времени после инфузии TRU-015. Элиминация В-лимфоцитов проявлялась у этих пациентов дозозависимым образом, выраженным в степени и продолжительности уменьшения В-лимфоцитов (фигура 2). Результаты показали, что пациенты в группах 6 и 7, получившие однократную дозу 5 мг/кг и 15 мг/кг TRU-015, соответственно, демонстрировали почти полную B-клеточную элиминацию вплоть до 4 недель после инфузии. Пациенты, получавшие 1,5 мг/кг TRU-015, показали менее чем 15% B-клеточное восстановление за период в 4 недели, в то время как пациенты, получавшие 0,5 мг/кг, демонстрировали В-клетки приблизительно на 45% исходного уровня к концу 4 недель. Данные по PK этих исследований недоступны.

Эти результаты показывают, что введение TRU-015 человеку на протяжении диапазона доз эффективно уменьшает В-клеточные популяции у пациентов, нуждающихся в таком лечении.

ПРИМЕР 6

ЛЕЧЕНИЕ CD20-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ SMIP ИДИОПАТИЧЕСКОЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ МИОПАТИИ

В настоящее время лечение идиопатической воспалительной миопатии (IIM) включает начальную терапию кортикостероидами, обычно в высоких дозах, по меньшей мере 1 мг/кг/день преднизолона. Метотрексат и азатиоприн часто используют в комбинации с коритикостероидами для тех пациентов, которые имеют плохие прогностические факторы, или для пациентов, устойчивых к кортикостероидам. Используют внутривенно имуноглобулин, циклофосфамид, циклоспорин, такролимус, микофенолят мофетил, антагонисты фактора некроза опухоли (TNF), хлорамбуцил и их комбинации. Большинство лекарственных средств используют без поддержки данных, полученных из контрольных испытаний (Miller, Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology. 15^th ed. 1614, 2005).

Недавно Levine (Arthritis Rheum. 2005, 52:601-607) опубликовал данные, показывающие, что лечение агентом, удаляющим В-клетки, ритуксикабом, облегчало течение миозита в группе 6 DM пациентов. Кроме того, сообщения, основанные на отдельных наблюдениях пациентов с высокорезистентным полимиозитом, свидетельствуют об улучшении после терапии, направленной на элиминацию В-клеток.

Для определения влияния CD20-специфических SMIP на развитие IIM, пациентов лечили типичной SMIP, TRU-015, и в течение заболевания наблюдали за элиминацией В-клеток, восстановлением В-клеток и за другими эффектами CD20-специфического SMIP лечения.

Пациенты в одной группе лечения получали либо плацебо, либо TRU-015 в однократной дозе 5 мг/кг. Пациентов во второй группе лечения случайным образом распределяли на тех, кто получал две дозы либо плацебо, либо TRU-015 по 5 мг/кг, причем первую дозу вводили в начальный момент и второю дозу вводили на 7 день. Пациентов в третьей группе лечения распределяли случайным образом на тех, кто получал либо плацебо, либо TRU-015 в однократной дозе 15 мг/кг. По меньшей мере 6 пациентов с активным полимиозитом (PM) или дерматомиозитом (DM) были включены в каждую группу лечения. В каждую группу входили примерно 4 пациента, получавших лечение, и 2 пациента, получавших плацебо.

Пациентов наблюдали не менее 12 недель. Пациентов с явлением В-клеточной элиминации обследовали каждые 4 недели для наблюдения активности заболевания и восстановления В-клеток. В-клеточную элиминацию определяли как уменьшение абсолютного числа В-клеток ниже минимального предела нормального диапазона значений. В-клеточное восстановление определяли как возвращение абсолютного числа В-клеток к одному из следующих значений: 1) 70% от их исходного значения у пациента; или 2) нормальный диапазон значений.

Перед введением CD20-специфической SMIP определяют исходные параметры заболевания и другие показатели состояния здоровья. Исходные параметры включают оценку результатов проводимого лечения (кровяное давление, пульс, температура и частота дыхания), целенаправленный врачебный осмотр, мануальный осмотр мышц, спирометрию, общую оценку состояния субъектом/врачом, индекс нетрудоспособности по анкете оценки состояния здоровья (HAQ), тестирование по анкете "инструмента оценки активности миозита" (MDAAT), проточную цитометрию, гематологический профиль (дифференциальная формула крови с подсчетом тромбоцитов), анализ мочи, биохимический профиль (электролиты, BUN, креатинин, щелочная фосфатаза, общий белок и альбумин), ферменты печени (AST, ALT, LDH), мышечные ферменты (CPK, альдолаза), количественный анализ иммуноглобулинов, образец крови на генотипирование, образец сыворотки крови для наблюдения за концентрацией лекарства и проверки на антитело к TRU-015.

Каждый пациент получает премедикацию метилпреднизолоном (например, SOLUMEDROL® 100 мг IV), ацетаминофеном и антигистаминным препаратом (например, дифенгидрамин, лоратидин или аналогичный продукт) перед введением TRU-015 или плацебо. Врач обследует каждого пациента и определяет подходящую дозу этих предварительно вводимых препаратов. Затем пациент получает подходящую дозу TRU-015 или плацебо путем IV инфузии.

Повторные обследования пациента проводят в дни 1, 7, 14, 28, 47, 56, 70 и 84. Пациентов продолжают наблюдать после 84 дня с интервалами в 28 дней, которые считают клинически целесообразными. Пациентов обследуют повторно по меньшей мере до восстановления В-клеток.

Подходящие количества TRU-015 вводят пациентам путем IV инфузии. Дозирование TRU-015 производят по массе тела (мг/кг). Любого пациента с массой тела 110 кг или более рассматривают как весящего 110 кг с целью расчета дозы. TRU-015 готовят в стеклянных флаконах для IV инфузий с разбавителем (например, 0,9% хлорид натрия, USP). Инфузии соединения начинают со скоростью 25 мл/час. Через 30 минут, если не наблюдается токсических явлений, скорость может быть увеличена до 50 мл/час. Скорость можно увеличивать на 25 мл/час каждые 20-30 минут при переносимости (но не более 250 мл/час).

В день 1 (18-24 часа после введения дозы) пациентов обследуют в следующих процедурах: оценка сопутствующих препаратов, оценка нежелательных явлений, показатели жизнедеятельности (кровяное давление, пульс, температура и частота дыхания), целенаправленный врачебный осмотр, проточная цитометрия, образец сыворотки крови для наблюдения за концентрацией лекарственного средства.

В день 7 (1 неделя) проводят обследование пациентов в следующих процедурах: оценка сопутствующих препаратов, оценка нежелательных явлений, показатели жизнедеятельности, целенаправленный врачебный осмотр, проточная цитометрия, гематологический профиль (дифференциальная формула крови с подсчетом тромбоцитов), анализ мочи, биохимический профиль (электролиты, BUN, креатинин, щелочная фосфатаза, общий белок и альбумин), ферменты печени (AST, ALT, LDH), мышечные ферменты (CPK, альдолаза) и образец сыворотки крови для наблюдения за концентрацией лекарственного средства.

В день 14 (2 недели), день 28 (4 недели), день 42 (6 недель), день 56 (8 недель), день 70 (10 недель), день 84 (12 недель) и каждые 4 недели после этого проводят обследование пациентов в следующих процедурах: оценка сопутствующих препаратов, оценка нежелательных явлений, показатели жизнедеятельности, целенаправленный врачебный осмотр, мануальный осмотр мышц, спирометрия (только день 84), общая оценка состояния субъектом/врачом, индекс нетрудоспособности по анкете оценки состояния здоровья (HAQ), тестирование по анкете "инструмента оценки активности миозита", количественный анализ иммуноглобулинов (только неделя 24).

Каждое из следующих измерений активности заболевания оценивают для определения лечебного эффекта: оценка общей активности врачом, оценка общей активности пациентом, напряжение мышц, оценка 15 мышечных групп (сгибатели шеи, дельтовидные мышцы, бицепсы, разгибатели запястья, большая ягодичная мышца, средняя ягодичная мышца, четырехглавая мышца бедра, задние сгибатели колена), каждый оценивают в баллах по 10-бальной шкале Кендалла; физическая функция: индекс нетрудоспособности по анкете оценки состояния здоровья (HAQ); мышечные ферменты: CPK, альдолаза, AST, ALT, LDH; оценка внемышечной активности: комбинация из 6 визуальных аналогичных шкал из инструмента оценки активности миозита, по которым оценивают конституционную, кожную, желудочно-кишечную, артикулярную, сердечную и легочную активность.

В дополнение к индивидуальным произведенным измерениям определяют, достигли ли пациенты обобщенных критериев ответа, используемых Интернациональной группой по оценке и клиническим исследованиям миозита (IMACS) (Rider, Arthritis Rheum. 2004, 50:2281-90). Эти предварительные критерии ответа определяют респондента как человека с улучшением на 20% или более, если по меньшей мере 3 из 6 основных измерений (перечисленных выше) улучшились, и не более чем 2 критерия ухудшились на 25% или более. Если мышечное напряжение возросло на 25% или более, то пациент не может рассматриваться как респондент.

Оценки первичной клинической ответной реакции

Первичной оценкой клинической ответной реакции является уточнение уровней мышечного фермента. Первичный анализ эффективности проводят путем сравнения улучшения CPK с использованием анализа значений площади под кривой (AUC) от исходного момента до 12 недель, у пациентов, получавших TRU-015, и у тех, кто получал плацебо. Также оценивают средние значения уровней CPK и альдолазы, процентное снижение CK и альдолазы и время достижения значимого улучшения (30% снижение от исходного уровня).

Вторичная оценка основана на улучшении мышечного напряжения, определяемого путем мануального тестирования описанных выше 15 групп мышц, с получением улучшенного показателя мануального тестирования мышц, рассчитываемого с помощью анализа AUC от исходного момента до 12 недель при сравнении пациентов, получавших TRU-015, и пациентов, получавших плацебо. Кроме того, оценивают среднее мышечное напряжение, процентное изменение мышечного напряжения и время достижения значимого улучшения (12% улучшение от исходного уровня). Также оценивают время достижения 15% улучшения.

Также оценивают каждое измерение других индивидуальных ответных реакций. Среднее значение улучшения, процентное изменение и время достижения значимого улучшения оценивают, используя общие оценки врача и пациента, индекс нетрудоспособности HAQ, мышечные ферменты (другие, чем CPK и альдолаза) и экстрамышечную активность.

ПРИМЕР 7

CD-20 СПЕЦИФИЧЕСКОЕ SMIP ЛЕЧЕНИЕ ПАЦИЕНТОВ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

У пациентов с ревматоидным артритом В-клетки подвергали антигензависимому клональному размножению, "созреванию аффинности" и дифференциации в плазматические клетки, и они продуцировали ревматоидный фактор, хорошо выявляемый прогностический фактор агрессивности RA. Воспаление, опосредованное иммунными комплексами, и презентнация антигенов являются дополнительными ролями В-клеток, которые, как считают, участвуют в патогенезе RA. В исследованиях с химерой человеческая RA синовиальная оболочка-SCID мышь было показано, что Т-клеточная активация зависит от В-клеток (Takemura et al., J. Immunol. 2001, 167:1072-80).

TRU-015 адаптируют для лечения воспалительных заболеваний путем снижения способности к уничтожению клеток посредством комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Однако TRU-015 по-прежнему обладает высокой ADCC активностью, и ответ на TRU-015 может быть не так чувствителен, как на CD16 полиморфизмы.

Для оценки эффектов CD20-специфических SMIP у пациентов с ревматоидным артритом выполняют два исследования с использованием типичной SMIP, TRU-015.

При введении одной дозы пациенты получают одну внутривенную инфузию (IV) TRU-015, в виде возрастающей дозы, в одной из следующих концентраций (≥4 пациентов в группе): 0,015, 0,05, 0,15, 0,5, 1,5, 5, 15 и 30 мг/кг. Пациенты с активным RA в этом исследовании не участвовали. Агент вводят внутривенно, как описано выше при лечении IIM, используя ту же композицию и аналогичные скорости введения.

При выполнении доклинических обследований собирают следующие данные: сопутствующее лечение, нежелательные явления, описанные выше, целенаправленный врачебный осмотр, показатели жизнедеятельности (кровяное давление, пульс, температура и частота дыхания), проточная цитометрия, гематологический профиль (дифференциальная формула крови с подсчетом тромбоцитов), коагуляционный профиль (PT/PTT), анализ мочи, биохимический профиль (электролиты, BUN, креатинин, AST, ALT, щелочная фосфатаза, общий белок и альбумин), количественный анализ иммуноглобулинов, ревматоидный фактор/CCP антитела, генотипирование, образец сыворотки крови для оценки концентрации лекарственного средства и тестирования на антитела к TRU-015, и для банка сывороток, т.е. банкирование образцов сыворотки в определенные даты для оценки.

В день 1 (18-24 часа после дозы) у пациентов определяют следующие показатели: оценка сопутствующего лечения, оценка нежелательных явлений, целенаправленный врачебный осмотр, показатели жизнедеятельности, проточная цитометрия, гематологический профиль, коагуляционный профиль (PT/PTT), анализ мочи, биохимический профиль, концентрация лекарственного средства в сыворотке.

В день 3 (72 часа) у пациентов определяют следующие показатели: оценка сопутствующего лечения, оценка нежелательных явлений, целенаправленный врачебный осмотр, показатели жизнедеятельности, проточная цитометрия, гематологический профиль (дифференциальная формула крови с подсчетом тромбоцитов), концентрация лекарства в сыворотке.

День 7 (1 неделя), день 14 (2 недели), день 21 (3 недели), день 28 (4 недели) пациентам проводят следующие процедуры: оценка сопутствующего лечения, оценка нежелательных явлений, целенаправленный врачебный осмотр, показатели жизнедеятельности, проточная цитометрия, гематологический профиль (дифференциальная формула крови с подсчетом тромбоцитов), коагуляционный профиль (PT/PTT) [день 7, день 14, день 28], анализ мочи [день 7, день 14 и день 28], биохимический профиль [день 7, день 14 и день 28], количественный анализ иммуноглобулинов [только в день 28], ревматоидный фактор/CCP антитела [день 14 и день 28], образец сыворотки крови для оценки концентрации лекарственного средства [и тестирование на антитела к TRU-015 в день 28], банк сывороток [только в день 28].

Пациенты с проявлением В-клеточной элиминации продолжают обследование, как описано выше, в 6 недель, 8 недель, 10 недель и 12 недель до тех пор, пока имеет место проявление восстановления В-клеток. Обследования включают вышеперечисленное и дополнительно коагуляционный профиль (PT/PTT) [неделя 8 и неделя 12], анализ мочи [неделя 8 и неделя 12], биохимический профиль [неделя 8 и неделя 12], количественный анализ иммуноглобулинов [неделя 8 и неделя 12], ревматоидный фактор/CCP антитела [только неделя 8 и неделя 12], образец сыворотки крови для оценки концентрации лекарственного средства [только неделя 6 и неделя 8] и тестирование на антитела к TRU-015 [только неделя 8], банк сывороток [только неделя 12].

Активная стадия заболевания. Пациентов в первой группе лечения распределяют в случайном порядке на тех, кто получает либо плацебо, либо TRU-015 в однократной дозе 5 мг/кг. Пациентов во второй группе лечения распределяют в случайном порядке на тех, кто получает две дозы либо плацебо, либо TRU-015 по 2,5 мг/кг, причем первую дозу вводят в исходном состоянии, а вторую вводят в день 7. Пациентов в третьей группе лечения распределяют в случайном порядке на тех, кто получает две дозы либо плацебо, либо TRU-015 по 7,5 мг/кг, причем первую дозу вводят в исходном состоянии, а вторую вводят в день 7. Пациентов в четвертой группе лечения распределяют в случайном порядке на тех, кто получает либо плацебо, либо TRU-015 в однократной дозе 15 мг/кг. По меньшей мере 6 пациентов с активным PM и DM зачисляют в каждую группу лечения. Каждая группа включает приблизительно 10 пациентов, получающих активное лечение, и 2 пациента, получающих плацебо.

В дополнение к доклиническому обследованию, выполненному выше, пациентам в указанной группе лечения, имеющим активный RA, оценивали на следующее: полная оценка сустава (не следует оценивать замещенные суставы), общая оценка состояния пациентом/врачом, оценка пациентом боли, индекс нетрудоспособности по анкете оценки состояния здоровья (HAQ), длительность утренней тугоподвижности, CRP и ESR.

Каждый пациент получает премедикацию метилпреднизолоном (например, SOLUMEDROL 100 мг IV), ацетаминофеном и антигистаминными препаратами, как описано выше в примере 3.

Пациентов наблюдают не менее 4 недель. Затем пациенты с проявлением В-клеточной элиминации проходят обследование каждые 2-4 недели для наблюдения за восстановлением В-клеток.

ПРИМЕР 8

КЛИНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПАЦИЕНТОВ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ TRU-015

Лечение пациентов с RA проводили, как описано в примере 7, и эффекты лечения TRU-015 оценивали до 42 недель после инфузии. По меньшей мере четыре пациента в группе получали либо 0,015, 0,05, 0,15, 0,5, 5, 15, либо 30 мг/кг (15 мг/кг лекарства, 2× неделя) TRU-015. Собирали фармакокинетические данные (РК) для TRU-015 в указанных группах пациентов. В таблице 3 показаны сравнительные PK данные для групп, получавших 0,5, 1,5, 5, 15 или 2× 15 мг/кг TRU-015.

Таблица 3
Группа мг/кг	AUCINF (мкг*час/мл)	Сmax (мкг/мл)	Время полужизни	Время полужизни
часы	CV%
0,5	1,342	13,8	281	59,1
1,5	7,082	58,2	282	26,5
5	18,140	169	315	28,6
15	71,753	550	484	42,1
2 × 15	114,670	643	352	7,5

Конечное время полувыведения TRU-015 изменялось в пределах 281-484 часа, показывая, что даже в низких дозах TRU-015 имеет продолжительный период полужизни in vivo, который увеличивается с увеличением дозы. Кроме того, с введением TRU-015 не были связаны ограничивающая дозу токсичность или серьезные побочные эффекты. Сообщалось о нескольких побочных эффектах лечения TRU-015, которые включали головные боли (13,5%), инфекцию верхних дыхательных путей (13,5%), бронхит (10,8%), периферические отеки (13,5%), зуд (10%), боль в спине (13,5%), боль в суставах (8,1%), кашель (8,1%), подкожное кровоизлияние (8,1%), утомление (8,1%), назофарингит (8,1%) и инфекцию мочевого тракта (8,1%). У пациентов, получавших TRU-015, наблюдали оценку нарушений 3, что включало оценку 3 AST/ALT (n=1), оценку 3 низких лейкоцитов (n=2) и оценку 3 низких нейтрофилов (n=3). Во время лечения не было оценки 4 и наблюдались только три оценки 3 для нежелательных явлений, включая сыпь/бронхоспазм, которые разрешались без прекращения лечения, боль в суставах около 2 недель после инфузии лекарства и гипертензия, не связанная с инфузией. В этом эксперименте наблюдали один серьезный случай нежелательного явления с развитием холецистита у пациента, получившего TRU-015, через 6 месяцев после лечения. В последующем исследовании у одного пациента развился рак предстательной железы и бактеремия/лихорадка после биопсии простаты через 4 недели после лечения, и у одного пациента в группе плацебо выявили обострение ранее диагностированной сердечной недостаточности с застойными явлениями.

У RA пациентов, получавших TRU-015, измеряли степень элиминации В-клеток и сравнивали со средними исходными уровнями у пациентов до лечения. На фигуре 4 показана продолжительность В-клеточной элиминации, измеренной по количеству CD19+ В-клеток у RA пациентов, получавших TRU-015. Пациенты, получавшие по меньшей мере 0,5 мг/кг TRU-015, показали почти полную элиминацию В-клеток в первый день после инфузии. У пациентов, получавших однократную дозу 15 мг/кг TRU-015 или 2× 15 мг/кг дозу, обнаружили, что В-клетки, полностью уничтоженные на 84 день после инфузии, возрастали примерно на 10-15% исходного уровня на 168 день. Пациенты, получавшие дозу 5 мг/кг, показали 15-20% исходного уровня В-клеток на 84 день после инфузии, с увеличением до 35% к 168 дню. Пациенты, получавшие однократную дозу 1,5 мг/кг TRU-015, демонстрировали В-клеточные титры, равные примерно 30% исходного уровня, на 84 день, которые оставались на том же уровне к 168 дню.

Во втором наборе схем лечения пациентам давали 5 мг/кг в дозах 2×2,5 мг/кг или давали 15 мг/кг в дозах 2×7,5 мг/кг и измеряли В-клеточную элиминацию в динамике по времени. Среднее значение В-клеточной элиминации при дозе 2×2,5 мг/кг отображало В-клеточную элиминацию у пациентов, получавших 1×5 мг/кг, опускаясь до примерно 10% исходного уровня на 72 день и увеличиваясь до примерно 30% исходных уровней на 172 день. Однако сравнение пациентов, получавших или 1 дозу 15 мг/кг TRU-015, или 2×7,5 мг/кг дозу, показало, что на 84 день В-клеточные титры в обеих группах были почти полностью истощены, в то время как на 168 день пациенты, получавшие однократную дозу, имели незначительное увеличение числа В-клеток (примерно 15%), по сравнению с увеличением до примерно 35-40% от исходных уровней при введении двух доз (фигура 5).

Всех пациентов проверяли на наличие нейтрализующих антител к TRU-015. Не обнаружено образцов сыворотки, положительных на нейтрализующие антитела. Тестирование образцов сывороток в группах пациентов, получавших 5 мг/кг и 15 мг/кг, не показало присутствия нейтрализующих антител. Однако в момент взятия проб в сыворотках все еще присутствовал TRU-015.

В процессе лечения пациентов также проверяли на титры антител ревматоидного фактора (RF) и обозначали как RF+ или RF- пациенты. Максимальная клиническая ответная реакция, достигнутая в этих группах к 42 неделе после лечения, представлена в таблице 4.

Таблица 4
	Все пациенты	RF+ пациенты
ACR20	76%	80%
ACR50	28%	35%
ACR70	12%	15%

Эти результаты показывают, что TRU-015 эффективен при лечении ревматоидного артрита. Терапия TRU-015 обеспечивает воздействия лекарственных средств, которые обычно пропорциональны дозе и период полужизни которых в сыворотке сходен с наблюдаемым при терапиях более крупными белками. Для TRU-015 получают кривую доза-ответ; величина и продолжительность элиминации В-клеток обычно увеличивается по мере увеличения дозы TRU-015, причем 100% элиминация клеток наблюдается в течение продолжительного периода времени. Кроме того, к настоящему времени не обнаружены нейтрализующие антитела к TRU-015.

Специалисты в данной области могут осуществить многочисленные модификации и вариации данного изобретения на основе приведенных выше иллюстративных примеров. Поэтому на изобретение следует накладывать только такие ограничения, которые представлены в прилагаемой формуле изобретения.

1. Способ лечения пациента человека, больного ревматоидным артритом, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества человеческого CD20-специфического малого модульного иммунофармацевтического (SMIP) белка в режиме введения однократной дозы, где поддерживающие лечение не проводят до периода примерно от трех месяцев до двух лет после первоначальной однократной дозы.

2. Способ по п.1, где введение человеческого СВ20-специфического SMIP белка дает в результате оценку по ACR (Американского ревматологического колледжа) в баллах, равную 20.

3. Способ по п.1, где число В-клеток в биологическом образце человека уменьшается, при этом биологическим образцом является кровь, синовиальная жидкость или синовиальная биопсия.

4. Способ по п.1, где введение человеческого СD20-специфического SMIP белка приводит к уменьшению числа В-клеток у человека по меньшей мере на 20%.

5. Способ по п.4, где число В-клеток у человека уменьшается по меньшей мере на 50%.

6. Способ по п.1, где экспрессия лиганда RANK в биологическом образце пациента уменьшается, при этом биологическим образцом является кровь, синовиальная жидкость или синовиальная биопсия.

7. Способ по п.1, где SMIP белок вводят в сочетании со вторым агентом.

8. Способ по п.7, где второй агент выбран из группы состоящей из второй связывающей молекулы, специфичной к В-клетке, цитокина, хемокина, фактора роста, иммуносупрессивного агента.

9. Способ по п.8, где второй агент выбран из группы, состоящей из нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID), анальгетиков, глюкокортикоидов, противоревматических лекарственных средств, модифицирующих течение болезни (DMARD), для лечения артрита и модификаторов биологического ответа.

10. Способ по п.9, где вторым агентом является DMARD.

11. Способ по п.10, где DMARD представляет собой метотрексат.

12. Способ по п.8, где второй агент представляет собой специфичную к В-клетке связывающую молекулу, которая связывается с человеческим CD37.

13. Способ по п.1, где человеческий CD20-cпeцифичecкий SMIP белок содержит аминокислотную последовательность как изложено в SEQ ID NO:2.

14. Способ по п.1, где человеческий CD20-cпeцифичecкий SMIP белок состоит из аминокислотной последовательности как изложено в SEQ ID NO:2.

15. Способ по п.1, где человеческий CD20-cпeцифичecкий SMIP белок содержит полипептид, связывающий гуманизированный одноцепочечный домен Fv (scFv).

16. Способ по п.13, где человеческий CD20-cпeцифичecкий SMIP белок вводят в интервале доз от приблизительно 800 мг до приблизительно 1600 мг.

17. Способ по п.16, где человеческий СD20-специфический SMIP белок вводят в дозе приблизительно 800 мг.

18. Способ по п.17, где человеческий CD20-cпeцифичecкий SMIP белок вводят в дозе приблизительно 15 мг/кг или приблизительно 30 мг/кг.

19. Способ по п.13, где человеческий CD20-cпeцифичecкий SMIP белок имеет аффинность к человеческому CD20 в интервале от приблизительно 1 нМ до приблизительно 30 нМ.

20. Способ по п.13, где человеческий СD20-специфический SMIP белок имеет период полужизни in vivo от приблизительно 7 дней до приблизительно 30 дней.

21. Способ по п.1 или 13, дополнительно включающий введение терапевтически эффективной второй дозы человеческого CD20-специфического SMIP белка в течение от приблизительно трех месяцев до приблизительно двух лет после введения первоначальной дозы.

22. Способ по п.1 или 13, в котором человеческий CD20-специфический SMIP белок вводят парентерально.

23. Способ по п.1 или 13, в котором человеческий CD20-специфический SMIP белок вводят подкожно.