Способ получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и ферментативный гидролизат молочного гриба

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано как стимулятор роста или компонент питательных сред для культивирования лактобактерий, а также в медицинской микробиологии. Промытый тибетский молочный гриб помещают в стеклянную емкость и добавляют 65,7 л (1:3) водопроводной воды, подогретой до температуры (45±1)°С. Смесь расщелачивают Nа₂СО₃ до рН 8,2-8,3 по фенолфталеину. Затем загружают измельченную поджелудочную железу крупного рогатого скота в количестве 0,101 кг. К общему объему содержимого добавляют 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом и помещают в термокамеру при температуре (48±1)°С. Выдерживают в течение 9-10 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 10-15 мин по 4-5 мин, а в последующие дни через каждые 1,5-2 ч по 4-5 мин. Динамику ферментативного процесса контролируют по нарастанию аминного азота. На 9-10 сутки увеличение данного показателя прекращается, термокамеру отключают, гидролизат оставляют на сутки. Затем фильтруют через фильтровальное полотно. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С. Аминный азот в готовом гидролизате 567,8 л/гр. Цвет: прозрачный, коньячный. Изобретение обеспечивает удешевление и упрощение способа получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба, повышение выхода бактериальной биомассы с высоким показателем сухого вещества. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и ферментативному гидролизату из тибетского молочного гриба, используемому в качестве стимулятора роста, который может быть использован как компонент питательных сред для культивирования лактобактерий, а также в медицинской микробиологии.

Уровень техники

Известен способ получения ферментативного гидролизата, включающий обработку белоксодержащего сырья, разведенного водой медицинским панкреатином или нативной поджелудочной железой свеньи, в щелочной зоне рН 7,6-7,8 в присутствии хлороформа при 37-38°С в течение 6-7 суток, прогревание при 90°С в течение 5-10 мин, последующее осаждение высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке белка, фильтрование целевого продукта и его высушивание, при этом в качестве белоксодержащего сырья используют обезжиренную, обезвоженную мозговую ткань крупного рогатого скота, фермент растворяют в воде в соотношении 1:25 и перед осаждением высокомолекулярных соединений проводят обработку гидролизата 20-22%-ным раствором хлористого кальция в течение 5-10 мин (см. пат. RU №2020153, МПК С12N 5/00, С12Р 21/06, опубл. 30.09.1994).

Недостатком данного способа является сложность технологического процесса, высокая себестоимость конечного продукта.

Известна полужидкая питательная среда МРС-2 для культивирования лактобактерий, включающая 50 г марганца сернокислого, 200 мл цистеина солянокислого, 200 мл магния сернокислого, 2 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 20 г глюкозы, 1 г микробиологического агара, 2 г лимоннокислого аммония и 5 г натрия уксуснокислого. Вышеуказанные ингредиенты растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Затем прибавляют 50 мл дрожжевого автолизата и 50 мл печеночного экстракта. Отдельно растворяют 10 г сухого ферментативного пептона в небольшом объеме горячей дистиллированной воды и вносят 1 мл Твин-80, тщательно перемешивая, добавляют в выше указанную смесь. Затем добавляют 330 мл гидролизованного молока Богданова и доводят весь объем жидкости дистиллированной водой до 1000 мл. РН среды не требует корректировки и устанавливается на уровне 6,2-6,6. Среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют 15 минут при t 120±3°C и давлении 1,0±0,1 кг с/см² (0,10±0,010) МПа (см. Регламент. Производство лактобактерина сухого, 23-75. 11 июня 1975 г. С.1-13).

Недостатком данной питательной среды является небольшое накопление объема бактериальной массы лактобактерий.

Известны способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда на его основе. Говяжье или конское мясо очищают от жира и сухожилий, нарезают кусочками или полосками в толщину пальца. Кладут в кипящую водопроводную воду из расчета 2 л водопроводной воды на 1 кг мяса; кипятят в течение 5 минут. Мясо вылавливают и пропускают через мясорубку. Смешивают фарш с жидкостью и остуживают до 45°С, добавляют 5-10 г панкреатина или 40-80 г поджелудочной железы КРС (в зависимости от того, какую степень расщепления хотят получить), с последующим добавлением 2% хлороформа от общего объема (см. Козлов, Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии / Ю.А.Козлов, 1950. - С.51).

Недостатком данного способа получения ферментативного гидролизата и питательной среды на его основе является высокая стоимость, недостаточное обогащение микро- и макроэлементами, витаминами, углеводами и аминокислотами, оказывающими высокий биостимулирующий эффект культивирования лактобактерий.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятым авторами за прототип является способ получения гидролизата из тибетского молочного гриба, заключающийся в следующем: молочный гриб тщательно промывают в проточной водопроводной воде, предварительно поместив его в марлю. Промытый гриб помещают в стеклянную емкость и добавляют подогретую водопроводную воду. Затем загружают измельченную поджелудочную железу сельскохозяйственных животных. Смесь подщелачивают углекислым натрием. Добавляли хлороформ и помещали в термокамеру при 45°С. Первые сутки смесь перемешивают через каждые 15 мин, в дальнейшем - через каждые 2 ч. Динамику ферментативного процесса контролировали по нарастанию аминного азота. На 9-10 сутки увеличение данного показателя прекращается, термокамеру отключали, гидролизат отстаивали сутки, затем фильтровали (см. Тимченко Л.Д. Технология получения гидролизата из субстанции «Тибетский молочный гриб» и предварительная оценка его свойств / Л.Д.Тимченко, В.В.Носков, Н.В.Пчелинцева //Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Материалы 52 научной конференции «Университетская наука - региону». - Ставрополь: СГУ, 2007. 239-240. - 348 с.).

Недостатком данного гидролизата является ограниченный срок хранения, а также высокая себестоимость.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и ферментативный гидролизат из тибетского молочного гриба, используемый в качестве стимулятора роста для культивирования лактобактерий из экологически чистого и доступного сырья, обогащающего питательные среды микро- и макроэлементами, витаминами, углеводами и аминокислотами, а также содержащий высокий показатель сухого вещества.

Технический результат, который может быть достигнут с использованием предлагаемого изобретения, сводится к получению ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба, используемого в качестве стимулятора роста из более дешевого, экологически чистого и доступного сырья, обогащающего даже в минимальных концентрациях питательные среды для культивирования лактобактерий и позволяющего получать большой выход бактериальной массы.

Технический результат достигается с помощью способа получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба, включающего приготовление из него белоксодержащей массы, смешивание ее с подогретой водопроводной водой, добавление измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота, подщелачивание Na₂CO₃, добавление 2% хлороформа с последующим размещением в термокамере, выдерживание в течение 9-10 суток с перемешиванием в первые сутки через каждые 15 минут, а в последующие дни через каждые 2 часа, измерение уровня аминного азота, и после прекращения на 9-10 сутки увеличения последнего термокамеру отключают, гидролизат отстаивают в течение суток и фильтруют, ОТЛИЧАЮЩЕГОСЯ тем, что смешивание проводят с водопроводной водой, подогретой до температуры (45±1)°С в соотношении 1:3, подщелачивают смесь до рН 8,2-8,3 по фенолфталеину, температуру в термокамере выдерживают (48±1)°С, встряхивание проводят в течение первых суток через 10-15 минут в течение 4-5 минут, а в последующие дни через каждые 1,5-2 часа в течение 4-5 минут, затем после фильтрования в фильтрат добавляют 2% хлороформа и хранят при температуре от 2 до 8°С.

Технический результат достигается с помощью ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба, используемого в питательных средах в качестве стимулятора роста лактобактерий, полученного способом по п.1, ОТЛИЧАЮЩЕГОСЯ тем, что он содержит поджелудочную железу крупного рогатого скота, хлороформ 2% от общего объема, карбонат натрия, водопроводную воду подогретую до (45±1)°С при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Тибетский молочный гриб	290-330
Поджелудочная железа крупного рогатого скота	100-160
Хлороформ	2% от общего объема
Карбонат натрия	4,5-5,5
Водопроводная вода при температуре (45±1)°С	остальное

Сущность способа получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба (ТМГ) и ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба, используемого в качестве стимулятора роста для культивирования лактобактерий, заключается в следующем.

Молочный тибетский гриб, в количестве 0,219 кг, тщательно промывают в проточной водопроводной воде (предварительно поместив в марлю). Промытый грибок помещают в стеклянную емкость и добавляют 0,657 л (1:3) водопроводной воды, подогретой до температуры (45±1)°С. Смесь расщелачивают Nа₂СО₃ до рН 8,2-8,3 по фенолфталеину. Затем загружают измельченную поджелудочную железу КРС в количестве 0,101 кг. К общему объему содержимого добавляют 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом и помещают в термокамеру при температуре (45±1)°С. Выдерживают в течение 9-10 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 10-15 минут по 4-5 минут, а в последующие дни через каждые 1,5-2 часа по 4-5 минут. Динамику ферментативного процесса контролируют по нарастанию аминного азота. На 9-10 сутки увеличение данного показателя прекращается, термокамеру отключают, гидролизат оставляют на сутки. Затем фильтруют через фильтровальное полотно. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С. Используют по мере необходимости. Аминный азот в готовом гидролизате 567,8 л/гр. Цвет: прозрачный, коньячный.

Для приготовления ферментативного гидролизата из ТМГ, используемого в качестве стимулятора роста для культивирования лактобактерий, берут следующее соотношение ингредиентов, г/л:

Тибетский молочный гриб	290-330
Поджелудочная железа крупного рогатого скота	100-160
Хлороформ	2% от общего объема
Карбонат натрия	4,5-5,5
Водопроводная вода при температуре (45±1)°С	остальное

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба, используемого в качестве стимулятора роста для культивирования лактобактерий

Пример №1. Молочный тибетский гриб, в количестве 0,29 кг, тщательно промывают в проточной водопроводной воде (предварительно поместив в марлю). Промытый грибок помещают в стеклянную емкость и добавляют 0,87 л (1:3) водопроводной воды, подогретой до температуры (35±1)°С. Смесь расщелачивают Nа₂СО₃ до рН 6,2-6,4 по фенолфталеину. Затем загружают измельченную поджелудочную железу КРС в количестве 0,1 кг. К общему объему содержимого добавляют 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом и помещают в термокамеру при температуре (45±1)°С. Выдерживают в течение 8 суток, встряхивая 3-4 раза в день. Динамику ферментативного процесса контролируют по нарастанию аминного азота, по мере прекращения его нарастания гидролизат считается готовым. Затем фильтруют через фильтровальное полотно и нейтрализуют до рН 7,0. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С.

При этом ферментативный гидролизат из тибетского молочного гриба, используемый в качестве стимулятор роста, получают при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Тибетский молочный гриб	290
Поджелудочная железа крупного рогатого скота	100
Хлороформ	2% от общего объема
Карбонат натрия	4,7
Водопроводная вода при температуре (35±1)°С	остальное

Недостатком полученного ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба, используемого в качестве стимулятора роста, является снижение биологической ценности, что связано с неполным расщеплением белков до аминокислот.

Пример №2. Молочный тибетский гриб, в количестве 0,3 кг, тщательно промывают в проточной водопроводной воде (предварительно поместив в марлю). Промытый грибок помещают в стеклянную емкость и добавляют 0,9 л (1:3) водопроводной воды, подогретой до температуры (40±1)°С. Смесь расщелачивают Nа₂СО₃ до рН 8,7-8,9 по фенолфталеину. Затем загружают измельченную поджелудочную железу КРС в количестве 0,14 кг. К общему объему содержимого добавляют 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом и помещают в термокамеру при температуре (38±1)°С. Выдерживают в течение 8 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 10 минут по 4 минуты, а в последующие дни через каждый час по 5 минут. Динамику ферментативного процесса контролируют по нарастанию аминного азота, на 9-10 сутки увеличение данного показателя прекращается, термокамеру отключают, гидролизат оставляют на сутки. Затем фильтруют через фильтровальное полотно. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С. Используют по мере необходимости.

При этом ферментативный гидролизат из тибетского молочного гриба, используемый в качестве стимулятор роста, получают при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Тибетский молочный гриб	300
Поджелудочная железа крупного рогатого скота	140
Хлороформ	2% от общего объема
Карбонат натрия	4,6
Водопроводная вода при температуре (40±1)°С	остальное

Полученный ферментативный гидролизат из тибетского молочного гриба, используемый в качестве стимулятор роста, имеет недостаточный уровень аминного азота и показателя сухого остатка, что снижает его биологическую ценность.

Пример №3. Молочный тибетский гриб, в количестве 0,32 кг, тщательно промывают в проточной водопроводной воде (предварительно поместив в марлю). Промытый грибок помещают в стеклянную емкость и добавляют 0,96 л (1:3) водопроводной воды, подогретой до температуры (45±1)°С. Смесь расщелачивают Na₂CO₃ до рН 8,0-8,2 по фенолфталеину. Затем загружают измельченную поджелудочную железу КРС в количестве 0,145 кг. К общему объему содержимого добавляют 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом и помещают в термокамеру при температуре (48±1)°С. Выдерживают в течение 9 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 10 минут по 4 минуты, а в последующие дни через каждые 1,5 часа по 4 минуты. Динамику ферментативного процесса контролируют по нарастанию аминного азота, на 9 сутки увеличение данного показателя прекращается, термокамеру отключают, гидролизат оставляют на сутки. Затем фильтруют через фильтровальное полотно. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С. Используют по мере необходимости.

При этом ферментативный гидролизат из тибетского молочного гриба, используемый в качестве стимулятор роста, получают при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Тибетский молочный гриб	320
Поджелудочная железа крупного рогатого скота	145
Хлороформ	2% от общего объема
Карбонат натрия	4,5
Водопроводная вода при температуре (40±1)°С	остальное

Полученный ферментативный гидролизат из тибетского молочного гриба, используемый в качестве стимулятор роста, обладает высокой биологической активностью, он не имеет осадка и хорошо фильтруется.

Пример №4. Молочный тибетский гриб, в количестве 0,325 кг, тщательно промывают в проточной водопроводной воде (предварительно поместив в марлю). Промытый грибок помещают в стеклянную емкость и добавляют 0,975 л (1:3) водопроводной воды, подогретой до температуры (45±1)°С. Смесь расщелачивают Nа₂СО₃ до рН 8,7-8,9 по фенолфталеину. Затем загружают измельченную поджелудочную железу КРС в количестве 0,155 кг. К общему объему содержимого добавляют 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом и помещают в термокамеру при температуре (48±1)°С. Выдерживают в течение 10 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 15 минут по 5 минут, а в последующие дни через каждые 2 час по 5 минут. Динамику ферментативного процесса контролируют по нарастанию аминного азота, на 10 сутки увеличение данного показателя прекращается, термокамеру отключают, гидролизат оставляют на сутки. Затем фильтруют через фильтровальное полотно. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С. Используют по мере необходимости.

При этом ферментативный гидролизат из тибетского молочного гриба, используемый в качестве стимулятор роста, получают при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Тибетский молочный гриб	325
Поджелудочная железа крупного рогатого скота	155
Хлороформ	2% от общего объема
Карбонат натрия	5,0
Водопроводная вода при температуре (4±1)°С	остальное

Полученный ферментативный гидролизат из тибетского молочного гриба, используемый в качестве стимулятор роста, обладает высокой биологической активностью, показатели аминного азота и сухого остатка высокие. Гидролизат не имеет осадка и хорошо фильтруется.

Пример №5. Молочный тибетский гриб, в количестве 0,33 кг, тщательно промывают в проточной водопроводной воде (предварительно поместив в марлю). Промытый грибок помещают в стеклянную емкость и добавляют 0,99 л (1:3) водопроводной воды, подогретой до температуры (45±1)°С. Смесь расщелачивают Na₂CO₃ до рН 8,7-8,9 по фенолфталеину. Затем загружают измельченную поджелудочную железу КРС в количестве 0,16 кг. К общему объему содержимого добавляют 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом и помещают в термокамеру при температуре (50±1)°С. Выдерживают в течение 10 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 15 минут по 5 минут, а в последующие дни через каждые 2 часа по 5 минут. Динамику ферментативного процесса контролируют по нарастанию аминного азота, на 10 сутки увеличение данного показателя прекращается, термокамеру отключают, гидролизат оставляют на сутки. Затем фильтруют через фильтровальное полотно. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С, используют в течение 10 дней.

При этом ферментативный гидролизат из тибетского молочного гриба, используемый в качестве стимулятор роста, получают при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Тибетский молочный гриб	330
Поджелудочная железа крупного рогатого скота	160
Хлороформ	2% от общего объема
Карбонат натрия	5,5
Водопроводная вода при температуре (4±1)°С	остальное

При такой рецептуре ферментативный гидролизат, используемый в качестве стимулятора роста примера №5 по биологической ценности и показателю аминного азота не уступает гидролизату, приготовленному по примеру №4. Однако его недостатками являются низкий показатель сухого остатка, непродолжительный срок хранения и увеличение стоимости способа.

Таким образом, наиболее оптимальными являются примеры 3 и 4, так как полученный гидролизат и стимулятор роста на его основе обладают высокой биологической активностью.

Важнейшим критерием качества ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба (ТМГ) и критерием особенностей культуральных свойств составляющих его микроорганизмов является содержание в нем аминокислот.

При определении суммарного содержания аминокислот в ферментативном гидролизате ТМГ (2 пробы) обнаружены: лизин солянокислый, пролин, валин, треонин, фенилаланин и другие неразделенные аминокислоты. Определялось суммарное содержание аминокислот в пересчете на определенную аминокислоту:

- содержание аминокислот в пересчете на метионин:

№1 - 3,11%; №2 - 2,5 7%

- содержание аминокислот в пересчете на валин:

№1 - 2,44%; №2 - 2,02%

- содержание аминокислот в пересчете на треонин:

№1 - 5,47%; №2 - 4,55%

- относительно аспарагиновой кислоты получено:

№1 - 6,2%; №2 - 5,9%

- содержание аминокислот в пересчете на фенилаланин:

№1 - 5,17%; №2 - 4,85%

Общее суммарное количество аминокислот, обнаруженных в ферментативном гидролизате ТМГ, составляет в пробе №1 - 22,39%, в пробе №2 - 19,89%.

Таким образом, ферментативный гидролизат ТМГ богат аминокислотами, что позволяет считать его достаточно качественным стимулятором роста.

При помощи качественных реакций на некоторые витамины в ферментативном гидролизате ТМГ нами были обнаружены следующие: тиамин (В1), рибофлавин (В2), никотиновая кислота (РР или В5), витамин А.

Было проведено химическое исследование полученного стимулятора роста на наличие аминокислот, углеводов, а так же микро- и макроэлементов.

На основании проведенных исследований получены следующие результаты таблица 1.

Таблица 1 Некоторые химические компоненты стимулятора роста из тибетского молочного гриба, приготовленного по примерам № 3-4
Химические компоненты / качественные показатели	Количественные показатели
1. Аминокислоты:	г/л:
Треонин	51,1±0,2
Пролин	41,2±0,1
Метионин	23,3±0,8
Лейцин	38,0±1,0
Аргинин солянокислый	43,0±0,5
2. Углеводы:
Глюкоза	количество не рассчитывали
Следы лактозы	количество не рассчитывали
Гликоген	количество не рассчитывали
3. Микро- и макроэлементы	мг/л:
Цинк	5,3
Медь	0,4
Железо	1,8
Натрий	52,3
Калий	213
Магний	18,0
Кальций	2,9

Определение активности гидролизата способом К.Бакирджиева.

Берут 2 флакона стимулятора роста. В первую пробирку помещают 500 мг дрожжей, 19,5 мл глюкозы и 0,5 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида (контроль). Во вторую и третью пробирки - 500 мг дрожжей, 19,5 мл глюкозы, 2,5мл гидролизата. Пробирки плотно укупориваются резиновыми пробками с вставленными в них изогнутыми стеклянными трубками, через которые выходит жидкость, вытесняемая углекислым газом, вырабатываемым дрожжами в процессе их жизнедеятельности. Объем вытесняемой жидкости в пробирках определяют каждые 24 часа.

Разница в объеме вытесняемой жидкости между контрольной пробиркой и тестовыми составила 30%. Это указывает на высокую биологическую активность стимулятора роста.

Для подтверждения биологической активности стимулятора роста из тибетского молочного гриба провели исследование его химического состава, испытали на активность способом К.Бакирджиева (Калашник И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии / И.А.Калашник. - 2-е изд., перераб. и доп. - К.: Урожай. - 1990. - 160 с.), а также провели исследование стимулятора роста в качестве основы микробиологических питательных сред для наращивания бактериальной массы лактобактерий. Для этого в среду МРС-1 (жидкая) добавили стимулятор роста из тибетского молочного гриба в разных концентрациях: первая 0,5, вторая 1,0, третья 1,5, четвертая 2,0.

При выполнении работы для тестирования ростовых качеств питательных сред были использованы 3 музейных тест-штамма микроорганизмов, полученных из ГИСК имени Л.А.Тарасовича: L. plantarum 8Р-А3, L. fermentum 90T-C4 и L. acidophilus EP 317-402. Все штаммы имели типичные морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства.

Приготовление питательной среды с использованием гидролизата из тибетского молочного гриба в качестве стимулятора роста лактобактерий заключается в следующем. В 200 мл дистиллированной воды последовательно растворяют: 50 мл марганца сернокислого, 200 мл магния сернокислого, 2 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 200 мл цистеина солянокислого, агар микробиологический и индикатор хлорфенол красный. 10 г пептона отдельно растворяют в небольшом объеме горячей дистиллированной воды и вносят в 1 мл Твин - 80. Тщательно перемешивают раствор пептона с Твином - 80 и добавляют в вышеуказанную смесь. Доводят объем жидкости дистиллированной водой до 1000 мл, РН среды не требует корректировки и устанавливается на уровне 6,2-6,6. Стерилизация 15 минут при t 120±3°C и давлении 1,0±0,1 кгс/см² (0,10±0,01) МПа. Затем добавляют гидролизат тибетского молочного гриба в различных концентрациях.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного добавления гидролизата из тибетского молочного гриба как стимулятора роста лактобактерий

Пример №1. В 200 мл дистиллированной воды последовательно растворяют: 50 мл марганца сернокислого, 200 мл магния сернокислого, 2 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 200 мл цистеина солянокислого, агар микробиологический и индикатор хлорфенол красный. Отдельно растворяют 10 г пептона в небольшом объеме горячей дистиллированной воды и вносят в 1 мл Твин - 80. Тщательно перемешивают раствор пептона с Твином - 80 и добавляют в вышеуказанную смесь. Доводят объем жидкости дистиллированной водой до 1000 мл, РН среды не требует корректировки и устанавливается на уровне 6,2-6,6. Стерилизация 15 минут при t 120±3°С и давлении 1,0±0,1 кгс/см² (0,10±0,01) МПа. Затем добавляют 0,5 мл гидролизата тибетского молочного гриба.

Пример №2. В 200 мл дистиллированной воды последовательно растворяют: 50 мл марганца сернокислого, 200 мл магния сернокислого, 2 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 200 мл цистеина солянокислого, агар микробиологический и индикатор хлорфенол красный. Отдельно растворяют 10 г пептона в небольшом объеме горячей дистиллированной воды и вносят в 1 мл Твин - 80. Тщательно перемешивают раствор пептона с Твином - 80 и добавляют в вышеуказанную смесь. Доводят объем жидкости дистиллированной водой до 1000 мл, РН среды не требует корректировки и устанавливается на уровне 6,2-6,6. Стерилизация 15 минут при t 120±3°С и давлении 1,0±0,1 кгс/см² (0,10±0,01) МПа. Затем добавляют 1 мл гидролизата тибетского молочного гриба.

Пример №3. В 200 мл дистиллированной воды последовательно растворяют: 50 мл марганца сернокислого, 200 мл магния сернокислого, 2 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 200 мл цистеина солянокислого, агар микробиологический и индикатор хлорфенол красный. Отдельно растворяют 10 г пептона в небольшом объеме горячей дистиллированной воды и вносят в 1 мл Твин - 80. Тщательно перемешивают раствор пептона с Твином - 80 и добавляют в вышеуказанную смесь. Доводят объем жидкости дистиллированной водой до 1000 мл, РН среды не требует корректировки и устанавливается на уровне 6,2-6,6. Стерилизация 15 минут при t 120±3°C и давлении 1,0±0,1 кгс/см² (0,10±0,01) МПа. Затем добавляют 1,5 мл гидролизата тибетского молочного гриба.

Пример № 4. В 200 мл дистиллированной воды последовательно растворяют: 50 мл марганца сернокислого, 200 мл магния сернокислого, 2 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 200 мл цистеина солянокислого, агар микробиологический и индикатор хлорфенол красный. Отдельно растворяют 10 г пептона в небольшом объеме горячей дистиллированной воды и вносят в 1 мл Твин - 80. Тщательно перемешивают раствор пептона с Твином - 80 и добавляют в вышеуказанную смесь. Доводят объем жидкости дистиллированной водой до 1000 мл, РН среды не требует корректировки и устанавливается на уровне 6,2-6,6. Стерилизация 15 минут при t 120±3°С и давлении 1,0±0,1 кгс/см² (0,10±0,01) МПа. Затем добавляют 2 мл гидролизата тибетского молочного гриба.

Результаты выращивания лактобактерий на питательной среде (ПС) с добавлением ферментативного гидролизата тибетского молочного гриба в качестве стимулятора роста лактобактерий, в разных концентрациях и МРС-среды, представлены в таблице 2.

Таблица 2 Ростовые качества различных вариантов питательной среды №1 и МРС-среды, n=450
Наименование питательной среды	Количество и диаметр колоний через 48 часов после культивирования
	L. plantarum 8P-A3	L. fermentum 90T-C4	L. acidophilus EP 317-402
Кол-во колоний	D колоний (мм)	Кол-во колоний	D колоний (мм)	Кол-во колоний	D колоний (мм)
ПС + 0,5	19,1±0,2*	0,83±0,02*	14,2±0,4*	0,91±0,02*	12,2±0,4*	0,72±0,03*
ФГТМГ
ПС+1,0	19,0±0,3*	1,81±0,03*	19,2±0,3 *	1,51±0,05*	16,2±0,5*	1,59±0,04*
ФГТМГ
ПС+1,5	20,0±0,3 *	2,01±0,02*	21,0±0.2*	1,82±0,05*	18,7±0,4 *	1,82±0,04*
ФГТМГ
ПС + 2,0	24,2±0,3 *	2,32±0,03*	Сплошной рост	Сплошной рост
ФГТМГ
Контроль -	17,1±0,3	1,00±0,02	17,3±0,3	1,21±0,04	15,3±0,4	0,98±0,03
МРС-среда
*(Р<0,01) - прирост показателя в сравнении с контрольной группой

Таким образом, наглядный ростостимулирующий эффект оказал гидролизат из тибетского молочного гриба в концентрации 2,0 мл согласно примеру №4. При использовании гидролизата из тибетского молочного гриба в качестве стимулятора роста лактобактерий тест-штаммов: L. plantarum, L. fermentum, L. acidophilus, - рост микроорганизмов на питательной среде превосходит их рост на МРС среде, в качестве стимулятора в которой используют дрожжевой автолизат.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- имеет более низкую себестоимость;

- включает большое количество аминокислот, углеводов, а также витаминов;

- повышает ростовые качества питательной среды по отношению к молочнокислым микроорганизмам;

- превосходит их рост на МРС среде, в качестве стимулятора в которой используют дрожжевой автолизат.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- имеет более низкую себестоимость;

- включает большое количество аминокислот, углеводов, а также витаминов;

- повышает ростовые качества питательной среды по отношению к молочнокислым микроорганизмам;

- не изменяет культуральные и морфологические свойства микроорганизмов;

- удешевляет питательную среду;

- доступность сырья и основных методик, используемых при приготовлении гидролизата.

1. Способ получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба, предусматривающий смешивание промытого молочного гриба с подогретой водопроводной водой, добавление измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота, подщелачивание углекислым натрием, добавление хлороформа с последующим размещением в термокамеру, выдерживание в течение 9-10 сут с периодическим перемешиванием и измерением уровня аминного азота, после увеличения последнего термокамеру отключают, гидролизат отстаивают в течение суток и фильтруют, отличающийся тем, что смешивание проводят с водопроводной водой, подогретой до 45±1°С в соотношении 1:3, поджелудочную железу добавляют в количестве 100-160 г/л смеси, а хлороформ - в количестве 2% от общего объема, подщелачивают смесь до рН 8,2-8,3 по фенолфталеину и выдерживают при температуре 48±1°С, встряхивание проводят в течение первых суток через 10-15 мин в течение 4-5 мин, а последующие дни - через каждые 1,5-2 ч в течение 4-5 мин, после фильтрования в фильтрат добавляют 2% хлороформа и хранят при температуре 2-8°С.

2. Ферментативный гидролизат тибетского молочного гриба, полученный способом по п.1 формулы изобретения.