Способ выделения минеральных зерен из жировой ткани
Владельцы патента RU 2421994:
Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования "Томский государственный университет" (RU)
Изобретение относится к области раздела биоминералогии - медицинской минералогии - и может быть использовано в медицине, фармакологии, биофизике (магнитобиологии), в биохимии, коллоидной химии и т.д. Способ выделения минеральных зерен из жировой ткани включает измельчение жировой ткани вручную в емкости с последующим добавлением под тягой растворителя липидов в пропорции 1:10, ведущим к растворению липидов в течение 0,5-1 часа, с последующим извлечением зерен из емкости. Измельчение жировой ткани проводят механическим способом, а также с помощью ультразвука. В качестве растворителей, применяемых для растворения липидов жировой ткани, используют этиловый эфир, этилацетат, хлороформ, ацетон, бензол, ксилол, бензин. Повторение стадии растворения липидов может повторяться два или несколько раз. После добавления растворителя возможно перемешивание жировой ткани (вручную, с помощью стеклянной палочки или встряхиванием). Также после добавления растворителя производят нагревание жировой ткани до 50°С. Извлечение из емкости зерен с повышенным удельным весом проводят простым декантированием. Извлечение из емкости зерен также можно проводить центрифугированием или выпариванием. 8 з.п. ф-лы, 4 ил.
Изобретение относится к области раздела биоминералогии - медицинской минералогии - и может быть использовано:
- в медицине при исследовании болезней, связанных с воспалениями, нарушением тканевого дыхания, разложением белков;
в фармакологии для выявления ятрогенных болезней, вызванных различными лекарственными наполнителями;
в биофизике (магнитобиологии) для объяснения механизма биомедицинских эффектов, производимых электромагнитными полями в организме человека;
- в минералогии, поскольку значительно расширяют температурно-барометрические, временные и окислительно-восстановительные рамки оксидного и сульфидного минералообразования;
- в биохимии, коллоидной химии и т.д.
Известен способ выделения кристаллов каротиноида из микробной биомассы, заключающийся в последовательных стадиях разрушения клеточных стенок микробов, отделения клеточного дебриса от остатка, содержащего каротиноиды, промывания микробной биомассы или разрушения клеток, или каротиноидсодержащего остатка растворителем, подходящим для удаления липида, флотирование каротиноидных кристаллов в воде и по необходимости дальнейшую очистку кристаллов (патент РФ №2235783, опубл. 10.09.2004, C12P 23/00, C12N 1/14). Недостатком существующего аналога является сложная многоступенчатость процесса отделения кристаллического материала из клеточного вещества, связанная с необходимостью высокой степени очистки каротиноида для последующего применения его в качестве пищевых и фармакологических компонентов, а также ограниченность наименований применяемых растворителей липидов, вызванная опасностью загрязнения или растворения этими растворителями каротиноида.
Подробно разработанная авторами изобретения процедура разрушения клеток содержит ряд неприменимых для выделения неорганических минеральных зерен способов. Абсолютно неприменим способ разрушения клеток с помощью шаровой мельницы, так как при этом минеральные частицы неизбежно будут растерты, и их дальнейшее изучение станет невозможным. Гомогенизация микробной биомассы в гомогенизаторе под высоким давлением также нежелательна, поскольку не совместима с сохранением формы минеральных зерен и их размеров. Ферментативное разрушение клеток представляется дорогим и неудобным из-за ограниченного времени эффективности ферментативного бульона. Заключительная стадия декантирования малоприменима для исследования минерального состава жировой ткани. При декантировании имеется риск потери части зерен с пониженным удельным весом. Центрифугирование не вызывает возражений, за исключением того обстоятельства, что это крайне редкое оборудование для минералогических лабораторий.
Задача данного изобретения заключается в разработке способа выделения минеральных зерен, образовавшихся и находящихся в жировой ткани человека для последующего изучения этих зерен с помощью минералогических, физических и физико-химических методов.
Поставленная задача решается тем, что способ выделения минеральных зерен из жировой ткани включает измельчение жировой ткани вручную в емкости с последующим добавлением под тягой растворителя липидов в пропорции 1:10, ведущим к растворению липидов в течение 0,5-1 часа, с последующим извлечением зерен из емкости.
Измельчение жировой ткани механическим способом также проводят с помощью ультразвука. В качестве растворителей, применяемых для растворения липидов жировой ткани, используют этиловый эфир, этилацетат, хлороформ, ацетон, бензол, ксилол, бензин. Повторение стадии растворения липидов может повторяться два или несколько раз. После добавления растворителя возможно перемешивание жировой ткани (вручную, с помощью стеклянной палочки или встряхиванием). Также после добавления растворителя производят нагревание жировой ткани до 50°C. Извлечение из емкости зерен с повышенным удельным весом проводят простым декантированием. Извлечение из емкости зерен также можно проводить центрифугированием или выпариванием.
Исследовались 50 образцов из жировой ткани кардиоваскулярной системы больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (операционный материал): из зон липидных пятен сосудов, липидных отложений атеросклеротических бляшек, жировые отложения внешней части восходящей аорты. Степень кальцификации исследованных тканей сосудов была различной - от сильной до очень слабой. Примерно половина образцов, по-видимому, относилась к бурой жировой ткани. Все образцы содержали большое количество липидов низкой плотности и имели гранулированное строение жировой ткани. Исследования велись на микроскопах МИН-9 и AXIOSCOP 40 фирмы ZEISS, прозрачные минералы исследовались в иммерсии. Исследования показали, что в белой и бурой жировых тканях человеческого организма обычно присутствуют в различных количествах разнообразные минеральные зерна, до настоящего времени почти не изученные ни с точки зрения причины их образования и влияния на окружающие ткани, ни со стороны их химического и минерального состава. Для всестороннего изучения этих неорганических минеральных зерен необходимо их выделение из жировой ткани для проведения микрозондового, поляризационно-оптического, рентгенофазового и др. анализов, общераспространенных в минералогической практике. Механическому выделению минеральных зерен вручную, с помощью манипуляций пинцетом и иглой, препятствует мелкий размер исследуемых зерен (крайне редко более 100 микрон, как правило, менее 50 микрон), недостаточная прозрачность жировой ткани и ее полужидкое состояние.
Изобретение данного метода продиктовано необходимостью выделения из жировой ткани неорганической минеральной составляющей для дальнейших минералогических исследований. Сущность метода связана с нерастворимостью неорганических минеральных зерен в растворителях липидов, в конкретном случае в растворителях липидов жировой ткани.
Из учебников по органической химии известно, что липиды экстрагируются из животной и растительной ткани неполярными растворителями: эфиром, хлороформом, бензолом и алканами.
Объектом применения изобретения является белая или бурая жировая ткань, в конкретном случае из кардиоваскулярной системы. Исследуемый материал может быть как биопсийным, так и аутопсийным. Фрагменты тканей фиксируются в 12% растворе формалина в течение 1 -2 недель, затем высушиваются на воздухе в течение 1-2 дней. После этих подготовительных процедур приступают к выделению минеральных зерен из жировой ткани.
Пример 1. Выделение минеральных зерен с помощью этиленового эфира.
Жировая ткань с содержащимися в ней минеральными частицами (фиг.1, 2) в объеме 0,5 см3, помещенная в соответствующую по размеру открытую емкость, вручную с помощью скальпеля была расчленена на 15-20 мелких частиц, затем под тягой в вытяжном шкафу ткань залили эфиром в объемном соотношении 1:10 и выдержали до полного растворения липидов (20 мин). Поскольку жировая ткань полностью не растворилась, процесс растворения нерастворившихся частиц был повторен. Эфир является легколетучим соединением, поэтому при выделении с помощью этих растворителей минеральных частиц стадия выпаривания и декантирования не нужна. Оставшиеся в чашке минеральные зерна собрали на двусторонний скотч для последующего изготовления шашки и исследования с помощью микрозонда.
Пример 2. Выделение минеральных зерен с помошью ацетона.
Белая жировая ткань в объеме около 1 см3 была механически измельчена вручную, с помощью двух стальных игл. Затем ее поместили в соответствующую открытую емкость под тягой, залили ацетоном в соотношении 1:10, нагрели на плитке до 50°C, периодически встряхивая емкость с жировой тканью и растворителем. После того как ацетон в течение 30 минут испарился, остатки жировой ткани снова залили ацетоном и продолжали растворение до полного растворения липидов. Затем остаток ацетона был осторожно декантирован, а минеральные зерна были собраны на двусторонний скотч для описания и дальнейшего изучения (результаты представлены на фиг.3, 4).
Пример 3. Выделение минеральных зерен с помощью бензина. Бурая жировая ткань в объеме около 0,2 см3 была механически измельчена вручную с помощью скальпеля. Затем ее поместили в соответствующую открытую емкость под тягой, залили бензином в соотношении 1/10, нагрели на плитке до 50°C, периодически встряхивая емкость до полного растворения липидов ткани. Остатки бензина испарялись естественным образом в вытяжном шкафу в течение нескольких часов. Минеральные зерна были извлечены из емкости с помощью стальной иглы и размещены в бумажные пакеты.
Заявленный способ является доступным, простым, экспрессным и, кроме вытяжного шкафа, не требует в обязательном порядке сложного оборудования и дорогих химреактивов.
1. Способ выделения минеральных зерен из жировой ткани, включающий измельчение жировой ткани с последующим добавлением под тягой растворителя липидов в пропорции 1:10, ведущим к растворению липидов в течение 0,5-1 ч, с дальнейшим перемешиванием и нагреванием жировой ткани до 50°С, с последующим извлечением зерен из емкости.
2. Способ по п.1, включающий измельчение жировой ткани вручную в емкости.
3. Способ по п.1, включающий измельчение жировой ткани механическим способом с помощью ультразвука.
4. Способ по п.1, включающий использование этилового эфира, этилацетата в качестве растворителя, применяемого для растворения липидов жировой ткани.
5. Способ по п.1, включающий использование хлороформа в качестве растворителя, применяемого для растворения липидов жировой ткани.
6. Способ по п.1, включающий использование ацетона в качестве растворителя, применяемого для растворения липидов жировой ткани.
7. Способ по п.1, включающий использование бензола, ксилола, бензина в качестве растворителя, применяемого для растворения липидов жировой ткани.
8. Способ по п.1, включающий извлечение из емкости зерен с повышенным удельным весом простым декантированием.
9. Способ по п.1, включающий извлечение из емкости зерен центрифугированием или выпариванием.
