Способ получения энтомопатогенного препарата
Владельцы патента RU 2421995:
Государственное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения энтомопатогенного препарата. Способ включает глубинное культивирование гриба Verticillium lecanii на питательной среде, с последующим концентрированием культуральной жидкости и введением в нее полифункциональной добавки, содержащей: мас.%: картофельный крахмал 6-8, диоксид титана 2-5, борная кислота 0,01-0,03, стрептомицин 0,004-0,008, соевый лецитин 8-14 или вазелиновое масло 4-6, вода - остальное. Изобретение позволяет повысить биологическую эффективность биопрепарата и сохранить активность биопрепарата при хранении в течение 4 месяцев. 3 табл.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается производства средств защиты растений от вредителей, в частности способа получения грибных энтомопатогенных препаратов. Известны способы получения энтомопатогенных препаратов путем глубинного культивирования микроскопических грибов, таких как Verticillium lecanii, Beauveria bassiana на питательных средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим концентрированием и сушкой концентрата (Вертициллин зерновой ТУ 10.01.28-89 [1], Вертициллин-К ТУ 10.01.29-89 [2]). Недостатками этих препаратов является низкопроизводительный поверхностный способ культивирования, необходимость стадии сушки, которая существенно снижает жизнеспособность спор и усложняет технологический процесс. В случае получения жидких препаратов (Боверин-концентрат Ж ТУ 10.01.26-88 [3]), их применяют сразу после получения. Современными препаративными формами, более экономичными и простыми в получении являются стабилизированные пасты.
Наиболее близким техническим решением к изобретению, взятый за прототип (Патент RU 2035144. Третьяков В.П. Способ получения энтомопатогенного препарата от 22.01.1993 [4]) является способ получения жидкого энтомопатогенного препарата путем глубинного культивирования микроскопических грибов (Verticillium lecanii, Beauveria bassiana или Metarhizium anisopliae) на питательной среде, содержащей глюкозу, глицерин, гидролизат белково-витаминного концентрата, мел и воду, концентрирование культуральной жидкости, введение в концентрат дополнительно глицерина и полиэтиленоксида или поливинилпироллидона.
Полученный по описанному способу влажный препарат (паста) имеет титр бластоспор 11·109 спор/мл, биологическая эффективность 80% на личинках оранжерейной белокрылки при рабочей концентрации 10·106 спор/мл, срок хранения до трех месяцев при температуре не выше 10°С.
Недостатком известного способа является сравнительно низкая биологическая эффективность биопрепарата и снижение жизнеспособности инфекционных единиц в процессе хранения за счет несбалансированного состава препаративной формы.
Цель изобретения - увеличение биологической эффективности биопрепарата и удлинение срока хранения без ее потери.
Сущность способа заключается в следующем. Готовят жидкую стерильную питательную среду (Леднев и др. «Возбудители микозов насекомых», СПб. 2003, с.71 [5]), содержащую, мас.: 20 г глюкозы, 10 г пептона, 2 г дрожжевого экстракта, Н2О - до 1 л. Доводят до рН 6,5 едким натром. Засевают штаммом гриба Verticillium lecanii P-81 (Каталог государственных коллекций полезных и вредных организмов, М. - СПб, РАСХН, 2001, с.14 [6]) и культивируют глубинно, скорость перемешивания 200-220 об/мин. Культивирование осуществляют в течение 5 суток при 27°С до максимального спорообразования. Полученную культуральную жидкость концентрируют до остаточной влажности 73-85% фильтрованием. Для получения пасты в концентрат культуральной жидкости вводят полифункциональную добавку, которая состоит из наполнителя - картофельного крахмала, в качестве эмульгатора и антиоксиданта соевого лецитина или вазелинового масла, ультрафиолетового протектора - диоксида титана, консерванта - борной кислоты (СанПиН 2.3.2.1078-01 Приложение 7, с.577, 578, 611, 616 [7]) и антибиотика - стрептомицина [5, с.70] при соотношении компонентов, мас.%: картофельный крахмал 6-8;.диоксид титана 2-5; борная кислота 0,01-0,03; стрептомицин 0,004-0,008; соевый лецитин 8-14 или вазелиновое масло 4-6; вода - остальное.
Пример 1, иллюстрирующий приготовление составов.
К 5 г концентрата культуральной жидкости с остаточной влажностью 78% и титром жизнеспособных единиц 5,0·1013 КОЕ/г добавляли 1 мл 0,1%-ного раствора борной кислоты, 1 мл 0,02%-ного раствора стрептомицина, 10% (0,5 г) соевого лецитина. После частичного растворения гранул лецитина, смешивали образец с 5 г 7,5%-ного картофельного крахмала. Полученный энтомопатогенный препарат, представляющий собой стойкую однородную суспензию (пасту), имеет следующую характеристику: исходный титр жизнеспособных спор 2,3·1012 КОЕ/г, срок хранения до четырех месяцев при температуре 4°С, титр после хранения составил 4,3·108 КОЕ/г. Непосредственно перед применением в препарат добавляли 5% (0,25 г) диоксида титана.
Биологическая эффективность препарата на виковой тле (Megoura viciae Buckt.) - 100%, на черемухо-злаковой тле (Rhopalosiphum padi L.) - (98,0±3,5)%, на белокрылке - (95,5±7,9)% (рабочая концентрация 5,0·106 спор/мл).
Пример 2. Так же как в примере 1 получали препарат на основе 5 г концентрата культуральной жидкости в такой же последовательности с заменой соевого лецитина на 0,3 г вазелинового масла. Полученный энтомопатогенный препарат, представляющий собой стойкую однородную суспензию (пасту), имеет следующую характеристику:
исходный титр жизнеспособных спор 2,3·1012 КОЕ/г, срок хранения до четырех месяцев при температуре 4°С, титр после хранения 2,0·108 КОЕ/г. Биологическая эффективность препарата на виковой тле (Megoura viciae Buckt) - (91,3±4,3)% (рабочая концентрация 5,0·10 спор/мл), на черемухо-злаковой тле (Rhopalosiphum padi L.) - (99,3±1,2)%, на белокрылке - (85,0±7,7)% (рабочая концентрация 5,0·106 спор/мл).
Приведенный в примерах 1-2 титр концентрата культуральной жидкости - 5,0·1013 КОЕ/г является промежуточным параметром при получении препарата. Из литературы известны различные показатели титра спор (спор/мл культуральной жидкости), полученные в результате культивирования штаммов этого вида гриба в глубинных условиях. Эти показатели определяются прежде всего штаммовыми особенностями продуцента. Например, в прототипе получают культуральную жидкость с титром спор гриба 1,5·103 спор/мл, концентрируют до титра 1,3·1010 спор/г и в готовом препарате получают в пересчете на граммы 2,27·109 спор/г.
Титр пасты после внесения добавок (исходный) составил 2,3·1012 КОЕ/г. Такие наработки были проведены многократно (таблица 1). Для всех образцов паст, полученных по предлагаемому способу, характерно первоначальное увеличение КОЕ/г (через неделю хранения) за счет частичного использования компонентов полифункциональной добавки и последующее снижение через 4 месяца хранения до уровня (0,5-3,5)·108 КОЕ/г. Паста, полученная по прототипу, не хранится в течение 4-х месяцев (таблица 2).
| Таблица 1 | ||||
| Номер наработки | Титр концентрата, КОЕ/г | Титр жизнеспособных единиц в пасте, КОЕ/г | ||
| исходный | 1 неделя | 4 месяца | ||
| 1 | 9.3·109 | 4,6·109 | 1,4·1010 | 9,7·107 |
| 2 | 4,7·1012 | 2,3·1012 | 1,6·1013 | 3,5·108 |
| 3 | 2.1·108 | 1.1·108 | 1,2·109 | 5,0·107 |
| 4 | 7,4·1010 | 9,8·109 | 8,0·1010 | 1,2·108 |
| 5 | 2,6·1010 | 1,0·1010 | 1,8·1011 | 3,3·108 |
| Без добавок | 6.0·109 | 3,0·109 | 2,6·1010 | не хранится |
Универсальность изобретения состоит в том, что при любом значении исходного титра жизнеспособных спор мы имеем эффект сохранения жизнеспособности спор за счет введения полифункциональной добавки, который проявляется в более высоком показателе КОЕ/г в результате хранения.
| Таблица 2 | ||||
| Изменение титра образцов паст при хранении. | ||||
| Композиция | Титр жизнеспособных спор в результате хранения | |||
| 1 неделя КОЕ/г, ·1012 | 1 месяц КОЕ/г, ·1012 | 2 месяца КОЕ/г, ·1010 | 4 месяца КОЕ/г, ·108 | |
| Примеры 1-2 описания: | ||||
| ЛПФ | 20,0±2,8 | 16,3±0,2 | 8,5±0,5 | 4,3±0,1 |
| ВПФ | 25,0±0,6 | 12,6±0,4 | 3,3±0,3 | 2,0±0,2 |
| Добавка Твин-80 | 35,0±0,2 | 6,3±2,2 | 2,0±0,2 | Не хранится |
| Контроль (без добавок) | 22,5±1,4 | 8,6±2,5 | 0,2±0,1 | Не хранится |
Пример 3. Запредельные параметры полифункциональной добавки приводили к ухудшению препарата (табл.3). При этом оптимальное соотношение концентрата культуральной жидкости к полифункциональной добавке на основе приведенных в таблице 3 и в примерах 1-2 концентраций отдельных компонентов в пересчете стандартными методами составляет 1: 1,2-1,9 соответственно. Это вытекает из известного уровня техники при пересчете процентов в пропорции.
Предлагаемый способ получения энтомопатогенного препарата путем глубинного культивирования гриба Verticillium lecanii при внесении полифункциональной добавки в процессе получения пасты (по сравнению с глицерином и полиэтиленоксидом по прототипу) обладает преимуществом: более высокая биологическая эффективность биопрепарата и жизнеспособность инфекционных единиц в процессе хранения за счет сбалансированного состава препаративной формы.
Источники информации
1. Вертициллин зерновой ТУ 10.01.28-89.
2. Вертициллин-К ТУ 10.01:29-89.
3. Боверин-концентрат Ж ТУ 10.01.26-88.
4. Патент RU 2035144. Третьяков В.П. Способ получения энтомопатогенного препарата от 22.01.1993.
5. Леднев Г.Р., Борисов Б.А., Митина Г.В. Возбудители микозов насекомых, СПб, 2003.
6. Каталог государственных коллекций полезных и вредных организмов, Москва-С.Петербург, РАСХН отд. защиты растений. 2001.
7. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов 2002 года. Приложение 7 (Пищевые добавки, не оказывающие вредного воздействия на здоровье человека при использовании для изготовления пищевых продуктов (с изменениями от 15 апреля 2003 г.).
Способ получения энтомопатогенного препарата путем глубинного культивирования гриба Verticillium lecanii на питательной среде с последующим концентрированием культуральной жидкости и введением в нее полифункциональной добавки, отличающийся тем, что в качестве полифункциональной добавки вводят крахмал, диоксид титана, борную кислоту, стрептомицин, соевый лецитин или вазелиновое масло, воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| картофельный крахмал | 6-8 |
| диоксид титана | 2-5 |
| борная кислота | 0,01-0,03 |
| стрептомицин | 0,004-0,008 |
| соевый лецитин | 8-14 |
| или вазелиновое масло | 4-6 |
| вода | остальное |
