Способ получения белкового изолята канолы, включающий изоэлектрическое осаждение
Изобретение относится к способу получения белкового изолята из муки масличных семян. Способ получения изолята белка канолы включает ряд стадий, (а) Проводят экстракцию муки семян канолы для того, чтобы вызвать солюбилизацию белка канолы в муке семян канолы с образованием водного раствора белка канолы, имеющего значение рН от 5 до 6,8. (b) Проводят отделение водного раствора белка канолы от остаточной муки семян канолы. (с) Проводят подкисление водного раствора белка канолы до значения рН от 3 до 4 для того, чтобы с помощью изоэлектрической преципитации осадить изолят белка канолы, имеющий содержание белка, по меньшей мере, 90 мас.% (N×6,25). (d) Проводят отделение осажденного с помощью изоэлектрической преципитации изолята белка канолы от надосадочной жидкости. Изобретние позволяет получить белковые изоляты канолы, преимущественно состоящие из 7S белка канолы, полученные путем изоэлектрического осаждения из экстрактов муки масличных семян канолы водным раствором соли и белковые изоляты канолы, преимущественно состоящие из 2S белка канолы, полученные из надосадочной жидкости, полученной на стадии изоэлектрического осаждения. 12 з.п. ф-лы, 25 табл.
Ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается дата приоритета в соответствии со статьей 35 USC 119(е) по предварительной заявке на патенты США № 60/718754 (подана 21 сентября 2005).
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу получения белкового изолята из муки масличных семян, особенно из муки масличных семян канолы.
Предшествующий уровень техники
В патентах США № 5844086 и 6005076 ("Murrey II"), переуступленных патентовладельцу настоящего изобретения, содержание которых включено в настоящее изобретение как ссылки, описан способ выделения белковых изолятов из муки семян масличных культур, содержащей достаточное количество жира, включая муку из семян канолы, имеющих значительное содержание жира. В этом способе предусмотрены стадии, которые включают растворение белкового материала из муки семян масличных культур, сопровождающееся также растворением содержащегося в муке жира, и удаление жира из полученного водного белкового раствора. Отделение водного белкового раствора от остаточной муки из семян масличных культур можно проводить до или после стадии удаления жира. Затем обезжиренный раствор белка концентрируют с целью повышения концентрации белка при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора, после чего концентрированный белковый раствор может быть вовлечен в последующую стадию удаления жира. Затем концентрированный белковый раствор разбавляется, что приводит к образованию клубовидной массы сильно агрегированных белковых молекул в виде дискретных белковых капель в мицеллярной форме. После осаждения белковых мицелл получают агрегатированную, слитую, плотную аморфную клейкую массу белкового изолята, похожую на клейковину, обозначенную термином «белковая мицеллярная масса», или БММ, которая отделяется от остаточной водной фазы и высушивается.
Белковый изолят имеет содержание белка (при определении азота по Кьельдалю, или эквивалентным методом, N×6,25), по меньшей мере, приблизительно 90 мас.%, представляет собой в основном нативный белок (что установлено методом дифференциальной сканирующей калориметрии) и имеет низкое остаточное содержание жира. Используемый здесь термин «содержание белка» означает количество белка в белковом изоляте в расчете на сухое вещество. Выход белкового изолята, полученного с использованием этого способа, в расчете на относительное количество белка, экстрагированное из муки из семян масличных культур в виде сухого белкового изолята, вообще составляет менее 40 мас.%, обычно около 20 мас.%.
Способ, описанный в вышеуказанных патентах, был разработан с целью модификации и усовершенствования способа получения белкового изолята из множества материалов - источников белка, включая семена масличных культур, как описано в патенте США № 4208323 (Murrey IB). Мука из семян масличных культур, которая вырабатывалась в 1980 г., когда был опубликован патент США № 4208323, не содержала столько жира, сколько мука из масличных семян канолы, и поэтому способ, описанный в патенте США № 4208323, не может быть применен к муке из семян масличных культур, обработанной согласно способу Murrey II, для получения белкового материала с содержанием белка свыше 90%. В описании патента США № 4208323 нет конкретных сведений о проведении экспериментов с использованием рапсовой муки (канолы) в качестве исходного сырья.
Способ по патенту США № 4208323, по сути, был разработан с целью усовершенствования способа, описанного в патентах США № 4169090 и 4285862 (Murrey IA), за счет введения стадии концентрирования раствора до его разбавления с образованием белковой мицеллярной массы. Стадия концентрирования обеспечивает повышение выхода белкового изолята, начиная приблизительно с 20 мас.% для способа Murrey IA.
В одновременно рассматриваемых заявках на патент США № 10/137391, поданной 3 мая 2002 (опубликованная заявка на патент США № 20030125526) и 10/476230, поданной 9 июня 2004 (опубликованная заявка на патент США № 20040254353) (WO 02/089597), которые все переуступлены патентовладельцу настоящего изобретения и содержание которых включено в настоящее изобретение как ссылки, описан способ получения белкового изолята, который имеет высокую степень чистоты, содержащий, по меньшей мере, около 100% (N×6,25). В способах, описанных в упомянутых выше заявках на патент США, белковый изолят, полученный в способе, в котором муку масличных семян экстрагируют водным раствором соли пищевого качества, полученный раствор экстрагированного белка, после начальной обработки обесцвечивающим адсорбентом, по желанию, концентрируют до содержания белка, по меньшей мере, приблизительно 200 г/л, и этот концентрированный раствор белка разбавляют холодной водой, что приводит к образованию белковых мицелл, которым дают отстояться с получением агрегатированной, слитой, плотной аморфной клейкой массы белкового изолята, похожей на клейковину, обозначенную термином «белковая мицеллярная масса», или БММ, которая отделяется от остаточной водной фазы и может использоваться как таковая или высушивается.
В одном варианте воплощения способа, описанного выше и, конкретно в заявках на патент США 10/137391 и 10/476230, надосадочную жидкость, полученную на стадии отстаивания БММ, обрабатывают, чтобы удалить белковый изолят, содержащий высушенный белок, из сырой БММ и надосадочные жидкости. Этот способ можно осуществить путем первоначального концентрирования надосадочной жидкости, используя ультрафильтрующие мембраны, смешивания концентрированной надосадочной жидкости с сырой БММ и сушки смеси. Полученный белковый изолят канолы имеет высокую степень чистоты, по меньшей мере, около 90%, предпочтительно, по меньшей мере, около 100% белка (N×6,25).
В другом варианте воплощения способа, описанного выше и, конкретно в заявках № 10/137391 и 10/476320, надосадочную жидкость, полученную при отстаивании БММ, обрабатывают, чтобы выделить белковый изолят из надосадочной жидкости. Этот способ можно осуществить путем первоначального концентрирования надосадочной жидкости, используя ультрафильтрующие мембраны, и сушки концентрата. Полученный белковый изолят канолы имеет высокую степень чистоты белка, по меньшей мере, около 90%, предпочтительно, по меньшей мере, около 100% (N×6,25).
Способы, описанные в вышеупомянутых заявках на патент США, по существу, представляют собой периодические способы. В одновременно рассматриваемой заявке на патент США № 10/298678 (подана 19 ноября 2002), которая переуступлена патентовладельцу настоящего изобретения и содержание которой включено в настоящее изобретение как ссылка, описан непрерывный способ получения белкового изолята канолы. В соответствии с этим способом, муку масличных семян канолы непрерывно смешивают с солевым раствором, смесь транспортируют по трубопроводу, в то время как экстрагируют белок из муки масличных семян канолы с образованием водного белкового раствора, полученный водный раствор белка непрерывно отделяется от остаточной муки масличных семян канолы, водный раствор белка непрерывно транспортируется через мембрану селективного разделения с целью повышения содержания белка в водном растворе белка, по меньшей мере, приблизительно до 200 г/л, при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора, полученный концентрированный раствор белка непрерывно смешивают с холодной водой, что приводит к образованию белковых мицелл, которым непрерывно дают отстояться, в то время как надосадочная жидкость непрерывно переливается через край, пока в отстойнике не накопится желательное количество БММ. Удаленная из отстойника БММ может быть высушена. Масса БММ имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, около 100 мас.%.
В таких способах белковый изолят канолы извлекают путем разбавления концентрированного раствора белка холодной водой для того, чтобы осадить БММ. Кроме того, белковый изолят канолы может быть дополнительно извлечен из надосадочной жидкости на стадии осаждения БММ.
Как описано в одновременно рассматриваемой заявке на патент США № 11/038,086 (опубликованная заявка на патент США № 20050181112) (WO 2005/067729), которая переуступлена патентовладельцу настоящего изобретения, и содержание которой включено в настоящее изобретение как ссылка, надосадочная жидкость со стадии осаждения БММ может быть подвергнута термообработке для того, чтобы вызвать осаждение белков 7S и 12S из надосадочной жидкости. Белок 2S, который извлекается при последующей термообработке надосадочной жидкости, обладает повышенной растворимостью в водных средах при различных значениях рН и может обеспечить лучшую прозрачность растворов безалкогольных напитков, таким образом, получаются прозрачные безалкогольные напитки, обогащенные белком.
Краткое изложение изобретения
Неожиданно в этом изобретении обнаружено, что, в случае подкисления концентрированного раствора белка канолы, осаждается белковый изолят канолы, который по составу аналогичен белковому изоляту канолы, полученному через БММ, и затем после выделения осажденного белкового изолята канолы, надосадочная жидкость может быть обработана с целью получения дополнительного белкового изолята канолы, который по составу аналогичен изоляту, полученному из надосадочной жидкости от осаждения БММ. Следовательно, этот способ представляет собой альтернативный способ получения белкового изолята канолы из концентрированного белкового раствора. Способ изоэлектрического осаждения обеспечивает то преимущество, что получается белковый изолят канолы, который облает существенно более высокой водосвязывающей способностью, чем произведенный из БММ белковый изолят.
В альтернативном способе согласно другому аспекту этого изобретения БММ может быть подвергнут изоэлектрическому осаждению путем повторного суспендирования БММ в водном растворе соли и подкисления образовавшегося раствора. Масса БММ может быть повторно суспендирована из влажной гранулы или из высушенного изолята, что менее предпочтительно. Таким способом получается изоэлектрически осажденный белковый изолят канолы, который обладает гораздо более высокой водосвязывающей способностью, чем БММ материал, который подвергнут изоэлектрическому осаждению.
В другом аспекте этого изобретения изоэлектрическое осаждение осуществляется до стадии концентрирования, и надосадочную жидкость от изоэлектрического осаждения обрабатывают с целью дополнительного извлечения из нее белкового изолята.
Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения разработан способ получения белкового изолята, который предусматривает: (а) экстракцию муки из семян масличных культур, для того чтобы вызвать солюбилизацию белка в указанной муке масличных семян с образованием водного белкового раствора, имеющего значение рН приблизительно от 5 до 6,8; (b) отделение водного белкового раствора от остаточной муки масличных семян; (с) подкисление водного раствора белка для того, чтобы осадить из него белковый изолят, имеющий содержание белка, по меньшей мере, 90 мас.% (N×6,25); и (d) выделение осажденного белкового изолята из надосадочной жидкости.
Настоящее изобретение конкретно относится к получению белкового изолята канолы. Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения разработан способ получения белкового изолята канолы, который заключается в: (а) экстракции муки масличных семян канолы, чтобы вызвать солюбилизацию белка канолы в муке масличных семян канолы и чтобы получить водный раствор белка, имеющий значение рН приблизительно от 5 до 6,8; (b) отделении водного раствора белка от остаточной муки масличных семян канолы; (с) подкислении водного раствора белка до значения рН приблизительно от 3 до 4 для того, чтобы осадить из него белковый изолят канолы, имеющий содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25) и содержащий преимущественно 7S белок канолы; и (d) отделении осажденного белкового изолята канолы из надосадочной жидкости.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения, разработан способ получения белкового изолята, который включает в себя (а) экстракцию муки масличных семян, чтобы вызвать солюбилизацию белка в муке масличных семян и чтобы получить водный раствор белка, имеющий значение рН приблизительно от 5 до 6,8; (b) отделение водного раствора белка от остаточной муки масличных семян; (с) увеличение концентрации белка водного раствора белка при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора с использованием технологии селективной мембраны для того, чтобы получить концентрированный белковый раствор; (d) разбавление концентрированного белкового раствора холодной водой, имеющей температуру приблизительно ниже 15°С, чтобы вызвать образование дискретных частиц белка в водном растворе в виде мицелл; (е) осаждение белковых мицелл с образованием аморфной, клейкой, студенистой, похожей на клейковину, белковой мицеллярной массы; (f) отделение белковой мицеллярной массы от надосадочной жидкости, причем белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, около 100 мас.% (N×6,25); (g) образование водного раствора белковой мицеллярной массы; (h) подкисление водного раствора белковой мицеллярной массы для того, чтобы осадить из него белковый изолят, имеющий содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, около 100 мас.% (N×6,25); и (i) выделение осажденного белкового изолята из надосадочной жидкости.
Белковый изолят канолы, полученный по способу настоящего изобретения, можно использовать в традиционных и новых областях применения белковых изолятов, таких как обогащение белком обработанных пищевых продуктов, для эмульгирования масел, в качестве текстурообразователей в хлебобулочных изделиях и пенообразователей в производстве взбитых продуктов. Кроме того, белковый изолят можно формовать в виде белковых волокон для производства аналогов мяса; этот изолят можно использовать в качестве заменителя яичного белка или наполнителя в пищевых продуктах, в которых яичный белок применяется как связующий агент. Как будет видно из данных, приведенных ниже, изоэлектрически осажденный белковый изолят канолы находит конкретное применение в качестве водного связующего/загустителя. Белковый изолят канолы, произведенный из надосадочной жидкости, находит конкретное применение в подкисленных напитках, в том числе в прозрачных, обогащенных белком, безалкогольных напитках. Белковый изолят канолы может использоваться также как питательная добавка. К другим сферам применения белкового изолята канолы относятся корма для домашних и сельскохозяйственных животных, промышленная переработка, производство косметических изделий и индивидуальных средств ухода.
Подробное описание изобретения
Начальной стадией способа выделения белкового изолята канолы является солюбилизация белкового материала из муки семян масличных культур, в частности из муки семян канолы, хотя этот способ может быть применен для обработки муки из семян других масличных культур, таких как соевой, традиционной рапсовой муки, традиционной льняной дробины, Linola®, муки из масличных семян подсолнечника и горчицы. Более конкретно, описание этого изобретения относится к муке из семян канолы.
Белковый материал, выделенный из муки семян канолы, может представлять собой нативный белок семян канолы или белковый материал может представлять собой генетически модифицированный белок, который, однако, обладает характерными гидрофобными и полярными свойствами нативного белка. Мука из семян канолы также известна под названием рапсовой муки или муки из семян рапса.
Наиболее эффективно стадия солюбилизации белка осуществляется с использованием раствора пищевой соли, так как в присутствии соли усиливается удаление растворимого белка из муки масличных семян. Когда белковый изолят канолы предназначается для непищевого применения, то могут быть использованы технические, непищевые химикаты. Пищевой солью обычно является хлорид натрия, хотя можно использовать и другие соли, такие как хлорид калия. Ионная сила раствора пищевой соли составляет, по меньшей мере, приблизительно 0,05, предпочтительно, по меньшей мере, около 0,1, для того чтобы обеспечить эффективную солюбилизацию значительного количества белка. С увеличением ионной силы раствора соли степень солюбилизации белка из муки масличных семян сначала повышается, пока не достигнет максимального значения. Однако последующее увеличение ионной силы не увеличивает общее количество солюбилизированного белка. Ионная сила раствора пищевой соли, которая обеспечивает максимальную степень солюбилизации белка, изменяется в зависимости от вида соли и выбранного источника белка.
В водном растворе пищевой соли может присутствовать антиоксидант. Этим антиоксидантом может быть любой подходящий антиоксидант, такой как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта, используемого на стадии солюбилизации, может изменяться приблизительно от 0,01 до 1 мас.%, предпочтительно около 0,05 мас.%. Назначением антиоксиданта является ингибирование окисления фенолов, присутствующих в водном растворе белка.
В периодическом способе солевая солюбилизация белка осуществляется при температуре, по меньшей мере, около 5°С и предпочтительно, приблизительно вплоть до 35°С, предпочтительно способ сопровождается перемешиванием с целью уменьшения продолжительности солюбилизации, которая обычно составляет приблизительно от 10 до 60 минут. Предпочтительно солюбилизацию осуществляют таким образом, чтобы экстрагировать, по существу, максимальное количество белка из муки масличных семян для того, чтобы обеспечить высокий суммарный выход продукта.
Нижний диапазон температуры около 5°С выбран, поскольку ниже этой температуры солюбилизация протекает нецелесообразно медленно, в то же время верхний предпочтительный диапазон температуры около 35°С выбран, поскольку при более высокой температуре периодический режим способа становится неэкономичным.
В непрерывном способе экстракция белка из муки масличных семян канолы проводится любым способом, который совместим с проведением непрерывной экстракции белка из муки масличных семян канолы. В одном варианте осуществления муку масличных семян канолы непрерывно смешивают с солевым раствором, и смесь транспортируют по трубопроводу или трубе такой длины и при такой скорости потока, чтобы время пребывания было достаточным для проведения желательной степени экстракции в соответствии с параметрами, описанными в настоящем изобретении. В таком непрерывном способе стадия солевой солюбилизации осуществляется быстро, приблизительно в течение 10 минут, предпочтительно с целью проведения солюбилизации для экстракции практически максимального количества белка из муки масличных семян канолы. Предпочтительно, солюбилизация в непрерывном режиме осуществляется при повышенной температуре, предпочтительно, приблизительно выше 35°С, обычно приблизительно до 65°С или выше.
Водный раствор соли и мука из масличных семян канолы имеют природный показатель рН приблизительно от 5 до 6,8. Предпочтительны значения рН приблизительно от 5,3 до 6,2.
В случае необходимости, величину рН раствора пищевой соли можно устанавливать на любом желаемом уровне в диапазоне приблизительно от 5 до 6,8 для использования на стадии экстракции с помощью любой подходящей пищевой кислоты, обычно соляной кислоты, или пищевой щелочи, обычно гидроксида натрия. В случае предполагаемого использования белкового изолята канолы не в качестве продукта питания могут быть использованы непищевые химикаты.
Концентрация муки масличных семян в растворе пищевой соли на стадии солюбилизации может варьироваться в широких пределах. Обычные значения концентрации составляют приблизительно от 5% до 15% (мас./об.).
Стадия экстракции белка водным раствором соли производит дополнительный эффект, способствуя солюбилизации жиров, которые могут присутствовать в муке канолы, что впоследствии приводит к наличию жиров в водной фазе.
Белковый раствор, образовавшийся на стадии экстракции, обычно имеет концентрацию белка приблизительно от 5 до 40 г/л, предпочтительно приблизительно от 10 до 30 г/л.
Затем образовавшаяся на стадии экстракции водная фаза может быть отделена от остальной муки из семян канолы любым подходящим для этой цели способом, например, с использованием декантирующей центрифуги с последующим дисковым центрифугированием и/или путем фильтрации для удаления остаточной муки. Отделенная остаточная мука может быть высушена для дальнейшего использования.
Цвет готового белкового изолята канолы можно улучшить, с целью получения более светлой и менее интенсивной желтой окраски, путем смешивания с порошкообразным активированным углем или другим веществом, адсорбирующим пигменты выделенного водного белкового раствора, с последующим удалением адсорбентов, обычно путем фильтрации, с получением белкового раствора. Удаление пигментов можно проводить также с использованием диафильтрации выделенного водного белкового раствора до или после концентрирования, как описано ниже.
Указанную стадию удаления пигментов из выделенного водного белкового раствора можно проводить в любых удобных условиях, обычно при комнатной температуре с использованием любого подходящего адсорбента пигментов. С этой целью используется порошкообразный активированный уголь, в количестве приблизительно от 0,025% до 5% (мас./об.), предпочтительно приблизительно от 0,05% до 2% (мас./об.).
Если мука из семян канолы содержит значительное количество жира, как описано в указанных выше патентах США 5844006 и 6005076, то могут быть проведены описанные в этих патентах стадии обезжиривания выделенного водного белкового раствора и концентрированного водного белкового раствора, как рассмотрено ниже. При проведении стадии улучшения цвета продукта такую стадию можно проводить после первой стадии обезжиривания.
В качестве альтернативы экстракции муки из семян масличных культур водным раствором пищевой соли может служить экстракция муки чистой водой, хотя использование одной воды приводит к извлечению меньшего количества белка из муки масличных семян, чем при использовании водного раствора пищевой соли. При использовании указанного альтернативного способа, пищевую соль в указанной выше концентрации можно добавлять к белковому раствору после его отделения от остаточной муки масличных семян, для того чтобы белок оставался в растворе в ходе описанной ниже стадии концентрирования. Если проводится стадия удаления пигмента и/или первая стадия обезжиривания, то пищевую соль обычно добавляют после завершения указанных операций.
Затем, водный раствор белка концентрируют с целью повышения концентрации белка в этом растворе при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора. Стадия концентрирования проводится таким образом, чтобы получить концентрированный белковый раствор, имеющий концентрацию белка, по меньшей мере, приблизительно между 10 и 300 г/л или выше, предпочтительно приблизительно от 50 до 100 г/л.
Стадия концентрирования может быть осуществлена любым подходящим способом, совместимым с периодическим или непрерывным режимом работы, например, с использованием любой подходящей технологии селективных мембран, такой как ультрафильтрация или диафильтрация с использованием мембран, таких как мембран из полых волокон или свернутых в виде спиралей, с соответствующей молекулярной массой отсечки, такой как приблизительно от 3000 до 100000 ед. Дальтона (Д), предпочтительно приблизительно от 5000 до 10000 Д, с учетом использования различных материалов и конфигураций мембран, и непрерывного режима работы, масштабированных для обеспечения заданной степени концентрирования водного раствора белка при прохождении сквозь мембраны.
Затем концентрированный белковый раствор может быть подвергнут обработке на стадии диафильтрации с использованием водного раствора соли при таких же значениях молярности и рН, как и при экстракции раствора. Указанная диафильтрация может быть осуществлена с использованием приблизительно от 2 до 20 объемов диафильтрационного раствора, предпочтительно приблизительно от 5 до 10 объемов диафильтрационного раствора. В ходе операции диафильтрации из водного раствора белка удаляются дополнительные количества примесей, которые проходят через мембрану с растворенным веществом (пермеатом). Операция диафильтрации может быть осуществлена до тех пор, пока в пермеате не будут наблюдаться существенные дополнительные количества фенолов и видимое окрашивание. Такая диафильтрация может быть осуществлена с использованием мембран, с соответствующей молекулярной массой отсечки в диапазоне приблизительно от 3000 до 100000 ед. Дальтона, предпочтительно приблизительно от 5000 до 10000 Д, с учетом использования различных материалов и конфигураций мембран.
В среде диафильтрации может присутствовать антиоксидант, по меньшей мере, частично на стадии диафильтрации. Этот антиоксидант может быть любым подходящим антиоксидантом, таким как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта, используемого в среде диафильтрации, зависит от применяемых материалов и может изменяться приблизительно от 0,01% до 1 мас.%, предпочтительно приблизительно 0,05 мас.%. Антиоксидант используется для ингибирования окисления фенолов, присутствующих в концентрированном растворе белкового изолята канолы.
Стадии концентрирования и диафильтрации могут быть осуществлены при любой подходящей температуре, обычно приблизительно от 20° до 60°С, предпочтительно приблизительно от 20° до 30°С, в течение времени, достаточного для осуществления желательной степени концентрирования. Температура и другие применяемые условия в некоторой степени зависят от мембранного оборудования, использованного для проведения концентрирования, и от желательной концентрации белка в растворе.
Как хорошо известно, в способе ультрафильтрации и аналогичных технологий селективных мембран сквозь мембрану могут проходить соединения с пониженной молекулярной массой и в то же время задерживаются соединения с повышенной молекулярной массой. Эти низкомолекулярные частицы включают в себя не только ионные частицы пищевых солей, но также и низкомолекулярные материалы, экстрагированные из исходного материала, такие как углеводы, пигменты и антипищевые факторы, а также любые низкомолекулярные формы белков. Проницаемость мембран (точка отсечки) для соединений с различной молекулярной массой обычно выбирается таким образом, чтобы обеспечить сохранность значительной части белка в растворе при свободном прохождении примесей сквозь мембрану, с учетом использования различных материалов и конфигураций мембран.
В случае необходимости, концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор может быть подвергнут дополнительной обезжиривающей обработке, как описано в патентах США № 5844086 и 6005076.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор может быть подвергнут обесцвечивающей обработке в качестве альтернативы описанной выше операции удаления окрашенных примесей. С этой целью может быть использован порошкообразный активированный углерод, а также гранулированный активированный углерод (ГАУ). Другим материалом, который может быть использован в качестве адсорбента окрашенных примесей, является поливинилпирролидон.
Стадия обработки адсорбентом окрашенных примесей может быть проведена в любых подходящих условиях, обычно при температуре окружающей среды белкового раствора канолы. Порошкообразный активированный углерод может быть использован в количестве приблизительно от 0,025% до 5% (вес./об.), предпочтительно приблизительно от 0,05% до 2% (вес./об.). Когда в качестве адсорбента окрашенных примесей используется поливинилпирролидон, он может быть использован в количестве приблизительно от 0,5% до 5% (вес./об.), предпочтительно приблизительно от 2% до 3% (вес./об.). Адсорбент окрашенных примесей можно удалить из раствора белка канолы с использованием любого подходящего средства, например, с помощью фильтрации.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор, образовавшийся на необязательной стадии удаления окрашивания, может быть подвергнут пастеризации с целью уничтожения любых бактерий, которые могут присутствовать в исходной муке в результате хранения или иначе и экстрагироваться из муки в раствор белкового изолята канолы на стадии экстракции. Такая пастеризация может быть осуществлена в любых желательных условиях пастеризации. Обычно концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор нагревают до температуры приблизительно от 55° до 70°С, предпочтительно приблизительно от 60° до 65°С, приблизительно в течение от 10 до 15 минут, предпочтительно около 10 минут. Затем пастеризованный концентрированный белковый раствор может быть охлажден для дальнейшей обработки, как описано ниже, предпочтительно до температуры приблизительно от 25° до 40°С.
Оптимальная концентрация белка в концентрированном, и необязательно диафильтрованном, и необязательно пастеризованном водном растворе белка составляет приблизительно от 5 до 10 мас.%, поскольку более высокие концентрации повышают вязкость смеси, что затрудняет равномерное подкисление раствора и выделение твердых частиц, осажденных на стадии подкисления. Эта оптимальная концентрации белка может быть достигнута путем концентрирования водного раствора белка до необходимой концентрации, или путем концентрирования водного раствора белка до более высокой концентрации приблизительно от 20 до 25 мас.% или выше, с последующим разбавлением концентрированного белкового раствора приблизительно в диапазоне от 5 до 10 мас.% водным раствором пищевой соли.
Для осуществления изоэлектрического осаждения, предусмотренного в изобретении, концентрированный, и необязательно диафильтрованный, и необязательно пастеризованный белковый раствор должен иметь проводимость, по меньшей мере, приблизительно 1 мСи (миллиСименс), предпочтительно приблизительно от 10 до 20 мСи.
Затем концентрированный, и необязательно диафильтрованный, и необязательно пастеризованный белковый раствор подкисляют при температуре приблизительно от 10 до 70°С, предпочтительно приблизительно от 20 до 40°С; до значения рН приблизительно от 3,0 до 4,0, предпочтительно около 3,5, с использованием любой подходящей кислоты, такой как хлористоводородная кислота, чтобы вызвать осаждение белкового изолята канолы. Полученный осадок, отделенный от надосадочной жидкости, может быть высушен с использованием любой подходящей методики, такой как распылительная сушка, лиофильная сушка или вакуумная сушка в барабане, с целью получения белкового изолята канолы. Высушенный белковый изолят канолы, полученный изоэлектрическим осаждением (IP), имеет высокое содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25), предпочтительно по меньшей мере, около 100 мас.%.
По желанию, стадия изоэлектрического осаждения может быть осуществлена с раствором белка канолы, без проведения стадии концентрирования. До стадии изоэлектрического осаждения могут быть осуществлены одна или несколько описанных выше необязательных стадий обесцвечивания, диафильтрации и пастеризации раствора белка канолы. Осажденный белковый изолят канолы извлекается из надосадочной жидкости и высушивается.
После изоэлектрического осаждения надосадочная жидкость содержит существенное количество белка канолы, не осажденного на стадии осаждения, и эту жидкость обрабатывают с целью извлечения белкового изолята канолы преимущественно в виде 2S белка. Надосадочная жидкость со стадии подкисления, после удаления изоэлектрического осадка, может быть концентрирована с целью повышения концентрации белка в ней. Такое концентрирование осуществляется с использованием любой подходящей технологии селективной мембраны, такой как ультрафильтрация, использование мембран с соответствующей отсечкой по молекулярной массе, обеспечивающих проницаемость низкомолекулярных частиц, включая соль и другие небелковые низкомолекулярные вещества, экстрагированные из исходного белкового материала, но удерживающих белок канолы в растворе. Можно использовать ультрафильтрационные мембраны с величиной отсечки по молекулярной массе приблизительно от 3000 до 100000 ед. Д, предпочтительно приблизительно от 5000 до 10000 ед. Д, в зависимости от материала и конфигурации мембран. Кроме того, концентрирование надосадочной жидкости указанным способом позволяет снизить объем жидкости, который необходимо удалить в способе сушки и извлечения белка. Обычно надосадочная жидкость концентрируется перед сушкой до содержания белка приблизительно от 100 до 400 г/л, предпочтительно приблизительно от 200 до 300 г/л. Такой способ концентрирования жидкости может быть осуществлен в периодическом или в непрерывном режиме, как описано выше для стадии концентрирования белкового раствора.
Концентрированная надосадочная жидкость может быть обработана на стадии диафильтрации с использованием воды в качестве экстракционной жидкости, с целью удаления соли и других примесей из концентрированной надосадочной жидкости. Такая диафильтрация может быть осуществлена с использованием от приблизительно от 2 до 20 объемов воды, предпочтительно приблизительно от 5 до 10 объемов воды. Такая диафильтрация может быть осуществлена с использованием мембраны, имеющей величину отсечки по молекулярной массе приблизительно от 3000 до 100000 ед. Д, предпочтительно приблизительно от 5000 до 10000 ед. Д, в зависимости от материала и конфигурации мембран.
По меньшей мере, частично на стадии диафильтрации в диафильтрационной среде может присутствовать антиоксидант. Этот антиоксидант может быть любым подходящим антиоксидантом, таким как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта, использованного в диафильтрационной среде, может изменяться приблизительно от 0,01 до 1 мас.%, предпочтительно около 0,05 мас.%.
Концентрированная и необязательно диафильтрованная надосадочная жидкость может быть высушена по любой подходящей методике, такой как распылительная сушка, лиофильная сушка или вакуумная сушка в барабане, чтобы получить дополнительно белковый изолят канолы в сухом виде. Такой дополнительный белковый изолят канолы имеет высокое содержание белка, приблизительно больше, чем 90 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, около 100 мас.% белка (рассчитано с определением азота по Кьельдалю, N×6,25).
По желанию, надосадочная жидкость может быть подвергнута термической обработке на стадии, как описано в упомянутой выше заявке на патент США № 11/038086 для того, чтобы вызвать осаждение из надосадочной жидкости 7S белка и любого присутствующего 12S белка, с целью извлечения 2S белкового изолята, имеющего повышенную долю 2S белка.
Такая термическая обработка может быть осуществлена с использованием температуры и периода времени, которые достаточны для снижения доли 7S белка, присутствующего в концентрированной надосадочной жидкости, предпочтительно с целью снижения доли 7S белка в существенной степени. Обычно за счет термической обработки содержание 7S белка в надосадочной жидкости снижается, по меньшей мере, приблизительно на 50 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 75 мас.%. Обычно термическая обработка может быть осуществлена при температуре приблизительно от 70° до 100°С, предпочтительно от 75° до 95°С, приблизительно в течение 2-30 минут, предпочтительно приблизительно от 5 до 15 минут. Осажденный 7S белок может быть удален любым подходящим способом, таким как центрифугирование или фильтрация.
Операция термической обработки может быть осуществлена до концентрирования надосадочной жидкости, но предпочтительно после стадии концентрирования. Стадия термической обработки может быть осуществлена с надосадочной жидкостью, полученной на стадии изоэлектрического осаждения, или может быть осуществлена после регулирования величины рН надосадочной жидкости с целью снижения кислотного числа, поскольку 7S и 12S белки обладают большей склонностью к разрушению и, следовательно, к осаждению при меньшей кислотности среды. Величина рН надосадочной жидкости может быть доведена до рН приблизительно от 5 до 6,8, предпочтительно приблизительно от 5,8 до 6,2. Такое регулирование рН может быть осуществлено с использованием любого подходящего подщелачивающего агента, такого как водный раствор гидроксида натрия. После такой термической обработки можно установить более кислотное значение рН, предпочтительно в диапазоне приблизительно от 5 до 10 мас.%.
Кроме того, надосадочная жидкость до концентрирования или после концентрирования, и/или предварительной термической обработки или последующей термической обработки, может быть подвергнута операции обесцвечивания с целью улучшения цвета конечного продукта, в качестве альтернативы или как дополнительной стадии к процедуре обесцвечивания, описанной выше, с использованием любого подходящего агента, поглощающего пигмент, такого как порошкообразный активированный углерод, гранулированный активированный углерод и/или поливинилпирролидон, в описанных выше количествах.
По желанию, по меньшей мере, часть влажного изоэлектрического осадка может быть объединена, по меньшей мере, с частью концентрированной надосадочной жидкости, до сушки объединенных потоков белка по любой подходящей методике, чтобы получить комбинированную композицию белкового изолята канолы. Относительные количества смешанных вместе белковых материалов могут быть выбраны таким образом, чтобы обеспечить получение композиции белкового изолята канолы, имеющей желательный профиль 2S/7S/12S белков. Альтернативно, высушенные белковые изоляты могут быть объединены в любых желательных пропорциях с целью получения смеси с любым желательным профилем конкретных 2S/7S/12S белков. Комбинированная композиция белкового изолята канолы имеет высокое содержание белка, приблизительно более 90 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, около 100 мас.%, (рассчитано с определением азота по Кьельдалю, N×6,25).
В другом альтернативном способе, где только часть концентрированной надосадочной жидкости смешивают только с частью изоэлектрического осадка, причем оставшуюся смесь высушивают, остаток концентрированной надосадочной жидкости может быть высушен, как любой остаток изоэлектрического осаждения. Кроме того, высушенный изоэлектрический осадок и высушенная надосадочная жидкость также может быть подвергнута сухому смешению в любых желательных относительных долях, как рассмотрено выше.
В результате таких приемов можно извлечь ряд белковых изолятов канолы, в виде высушенного изоэлектрического осадка, высушенной надосадочной жидкости и высушенных смесей с различными весовыми соотношениями белкового изолята канолы, произведенного изоэлектрическим осаждением, и белкового изолята канолы, произведенного из надосадочной жидкости, обычно приблизительно от 5:95 до 95:5 по весу, что может быть желательным для достижения различных функциональных и питательных характеристик, на основе различных пропорций 2S/7S/12S белков в композициях.
Как отмечено ранее, белок канолы, произведенный изоэлектрическим осаждением, имеющий содержание белка по меньшей мере, около 90 мас.% (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, около 100 мас.%, может быть получен из БММ, произведенной путем разбавления концентрированного, и необязательно диафильтрованного, и необязательно пастеризованного белкового раствора в соответствии с приемами в упомянутых выше заявках на патенты США № 10/137391 и 10/476630,
Массу БММ, предпочтительно в сыром виде, но возможно и в высушенном виде, солюбилизируют в растворе пищевой соли, таком как раствор хлорида натрия, имеющий ионную силу, по меньшей мере, приблизительно 0,05, предпочтительно, по меньшей мере, около 0,1, предпочтительно при температуре окружающей среды, хотя могут быть использованы повышенные температуры, с образованием водного белкового раствора, обычно имеющего концентрацию белка приблизительно от 1 до 30 мас.% или выше, предпочтительно приблизительно от 5 до 10 мас.%. Затем полученный водный раствор белка обрабатывают на стадии изоэлектрического осаждения, как описано выше.
Кроме того, как описано выше и как показано ниже в Примерах, изоэлектрически осажденный белковый изолят канолы обладает гораздо большей водосвязывающей способностью, чем белковый изолят канолы, произведенный из БММ. Применение этого способа позволяет получать высокорастворимый белковый изолят канолы, который представляет собой белковый изолят канолы, произведенный из надосадочной жидкости на стадии осаждения БММ, и белковый изолят канолы с высокой водосвязывающей способностью путем превращения БММ в изоэлектрический осадок.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Этот пример демонстрирует получение белкового изолята канолы в соответствии с одним вариантом воплощения изобретения.
Муку масличных семян канолы (150 кг) добавляют к 1000 л 0,1-молярного раствора хлорида натрия (NaCl) при 60°С и перемешивают в течение 5 минут, чтобы получить водный раствор белка.
Объем осветленного белкового раствора канолы, имеющего содержание белка 16,8 г/л, уменьшают до 60 л за счет концентрирования при 60°С в системе ультрафильтрации, с использованием поливинилидендифторидной (PVDF) и полиэфирсульфоновых (PES) мембран, имеющих значения отсечки по молекулярной массе соответственно 5000 и 10000 ед. Дальтона (ретентат UF1). Затем ультрафильтрованный раствор белка канолы подвергают диафильтрации (5 раз) при 60°С в диафильтрационной системе с использованием мембран PVDF и PES, имеющих значения отсечки по молекулярной массе соответственно 5000 и 10000 ед. Дальтона, с использованием 0,1 М раствора NaCl, содержащего 0,05 мас.% аскорбиновой кислоты, до конечного объема 45 литров, с содержание белка 174,7 г/л.
Образец (4 л) концентрированного и диафильтрованного раствора белка канолы (ретентат UF1) объединяют с 12 литрами 0,1 М раствора NaCl, доводя концентрацию белка до 46,8 г/л. В разбавленный раствор добавляют концентрированную HCl-кислоту при 22°С, до значения рН подкисленного раствора белка канолы, равного 3,5, чтобы вызвать изоэлектрическое осаждение.
Помутневшему образцу дают отстояться в течение 15 минут. Затем образец подвергают центрифугированию, при загрузках 4×1 литр, при ускорении 7100 g в течение 15 минут, чтобы отделить осадок. Собранный осадок (IEP) отделяется от надосадочной жидкости и подвергается лиофильной сушке. Установлено, что высушенный осадок (С302) имеет содержание белка 102,43 мас.% (N×6,25), сухая масса (Процент белка определен с использованием анализатора азота LECO FP 328 Nitrogen Determinator).
Приблизительно 16 л надосадочной жидкости после центрифугирования (надосадочная жидкость) концентрируют до объема 3 л в системе ультрафильтрация (UF2) с использованием мембраны PES, имеющей отсечку по молекулярной массе 100000 ед. Дальтона. Затем концентрированную надосадочную жидкость подвергают диафильтрации в диафильтрационной системе, используя PES мембрану, имеющую отсечку по молекулярной массе 100000 ед. Дальтона, с 9 объемами воды до конечного объема 3,5 л, с содержанием белка 72,1 г/л. Белковый раствор подвергают сушке распылением.
Найдено, что высушенный белок (С202) имеет содержание белка 104,05 мас.% (N×6,25), сухая масса
Пример 2
В этом примере описано получение образов белкового изолята канолы по методике упомянутой выше заявки на патент США № 10/137391.
Муку канолы "а" килограмм добавляют к "b" литрам 0,1 М раствора NaCl при 60°С, и непрерывно экстрагируют при времени выдерживания 5 минут, чтобы получить водный раствор белка. Остаток муки канолы удаляют, и полученный белковый раствор осветляют путем центрифугирования и фильтрации, получая "с" литров отфильтрованного белкового раствора, имеющего содержание белка "d" % по массе.
Объем аликвоты белкового экстракционного раствора в "е" литров уменьшают до объема "f" литров путем концентрирования в ультрафильтрационной системе, используя мембраны PVDF и PES, имеющие отсечки по молекулярной массе соответственно 5000 и 10000 ед. Дальтона, и затем подвергают диафильтрации с "g" литрами 0,1М раствора NaCl, содержащего 0,05% аскорбиновой кислоты. Полученный концентрированный белковый раствор имеет содержание белка "h" % по массе.
Концентрированный раствор (меньшая часть, удаленная для изоэлектрического осаждения) при температуре "i"°С разбавляют "j" раз холодной обратноосмотической водой, имеющей температуру "k" °С. Сразу образуется белый сгусток, которому дают осадиться. Верхний слой разбавляющей воды удаляют, а осажденную, вязкую, липкую массу (БММ) извлекают со дна сосуда с выходом "i" мас.% в расчете на отфильтрованный белковый раствор. Найдено, что высушенный белок, произведенный из БММ, имеет содержание белка "m"% (N×6,25), сухая масса. Этому продукту дано обозначение "n" (C300).
Значения параметров от "а" до "n" приведены в следующей Таблице I:
| Таблица I | ||
| n | BW-AL022-H23-04A | BW-AL022-L15-04A |
| а | 150 | 22,5 |
| b | 1000 | 150 |
| с | 847 | 95 |
| d | 1,68 | 2,01 |
| е | 847 | 95 |
| f | 60 | 5 |
| g | 300 | 25 |
| h | 17,47 | 21,85 |
| i | 29,6 | 30 |
| j | 1:10 | 1:10 |
| k | 2,4 | 3 |
| l | 33,24 | 41,88 |
| m | 105,45 | 106,67 |
Объем удаленной разбавляющей воды уменьшают до "о" литров путем ультрафильтрации с использованием PES мембраны, имеющей отсечку по молекулярной массе 10000 ед. Дальтона. Концентрат содержит "р" % белка по массе. Вместе с количеством белка, выделенным из надосадочной жидкости, суммарное извлечение белка из отфильтрованного белкового раствора составляет "q" мас.%. Концентрат подвергают распылительной сушке, чтобы получить конечный продукт, которому дано обозначение "n" (C200), имеющий содержание белка "r"% (N×6,25), сухая масса
Значения параметров от "n" до "r" приведены в следующей Таблице II.
| Таблица II | |
| n | BW-AL022-H23-04A |
| o | 23,5 |
| p | 7,27 |
| q | 45,26 |
| r | 98,99 |
Пример 3
В этом Примере приведены результаты анализа белковых изолятов, полученных путем изоэлектрического осаждения (С302) и из образовавшейся надосадочной жидкости (С202).
Изоэлектрический осадок, полученный в способе Примера 1, не растворяется в воде, и поэтому его белковый профиль нельзя определить методом ЖХВР (жидкостной хроматографии высокого разрешения). Однако анализ ЖХВР для 12S, 7S и 2S белков канолы проведен на материалах, предоставленных на некоторых стадиях способа, и результаты суммированы в следующей Таблице III. Белковые профили выражены в процентах от общей площади пиков, отнесенных к белкам.
| Таблица III | |||
| Белковый профиль различных фракций | |||
| Образец | %12S | %7S | %2S |
| Отрегулированный UF 1 ретентат | 7,9 | 82,6 | 9,6 |
| IEP осадок | Анализ невозможен | ||
| IEP надосадочная жидкость | 0,6 | 11,2 | 88,2 |
| Концентрированная и диафильтрованная IEP надосадочная жидкость | 1,0 | 18,6 | 80,4 |
| IEP UF 2 композиционный пермеат | Не содержит белка | ||
| IEP UF 2 диафильтрационные пермеаты | Не содержат белка | ||
| С302 | Анализ невозможен | ||
| С202 | 1,1 | 17,2 | 81,7 |
Как можно видеть из этих данных, изоэлектрическое осаждение вызывает сильное снижение доли 12S и 7S белков в растворе. Полагают, что эти частицы осаждены, однако при малых значениях рН среды происходит диссоциация 12S и 7S белков до субъединиц меньшего размера, которые при элюировании перекрываются с пиком 2S белка.
Для лучшего понимания состава продуктов был проведен качественный анализ продуктов AL022-H23-04A методом гель-электрофореза SDS-PAGE. Продукт С302 не обладает полной растворимостью в буфере электрофореза, и поэтому часть образца не поступает в гель и остается в исходном образце. В разрешенных полосах для продукта С302 в основном обнаружено наличие 7S/12S, при пониженной концентрации 2S белка, аналогичная картина наблюдалась при анализе С300. Оба продукта С202 и С200 полностью растворимы, и поэтому их можно надежно сопоставить. Оказалось, что доля 7S/12S, оставшаяся в продукте С202, выше, чем доля, обнаруженная в С200. Это противоречит результатам анализа ЖХВР, и подтверждает предположение о том, что при анализе ЖХВР, часть разложенных белков 7S/12S элюируется совместно с 2S. Результаты ЖХВР анализа приведены в следующей Таблице IV:
| Таблица IV | |||
| Белковый профиль (ЖХВР) изолятов, произведенных из надосадочной жидкости | |||
| Образец | %12S | %7S | %2S |
| С202 (Пример 1) | 1,1 | 17,2 | 81,7 |
| С200 (Пример 1) | 1,2 | 25,1 | 73,7 |
Цвет изолятов С302 и С202 является довольно темным, но все же похожим на соответствующие продукты С300 и С200, полученные, как описано в Примере 2. Результаты, полученные с использованием колориметра Minota CR310, сочлененного с сбором данных DP301, приведены в следующей Таблице V:
| Таблица V | |||
| Лабораторные данные цветности продуктов С302 и С202 | |||
| Образец | L | а | b |
| С302 | 63,53 | 2,44 | 19,63 |
| С300 | 66,57 | 2,09 | 22,17 |
| С202 | 74,27 | 1,62 | 16,66 |
| С200 | 73,79 | 1,69 | 17,68 |
Пример 4
В этом Примере сопоставляется растворимость белка, полученного путем изоэлектрического осаждения (С302), и белка, полученного из надосадочной жидкости (С202) в соответствии с Примером 1, с продуктами, произведенными из БММ (С300) и из надосадочной жидкости от осаждения БММ (С200), произведенных по методике Примера 2.
Растворимость определяют с использованием методики на основе публикации Моrr и др., J. Food Sci., том 50, с.1715-1718. Взвешивают в стакане достаточное количество белкового порошка для того, чтобы получить 0,5 г белка, и затем добавляют небольшое количество воды, очищенной обратным осмосом, и смесь перемешивают до образования однородной пасты. Затем еще добавляют воду, доводя объем приблизительно до 45 мл, затем содержимое стакана медленно перемешивают в течение 60 минут, используя магнитную мешалку.
Значение рН каждого образца определяют сразу после диспергирования белка и доводят до 4, 5, 6 или 7, используя NaOH или НСl. Измеряют значение рН и дважды корректируют в течение 60 минут перемешивания. По окончании перемешивания суммарный объем образца доводят до 50 мл, добавляя обратноосмотическую воду и получая дисперсию 1% (вес./об.) белка. Оставляют аликвоту белковой дисперсии для определения содержания белка. Другую часть образца центрифугируют при ускорении 8000 g в течение 10 минут, что приводит к осаждению всех нерастворенных материалов, и получается прозрачная надосадочная жидкость. Затем определяют содержание белка в надосадочной жидкости и растворимость рассчитывают следующим образом:
Растворимость (%) = (концентрация белка в надосадочной жидкости/концентрация белка в исходной дисперсии)×100
Кроме того, растворимость образцов С302 и С202 в 0,1 М растворе NaCl определяют с использованием описанной выше методики, заменяя воду рассолом.
Растворимости образца С302 в воде и в 0,1 М растворе NaCl, а также образца С300 в воде приведены соответственно в следующих Таблицах VI и VII:
| Таблица VI | ||
| Растворимость в воде для образцов С302 и С300 | ||
| рН | Растворимость С302 (%) | Растворимость С300 (%) |
| 4 | 8,7 | 83,0 |
| 5 | 10,4 | 63,5 |
| 6 | 6,3 | 18,3 |
| 7 | 8,1 | 84,6 |
| Таблица VII | |
| Растворимость продукта С302 в 0,1 М растворе NaCl | |
| рН среды | Растворимость (%) |
| 4 | 0 |
| 5 | 1,5 |
| 6 | 8,0 |
| 7 | 3,8 |
Как можно увидеть из этих Таблиц, растворимость образца С302 как в воде, так и в 0,1 М растворе соли является низкой, независимо от рН среды. Растворимость образца С302 в воде была гораздо хуже, чем для образца С300.
Растворимости образца С202 в воде и в 0,1 М растворе NaCl, а также образца С200 в воде приведены соответственно в следующих Таблицах VIII и IX:
| Таблица VIII | ||
| Растворимость в воде для образцов С202 и С200 | ||
| рН | Растворимость С202(%) | Растворимость С200(%) |
| 4 | 91,6 | 100,0 |
| 5 | 95,6 | 97,8 |
| 6 | 54,1 | 97,7 |
| 7 | 46,9 | 95,0 |
| Таблица IX | |
| Растворимость С202 в 0,1 М растворе NaCl | |
| рН | Растворимость (%) |
| 4 | 70,8 |
| 5 | 65,9 |
| 6 | 66,0 |
| 7 | 67,2 |
Как можно увидеть из этих данных, растворимость для образца С202 гораздо выше, чем для образца С302. Растворимость образца С202 в воде сопоставима с растворимостью образца С200 при рН 4 и 5, но хуже при рН 6 и 7.
Пример 5
Этот Пример иллюстрирует пенообразующие свойства образцов С302 и С202 белкового изолята канолы, полученных в соответствии с методикой Примера 1, в сопоставлении со свойствами образцов С300 и С200 белкового изолята канолы, полученных в соответствии с методикой Примера 2.
Взвешивают в стакане достаточное количество белкового порошка для того, чтобы получить 7,5 г белка. Добавляют небольшое количество 0,075 М раствора NaCl к белковому порошку и перемешивают, чтобы получить пасту. Затем добавляют достаточное количество раствора соли, доводя объем приблизительно до 140 мл, и смесь перемешивают магнитной мешалкой. Скорость перемешивания регулируют таким образом, чтобы избежать образования пены. Через 10 минут перемешивания доводят значение рН раствора до 7, используя NaOH или НСl, по необходимости. Затем смесь перемешивают дополнительно в течение 10 минут и корректируют значение рН. Затем объем образца доводят до 150 мл, добавляя 0,075 М раствор NaCl, чтобы получить дисперсию 5% (вес/об.) белка.
Образец белковой дисперсии (75 мл) выливают в чашку смесителя Hobart N-50 (Hobart Corporation, Troy, шт.Огайо) и взбивают в течение 15 минут при самой высокой скорости смесителя (уставка 3) с использованием приспособления типа метелочки. Через каждые 5 минут прекращают взбивание, заполняют два мерных стакана (125 мл) пеной и взвешивают их. Затем эти образцы пены возвращают в чашку, до того как продолжают взбивание. Переполнение рассчитывают для каждого момента времени, используя следующее уравнение (Phillips и др., J. Food Sci., 55(5); 1441-1444, 1453):
Переполнение (%)=[(вес жидкого образца (125 мл))-вес пены (125 мл))/вес пены (125 мл)]×100
Для определения стабильности пены второй образец (75 мл) белковой дисперсии выливают в специальную чашку смесителя Hobart N-50 и взбивают в течение 15 минут при самой высокой скорости смесителя (уставка 3) с использованием приспособления типа метелочки. В этой специальной чашке имеется отверстие диаметром 6 мм, высверленное на дне чашки, сразу за пределами траектории взбивалки. В ходе взбивания это отверстие закрывают клейкой лентой. По завершении взбивания ленту удаляют, и отверстие очищают стержнем мешалки. Вес материала, удалившегося из чашки, определяют через 5 минут в течение 15 минут. Для расчета процентной доли материала, удалившегося из чашки, вес удаленного образца делят на исходный вес пены.
Показатели переполнения пены и стабильности пены для образца С302 приведены соответственно в Таблицах Х и XI:
| Таблица X | |
| Переполнение пены для С302 | |
| Время взбивания (мин) | Переполнение (%) |
| 5 | 304,4 |
| 10 | 315,0 |
| 15 | 311,1 |
| Таблица XI | |
| Стабильность пены С302 | |
| Время дренирования (мин) | Потеря веса (%) |
| 5 | 16.7 |
| 10 | 27,2 |
| 15 | 33,7 |
Очевидно, что для продукта С302 наблюдается низкая пенообразующая способность и низкая стабильность пены, что можно объяснить низкой растворимостью, как видно из Примера 3.
Сопоставление показателей переполнения пены и стабильности пены для образцов С202 и С200 проведено соответственно в следующих Таблицах XII и XIII:
| Таблица XII | ||
| Переполнение пены для образцов С202 и С200 | ||
| Время взбивания (мин) | Переполнение для С202 (%) | Переполнение для С200(%) |
| 5 | 1707,6 | 3118,9 |
| 10 | 2178,8 | 3110,9 |
| 15 | 2357,4 | 3211,2 |
| Таблица XIII | ||
| Стабильность пены для образцов С202 и С200 | ||
| Время дренирования (мин) | Потеря веса для С202 (%) | Потеря веса для С200 (%) |
| 5 | 0 | 0 |
| 10 | 0 | 0 |
| 15 | 0 | 0,5 |
Как видно из этих Таблиц, образец С202 обладает хорошими пенообразующими свойствами, с хорошими показателями переполнения и отличной стабильностью. Однако объем пены был хуже, чем у С200. Внешний вид пены для образца С202 также был хуже, чем для С200: из образца С200 образуется ровная пена, тогда как пена из С202, по-видимому, является более сухой, и в ней имеются некоторые недиспергированные частицы белка, возможно, из-за ограниченной растворимости С202 в растворе соли при рН 7.
Пример 6
В этом Примере продемонстрирована эмульгирующая способность образцов С302 и С202 белкового изолята канолы, полученных по методике Примера 1.
Взвешивают достаточное количество белкового порошка для того, чтобы получить 1,5 г белка, и затем добавляют 150 г воды, очищенной обратным осмосом. Образец обрабатывают в смесителе Silverson при скорости перемешивания 4500 об/мин, пока белок полностью не диспергируется. Затем рН образца доводят до 7, используя NaOH или НСl, по необходимости. Добавляют масло канолы (150 г), чтобы получить смесь, содержащую 50 мас.% масла и 0,5 мас.% белка. Эмульгирование смеси достигается за счет обработки в смесителе Silverson при скорости перемешивания 5000 об/мин в течение 5 минут.
Образец эмульсии разбавляют в 500 раз в 0,1% растворе додецилсульфата натрия (SDS), регистрируют ИК-поглощение при 500 нм (по меньшей мере, 2 ИК-анализа). Кроме того, рассчитывают содержание влаги в образце эмульсии. Затем рассчитывают показатели помутнения и эмульгирующей способности (площадь поверхности (м2) стабилизированной капли жира на 1 г белка), как подробно описано в публикации Hill, Эмульсии. В сб.: Методы испытания функциональности белка. Hall, G.M. (ред). pp.153-185 (1996).
Данные об эмульгирующей способности образцов С302, С300, С202 и С200 приведены в следующей Таблице XIV.
| Таблица XIV | |
| Эмульгирующая способность образцов | |
| Образец | Эмульгирующая способность (м2/г) |
| С302 | 6,9 |
| С300 | 24,5 |
| С202 | 14,6 |
| С200 | Не определена |
Как можно увидеть из этих данных, С302 образец обладает очень плохой эмульгирующей способностью, которая существенно хуже, чем у образца С300.
Пример 7
В этом Примере проиллюстрирована водосвязывающая способность образцов С302 и С202, полученных в соответствии с методикой Примера 1, в сопоставлении с образцами С300 и С200, полученными в соответствии с методикой Примера 2.
Взвешивают порошок белка (1 г) в пробирках для центрифугирования (50 мл) известного веса. К порошку добавляют 20 мл деионизированной воды с естественным значением рН. Содержимое пробирок перемешивают с использованием вихревого смесителя при средней скорости в течение 1 минуты. Затем образцы выдерживают в термостате при комнатной температуре, всего в течение 10 минут, причем через пять и десять минут проводят вихревое перемешивание в течение 30 секунд. Затем образцы подвергают центрифугированию при ускорении 1000 g в течение 15 минут при 20°С. После центрифугирования осторожно сливают надосадочную жидкость, убедившись, что весь твердый материал остается в пробирке. Затем пробирку для центрифугирования повторно взвешивают и определяют вес образца, насыщенного водой.
Водосвязывающую способность (WBC) рассчитывают следующим образом:
WBC (мл/г)=(масса влажного образца - масса сухого образца)/(масса сухого образца×общее содержание твердого вещества в образце)
Значения водосвязывающей способности образцов С302 и С202 по сравнению с образцами С300 и С200 приведены в следующей Таблице XV.
| Таблица XV | |
| Водосвязывающая способность С302 и С202 | |
| Образец | Водосвязывающая способность (мл/г) |
| С302 | 7,35 |
| С300 | 1,35 |
| С202 | 0,00 |
| С200 | 0,00 |
Из этих данных можно видеть, что водосвязывающая способность образца С302 является превосходной и гораздо выше, чем для образца С300. Как отмечено в Примере 3, образцы С202 и С200 обладают высокой растворимостью в воде и поэтому вес материала, оставшегося в пробирке после сливания воды, меньше, чем исходный вес белкового порошка. Следовательно, водосвязывающая способность этих образцов равна нулю.
Пример 8
Этот Пример иллюстрирует маслосвязывающую способность образцов С302 и С202, полученных в соответствии с Примером 1, по сравнению с образцами С300 и С200, полученными в соответствии с Примером 2.
Маслосвязывающую способность оценивают таким же методом, как и водосвязывающую способность, описанную в Примере 6, за исключением того, что вместо 20 мл воды используют 20 мл воды и маслосвязывающую способность (ОВС) рассчитывают так:
ОВС (мл/г)=[(масса смоченного образца - масса сухого образца)/плотность масла]/(масса сухого образца×общее содержание твердого вещества в образце)
Результаты, полученные для образцов С302 и С202, по сравнению с образцами С300 и С200 приведены в следующей Таблице XVI.
| Таблица XVI | |
| Маслосвязывающая способность С302 и С202 | |
| Образец | Маслосвязывающая способность (мл/г) |
| С302 | 2,83 |
| С300 | 3,26 |
| С202 | 5,36 |
| С200 | 3,49 |
Из этих данных можно видеть, что маслосвязывающая способность образца С202 лучше, чем для образца С200; в то же время маслосвязывающая способность образца С302 немного хуже, чем для образца С300.
Пример 9
Этот Пример иллюстрирует получение изоэлектрического осадка из БММ, произведенной в соответствии с методикой Примера 2.
Содержащую БММ разбавленную гранулу из технологического пробега BW-AL 022-L15-04A (100,47 г, 23,15% белка), проведенного по методике, описанной в Примере 2, объединяют с 0,1 М раствором NaСl (364,73 г), чтобы получить образец, имеющий содержание белка 4,54%. Раствор подкисляют от начального значения рН 6,02 до 3,50, используя 5% НСl. Образцу дают спокойно отстояться в течение 15 минут и затем подвергают центрифугированию при ускорении 7100 g в течение 15 минут, с целью отделения осажденного белка от надосадочной жидкости. Влажный осадок (26,01 г) подвергают лиофильной сушке, чтобы получить 5,45 г белка С302. Содержание белка в продукте С302 составляет 90,17% (в сыром виде, содержание влаги не определялось), это указывает, что белок является изолятом.
Водосвязывающую способность белка С302 определяют по методике Примера 7 и сопоставляют с белком С300 из того же опыта. Результаты приведены в следующей Таблице XVII.
| Таблица XVII | |
| Водосвязывающая способность различных продуктов | |
| Образец | Водосвязывающая способность(мл/г) |
| AL022-L15-04AC302 | 8,51* |
| AL022-L15-04A С300 | 1,14 |
| * Примечание: содержание влаги в образце С302 не определено и принято равным 2% для расчета водосвязывающей способности |
Как видно из этой Таблицы, продукт С302 связывает больше воды, чем белок С300, полученный в той же самой загрузке, и проявляет такую же высокую водосвязывающую способность, что и белок С302 в Примере 7 по сравнению с продуктом С300.
Пример 10
В этом Примере проиллюстрировано осуществление изоэлектрического осаждения в водном растворе белка без стадии концентрирования и обработка надосадочной жидкости с целью извлечения белкового изолята канолы, который преимущественно представляет собой 2S белок.
Муку масличных семян канолы (15 кг) экстрагируют 150 литрами 0,15 М раствора NaCl путем перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут. Экстракт отделяется от отработанной муки путем пропускания через декантатор, и экстракт дополнительно осветляют путем последовательного пропускания через фильтровальные подушки с размером пор 2,0 мкм и 0,8 мкм. Затем фильтрат подкисляют от начального значения рН 5,66 до 3,5 за счет добавления 2М раствора НСl, что приводит к образованию осадка, который удаляют путем последовательного пропускания образца через фильтровальные подушки с размером пор 2,0 мкм и 0,8 мкм. В этом эксперименте осадок не извлекают.
Затем надосадочную жидкость от изоэлектрического осаждения концентрируют на небольшой мембранной установке с использованием PES мембраны с отсечкой по молекулярной массе 10000 ед. Дальтона. Образец концентрируют от объема 106 л до приблизительно 5 литров. Затем концентрированный образец подвергают диафильтрации с 7 объемами воды, имеющей рН 3,5, чтобы снизить содержание соли. Затем диафильтрованный ретентат разделяют на три образца.
Первый образец (контрольный) пастеризуют при 60°С в течение 10 минут, охлаждают до 25°С, подвергают центрифугированию при 10200 g в течение 10 минут и фильтруют через фильтровальные подушки № 3 (сверхтонкие). Второй образец подвергают термообработке при 85°С в течение 10 мин, охлаждают до 25°С, центрифугируют при 10200 g в течение 10 минут и затем фильтруют через фильтровальные подушки № 3. Значение рН третьего образца повышают до 6 путем добавления водного гидроксида натрия, образец подвергают термообработке при 80°С в течение 10 минут и затем охлаждают до 25°С. Образовавшийся осадок извлекают путем центрифугирования при 10200 g в течение 10 минут с последующей фильтрацией через фильтровальные подушки № 3. Затем эти три продукта подвергают распылительной сушке и обозначают С202 (контроль), С202Н рН 3,5 (термообработка при рН 3,5) и С202Н рН6 (термообработка при рН 6).
Обработанные образцы анализируют на содержание свободных фенолов (поглощение при 330 нм), видимое окрашивание (поглощение при 390 нм), содержание белка (LECO) и/или белковый профиль (SEC ЖХВР). Хроматограммы ЖХВР для подкисленных образцов трудно интерпретировать, так как в условиях малых рН белки 7S и 12S превращаются в меньшие субъединицы, пики которых при элюировании перекрываются с пиком 2S. Кроме того, конечные продукты также анализируют на содержание влаги (метод потери влаги в печи), окрашивание в сухом виде (колориметр Minolta), и готовят растворы для анализа окрашивания во влажном виде. Белковый порошок (0,35 г) растворяют в воде (10 мл), используя вихревой смеситель. Для продукта С202 рН 6 значение рН образца для влажного окрашивания снижают до 4, добавляя НСl. Видимое окрашивание влажных образцов оценивают по поглощению при 390 нм (A390), прозрачность по поглощению при 600 нм и по измеренной величине рН.
Стадия изоэлектрического осаждения приводит к удалению 46% азота из осветленного экстракта. Белковый профиль фильтрата до подкисления имеет вид - 48,9% 7S:1,7% 12S:49,4% 2S и после удаления изоэлектрического осадка - 2,0% 7S:0,4% 12S:97,6% 2S. Полагают, что белки 7S и 12S являются первичными осажденными частицами, но их удаление не может быть настолько полным, как показывают данные ЖХВР. Как упомянуто выше, в условиях низкого значения рН происходит превращение 7S и 12S в субъединицы, пики которых при элюировании перекрываются с пиком 2S. Поэтому некоторая часть пика "2S" в подкисленном образце может быть обусловлена разложением белков 7S и 12S. Термическая обработка концентрированного образца при рН 3,5 вызывает небольшое увеличение помутнения, но без существенного образования осадка. Термическая обработка при рН 6 приводит к осаждению значительного количества белка.
Все полученные С202 продукты являются изолятами, как показано в Таблице XVIII.
| Таблица XVIII | ||||
| Выход и содержание белка в продуктах С202 | ||||
| Образец | Вес продукта (г) | Содержание белка (влажная масса, %) | Содержание влаги (%) | Содержание белка (сухая масса, %) |
| С202 контроль | 108 | 89,52 | 6,47 | 95,71 |
| С202Н рН 3,5 | 102 | 90,59 | 5,21 | 95,57 |
| С202Н рН 6 | 58 | 89,77 | 4,46 | 93,96 |
Цвет сухих продуктов С202 показан в Таблице XIX. Эти результаты являются довольно близкими, хотя термически обработанный образец при рН 3,5 был более красным и менее желтым, чем контрольный образец. Образец С202Н рН 6, который содержит меньше белков 7S и 12S по сравнению с другими образами, является наиболее светлым, наиболее зеленым (наименее красным), а также менее желтым, чем контроль.
| Таблица XIX | |||
| Цвет сухих продуктов С202 | |||
| Образец | L | а | b |
| С202 контроль | 85,39 | -1,49 | 22,49 |
| С202Н рН 3,5 | 85,45 | -1,07 | 20,76 |
| С202Н рН 6 | 86,02 | -1,69 | 20,86 |
Окрашивание влажных образцов С202 оказалось вполне подобным. Наилучшей прозрачностью обладает образец С202Н рН 6. При оценке по измерениям поглощения установлено, что образец С202Н рН 6 образец является наиболее светлым и самым прозрачным. Однако различия между этими тремя образами являются совершенно незначительными, причем все образцы являются приемлемыми (Таблица XX). Найдено, что прозрачность всех образцов остается стабильной, когда образцы охлаждены до температуры холодильника.
| Таблица XX | |||
| Анализ цвета влажных образцов | |||
| Образец | РН | А390 | А600 |
| С202 контроль | 3,71 | 1,75 | 0,213 |
| С202Н рН 3,5 | 3,78 | 1,94 | 0,297 |
| С202Н рН 6, подкислен до рН 4 | 4,00 | 1,04 | 0,160 |
Пример 11
Этот Пример иллюстрирует функциональность белкового изолята канолы, произведенного из надосадочной жидкости, как описано в Примере 10, по характеристикам растворимости, переполнения пены и стабильности пены.
Образцы белкового изолята канолы, полученные, как описано в Примере 10, оценивают на функциональность.
Растворимость
Растворимость продукта определяют с использованием метода на основе публикации Моrr и др. В каждом из пяти стаканов взвешивают достаточное количество белкового порошка, чтобы получить 0,5 г белка, и затем к каждому образцу добавляют небольшое количество воды, очищенной обратным осмосом, и смеси перемешивают, пока не образуется гладкая паста. Затем добавляют еще воды, доводя объем образцов приблизительно до 40 мл. Затем содержимое стаканов медленно перемешивают в течение 60 минут, используя магнитную мешалку. Значение рН определяют сразу после диспергирования белка, один образец перемешивают при естественном значении рН, а другие доводят до рН 4, 5, 6 или 7 с использованием NaOH или НСl. Доведенные значения рН образцов измеряют и корректируют два раза в течение 60 минут перемешивания, после 60 минутного перемешивания общий объем образов доводят до 50 мл, добавляя обратноосмотическую воду и получая дисперсии с 1% (вес./об.) белка. Сохраняют аликвоту каждой белковой дисперсии для определения содержания белка с помощью LECO. Другую часть образцов подвергают центрифугированию при 7800 g в течение 10 минут. Это приводит к осаждению всех нерастворенных материалов, причем образуется прозрачная надосадочная жидкость. Затем определяют содержание белка в надосадочной жидкости.
Растворимость (%)=(концентрация белка в надосадочной жидкости/концентрация белка в исходной дисперсии белка)×100
Величины растворимости для контрольного образца С202 приведены в следующей Таблице XXI:
| Таблица XXI | |
| Растворимость для контрольного образца С202 | |
| pН | Растворимость (%) |
| естественный (3,68) | 96,4 |
| 4 | 100 |
| 5 | 100 |
| 6 | 94,9 |
| 7 | 92,7 |
Как видно из этой Таблицы, установлено, что растворимость контрольного образца С202 является очень хорошей во всем рассмотренном диапазоне рН.
Переполнение пены
Взвешивают в стакане достаточное количество белкового порошка для того, чтобы получить 8 г белка. При перемешивании добавляют небольшое количество воды к белковому порошку, чтобы получить пасту. Затем добавляют достаточное количество воды, доводя объем приблизительно до 150 мл, и смесь перемешивают магнитной мешалкой. Скорость перемешивания регулируют таким образом, чтобы избежать образования пены. Приблизительно через 20 минут перемешивания доводят значение рН раствора до 7, используя NaOH или НСl, по необходимости. Затем смесь перемешивают дополнительно в течение 10 минут и корректируют значение рН. Затем объем образца доводят до 160 мл, добавляя воду, чтобы получить дисперсию 5% (вес./об.) белка.
Образец белковой дисперсии (75 мл) выливают в чашку смесителя Hobart N-50 (Hobart Corporation, Troy, шт.Огайо) и взбивают в течение 5 минут при самой высокой скорости смесителя (уставка 3) с использованием приспособления типа метелочки. Через 2; 3,5 и 5 минут взбивание прекращают и заполняют два мерных стакана (125 мл) пеной и взвешивают. Затем эти образцы пены возвращают в чашку, до того как продолжают взбивание. Переполнение рассчитывают для каждого момента времени, используя следующее уравнение (Phillips и др.):
Переполнение (%)=[(вес жидкого образца (125 мл)) - вес пены (125 мл))/вес пены (125 мл)]×100
Стабильность пены
Для определения стабильности пены второй образец (75 мл) белковой дисперсии выливают в специальную чашку смесителя Hobart N-50 и взбивают в течение 15 минут при самой высокой скорости смесителя (уставка 3) с использованием приспособления типа метелочки. В этой специальной чашке имеется отверстие диаметром 6 мм, высверленное на дне чашки, сразу за пределами траектории взбивалки (Phillips и др., 1990). В ходе взбивания это отверстие закрывают клейкой лентой. По завершении взбивания ленту удаляют, и отверстие очищают стержнем мешалки. Вес материала, удалившегося из чашки, определяют через каждые 5 минут в течение 15 минут. Для расчета процентной доли материала, удалившегося из чашки, вес удаленного образца делят на исходный вес пены.
Влияние времени взбивания на переполнение пены для продуктов С202 охарактеризовано в следующей Таблице XXII:
| Таблица XXII | ||
| Влияние времени взбивания на переполнение пены для продуктов С202 | ||
| Время взбивания (мин) | Переполнение (%) С202 | Переполнение (%) С202Н рН 6 |
| 2 | 3078 | 2957 |
| 3,5 | 3090 | 3211 |
| 5 | 3070 | 3069 |
Пенообразующие свойства испытанных продуктов С202 являются превосходными, с высокими показателями переполнения (Таблица XXII) и хорошей стабильностью. Для контрольного образца С202 и С202Н рН 6 не наблюдается какая-либо потеря веса в течение 15 минутного периода после взбивания пены. Отмечено, что стабильность контрольного образца С202 лучше стабильности образца С202Н рН 6, поскольку для этого образца через 15 минут образуется капля жидкости, свисающая из чашки, в то время как для контрольного образца не наблюдается образование капель после такого периода времени.
Пример 12
В этом Примере проиллюстрировано осуществление изоэлектрического осаждения в водном растворе белка без стадии концентрирования и извлечения белкового изолята канолы, который преимущественно представляет собой 7S белок, и обработка надосадочной жидкости с целью извлечения белкового изолята канолы, который преимущественно представляет собой 2S белок.
Муку масличных семян канолы (180 г) экстрагируют 1,80 литрами 0,15 М раствора NaCl путем перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут, используя верхнюю мешалку. Экстракт отделяется от отработанной муки путем центрифугирования при 7100 g в течение 10 минут, и экстракт дополнительно осветляют путем последовательного пропускания через фильтровальные подушки, набор №3 (сверхтонкие). Затем фильтрат подкисляют от начального значения рН 5,72 до 3,5 за счет добавления 6М раствора НСl, и образец выдерживают в течение 15 минут. Образовавшийся осадок удаляют с помощью центрифугирования при 7100 g в течение 10 минут и затем подвергают лиофильной сушке. Этот продукт имеет наименование С302.
Надосадочную жидкость от изоэлектрического осаждения дополнительно осветляют путем пропускания через фильтровальные подушки, набор №3. Затем осветленную надосадочную жидкость концентрируют на мембранной установке Vivaflow, снабженной мембраной Hydrosart с отсечкой по молекулярной массе 10000 ед. Дальтона. Образец концентрируют приблизительно от объема 950 мл до 26,5 мл. Затем концентрированный образец подвергают диафильтрации с 5 объемами воды, имеющей рН 3,5, чтобы снизить содержание соли. Затем диафильтрованный ретентат разделяют на два образца. Первый образец (контрольный) подвергают лиофильной сушке, этот продукт имеет наименование С202. Второй образец подвергают термообработке при 85°С в течение 5 мин, охлаждают до 25°С, центрифугируют при 10200 g в течение 10 минут и затем подвергают лиофильной сушке, этот продукт имеет наименование С202Н.
Обработанные образцы анализируют на содержание свободных фенолов (поглощение при 330 нм), видимое окрашивание (поглощение при 390 им), содержание белка (LECO) и/или белковый профиль (SEC ЖХВР). Отмечено, что хроматограммы ЖХВР для подкисленных образцов трудно интерпретировать, так как в условиях малых рН белки 7S и 12S превращаются в меньшие субъединицы, пики которых при элюировании перекрываются с пиком 2S. Кроме того, конечные продукты анализируют на содержание влаги (метод потери влаги в печи), окрашивание в сухом виде (колориметр Minolta), и готовят растворы для анализа окрашивания во влажном виде. Белковый порошок (0,35 г) растворяют в воде (10 мл), используя вихревой смеситель. Видимое окрашивание влажных образцов оценивают по поглощению при 390 нм (А390), и прозрачность оценивают по поглощению при 600 нм.
Стадия изоэлектрического осаждения приводит к удалению 53,7% азота из осветленного экстракта. Белковый профиль фильтрата до подкисления (выражен в процентах от общей площади пиков белков муки) имеет вид - 62,3% 7S:3,4% 12S:34,3% 2S и после удаления изоэлектрического осадка - 3,0% 7S:0,8% 12S:96,2% 2S. Полагают, что белки 7S и 12S являются первичными осажденными частицами, но их удаление не может быть настолько полным, как показывают данные ЖХВР. Как упомянуто выше, в условиях низкого значения рН происходит превращение 7S и 12S в субъединицы, пики которых при элюировании перекрываются с пиком 2S. Поэтому некоторая часть пика "2S" в подкисленном образце может быть обусловлена разложением белков 7S и 12S. Термическая обработка концентрированного образца при рН 3,5 вызывает небольшое увеличение помутнения, но без существенного образования осадка. Термическая обработка концентрированной надосадочной жидкости при рН 3,5 приводит к несущественному увеличению помутнения, но не образуется значительное количество осадка.
Все полученные в этом исследовании продукты являются изолятами, причем содержание белка (сухая масса) составляет более 90% (Таблица XXIII).
| Таблица XXIII | ||||
| Выход и содержание белка в продуктах изоэлектрического осаждения | ||||
| Образец | Вес продукта (г) | Содержание белка (влажная масса, %) | Содержание влаги (%) | Содержание белка (сухая масса, %) |
| С302 | 7,29 | 91,68 | 5,47 | 96,99 |
| С202 | 2,44 | 84,62 | 6,64 | 90,64 |
| С202Н | 2,56 | 85,21 | 6,67 | 91,30 |
Цвет сухих продуктов C202 показан в Таблице XXIV. Показатель осветленности для продукта С302 является хорошим, но показатели осветленности для продуктов С202 были хуже. Образец С302 был более желтым и зеленым, чем продукты С202. Термически обработанный образец С202Н был темнее и менее желтым, чем продукт С202 без термической обработки.
| Таблица ХХIV | |||
| Цвет сухих продуктов изоэлектрического осаждения | |||
| Образец | L | а | b |
| С302 | 86,00 | -2,83 | 25,33 |
| С202 | 79,76 | 0,05 | 21,69 |
| С202Н | 78,07 | 0,07 | 20,34 |
Цвет влажных образцов С202 и С202Н является до некоторой степени неопределенным. Вероятно, прозрачность может быть улучшена путем фильтрации образцов до лиофильной сушки, поскольку образцы диафильтрационных ретентатов являются до некоторой степени мутными, особенно после термической обработки (С202Н). По визуальным показателям цвета, на глаз, образцы выглядят аналогично. В соответствии с показаниями поглощения, образец С202Н является несколько более окрашенным, а также более мутным, чем С202 (Таблица XXV).
| Таблица XXV | ||
| Анализ цвета влажных образцов | ||
| Образец | А390 | А600 |
| С202 | 5,52 | 0,825 |
| С202Н | 6,79 | 1,054 |
Термическая обработка диафильтрованной, концентрированной надосадочной жидкости при рН 3,5, по-видимому, не дает никаких преимуществ по показателям цвета или прозрачности. Следовательно, для этих образцов стадия термической обработки не является обязательной.
Определена водосвязывающая способность изолята С302.
Взвешивают порошок белка (1 г) в пробирках для центрифугирования (50 мл) известного веса. К этому порошку добавляют приблизительно 20 мл воды, очищенной обратным осмосом, с естественным значением рН. Содержимое пробирок перемешивают с использованием вихревого смесителя при средней скорости в течение 1 минуты. Затем образцы выдерживают в термостате при комнатной температуре, всего в течение 10 минут, причем через пять и десять минут проводят вихревое перемешивание в течение 30 секунд. Затем образцы подвергают центрифугированию при ускорении 1000 g в течение 15 минут при 20°С. После центрифугирования осторожно сливают надосадочную жидкость, убедившись, что весь твердый материал остается в пробирке. Затем пробирку для центрифугирования повторно взвешивают и определяют вес образца, насыщенного водой.
Водосвязывающую способность (WBC) рассчитывают следующим образом:
WBC (мл/г)=(масса влажного образца - масса сухого образца)/(масса сухого образца×общее содержание твердого вещества в образце)
Найдено, что водосвязывающая способность продукта С302 равна 2,95 мл/г. Эта величина меньше, чем водосвязывающая способность продуктов С302 в предыдущих исследованиях изоэлектрического осадка (приблизительно от 5 до 9 мл/г, например, см. Пример 7). Различие может быть вызвано тем фактом, что в этом Примере стадия изоэлектрического осаждения проведена на экстракте, вместо более очищенных потоков, таких как гранула разбавленного UF1 ретентата или повторно солюбилизированного С300. Несмотря на то что водосвязывающая способность, найденная для С302 в этом Примере, была ниже, чем для других продуктов С302, все же эта величина была выше, чем обычно наблюдаемая для продуктов С300 (приблизительно от 1 до 2 мл/г).
Краткое изложение описания изобретения
Таким образом, в настоящем изобретении изоэлектрическое осаждение успешно использовано для получения двух новых продуктов белкового изолята канолы, обозначенных С302 и С202. Продукты С302 и С202 аналогичны продуктам С300 и С200 по цвету и чистоте. По функциональности продукт С202 напоминает продукт С200. Продукт С302 в большей степени отличается от продукта С300, причем продукт С302 не настолько растворим, и не является настолько хорошим эмульгатором, как С300. Однако продукт С302 является очень хорошим водосвязывающим агентом, существенно превосходящим продукт С300. Возможны модификации в рамках объема изобретения.
1. Способ получения изолята белка канолы, включающий:
(a) экстракцию муки семян канолы для того, чтобы вызвать солюбилизацию белка канолы в муке семян канолы с образованием водного раствора белка канолы, имеющего значение рН от 5 до 6,8,
(b) отделение водного раствора белка канолы от остаточной муки семян канолы,
(c) подкисление водного раствора белка канолы до значения рН от 3 до 4 для того, чтобы с помощью изоэлектрической преципитации осадить изолят белка канолы, имеющий содержание белка, по меньшей мере, 90 мас.% (N×6,25), и
(d) отделение осажденного с помощью изоэлектрической преципитации изолята белка канолы от надосадочной жидкости.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный водный раствор белка концентрируют при поддержании практически постоянного значения ионной силы с использованием технологии селективной мембраны до указанной стадии подкисления.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную экстракцию указанной муки семян канолы осуществляют, используя водный раствор соли, имеющий ионную силу, по меньшей мере, 0,05, предпочтительно от 0,1 до 0,6, и значение рН от 5 до 6,8, предпочтительно от 5,3 до 6,2.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную надосадочную жидкость обрабатывают, чтобы извлечь из нее дополнительный изолят белка канолы, имеющий содержание белка, по меньшей мере, 90 мас.% (N×6,25) и содержащий преимущественно 2S белок канолы.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанную надосадочную жидкость термически обрабатывают, чтобы осадить 7S и любой 12S белок из надосадочной жидкости, и осажденный 7S и любой 12S белок выделяется из термически обработанной надосадочной жидкости, и указанную надосадочную жидкость необязательно концентрируют до указанной стадии термической обработки.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что рН указанной надосадочной жидкости доводят до диапазона от 5 до 6,8, предпочтительно от 5,3 до 6,2, перед указанной стадией термической обработки.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанную надосадочную жидкость подвергают обесцвечивающей обработке после выделения осажденного 7S и любого 12S белка перед извлечением изолята белка канолы, содержащего преимущественно 2S белок канолы, и/или перед указанной стадией концентрирования.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный раствор белка канолы концентрируют при поддержании практически постоянного значения ионной силы с использованием технологии селективной мембраны, перед указанной стадией подкисления, предпочтительно до концентрации 10-300 г/л, более предпочтительно от 50 до 100 г/л.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный раствор белка канолы концентрируют до концентрации от 20 до 25 мас.% белка и перед указанной стадией подкисления, концентрацию раствора белка канолы доводят до 5-10 мас.% путем добавления водного раствора соли, или тем, что указанный водный раствор белка, обработанный на стадии подкисления, имеет проводимость, по меньшей мере, 1 мСм, предпочтительно от 10 до 20 мСм.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный водный раствор белка имеет концентрацию белка от 5 до 10 мас.%.
11. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий после стадии (b) и до стадии (с) следующие стадии:
(i) повышение концентрации белка указанного водного раствора белка канолы при поддержании практически постоянного значения ионной силы с использованием технологии селективной мембраны, чтобы получить концентрированный раствор белка канолы,
(ii) разбавление указанного раствора белка канолы в охлажденной воде, имеющей температуру ниже 15°С, чтобы вызвать образование дискретных частиц белка канолы в водном растворе в форме мицелл,
(iii) осаждение мицелл белка канолы с образованием аморфной, клейкой, студенистой, похожей на клейковину мицеллярной массы белка канолы,
(iv) выделение мицеллярной массы белка канолы из надосадочной жидкости, причем белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, 90 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, 100 мас.% (N×6,25) и
(v) образование водного раствора мицеллярной массы белка канолы, и где указанную стадию подкисления осуществляют в водном растворе мицеллярной массы белка канолы для того, чтобы осадить из него с помощью изоэлектрической преципитации изолят белка канолы, имеющий содержание белка, по меньшей мере, 90 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, 100 мас.% (N×6,25).
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что водный раствор мицеллярной массы белка канолы образуется путем солюбилизации мицеллярной массы белка канолы, которая может быть в сухом виде, водным раствором соли, имеющим ионную силу, по меньшей мере, 0,05, предпочтительно, по меньшей мере, 0,1.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный водный раствор мицеллярной массы белка канолы имеет концентрацию белка канолы от 5 до 10 мас.%.
