Применение омега-3 жирных кислот при лечении остеоартрита у псовых


 


Владельцы патента RU 2422140:

ХИЛЛ'С ПЕТ НЬЮТРИШН, ИНК. (US)

Группа изобретений относится к области ветеринарии. Способы включают введение в их рацион омега-3-жирных кислот, при этом омега-3 жирные кислоты вводят в рацион собак в количестве 27,5-150,0 мг/кг массы тела, причем содержание ЕРА в составе омега-3 жирных кислот составляет до 100%. Группа изобретений позволяет снизить вероятность развития остеоартрита у собаки, а также восстановить функции сустава у собаки, страдающей остеоартритом. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 17 табл.

 

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Остеоартрит представляет собой дегенеративное заболевание суставов, обычно встречающееся у людей и других крупных млекопитающих (Richardson et al., Vet. Clin. North Amer.Small Animal Practice 27:883-911, 1997; Curtis et al., Drug Disc. Today 9:165-172, 2004). Заболевание проявляется прогрессирующим изнашиванием суставного хряща с минимальным воспалением (Schoenherr et al. in Small Animal Clinical Nutrition 4th Ed., Hand et al. Eds., Walsworth Publishing Company, Marceline, MO, 2000, 907-921; Hedborn et al., Cell Mol.Life Sci 59: 45-53, 2002; Pool, Front Biosci 4: D662-70, 1999). Лечение остеоартрита может включать в себя фармакологическое лечение, хирургическое вмешательство, применение нутрицевтиков и диетотерапию. Однако существующие подходы к лечению направлены на облегчение симптомов заболевания и, например, они не были полностью успешными при лечении заболевания или лечении основной патологии. Следовательно, остается необходимость в новых подходах к лечению остеоартрита у человека и других крупных млекопитающих.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, в этом документе авторы изобретения показали, что применение эффективного количества омега-3 жирных кислот, в частности эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА), может обеспечить новый подход к лечению остеоартрита у собак. Способы являются эффективными при лечении остеоартрита у собак.

Таким образом, в различных вариантах осуществления настоящее изобретение может включать в себя способы восстановления функций сустава собаки, страдающей остеоартритом, почти до нормы. Способы могут включать в себя кормление собаки композицией, содержащей ЕРА в концентрации, по крайней мере, 0,2% по массе или, по крайней мере, 0,3% по массе.

Настоящее изобретение также может включать в себя способы снижения вероятности развития остеоартрита у собаки. Способы могут включать в себя кормление собаки композицией, содержащей ЕРА в концентрации, по крайней мере, 0,2% по массе или, по крайней мере, 0,3% по массе.

Способы по настоящему изобретению для восстановления функций сустава у собаки, страдающей остеоартритом, почти до нормы, могут также включать в себя кормление собаки композицией, основанной на композиции, включающей в себя жирно-кислотный компонент, содержащий достаточное для восстановления функции суставов количество ЕРА.

Способы по настоящему изобретению для снижения вероятности развития остеоартрита у собаки подобным образом могут включать в себя кормление собаки композицией, основанной на композиции, включающей в себя жирно-кислотный компонент, содержащий достаточное для восстановления функции суставов количество ЕРА.

Настоящее изобретение может также включать в себя способы снижения вероятности развития остеоартрита у собаки и способы восстановления функций сустава у собаки, страдающей остеоартритом, почти до нормы, включающие в себя введение в организм собаки композиции, содержащей количество ЕРА около 37,5 мг/кг массы тела, около 56,25 мг/кг массы тела, около 75 мг/кг массы тела или около 93,75 мг/кг массы тела. Такие композиции могут быть включены в состав композиции корма животного, лакомства или добавки к корму животного.

В различных вариантах осуществления, способы восстановления функций сустава у собаки, страдающей остеоартритом, почти до нормы, могут включать в себя лечение заболевания или ослабление симптомов заболевания у собаки и способы снижения вероятности развития остеоартрита у собаки могут включать в себя профилактику развития остеоартрита у собаки или профилактику или ослабление проявления симптомов заболевания у собаки.

Способы по настоящему изобретению дополнительно могут быть основаны на составах, которые дополнительно содержат омега-6 жирные кислоты, общее количество которых составляет не более 3 массовых %, и/или отношение омега-6 жирных кислот к омега-3 жирным кислотам составляет приблизительно 0,2 приблизительно к 1,1, и/или отношение омега-6 жирных кислот к ЕРА приблизительно 1,0 приблизительно к 12,5.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение может включать в себя введение омега-3 жирных кислот, в частности ЕРА при лечении остеоартрита и симптомов подобных заболеваний у млекопитающих, в частности у собак.

Омега-3 жирные кислоты, также известные как n-3 жирные кислоты, принадлежат к группе полиненасыщенных жирных карбоновых кислот. В большинстве случаев омега-3 жирные кислоты содержат 12-26 атомов углерода с двойной связью. Физиологически более важными являются омега-3 жирные кислоты, содержащие 18-22 атомов углерода с неразветвленной цепью. n-3 жирные кислоты содержат двойную связь между 3 и 4 атомами углерода от метилового конца молекулы. Эйкозопентаеновая кислота (ЕРА), докозагексаеновая кислота (DHA) и альфа-линоленовая кислота (ALA) являются n-3 жирными кислотами, имеющими большое значение при лечении остеоартрита у млекопитающих, и ЕРА в частности имеет большое значение при лечении остеоартрита у собак. Производные омега-3 жирных кислот также могут быть использованы при лечении остеоартрита. Специалисту в данной области хорошо известны многие виды производных омега-3 жирных кислот. Примерами подходящих производных являются зфиры, например разветвленные или неразветвленные и/или насыщенные или ненасыщенные C130 циклоалкиловые эфиры, в частности C1-C6 алкиловые эфиры омега-3 жирных кислот, в особенности ЕРА.

Омега-3 жирные кислоты, и в частности ЕРА, могут быть введены в организм млекопитающего, в частности собаки, с помощью различных путей введения, например перорально, интраназально, внутривенно, подкожно и тому подобное. Особенно удобным является пероральный путь введения, и ЕРА может быть введена перорально в составе жидкого или сухого рациона питания, либо включена в композицию рациона, либо нанесена на поверхность любого компонента рациона, например путем распыления на поверхность, спекания, напыления или преципитацией на поверхность. ЕРА может быть представлена непосредственно в пищевом рационе или в составе легкой закуски, в пищевой добавке или лакомстве. ЕРА также может присутствовать в жидкостной части рациона, например в воде, или другой жидкости. ЕРА может быть применена в виде порошка, твердом виде или жидкой форме, включая гель. При желании, ЕРА может быть введена в организм перорально в форме нутрицевтика или фармацевтического препарата как, например, капсулы, таблетки, таблетки в форме капсулы, введена с помощью шприца и тому подобное. В составе лекарственной формы ЕРА может присутствовать в порошкообразном виде или жидком виде, например гелеобразном. Вместе с ЕРА может использоваться любой обычный нутрицевтический или фармацевтический наполнитель, например вода, глюкоза, сахароза и тому подобное.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение может включать в себя композиции ЕРА-рационов, по существу не содержащих DHA и/или ALA. Существенно свободная композиция от DНА или ALA или их смеси означает, что или ALA, или DHA, или обе кислоты вместе, в основном отсутствуют или они находятся только в малых незначительных количествах, например приблизительно менее 0,01%, приблизительно менее 0,03% или приблизительно менее 0,001%. В вариантах осуществления, в которых по существу отсутствуют DHA и/или ALA, любые количества DHA и/или ALA представлены в достаточно низких концентрациях, не вызывающих существенных воздействий на течение болезни у собак, страдающих остеоартритом, на прогрессирование остеоартрита или симптомов этого заболевания.

Омега-3 жирные кислоты и, в частности, ЕРА являются эффективными при различных формах остеоартрита, так же как других формах артрита, включая ревматоидный артрит.

Омега-3 жирная кислота ЕРА действует профилактически в отношении развития дегенеративного процесса в суставном хряще или снижает дегенеративный процесс и таким образом улучшает состояние сустава у собак, страдающих остеоартритом, или у собак, у которых иначе мог бы развиться остеоартрит. Этот эффект является дополнительным к противовоспалительному действию омега-3 жирных кислот, который может быть менее значимым при остеоартрите собак из-за ограниченного вовлечения воспаления в развитие остеоартрита.

Применение in vitro процедуры выращивания эксплантата, включающего в себя хрящ коленного сустава, как показано далее в примерах, демонстрирует, что ЕРА является единственной омега-3 жирной кислотой, которая существенно снижает индуцированную секрецию гликозаминогликана (GAG) из хряща. Относительно профилактики повреждения суставов остеоартритом конкретная целевая группа домашних животных, особенно собаки, является группой, которая особенно нуждается в такой профилактике в отличие от популяции в целом. Например, домашние животные, в частности собаки крупных пород, таких как лабрадор-ретривер, ротвейлер, немецкая овчарка и тому подобное, являются наиболее подверженными остеоартриту, что демонстрируется большой частотой распространения заболевания среди этих домашних животных. Кроме того, остеоартрит значительно распространен у домашних животных старше шести (6) лет, особенно у собак. ЕРА можно дополнительно использовать при лечении остеоартрита у собак и кошек. Также вместе с ЕРА могут присутствовать другие омега-3 жирные кислоты, такие как DHA и ALA, а также омега-6 жирные кислоты, все они обнаруживаются в относительно больших количествах в таком источнике, как рыбий жир.

Количество используемой ЕРА может существенно варьировать. Как показано далее в примерах, соблюден фактический эффект дозы - чем больше количество ЕРА, тем больше противоартрический эффект. Как правило, минимум, по крайней мере, около 0,2% по массе, исходя из количества питательных веществ в рационе, удовлетворяет обычным ежедневным потребностям собаки или кошки. Например, определенное количество может присутствовать в обычном ежедневном пищевом рационе, или то же самое количество может быть обеспечено животному в составе лакомства или добавки к корму. Дополнительно, комбинация таких способов или любых других способов дозировки может применяться, пока обеспечивается эффективное количество ЕРА. Диапазон количества ЕРА охватывает по крайней мере примерно от 0,2%, по крайней мере примерно от 0,25%, по крайней мере примерно от 0,30%, по крайней мере примерно от 0,4%, по крайней мере примерно от 0,5%, по крайней мере примерно от 0,6% приблизительно до 2%, приблизительно до 2,25%, приблизительно до 2,5%, приблизительно до 3%, приблизительно до 4% или приблизительно до 5% по массе. Следует указать, что все проценты по массе рассчитываются исходя из массы сухого вещества (DMB). ЕРА является омега-3 жирной кислотой. В большинстве случаев, отношение ЕРА или омега-3 жирной кислоты к омега-6 жирной кислоте может значительно варьировать. В ряде вариантов осуществления, отношение омега-6:омега-3 может быть в пределах приблизительно от 1,10 до 0,2 омега-6 к 1,0 омега-3 или приблизительно от 1,08 до 0,42 омега-6 к 1,0 омега-3, и конкретнее, приблизительно 0,2, приблизительно 0,25, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,8, приблизительно 1,0 или более. В различных вариантах осуществления, отношение омега-6 к ЕРА может быть примерно от 12,5 до 1,0 омега-6 к 1,0 ЕРА, или приблизительно от 12,4 до 1,12 омега-6 к 1,0 ЕРА и конкретнее, приблизительно 0,2, приблизительно 0,25, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,8, приблизительно 1,0, приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7,5, приблизительно 10, приблизительно 12,5 или более. Отношение арахидоновой кислоты, АА, (омега-6) к ЕРА может быть приблизительно от 0,28 до приблизительно 0,01 АА к 1,0 ЕРА, приблизительно от 0,28 до 0,08 АА к 1,0 ЕРА, и конкретнее, приблизительно 0,01, приблизительно 0,02, приблизительно 0,04, приблизительно 0,06, приблизительно 0,08, приблизительно 1,0, приблизительно 1,5, приблизительно 2,8 или более.

Омега-3 жирную кислоту, в частности ЕРА, можно применять в количестве, рассчитанном как мг/кг массы тела. Так, например, собаке с массой тела 20 кг желательно потреблять 275 г рациона. Содержание ЕРА в рационе приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,5% или приблизительно 0,6% по массе достигалось бы введением в организм собаки приблизительно 27,5 мг/кг массы тела, приблизительно 41,25 мг/кг массы тела, приблизительно 55 мг/кг массы тела, приблизительно 68,75 мг/кг массы тела или приблизительно 82,5 мг/кг массы тела соответственно. Конкретнее, ЕРА может быть введена в организм в количестве приблизительно 20 мг/кг массы тела, приблизительно 28 мг/кг массы тела, приблизительно 30 мг/кг массы тела, приблизительно 40 мг/кг массы тела, приблизительно 41 мг/кг массы тела, приблизительно 50 мг/кг массы тела, приблизительно 55 мг/кг массы тела, приблизительно 60 мг/кг массы тела, приблизительно 69 мг/кг массы тела, приблизительно 70 мг/кг массы тела, приблизительно 80 мг/кг массы тела, приблизительно 82 мг/кг массы тела, приблизительно 90 мг/кг массы тела, приблизительно 100 мг/кг массы тела, приблизительно 120 мг/кг массы тела, приблизительно 150 мг/кг массы тела или более.

Как отмечено выше, ЕРА может входить в состав корма, предусмотренного для домашнего животного. Примерами такого корма являются обычные рационы, обеспечивающие все нутриенты, необходимые животному, лакомства, добавки к корму и тому подобное. ЕРА может быть представлена в жидкой форме или в составе фармацевтических форм, таких как капсулы, таблетки, пилюли, жидкости или даже формах, вводимых в организм парентерально, например с помощью шприца. Самым важным аспектом является обеспечение домашнего животного эффективным количеством ЕРА для профилактики или лечения остеоартрита. В различных вариантах осуществления, путь введения может быть пероральным и ЕРА может входить в состав корма. В индустрии кормов для животных корма обычно классифицируются как «консервированные в заливке» и «сухие». Консервированный корм содержит довольно большое количество воды и обычно помещен в банку или контейнер, в котором существенно или полностью исключено содержание воздуха. Примерами такого корма являются «кусочек в соусе», отдельные твердые частицы в присутствии жидкого соуса или хлебоподобного продукта, который обычно принимает форму контейнера. Сухой корм представляет собой высушенный при нагревании или предпочтительно прессованный продукт, позднее нарезанный на индивидуальные порционные кусочки, обычно известные как крупные гранулы. ЕРА без труда можно ввести в состав консервированного корма с помощью удобных способов. Можно применять герметичную упаковку для предотвращения окисления ЕРА в составе сухого корма воздухом. Дополнительно, можно применять антиоксиданты и удалять азот из упаковки. Это представлено в патенте США №4895725, в котором особое внимание уделено микрокапсулированию рыбьего жира определенных видов рыб. К рыбам, чей жир содержит высокий уровень омега-3 жирных кислот, относятся менхаден (американская сельдь), лосось, треска и тому подобное.

Настоящее изобретение в различных вариантах осуществления также включает в себя способы, предусматривающие введение композиции, содержащей ЕРА, для уменьшения тяжести и частоты клинических проявлений остеоартрита и боли, связанной с этим заболеванием, без существенных побочных патологических реакций и побочных эффектов. Дополнительно, в различных вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает способ снижения клинического прогрессирования остеоартрита у животных. Также, в различных вариантах осуществления, предлагается способ, который существенно улучшает в целом течение остеоартрита у животного, это благоприятное воздействие может быть объективно оценено по увеличению весовой нагрузки на пораженные остеартритом конечности. Настоящее изобретение также обеспечивает способы, предусматривающие введение в организм ЕРА в комбинации с другими методами лечения остеоартрита, включающими в себя применение различных медикаментов и/или обеспечение животному рациона питания, оптимизирующего вес, оба метода известны в области применения изобретения.

ПРИМЕР 1

Этот пример иллюстрирует выделение гликозаминогликанов, вызванное омега-3 жирными кислотами в культуре хрящевой ткани собаки.

Суставной хрящ получали из левого и правого коленных суставов (и бедренного сочленения, и верхней суставной поверхности большеберцовой кости) собак. Хрящевые эксплантаты, культивированные в течение 3 дней в среде, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку, затем трижды отмывали средой, не содержащей сыворотку. Затем эксплантаты культивировали в течение 6 дней в среде без сыворотки, содержащей 0,100 или 300 мкг/мл n-3 жирную кислоту (ЕРА, ALA или DHA). После стадии культивирования в среде, содержащей жирную кислоту, все эксплантаты отмывали три раза в среде, свободной от жирной кислоты и сыворотки. Затем эксплантаты культивировали отдельно в течение 4 дней в 1 мл среды, свободной от жирной кислоты и сыворотки, без добавок (С), 10-6 М ретиноевой кислоты или 50 нг/мл онкостатина М (OSM). Необходимо заметить, что не все виды обработки были возможны для всех собак из-за доступности хряща. Высвобождение протеогликана в среде (мкг/мг сырого веса) измеряли в конце культивирования. В нижеприведенных таблицах представлены средние и стандартные отклонения высвобождения гликозаминогликана после тройного культивирования для каждой из четырех собак. Кроме того, представлены средние концентрации лактата (мкг/мг сырого веса) для каждой обработки.

ТАБЛИЦА 1.*
Собака 1,
лечебная схема
GAC,
среднее
GAC,
стандартное отклонение
n GAC, минимум GAC, максимум Лактат, среднее Лактат,
стандартное отклонение
С 1,363 0,497 3 0,849 1,84 26,07 33,7
С + носитель 1,630 0,306 3 1,31 1,92 21,95 22,6
С + 100 ЕРА 1,590 0,291 3 1,29 1,87 23,85 25,4
С + 300 ЕРА 1,036 0,528 3 0,57 1,61 NA**
RA 10,497 1,837 3 8,89 12,5 36 39,3
RA + носитель 7,15 4,527 3 2 10,5 33,067 45,4
RA + 100 EPA 8,677 1,999 3 6,61 10,6 29,367 34,8
RA + 300 EPA 1,593 1, 696 3 0,436 3,54 26,4 39,1
OSM 13,6 1,562 3 12,6 15,4 25,367 30,8
OSM + носитель 14,25 6,44 3 7,35 20,1 27,4 33,8
OSM + 100 EPA 6,293 2,301 3 4,34 8,8 33,567 52,5
OSM + 300 EPA 2,167 1,93 3 0,93 4,39 20,05 23,8
*GAG = гликозаминогликан; С = среда, свободная от сыворотки без добавок, ЕРА = эйкозапентаеновая кислота; RA = ретиноевая кислота; OSM = онкостатин М.
**не анализировали

Как показано в Таблице 1, существенное снижение высвобождения GAG происходило в присутствии 100 мкг/мл ЕРА в культурах, обработанных OSM, и в присутствии 300 мкг/мл ЕРА в культурах, обработанных OSM и RA. Не было отмечено существенного снижения средних концентраций лактата в присутствии любых доз ЕРА.

ТАБЛИЦА 2.*
Собака 2,
лечебная схема
GAG, среднее GAG,
стандартное отклонение
n GAG, минимум GAG, максимум Лактат, среднее Лактат, стандартное отклонение
С + носитель 0,503 0,422 3 0,127 0,96 22,8 NA
С + 100 ЕРА 0,340 0,333 3 0,1 0,72 39,523 24,568
С + 300 ЕРА 0,573 0,46 3 0,250 1,1 39,2 13,865
OSM + носитель 11,7 5,11 3 7,1 17,2 26,9 4,766
OSM + 100 EPA 5,25 3,002 3 2,19 8,19 21,7 9,838
OSM + 300 EPA 2,83 0,229 3 2,66 3,09 16,233 3,602
С + носитель 0,973 0,222 3 0,84 1,23 17,4 NA
C + 100 DHA 0,640 0,312 3 0,45 1 21 6,265
C + 300 DHA 0,843 0,361 3 0,43 1,1 36,2 NA
OSM + носитель 8,73 0,777 3 8,1 9,6 25,333 7,106
OSM + 100 DHA 8,567 4,219 3 3,7 11,2 28,133 2,715
OSM + 300 DHA 6,073 4,029 3 3,18 10,7 24,8 1,947
С + носитель 0,821 0,684 3 0,193 1,55 15,567 1,955
C + 100 ALA 1,12 0,0,89 3 1,05 1,22 28,4 13,718
C + 300 ALA 0,993 1,104 3 0,14 2,24 41,667 14,958
OSM + носитель 7,81 7,471 3 0,26 15,2 51,7 28,488
OSM + 100 ALA 8,497 4,356 3 4,09 12,8 28,8 4,957
OSM + 300 ALA 6, 72 2,730 3 3,44 8,8 55,233 30,305
*GAG = гликозаминогликан; С = среда, свободная от сыворотки без добавок, ЕРА = эйкозапентаеновая кислота; RA = ретиноевая кислота; OSM = онкостатин М.

Как показано в Таблице 2, ЕРА, а не ALA или DHA, существенно снижала высвобождение GAG в культурах, обработанных OSM. Не отмечено существенного влияния на среднюю концентрацию лактата любой жирной кислоты в любой дозировке.

ТАБЛИЦА 3.*
Собака 3,
лечебная схема
GAG,
среднее
GAG,
стандартное отклонение
n GAG, минимум GAG, максимум Лактат, среднее Лактат, стандартное отклонение
С + носитель 2,727 0,867 3 2,01 3,69 26,33 4,366
C + 100 ALA 2,117 0,428 3 1,81 2,61 24,4 3,995
C + 100 DHA 1,903 0,826 3 1,28 2,84 29,35 5,728
С + 100 ЕРА 1,673 0,409 3 1,3 2,11 36,1 NA
C + 300 ALA 2,447 0,321 3 2,14 2,18 20,75 7
C + 300 DHA 1,55 0,73 3 0,73 2,13 28,4 0,566
С + 300 ЕРА 1,567 0,387 3 1,3 2,01 10,525 10,854
RA + носитель 20,823 0,653 3 20,1 21,37 38,467 4,782
RA ++ 100 ALA 20,44 0,903 3 19,4 21,02 43,233 2,281
RA + 100 DHA 21,093 6,881 3 13,38 26,6 45,667 8
RA + 100 EPA 16,223 6,654 3 8,61 20,93 41,533 2,515
RA + 300 ALA 24,467 2,987 3 21,1 26,8 44,733 4,821
RA + 300 DHA 19,457 2,389 3 17,28 22 47,967 9,139
RA + 100 EPA 1,537 0,618 3 1,08 2,24 NA NA
OSM + носитель 12,773 5,845 3 6,36 17,8 37,867 11,547
OSM - 100 ALA 22,033 4,596 3 18,4 27,2 32,767 1,815
OSM - 100 DHA 11,667 6,007 3 5,5 17,5 32,267 11,467
OSM - 100 EPA 17,85 2,051 3 16,4 19,3 39,05 11,526
OSM - 300 ALA 23,467 3,102 3 20,3 26,5 34,033 1,38
OSM - 300 DHA 11,630 5,069 3 6,79 16,9 30,0 5,963
OSM - 300 EPA 8,1 6,767 3 3,79 15,9 21,467 1,93
*GAG = гликозаминогликан; С = среда, свободная от сыворотки без добавок, ЕРА = эйкозапентаеновая кислота; RA = ретиноевая кислота; OSM = онкостатин М.

Как показано в Таблице 3, ни одна из жирных кислот существенно не влияет на высвобождение GAG из RA- или OSM-стимулированных хрящей у этих конкретных животных. Не выявлено никаких изменений среднего лактата в связи с любой дозировкой любой жирной кислоты.

ТАБЛИЦА 4.*
Собака 4,
лечебная схема
GAC,
среднее
GAC, стандартное отклонение n GAC, минимум GAC, максимум Лактат, среднее Лактат, стандартное отклонение
С + носитель 1,96 0,533 3 1,51 2,55 22,933 4,75
C + 100 ALA 2,103 0,107 3 1,98 2,17 20,533 3,478
C + 100 DHA 2,343 0,331 3 2 2,66 19,1 2,352
С + 100 ЕРА 2,687 0,996 3 1,72 3,71 23 6,183
С + 300 ALA 1,533 1,244 3 0,13 2,5 29,167 22,074
C + 300 DHA 2,307 0,361 3 1,93 2,65 24,933 3,4
С + 300 ЕРА 2,1 0,455 3 1,64 2,55 24,767 13,004
RA + носитель 14,113 3,89 3 9,64 16,7 34,533 12,368
RA + 100 ALA 12,547 6,348 3 5,94 18,6 39,933 11,594
RA + 100 DHA 11,28 7,123 3 4,79 18,9 25,6 11,766
RA + 100 EPA 14,393 2,9 3 11,23 16,93 32,967 4,219
RA + 300 ALA 14,093 6,138 3 8,98 20,9 59,367 31,166
RA + 300 DHA 11,3 6,815 3 3,5 16,1 25,333 11,684
RA + 300 EPA 9,093 1,316 3 8,26 10,61 25,1 4,67
OSM + носитель 16,083 3,544 3 12,05 18,7 31,2 5,991
OSM + 100 ALA 11,7 2,19 3 9,43 13,8 26,333 9,25
OSM + 100 DHA 24,967 3,262 3 21,2 26,9 36,833 5,066
OSM + 100 EPA 15,883 4,316 3 11,95 20,5 27,237 6,34
OSM + 300 ALA 19,557 3,909 3 15,5 23,3 26,667 6,099
OSM + 300 DHA 16,4 6,27 3 9,4 21,5 36,233 20,342
OSM + 300 EPA 13,493 5,752 3 7,54 19,02 27,8 2,722
*GAG = гликозаминогликан; С = среда, свободная от сыворотки без добавок, ЕРА = эйкозапентаеновая кислота; RA = ретиноевая кислота; OSM = онкостатин М.

Как показано в Таблице 4, 300 мкг/мл ЕРА, а никакая другая жирная кислота в какой-либо дозировке, существенно снижает высвобождение GAG из культур, обработанных RA. Не выявлено существенного снижения средней концентрации лактата в контроле. Культуры, обработанные RA и OSM, предварительно обрабатывали 300 мкг/мл ЕРА OSM.

ПРИМЕР 2

В этом примере продемонстрировано включение n-3 жирных кислот в мембраны хондроцитов собаки.

Большинство из представленных экспериментов были выполнены с использованием однослойных культур, однако, в одном эксперименте было проанализировано включение жирных кислот в культуры хрящевых эксплантатов собаки.

Однослойные культуры.

Более 24 или 48 часов не отмечали включения 18 : 3 n-3 жирной кислоты ALA в мембраны хондроцитов двух собак. Процентное содержание 18 : 3 n-3 в хондроцитах, инкубированных в среде без добавок, было < 1 из 5 (диапазон 0,3-0,9%) и после 24 или 48 часов инкубации с добавлением 100 или 300 мкг/мл ALA, это процентное содержание существенно не изменилось (диапазон 0,3-2,5%).

Более чем через 48 часов было отмечено существенное включение 20 : 5 n-З жирной кислоты ЕРА в мембраны хондроцитов одной собаки. Процентное содержание 20:5 n-3 повысилось от < 1% (диапазон 0,2-0,6%) приблизительно до 7% (диапазон 5,6-8%) после обработки культур 100 или 300 мкг/мл ЕРА в течение 48 часов. Не было выявлено различий во включении ЕРА в мембраны хондроцитов при культивировании в присутствии или отсутствии 5% FCS.

Более чем через 48 часов было отмечено существенное включение 20 : 5 n-3 жирной кислоты ЕРА, но не 18 : 3 n-3 жирной кислоты ALA в мембраны хондроцитов одной собаки (дозировки 300 мкг/мл для каждой жирной кислоты). Процентное содержание 20:5 n-3 повысилось от < 1% приблизительно до 15%.

Более чем через 3 или 6 дней инкубации было отмечено существенное включение 20 : 5 n-3 жирной кислоты ЕРА мембраны хондроцитов одной собаки (дозировка 300 мкг/мл ЕРА). Процентное содержание 20 : 5 n-3 повысилось от < 1% до 16-18% без различия между 3 и 6 днями инкубации.

Культура эксплантата

Через 6 дней было отмечено несомненное включение 20:5 n-3 жирной кислоты ЕРА, но не 18:3 n-3 DHA или n-6 жирной кислоты АА (арахидоновая кислота) в хрящевые эксплантаты одной собаки (дозировки 300 мкг/мл для каждой жирной кислоты). Процентное содержание n-3 20 : 5 повысилось от 0% (неопределяемое) приблизительно до 2%.

Эти данные указывают на то, что ЕРА, но не другая n-3 жирная кислота, включалась в мембрану хондроцитов собаки или в однослойных культурах, или в культурах эксплантатов.

ПРИМЕР 3

В этом примере продемонстрировано действие n-2 жирных кислот на метаболизм хондроцитов собаки.

Для оценки потенциального действия n-3 жирных кислот на метаболизм белка и протеогликанов в хрящевой ткани собаки, были созданы культуры, как описано в Примере 1, за исключением последних 4 дней культивирования, не добавляли никакого стимулятора катаболизма (то есть все «контрольные» культуры). В течение последних 24 часов культивирования, в культуральную среду для радиометки вновь синтезированных протеогликанов и белков, добавляли (1)35SO4, или (ii) 35S-метионин и 35S-цистеин соответственно. Включение радиометки в хрящевую основу измеряли по окончании культивирования. Не было предпринято попытки провести количественный анализ потери радиомеченного материала в хряще сверх 24-часового периода после введения метки. Среднее и стандартное отклонение включения 35SO4 ("PG") или 35S-метионина, или 35S-цистеина ("PROT"), выраженные как DPM/мг сырого веса, представлены в Таблице 5 ниже.

ТАБЛИЦА 5.*
Лечебная схема PG,
среднее
PG,
стандартное отклонение
N PROT,
среднее
PROT,
стандартное отклонение
Носитель 292,667 53,144 3 574,333 198,336
100 ALA 246,333 100,779 3 503,667 184,218
100 DHA 156,0 82,529 3 503,667 81,365
100 ЕРА 537,333 161,81 3 442,0 72,746
300 ALA 443,0 205,385 3 393,667 34,962
300 DHA 123,333 38,24 3 564,333 220,048
300 ЕРА 275,667 161,661 3 504,0 44,542
*PG = включение 35SO4, выраженное в DPM/мг сырого веса; PROT = включение 35S-цистеина, выраженные как DPM/мг сырого веса; ЕРА = эйкозапентаеновая кислота; DHA = докозагексаеновая кислота; ALA = альфа-линоленовая кислота.

Как показано в Таблице 5, не было выявлено существенного влияния любой n-3 жирной кислоты на синтез белка и включение в хрящевую основу. ЕРА в дозировке 100 мкг/мл существенно повышала синтез и включение протеоглиганов. Никакие другие дозировки или жирные кислоты существенно не изменяли синтез протеогликанов и включение в хрящевую основу.

Для измерения уровней экспрессии мРНК протеиназ матрикса (аггреканазы-1 и аггреканазы-2), циклооксигеназы-1 и 2, липоксигеназы-5 и 12 и потенциальных аутокринных цитокинов и их рецепторов (например, IL-1, IL-6 и TNF) использовали метод ПЦР с обратной транскрипцией.

Результаты этого исследования показали, что мРНК аггреканазы-1 и аггреканазы-2 экспрессировались в «нормальной» хрящевой ткани собаки. Кроме того, у некоторых собак экспрессировалась мРНК циклооксигеназы-2 (СОХ-2), хотя у этих собак не было признаков патологии суставов. Это позволило контролировать эффекты добавления n-3 и n-6 жирных кислот на экспрессию мРНК аггреканаз и СОХ-2 в не стимулированных эксплатнтатах суставных хрящей собак. ЕРА была единственной жирной кислотой, способной снижать синтез мРНК ферментов деструкции, аггреканазы-1 и аггреканазы-2, в суставном хряще собаки. Это служит доказательством способности ЕРА «выключать» гены, ответственные за деградацию хряща.

ПРИМЕР 4

Это исследование демонстрирует эффекты омега-3 жирных кислот в клинических испытаниях остеоартрита собак.

Три клинических испытания проводили у собак с клиническим диагнозом остеоартрит. Ветеринары-терапевты и ветеринары-ортопеды регистрировали владельцев, чьи собаки удовлетворяли определенным критериям. Для всех пациентов было необходимо иметь радиографичекие признаки остеоартрита с заметными клиническими проявлениями заболевания, основанными на описаниях владельцев собак и объективных обследованиях ветеринарами; в остальном быть здоровыми и не страдать конкурирующими заболеваниями, что должно быть подтверждено объективным обследованием, общим анализом крови, биохимическим анализом крови и анализом мочи; поддерживать режим лечения при получении медикаментов или пищевых добавок, прописанных для лечения остеоартрита, в течение 30 дней до зачисления в список клинического исследования.

Были проведены следующие измерения.

Профиль жирной кислоты в сыворотке крови определяли методом газовой хромотографии, включая экстракцию жирных кислот с помощью фенольно-метанольной смеси (2:1), метилирование с использованием трехфтористого бор-метилового реагента (BF3:MeOH) с последующим использованием плазменно-ионизационного детекора (FID). Метиловые эфиры жирных кислот определяли путем сравнения времен удержания с таковым известных стандартов и количественного анализа с использованием внутреннего стандарта.

Ветеринарная клиническая оценка: ветеринары проводили и физикальную оценку, и клиническую оценку собак с остеоартритом на протяжении скрининговой фазы и в заключение каждого периода кормления на протяжении курса клинического испытания. Ветеринары оценивали тяжесть пяти параметров остеоартрита: хромота, нежелание оказывать весовую нагрузку на поврежденную конечность, уменьшение диапазона движения, нежелание удерживать на весу контралатеральную конечность, и боль при пальпации сустава. Изменения в шкале тяжести для этих отдельных параметров измеряли на протяжении периода кормления. Всесторонняя ветеринарная клиническая оценка эффективности диетического воздействия на состояние остеоартрита у пациентов была получена путем объединения показателей тяжести всех пяти отдельных параметров.

Субъективная оценка владельцем домашнего животного: владельцам домашних животных было необходимо заполнить регистрационную анкету перед участием в исследовании и ответить на дополнительные вопросы по завершении каждого периода кормления на протяжении курса клинического испытания.

Регистрационный опросный лист - владельцы домашних животных оценивали наблюдаемую частоту и тяжесть наиболее общих проявлений остеоартрита у собак, включая затруднение при подъеме после отдыха, прихрамывание, неподвижность, болезненность при ощупывании, отставание во время прогулок, взвизгивание или скуление от боли, агрессивное поведение, затруднение при беге, затруднение при ходьбе, затруднение при преодолении подъема, затруднение при прыганиях, затруднение при игре, снижение подвижности и общего уровня активности. Кроме того, владельцы оценивали состояние остеоартрита в целом у своих домашних животных.

Опросный лист во время периодов кормления - владельцы домашних животных оценивали и частоту, и изменение тяжести проявлений остеоартрита у собак, оцененные при регистрации. Кроме того, владельцы оценивали у своих животных интенсивность боли, связанной с остеоартритом.

Анализ ходьбы по плите распределения нагрузки: собак тестировали в соответствующих институтах с использованием компьютеризированной биомеханической плиты распределения нагрузки в день 0, на 6 неделе и на 12 неделе. Плита была установлена по центру и вровень с поверхностью длиной пробега 10 метров. Проводчик пробегал с собаками через плиту распределения нагрузки, а наблюдатель оценивал каждое прохождение через плиту для подтверждения опоры на лапы и походки. Испытание считалось действительным, если были отличимые опоры на переднюю и заднюю конечности, расположенные на одной стороне, во время пробегания собакой через плиту распределения нагрузки со скоростью 1,7-2,0 м/сек, с изменением ускорения от -0,5 до 0,5 мс2. В течение каждого испытания с использованием миллисекундометра и двух фотоэлектрических выключателей измеряли поступательную скорость собаки. Каждое испытание было записано на видеокассету для просмотра и подтверждения полноценных опираний на лапы. Такая мера предосторожности была предпринята для того, чтобы быть уверенным, что собака начала движение, таймер и согласованная скорость (воспринятая проводчиком и наблюдателем) поддерживались на протяжении каждого испытания.

Для каждой поврежденной конечности и каждой ипсолатеральной конечности каждой собаки были проведены пять полноценных испытаний для каждого периода тестирования. С помощью специализированной компьютерной программы были измерены и зарегистрированы ортогональное воздействие на грунт максимальной вертикальной силы, вертикальное усилие, максимальные сила торможения и толкающая сила, импульсы толчка и торможения (Acquire, Sharon Software, DeWitt, MI). Все силы были стандартизированы относительно массы тела в килограммах. Результаты полноценных испытаний для каждой конечности были усреднены для получения среднего значения для каждой силы или импульса в каждый временной период.

Данные воздействия на грунт сравнивали между экспериментальной группой и группой, получающей плацебо, как процентную разницу между поврежденной и ипсолатеральной конечностями в каждый период времени. Относительное изменение воздействия на грунт поврежденной конечности, выраженное в процентах, сравнивали в начале и по окончании периода кормления.

ИССЛЕДОВАНИЕ 1

Исследование собак проводили для того, чтобы оценить диетический эффект высоких дозировок n-3 жирных кислот у собак с диагнозом остеоартрит. Восемнадцать ветеринаров-терапевтов были временно наняты для регистрации пациентов в этом исследовании. Собаки общей численностью 131 особь случайным образом были распределены на две группы режима питания и продолжительностью кормления 180 дней. Экспериментальный и контрольный рационы имели схожее содержание макронутриентов, но имели существенное различие по составу жирных кислот (Таблица 6). Экспериментальный рацион содержал высокие уровни ALA, EPA и DHA и был составлен с низким отношением n-6 : n-3. Контрольный рацион представлял собой наиболее продаваемый коммерчески доступный корм для собак, с типичными уровня