Циклофилин а - средство, обладающее гепариноподобным действием

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к средствам, обладающим гепариноподобным действием. Циклофилин А - белок с молекулярной массой 18 кД в дозе 10 мкг/мл обладает гепариноподобным действием. Изобретение обеспечивает расширение спектра веществ с гепариноподобным действием. 4 ил.

 

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к средствам, обладающим гепариноподобным действием.

Известно, что для профилактики и лечения тромбофилий в качестве лекарственных средств используют вещества, обладающие ингибирующим действием на активированный фактор X. К таким веществам относятся низкомолекулярные гепарины, гепариноиды [Чарная М.А., Морозов Ю.А. Тромбозы в клинической практике. // М., ГЭОТАР-Медиа. - 2009. - С.39-92; Hirsh J., Raschke R. Heparin and low-molecular-weight heparin: the Seventh ACCP Conference on antithrombotic and thrombolytic therapy. // Chest. - 2004. - Vol.126 (3 suppl.). - P.188S-203S; Rutherford R. Vascular surgery, sixth edition. Prevention and medical treatment of acute deep venous thrombosis. // Philadelphia, Pa. - WB Saunders C, 2005. - 780 p.].

Циклофилин A - белок с молекулярной массой 18 кД, участвующий в процессах внутриклеточного транспорта белков и обладающий цис-транс-изомеразной активностью [Fisher G., Bang С., Mech С.Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides. // Biomed. Biochem. Acta. - 1984. - Vol.43. - P.1101-1111]. Циклофилин А секретируется клетками тимуса и регулирует миграцию клеток-предшественников из костного мозга в кровь [Khromykh L.M., Kulikova N.L., Anfalova T.V., Muranova Т.А., Abramov V.M., Vasiliev A.M., Khlebnikov V.S., Kazansky D.B. Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells. // Cell Immunol. 2007 Sep; 249(1):46-53], а также миграцию зрелых моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов и Т-лимфоцитов к месту воспаления [Q.Xu, M.C.Leiva, S.A.Fischkoff, R.E.Handschumacher, C.R.Lyttle. Leukocyte chemotactic activity of cyclophilin. J Biol. Chem. 267. 1992. P.1168-71]. При повреждении сосудистой стенки активированные тромбоциты также способны секретировать циклофилин A [Coppinger J.A., Cagney G., Toomey S. et al. Characterization of the proteins released from activated platelets leads to localization of novel platelet proteins in human atherosclerotic lesions. // Blood. - 2004. - Vol.103, №6. - P.2094-2104].

При оксидативном стрессе циклофилин A секретируется гладкомышечными клетками сосудистой стенки и стимулирует пролиферацию эндотелиоцитов [Lay A., Jiang Х.М., Kisker О., et al. Phosphoglycerate kinase acts in tumour angiogenesis as a disulphide reductase. // Nature. - 2000. - Vol.408. - P.869-873].

Задачей изобретения является расширение спектра биологической активности циклофилина A как средства, обладающего гепариноподобным действием.

Для выполнения поставленной задачи использовали рекомбинантный циклофилин A человека и проводили оценку его влияния на показатели свертывающей системы крови in vitro.

Рекомбинантный циклофилин A человека получали из трансфецированных геном циклофилина A человека клеток E-coli с дальнейшей очисткой. Чистота используемого белка ~98%.

Для исследования использовали кровь пациентов с ишемической болезнью сердца (25 человек) или ревматическим пороком сердца (25 человек), которую получали из центрального венозного катетера, установленного в подключичную или яремную вену. Полученную кровь стабилизировали раствором 3,8% цитрата натрия в соотношении кровь/цитрат = 9/1. Кровь центрифугировали при скорости 3000 об/мин в течение 15 минут, отбирали бедную тромбоцитами плазму, которую использовали в экспериментах.

Циклофилин A добавляли к исследуемой плазме до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубировали при температуре 37°C. Для проведения анализа от основного объема отбирали аликвоты плазмы через 10, 30 и 60 минут инкубации, в которых определяли протромбиновое время (ПТВ, с), тромбиновое время (ТВ, с), активированное частичное.

Для определения ПТВ 0,1 мл плазмы нагревали при температуре 37°C в течение 2 минут, добавляли 0,2 мл раствора тромбопластина (Ренампластин, фирма «Ренам», Москва) и регистрировали время образования сгустка.

Для определения ТВ 0,1 мл плазмы нагревали при температуре 37°C в течение 1 минуты, затем добавляли 0,1 мл раствора тромбина с активностью 6 NIH (Тромбо-тест, фирма «Технология-Стандарт», Россия) и регистрировали время образования сгустка.

Для определения АЧТВ к 0,1 мл плазмы добавляли 0,1 мл АЧТВ-реагента (фирма «Технология-Стандарт», Россия), инкубировали в течение 2 минут, затем добавляли 0,1 мл 0,025М раствора хлорида кальция (фирма «Технология-Стандарт», Россия) и регистрировали время образования сгустка.

Для определения анти-Ха-активности к 0,1 мл субстратной (донорской) плазмы добавляли 0,025 мл плазмы пациента, нагревали в течение 1 минуты и добавляли 0,05 мл раствора фосфолипидов (фирма «Ренам», Москва), инкубировали 2 минуты, добавляли 0,035% раствор хлорида кальция и регистрировали время образования сгустка. По контрольному графику находили анти-Ха-активность, соответствующую данному времени свертывания.

Влияние циклофилина A на протромбиновое время.

ПТВ характеризует оценку внешнего пути свертывания крови, отражает активность факторов VII, V, II, I. Влияние циклофилина A в дозе 10 мкг/мл на ПТВ показано на Фиг.1. Из представленных данных следует, что циклофилин A не влияет на величину ПТВ.

Влияние циклофилина A на тромбиновое время.

ТВ отражает общий (конечный) путь свертывания крови. Влияние циклофилина A в дозе 10 мкг/мл на ТВ показано на Фиг.2. Из представленных данных следует, что циклофилин A не влияет на величину ТВ.

Влияние циклофилина A на активированное частичное тромбопластиновое время.

АЧТВ отражает внутренний путь свертывания крови и активность факторов XII, XI, X, VIII. Влияние циклофилина A в дозе 10 мкг/мл на АЧТВ представлено на Фиг.3. Показано, что через 10 минут инкубации АЧТВ удлинялось в среднем на 18,4% и это удлинение сохранялось вплоть до 60 минуты инкубации.

Влияние циклофилина A на анти-Ха-активность плазмы.

Влияние циклофилина А в дозе 10 мкг/мл на анти-Ха-активность плазмы представлено на Фиг.4. Установлено, что при действии циклофилина A через 10 минут инкубации анти-Ха-активность плазмы увеличивалась с 0,03 до 0,24 анти-Ха ЕД/мл (800%), а через 30 и 60 минут инкубации анти-Ха-активность снижалась до 0,11 и 0,10 анти-Ха ЕД/мл, соответственно.

Технический результат изобретения.

Циклофилин A - средство, обладающее гепариноподобным действием.

Циклофилин А - средство, обладающее гепариноподобным действием.