Способ очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол



Способ очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол
Способ очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол
Способ очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол
Способ очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол

 

C07K1/16 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2422456:

Государственное научное учреждение (ГНУ) Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол. Очистку высокомолекулярных белковых антигенов фасциол проводят с использованием высокоэффективной хроматографии. Причем белковые экстракты фасциол (F.hepatica и F.gigantica) фракционируют гель-фильтрацией экстракта на колонке HR 10/30 с суперозой 12. После чего полученный при первом фракционировании пул фракций, в которых обнаружены высокомолекулярные белковые антигены, повторно хроматографируют на колонке с тем же сорбентом. Антигенную активность фракций определяют реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле с использованием трех типов сывороток, содержащих антитела к разным антигенным компонентам фасциол. Полученный данным способом продукт может быть использован в качестве диагностикума, а также для изучения молекулярных основ иммунологического родства и видовых различий в антигенах разного происхождения. Предложенное изобретение позволяет повысить степень очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов двух видов фасциол (F.hepatica и F.gigantica). 4 ил.

 

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а более конкретно - к получению диагностических антигенных препаратов из гельминтов, в частности - из фасциол.

Известны способы получения из фасциол суммарных антигенных материалов в виде белковых экстрактов или секреторно-экскреторных продуктов этих паразитов, которые включают массу иммунологически активных компонентов, не равнозначных по своей диагностической эффективности (3-5, 7).

Известны способы получения отдельных диагностически ценных антигенных компонентов фасциол путем освобождения экстрактов от неспецифических примесей. Однако физико-химические характеристики выделенных антигенных компонентов не соответствуют параметрам группы высокомолекулярных белковых антигенов. Это другие вещества (2, 6, 8, 9).

Наиболее близким прототипом является способ фракционирования белковых экстрактов фасциол на сефадексе G-200 или сефарозе 6В (1), позволяющий в процессе одного хроматографического опыта разделить многочисленные антигены фасциол на 3 группы, каждая из которых включает, помимо балластных веществ, по несколько антигенных компонентов, обладающих диагностической ценностью:

1) высокомолекулярные небелковые антигены, растворимые в трихлоруксусной кислоте (мукополисахариды);

2) высокомолекулярные белковые антигены;

3) белковые антигены относительно невысокого молекулярного веса, основным компонентом которых является антиген с молекулярной массой около 28kD, обладающий протеолитической активностью (кислая протеиназа - гемоглобиназа).

Недостатком группы высокомолекулярных белковых антигенов, полученной на сефадексе G-200 или сефарозе 6В, является то, что она в отличие от мукоидов и протеиназы дополнительной очистке не подвергалась и представляет собой гетерогенную белковую смесь, включающую, кроме нескольких преципитирующих антигенных компонентов, многие балластные белки, в том числе и белки хозяина, а также небольшие примеси мукоидов и протеиназы.

Целью данного изобретения является повышение степени очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов двух видов фасциол (Fasciola hepatica и Fasciola gigantica).

Поставленная цель достигается тем, что проводят хроматографическое фракционирование полученного из фасциол белкового экстракта на суперозе 12 с последующей рехроматографией на той же колонке пула фракций, в которых обнаружена активность высокомолекулярных белковых антигенов.

Примеры конкретного исполнения

Пример 1. Взрослых паразитов вида F.hepatica, собранных из желчных протоков при убое зараженного скота, свежих или замороженных, гомогенизируют в блендерах разных конструкций на холоде при соотношении веса фасциол и объема буферного раствора 1:1 с добавлением охлажденного эфира. Можно использовать любой буферный раствор, обеспечивающий величину рН 7-8. В качестве детергента, вместо эфира, можно использовать неионный детергент тритон Х-100.

Полученный гомогенат центрифугируют 20 минут на рефрижераторной центрифуге (+4°С) при 10000 об/мин. Супернатант, представляющий собой тотальный белковый экстракт, отделяют от осадка и фракционируют методом гель-фильтрации на колонке HR 10/30 с суперозой 12 в хроматографической системе FPLC шведской фирмы Pharmacia

- LKB при скорости потока 0,5 мл/мин. Максимальный объем образца - 500 µl. Сбор фракций по 1 мл в 2-минутные интервалы времени.

Результаты фракционирования экстракта представлены на фиг.1 (верхний график), где по горизонтали обозначены номера фракций, а по вертикали - оптическая плотность в процентах при длине волны 280 нм. График вычерчен плоттером на термической бумаге при чувствительности монитора 0,1.

На фиг.2 (верхний снимок) представлены результаты иммунологического анализа фракций №№7-18 реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле. Использовали штамп "семерка", периферические лунки которого заполняли образцами фракций, а центральные лунки - соответствующими референс-сыворотками. Сыворотка А содержит антитела к группе мукоидных антигенов. Сыворотка В реагирует с высокомолекулярными белковыми антигенами, а сыворотка С - с антигеном-протеиназой.

Активность основного антигенного компонента группы высокомолекулярных белковых антигенов в виде единственной полосы преципитации обнаружена во фракциях №№10-11, тогда как мукоиды попадают во фракции №№7-8, а протеиназа

- во фракции №№13-16. Антигенные фракции в соответствии с их специфической активностью были объединены в 3 пула (мукоиды, высокомолекулярные белковые антигены и антиген-протеиназа).

При фракционировании экстракта с 5-кратно большей концентрацией антигенного материала в элюате, вытекающем из колонки, удается обнаружить не один, а до 4 антигенных компонентов группы высокомолекулярных белковых антигенов (2 основных и 2 минорных), которые распределяются во фракциях №№10-12 с максимальной активностью во фракции №11 (фиг.2, штамп В внизу).

Таким образом, на суперозе 12 происходит разделение антигенов фасциол на 3 группы, в которых в отличие от разделения на сефадексе G-200 или сефарозе 6В препипитиновые реакции не показали взаимных примесей. Однако эти примеси и примеси других белков в полученном препарате высокомолекулярных белковых антигенов были обнаружены иммуноблоттингом (фиг.3), где под номером 1 представлен анализ исходного экстракта, под номером 2 - препарат мукоидных антигенов (сами мукоиды, ввиду их незаряженности в данных условиях опыта, не видны, а видны лишь примеси), под номером 3 представлены результаты иммуноблоттинга высокомолекулярных белковых антигенов, где присутствует примесь протеиназы и других белков, под номером 4 представлены результаты иммуноблоттинга препарата протеиназы с примесями.

На графике фракционирования экстракта (фиг.1, вверху) группа высокомолекулярных белковых антигенов (фракции 10-11) соответствует пику 2, на долю которого приходится около 7% белка исходного экстракта.

Хроматографический анализ продукта, полученного после первого разделения (пул фракций №№10-11) показал его гетерогенность, выражающуюся в множественности пиков (фиг.1, средний график). Здесь на долю пика 2, соответствующего высокомолекулярным белковым антигенам (фракции 10-12), приходится около 33% белка фракционируемого образца.

Проведение второго этапа (рехроматография на той же колонке с суперозой 12 пула фракций №№10-11, полученных при первом разделении) показало отделение многих белков в виде отдельных пиков (фиг.1, график посередине). Большинство фракций, как ненужные примеси, было отброшены, а оставшийся продукт (пул фракций 10-12, в которые попали высокомолекулярные белковые антигены) при третьем разделении не показал примесей и дал единственный пик (фиг.1, нижний график), на долю которого приходится около 98% белка фракционируемого образца. Удаление примесей других антигенных компонентов показал иммуноблоттинг (фиг.3, номер 5). Следовательно, в третьем разделении нет необходимости.

Таким образом, проведение второго разделения оказалось достаточным и полученный при этом препарат высокомолекулярных белковых антигенов (фракции №№10-12) не содержал антигенов смежных групп - мукоидов и протеиназы.

Параметры фракционирования на суперозе 12 при скорости потока 0,5 мл/мин для группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол на конечном этапе: Retention - 20,02 min Duration - 7,28 min Accumulated Area (AA) - 98,3%, Max tube - 11 (при min/ mark-2,0).

Хроматографический анализ исходного экстракта с множеством пиков и конечного продукта в виде единственного пика представлен на фиг.4. Графики вычерчены рекордером и относятся к тем же опытам, что и на фиг.1. Помеченный стрелкой пик соответствует группе высокомолекулярных белковых антигенов.

В очищенном препарате преципитиновым методом обнаружено два основных и два минорных антигенных компонента. Методом электрофореза в денатурирующей системе с последующим иммуноблоттингом установлено, что молекулярная масса основных антигенных компонентов близка к молекулярной массе сывороточного альбумина (68 kD).

Пример 2. Тотальный белковый экстракт получают из фасциол вида F. gigantica. Параметры выделения группы высокомолекулярных белковых антигенов из этого вида фасциол те же, что и в примере 1. Антигенные компоненты очищенного препарата в реакции диффузионной преципитации показывают иммунологическую идентичность с соответствующими компонентами F. hepatica.

Полученные препараты высокомолекулярных белковых антигенов двух видов фасциол могут быть использованы в качестве диагностикумов, а также для изучения молекулярных основ иммунологического родства и видовых различий в антигенах разного происхождения.

Источники информации

1. Клименко В.В. Сочетание фракционирования антигенов фасциол на гелях сефадекса и сефароза, их физико-химические и иммунологические свойства. Тр. Всес. ин-та гельминтол. 1984, т.27, c.67-79.

2. Клименко В.В. Очистка главного антигенного компонента Fasciola hepatica и его функция в организме этого гельминта. Тр. Всес. ин-та гельминтол. 1992, т.31, c.59-73.

3. Ambroise-Thomas P., Desgeorges P.T., Bouttaz M. Le diagnostic immunoenzymologique (ELISA) de la fasciolose humaine et bovine. Detection d'anticorps et/or d'antigens circulans. Ann. Soc. beige Med. trop., 1980, 60, 47-60.

4. Espino Ana M., Dumenigo Blanca E., Femandez Roberto, Finlay Carlos M. Immunodiagnosis of human fascioliasis by enzyme-linked immunosorbent assay using excretory-secretory products. Am. J. Trop.Med. Hyg. 1987, 37, №3, 605-608.

5. Farrell С.J., Shen D.Т., Wescott R.В., Lang B.Z. An enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis on Fasciola hepatica in cattle. Am. J. Vet. Res. 1981, 42, 237-240.

6. Geyer E. Darstellung und Charakterisierung eines Fasciola hepatica-Totalhomogenatextrakt-Antigens. Z. Parasitenkunde, 1969, 33, №2, 135-163.

7. Speiser F., Weiss N. Comparative evaluation of 7 helminth antigens in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Experientia, 1979, 35, 1512-1593.

8. Tailliez R., Korach S. Les antigenes de Fasciola hepatica. 1. Isolement et characterization d'un antigene specifique du genre. Ann. Inst. Pasteur, 1970, 118, №1, 61-78.

9. Zimmerman G.L., Clark С.R.В. Separation of parasite antigens by molecular exclusion, anion exchange and chromatofocusing utilizing FPLC-protein fraction systems. Veter. Parasitol., 1986, 20, №1-3, 217-228.

Способ очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол, включающий фракционирование тотального белкового экстракта фасциол с использованием хроматографических методов, отличающийся тем, что проводят гель-фильтрацию экстракта на колонке HR 10/30 с суперозой 12, а полученный при этом пул фракций, в которых обнаружены высокомолекулярные белковые антигены, повторно хроматографируют на колонке с тем же сорбентом.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантных белков шелка пауков. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных белков шелка паука, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам получения полипептидов, обладающих выраженным анальгетическим действием. .

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. .
Изобретение относится к косметическому средству, предназначенному для повышения эластичности кожи и содержащему активный ингредиент и носитель, где активный ингредиент содержит комплекс, который включает теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид, имеющий сигнал ядерной локализации, и который способен проникать через плазматическую мембрану клетки.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в различных областях промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медико-биологической промышленности при получении препаратов, используемых в качестве смазывающих веществ, антиадгезивных средств и/или внутрисуставных добавок.

Изобретение относится к способу выделения рекомбинантных белков из трансформированных хозяев. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности касается вакцинного препарата, который может быть использован для борьбы с вирусными и другими заболеваниями инфекционной природы.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения иммуногенного рекомбинантного экстраклеточного фрагмента коннексина-43. .

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии эукариотической клетки и может быть применено к анализу молекулярно-генетических механизмов формирования структур клеточного ядра и роли белковых компонентов в их организации, что необходимо для получения дополнительной информации в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления.
Изобретение относится к способу получения железосодержащего сукцинилированного казеина, включающий стадии: а) реакция казеина, по меньшей мере, с одним сукцинилирующим агентом с образованием водной суспензии сукцинилированного казеина, причем стадия (а) включает стадии: (а1) суспендирование казеина в воде; (а2) при необходимости, доведение рН водной суспензии по меньшей мере до 6; (а3) добавление, по меньшей мере, одного сукцинилирующего агента при поддержании рН, по меньшей мере, 6 посредством добавления, по меньшей мере, одного основания; (а4) осаждение полученного сукцинилированного казеина после добавления сукцинилирующего агента путем доведения рН до приблизительно от 2 до 7,0 для получения водной суспензии сукцинилированного казеина, имеющей рН приблизительно от 2 до 7,0, b) реакция водной суспензии сукцинилированного казеина, полученного на стадии (а), с, по меньшей мере, одной солью железа с образованием железосодержащего сукцинилированного казеина, причем стадия (b) включает добавление, по меньшей мере, одной соли железа к водной суспензии сукцинилированного казеина при поддержании рН казеина равным, по меньшей мере, 2 посредством добавления, по меньшей мере, одного основания для получения железосодержащего сукцинилированного казеина.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается конъюгатов "производное калихеамицина-носитель". .
Наверх