Антимикробные и противовоспалительные вещества, выделенные из экстракта лакричника

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к антибактериальной и противовоспалительной композиции. Антибактериальная или противовоспалительная композиция по уходу за ротовой полостью или телом, включающая экстракт корней растения Glycyrrhiza sp., при этом главными компонентами экстракта являются пренилированные флавоноиды, и корни экстрагированы способом экстрагирования СО₂ в сверхкритическом состоянии. Вышеописанная композиция обладает повышенным антибактериальным и противовоспалительным действием. 27 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

 

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Экстракты из корней растений рода Glycyrrhiza (Glycyrrhiza sp.) используют, кроме прочего, в качестве вкусовых добавок, причем экстракт придает вкус лакрицы (лакричника; солодки). В современных методах экстрагирования используют метод экстрагирования горячей водой. В этом способе преимущественно выделяют гидрофильные компоненты корня растений. Главным отдельным компонентом, выделенным с помощью методов экстрагирования, известных из уровня техники, является глицирризиновая кислота. Глицирризиновую кислоту используют преимущественно в качестве подсластителя и вкусовой добавки. В способах экстрагирования, известных из предшествующего уровня, удаляется мало или не извлекаются гидрофобные или липофильные компоненты корня растений.

В других известных методах в процессе экстрагирования используются органические растворители. В этих процессах удаляется больше липофильных компонентов корня растений, но есть большие проблемы с окружающей средой, связанные с использованием органических растворителей. Кроме того, оба известных способа экстрагирования (горячей водой и органическим растворителем) имеют значительные проблемы в отношении, например, образования и удаления отходов. Экстракты в органических растворителях имеют проблему с отработанными органическими веществами, с их удалением или рециклизацией. Способы с экстрагированием горячей водой, которые являются предпочтительными при экстрагировании гидрофильных соединений, не эффективны при экстрагировании липофильных соединений. К тому же израсходованная использованная вода должна быть обработана перед тем как возвратиться в источник воды в окружающей среде.

Различные компоненты экстрактов Glycyrrhiza sp., как показано, обладают противовоспалительным, антибактериальным и антиадгезивным действием. Однако эффекты, наблюдаемые у известных экстрактов, были противоречивыми. Например, по одному из исследований сообщали, что включение 0,25-0,5% глицирризиновой кислоты (главного компонента экстрактов лакрицы, полученного известными методами экстрагирования) было неэффективно для удаления или профилактики образования бляшек (Goultschin et al., J. Clin. Periodontol. 18:210-212, 1991).

Поэтому необходим способ экстрагирования корней Glycyrrhiza sp., который дает меньше отходов и оказывает меньшее воздействие на окружающую среду, чем прежние способы экстрагирования, в то же время дает экстракт, который более эффективен для обеспечения противовоспалительных, антибактериальных и антиадгезивных свойств путем выделения большего процента всех возможных липофильных компонентов корней растений и, в частности, большего общего процента доступных пренилированных флавоноидов корней растений.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение представляет в одном из аспектов новые и неочевидные способы получения экстрактов из корней Glycyrrhiza sp. В одном из воплощений способ экстрагирования данного изобретения включает использование процесса экстрагирования СО₂ в суперкритическом состоянии. Детали процесса по данному изобретению представлены ниже в описании предпочтительных воплощений. Способами данного изобретения решаются проблемы способов экстрагирования, известных из предшествующего уровня, путем значительного снижения или устранения необходимости органических растворителей во время процесса экстрагирования и получения экстракта, который богат пренилированными флавоноидами (например, изофлаванами, изофлаванолом, флавононом, изофлавоном), тогда как также фактически свободен или свободен от глицирризиновой кислоты (например, без обнаруживаемой глицирризиновой кислоты). Способами данного изобретения экстрагируются также липофильные компоненты в то же время с очень слабым экстрагированием гидрофильных компонентов. По способу данного изобретения также значительно снижается или устраняется образование потока выбрасываемой воды в результате процесса экстрагирования.

Данное изобретение, кроме того, относится к экстрактам, полученным по процессам экстрагирования данного изобретения. В одном из воплощений экстракт данного изобретения включает экстракт из G. uralensis, содержащий преимущественно ликорицидин и ликоризофлаван А (5-О-метилликорицидин) в качестве липофильных компонентов. По процессу экстрагирования данного изобретения не извлекается обнаруживаемое количество глицирризиновой кислоты, гидрофильного компонента корня растения. Оба, ликорицидин и ликоризофлаван А, являются пренилированными изофлаванами, особым видом флавоноидов. Для ликорицидина молекулярный вес составляет m/z=424. Для ликоризофлавана А молекулярный вес составляет m/z=438; УФ (МеОН): λmax=283 нм. В одном из воплощений экстракт данного изобретения выделяют без использования этанола в качестве модификатора во время процесса экстрагирования. В этом воплощении интервал концентрации ликорицидина и ликоризофлавана А составляет примерно 0,5-6,0% для обоих. В еще одном воплощении экстракт данного изобретения производят с использованием этанола в качестве модификатора во время процесса экстрагирования. При этом воплощении интервал концентраций ликорицидина и ликоризофлавана А составляет примерно 2,0-20,0% для ликорицидина и 1,0-8,0% для ликоризофлавана А. В еще одном воплощении концентрация глицирризиновой кислоты в экстрактах составляет менее 0,10%. В еще одном воплощении концентрация глицирризиновой кислоты в экстрактах составляет менее 0,01% или 0,001%. Кроме того, экстракты, полученные с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии, данного изобретения содержат также значительное количество жирных кислот (например, пальмитиновой и линоленовой кислот).

В дальнейших исследованиях обнаружено, что некоторые компоненты экстракта лакричника, полученного с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии, по данному изобретению исключительно хорошо подходят для получения противовоспалительных и антимикробных эффектов. В этом отношении ликорицидин и ликоризофлаван А обеспечивают наибольший уровень антимикробного эффекта. Кроме того, в этом отношении данное изобретение предполагает пероральные и по уходу за телом композиции, которые содержат ликорицидин и ликоризофлаван А в количестве, эффективном для получения антимикробного и противовоспалительного эффектов.

Другие виды Glycyrrhiza дают экстракты, в которых преобладающие липофильные компоненты являются пренилированными флавоноидами, хотя конкретные пренилированные флавоноиды могут меняться. Например, экстракт G. glabra, изготовленный путем процесса экстрагирования по данному изобретению, будет иметь в качестве основных пренилированных флавоноидов глабридин, метилглабридин и глаброл.

Когда используют этанол в качестве модификатора в процессе экстрагирования данного изобретения, этанол имеет концентрацию в диапазоне примерно 2,0 и 10%. В предпочтительном воплощении этанольный модификатор находится в количестве между примерно 4,0 и 6,0%. Использование этанола не является необходимым для получения экстрактов по данному изобретению. Этанол помогает экстрагировать наибольшие количества соединений, которые обладают менее липофильными свойствами, чем при использовании только СО₂.

Данное изобретение относится также к продуктам, которые изготовлены из указанных экстрактов. Хотя данное изобретение не ограничивается каким-либо конкретным использованием в отношении экстракта по данному изобретению, в предпочтительном воплощении экстракт используют в продукте для ухода за полостью рта. Примеры продуктов, подходящих для ухода за полостью рта, в которых можно использовать экстракт по данному изобретению, включают, но не ограничиваются этим, средства для ухода за зубами (зубную пасту, гели зубной пасты, зубные порошки, средства и соединения для чистки зубных протезов, жидкости для промывания ротовой полости и полоскания рта, зубочистки, зубные нити, жевательные резинки, пастилки, лепешки, растворимые таблетки, жевательные таблетки и т.д.). Кроме того, экстракты по данному изобретению можно использовать в продуктах по уходу за телом, таких как, но без ограничения ими, кремы для кожи, лосьоны для кожи, солнцезащитные композиции, мыла, продукты по уходу за детьми, продукты для бритья, дезодоранты, шампуни и т.д.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1 представлена хроматограмма экстрактов Glycyrrhiza uralensis, полученных А) экстрагированием горячей водой, В) экстрагированием этанолом, С) экстрагированием этилацетатом, D) экстрагированием СО₂ в суперкритическом состоянии и Е) экстрагированием СО₂ в суперкритическом состоянии с этанолом в качестве модификатора.

На фигуре 2 показаны химические структуры ликорицидина и ликоризофлавана А, в которых R=H для ликорицидина и R=Me для ликоризофлавана А.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

Данное изобретение относится к экстрактам из Glycyrrhiza sp., которые получены способом с меньшим воздействием на окружающую среду, чем в известных способах экстрагирования, и при котором экстрагируется больший процент липофильных компонентов с экстрагированием в то же время меньшего количества гидрофильных компонентов, чем в известных способах. Данное изобретение относится также к использованию экстрактов по данному изобретению. В другом аспекте данное изобретение относится к способу экстрагирования Glycyrrhiza sp., при котором используется процесс экстрагирования СО₂ в суперкритическом состоянии.

Экстракты могут быть получены из корней разных видов бобовых растений из рода Glycyrrhiza, а более конкретно из вида Glycyrrhiza uralensis. Данные растения являются естественной флорой на юге Европы и частично Азии. G. uralensis широко используется в традиционной китайской медицине. Также данное изобретение не ограничивается каким-либо конкретным растительным источником. Другие известные виды Glycyrrhiza, из которых могут быть произведены экстракты способами по данному изобретению, включают, но не ограничиваются этим, Glycyrrhiza acanthocarpa, Glycyrrhiza aspera, Glycyrrhiza astragalina, Glycyrrhiza bucharica, Glycyrrhiza echinata, Glycyrrhiza eglandulosa, Glycyrrhiza foetida, Glycyrrhiza foetidissima, Glycyrrhiza glabra, Glycyrrhiza gontscharovii, Glycyrrhiza iconica, Glycyrrhiza korshinskyi, Glycyrrhiza lepidota, Glycyrrhiza pallidiflora, Glycyrrhiza squamulosa, Glycyrrhiza triphylla, Glycyrrhiza uralensis и Glycyrrhiza yunnanensis.

Диоксид углерода в сверхкритическом состоянии относится к двуокиси углерода с некоторыми уникальными свойствами. Диоксид углерода обычно проявляется в виде газа в воздухе или в виде твердого вещества как сухой лед. Если температура и давление оба повышены, она может приобретать свойства, промежуточные между газом и жидкостью. Это проявляется в виде жидкости в суперкритическом состоянии при показателях выше критических температуры (31,1 градуса Цельсия) и давления (73 атм = 73,96 бар), расширяющейся с заполнением контейнера подобно газу, но с плотностью, подобной плотности жидкости. Фактическая температура, необходимая для получения CO₂ в сверхкритическом состоянии, зависит от давления и наоборот. Например, для достижения сверхкритического состояния необходимы более высокое давление, более низкая температура. И подобным же образом для достижения сверхкритического состояния необходимы более высокая температура, более низкое давление.

Хотя CO₂ в сверхкритическом состоянии использовали в некоторых случаях в качестве экстрагирующего средства для других веществ, его не использовали, насколько нам известно, в качестве экстрагирующего средства для экстрагирования корней Glycyrrhiza sp., в частности при котором получаемый экстракт содержит преимущественно пренилированные флавоноиды (пренилированные изофлаваны) и конкретно ликорицидин и ликоризофлаван А из G. uralensis (и подобным же образом, пренилированные флавоноиды глабридин, метилглабридин и глаброл из G. glabra) и, по существу, свободен от или лишен глицирризиновой кислоты. Только посредством эмпирического экспериментирования возникла идея данного изобретения и она была приведена к практическому осуществлению. Не было давления рынка или других рыночных соображений, которые привели бы специалиста, работающего в данной области, к установлению или разработке компонентов данного изобретения, модификации компонентов, которые необходимы для возникновения идеи и осуществления на практике данного изобретения, и представить себе и получить продукты по данному изобретению. Только после концептуального осуществления на практике данного изобретения было показано какое-то рыночное значение.

Некоторые из выгодных для окружающей среды сторон использования CO₂ в сверхкритическом состоянии являются следующими. Во-первых, CO₂, который используют в данном процессе, остается, по существу, неизменным и его можно использовать повторно. Во-вторых, фактически нет потока отходов, т.е. нет затрат растворителя, летучих органических веществ, загрязненной выбрасываемой воды и т.д., которыми нужно заниматься. Таким образом, экстракт по данному изобретению является более правильным (обоснованным), чем экстракты по известным способам получения.

Экстракты по данному изобретению отличаются от предыдущих экстрактов Glycyrrhiza sp. Экстракты по данному изобретению имеют высокое содержание соединений, известных как пренилированные флавоноиды (например, ликорицидин и ликоризофлаван А). Оба эти соединения обладают противовоспалительным, антибактериальным, антиадгезивным и противогрибковым действием. Например, экстракт по данному изобретению, как показано, обладает значительной антибактериальной активностью против грамположительных бактерий, таких как Staphylococcus aureus и Streptococcus mutans, грамотрицательных анаэробных бактерий, подобных Porphyromonas gingivalis и Prevotella intermedia, а также противогрибковой активностью против Aspergillus niger. Кроме того, экстракты по данному изобретению лишены или почти лишены глицирризиновой кислоты по исследованию с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, HPLC) (см., экспериментальный раздел ниже). Глицирризиновую кислоту прежде использовали как подсластитель и вкусовую добавку и она не нужна в композициях по данному изобретению.

Ликорицидин и ликоризофлаван А являются двумя компонентами экстракта, полученного с помощью CO₂ в сверхкритическом состоянии, по данному изобретению. Они оба проявили антимикробную активность (МПК) в отношении Streptococcus mutans при 3,125 мкг/мл, возбудителем, являющимся причиной кариеса, и против Prevotella intermedia при 0,78 мкг/мл и при 1,56 мкг/мл для ликорицидина и ликоризофлавана А соответственно, и против Porphyromonas gingivalis при 0,39 мкг/мл и 0,78 мкг/мл для ликорицидина и ликоризофлавана А соответственно. Prevotella sp. и Porphyromonas gingivalis вовлечены в процесс при периодонтите. Оба компонента проявили также превосходную активность в качестве противовоспалительных средств. Таким образом, можно видеть, что экстракт в целом и эти соединения, в частности, могут отличаться своей способностью действовать как противовоспалительные, антибактериальные и противогрибковые средства (см., экспериментальный раздел ниже).

Как упомянуто выше, экстракт, получаемый по способу данного изобретения, можно использовать во многих продуктах, включая продукты по уходу за полостью рта и продукты по уходу за телом, благодаря их противовоспалительным, антибактериальным, антиадгезивным и противогрибковым свойствам. Ниже авторы описывают некоторые из продуктов, пригодных для использования с экстрактом по данному изобретению.

Композиции для полости рта

Нить

Экстракт корней Glycyrrhiza sp. (т.е. экстракт лакричника) может применяться в форме зубной нити. Например, экстрактами по данному изобретению можно пропитывать зубную нить так, чтобы они приходили в контакт с зубами пользователя при чистке зубной нитью. Концентрации экстракта по данному изобретению при использовании в композиции для зубной нити составляют примерно 0,1-5,0% по весу в восковой смеси, используемой для покрытия материала нити. Предпочтительные концентрации составляют примерно 0,5-3,0% по весу восковой смеси, используемой для покрытия материала нити. Зубную нить можно использовать с обеспечением того, что экстракты по данному изобретению могут приходить в контакт с поверхностями зубов, которые обращены одна к другой и являются твердыми, с достижением некоторых из других описанных средств. Когда используют ликорицидин и ликоризофлаван А в качестве антимикробных средств в нити по данному изобретению, их можно использовать отдельно или в смеси при общей концентрации от 0,01 масс.% до 1,0 масс.%, при общей концентрации от 0,05 масс.% до 0,5 масс.% или при общей концентрации от примерно 0,1 масс.% до 0,2 масс.%.

В некоторых воплощениях данного изобретения указанная зубная нить изготовлена, как описано ниже. Специалист в данной области поймет, что существуют другие способы и композиции для производства зубной нити, которые сходны с композицией на основе лакричника по данному изобретению.

Значение слов «зубная(ые) нить(и)» в соответствии с описанием, как нужно понимать, включает как зубные нити и зубные ленты, а также любые другие подобные изделия. Кроме того, зубные нити и ленты, использованные в данном изобретении, могут включать любые подходящие или промышленно производимые зубную нить или ленту. Эти нити и ленты могут быть произведены из или природных или синтетических источников, примеры которых включают, но не ограничиваются этим, нити или пряжу из полимеров с высокой или нормальной прочностью на разрыв, GoreTex™, нейлонов, полиолефинов, полиэтиленов, полипропиленов, фторуглеродных соединений, политетрафторэтиленов, вискозных волокон, дакронов, акриловых, ацетатных полимеров и других пластических волокон отдельно или в комбинации. Природные вещества могут включать, но не ограничиваются этим, хлопок, шерсть, шелк, лен, волокно конопли, сои и другие штапельные волокна, отдельно или в комбинации. Можно также использовать смеси синтетических и природных волокон. Однако синтетические волокна имеют свойство меньше истираться, чем природные волокна.

Прочность нити на растяжение должна быть равномерно распределена по ее длине. Это является ключевым свойством для волокон - они будут разрываться в их самой слабой точке, поэтому стабильная прочность на разрыв является основным свойством. Таким образом, зубная нить данного изобретения относится к волокнам с высокой прочностью на разрыв, в то же время все же являясь применимой для чистки между зубами. Денье нити или критерием оценки волокна нити является ее вес, а также прочность нити. Денье волокна определяется как вес 9000 метров непокрытой нити в граммах. Существует прямая корреляция между числовым значением номера волокна и толщиной пучка пряжи нити: если это значение повышается, толщина нити пряжи также повышается. Таким образом, обычно, чем выше номер волокна, тем выше прочность на разрыв, причем все остальное остается соответствующим. В одном из воплощений данного изобретения номер волокна круглой нити равен примерно 750-950, а для плоской нити он равен примерно 950-1150.

Длина, диаметр, структура и строение самой нити также не ограничиваются каким-либо конкретным размером, формой, компоновкой или конфигурацией, и, таким образом, она может быть изготовлена так, чтобы соответствовать любой конкретной цели. Она, например, может быть образована множеством отдельных волокон, которые были сформированы вместе с получением более толстой пряжи, имеющей достаточно малый диаметр, чтобы позволить ей пройти между зубами. Она может также состоять из сложной поливолоконной пряжи, связанной в экструдируемое моноволокно или в другую поливолоконную нить. Также применима одинарная круглая, квадратная, прямоугольная моноволоконная нить. Также хорошо известны в данной области другие подходящие вариации и, как таковые, они также применимы в описанном здесь изобретении.

Связывающие вещества, например, используют в изобретении, описанном здесь, для связывания с нитью или иначе прикрепления к зубной нити ингредиентов, указанных в данном описании. Они также обеспечивают возможность изменять фрикционные характеристики зубной нити, а также помогают связывать вместе отдельные волокна, образующие саму нить. Кроме того, модификации, используемые здесь, не ограничиваются какими-либо конкретными типами или композициями и представлены таким образом с условием большой свободы в их составах, структурах или формах. Примеры некоторых подходящих связывающих веществ поэтому могут включать, но не ограничиваются этим, природные воски растений (например, воск карнаубы, воск сои и воск жожоба), а также другие водорастворимые или нерастворимые в воде восковые или воскоподобные соединения, или водорастворимые или нерастворимые в воде полимеры, мыла, камеди, смолы (например, мирра и прополис) и другие известные специалистам в данной области вещества.

В нитях можно также использовать, например, одно или более солюбилизирующих веществ. Их функцией, как таковых, будет помощь диссоциации. Подходящие солюбилизирующие вещества могут поэтому включать, но не ограничиваются этим, фильтрованную воду, воду обратного осмоса, дистиллированную воду и деионизированную воду, отдельно или в комбинации. Однако деионизированная вода, как обнаружено, предпочтительнее других.

В нитях можно также использовать, например, одно или более из улучшающих вкус и запах веществ. Эти вещества предпочтительно включают масла и экстракты, полученные из растений и фруктов, такие как цитрусовые масла, фруктовые эссенции, масло мяты, перечной мяты, курчавой мяты, гвоздичное масло, масло грушанки, анисовое, американского лавра, шалфея, эвкалипта, майорана, коричного дерева, лимона, апельсиновое, банановое, вишни, фенхеля, яблока, ананаса, винограда, земляники и черники. Специалисты в данной области поймут, что такие природные улучшающие вкус и запах вещества можно использовать независимо или в сочетании в любой сенсорно приемлемой смеси. Все такие улучшающие вкус и запах вещества и их смеси подразумеваются в данном изобретении.

Для создания большей привлекательности для потребителя нити могут также содержать, например, один или более из природных подсластительных средств. Эти средства могут включать, но без ограничения ими, ксилит, глицерин, сорбит, мальтит, эритрит, сахарозу, лактозу, декстрозу, мальтозу, декстрин, фруктозу, галактозу и тому подобное.

Фториды, как обнаружено ранее, помогают предотвращать появление кариозных повреждений. Кариес вызывается, когда зубы деминерализуются с большей скоростью, чем они реминерализуются, и большей частью деминерализация вызывается продуцирующими кислоту зубными бляшками. Реминерализация, однако, стимулируется кальцием и фосфатом, причем главные реминерализирующие средства обнаружены также в слюне. Соединения на основе фтора поэтому обеспечивают защиту от кариозных повреждений или кариеса путем действия в качестве катализатора для ускорения отложения фосфата кальция в форме гидроксиапатита в ткани зуба, внутри или снаружи. Однако это не единственная роль фторида. Он также способен подавлять активность некоторых бактериальных ферментов и их продуцирующих кислоту процессов, и при чрезмерно высоких концентрациях он может также убивать некоторые бактерии бляшек. Еще более важно, что он имеет свойство становиться включенным в апатит в виде фторированного гидроксиапатита или «фторапатита», образуя минерал, который значительно менее растворим в кислоте.

Следовательно, нити могут содержать, например, одно или более соединений на основе фторида. Эти соединения могут также быть слегка растворимыми в воде или могут быть полностью растворимы в воде. Они, однако, прежде всего характеризуются способностью высвобождать фторидные ионы в воду и отсутствием у них нежелательных реакций с другими компонентами нити. Среди этих материалов находятся многочисленные соединения на основе фтора, которые могут содержать неорганические фторидные соли, такие как растворимые соли щелочных металлов, соли щелочноземельных металлов и другие. Когда используют фторидное соединение, применяемое количество зависит в большой степени от вида фторидного соединения, его растворимости и выбранных конечного препарата и структуры. В качестве такового ему дается существенная свобода по используемому количеству при условии соблюдения нормальной технологии изготовления и фармацевтической безопасности. Следовательно, всякий раз когда используются соединения на основе фтора в препаратах, перечисленных ниже, их количество не должно быть более 0,30 процента (весовых). Однако было обнаружено, что установка максимального интервала на уровне 0,24 процента (весовых) является предпочтительной, причем 0,22-0,24 процента (весовых) является наилучшим для использования интервалом.

Зубной порошок или зубная паста

Экстракты лакричника с помощью CO₂ в сверхкритическом состоянии (экстракт корней Glycyrrhiza sp.) по данному изобретению можно также использовать в зубных пастах, зубных гелях и зубных порошках. В одном из воплощений данного изобретения концентрация экстракта по данному изобретению, используемого в средствах для чистки зубов, находится в интервале от примерно 0,002 до 2,0% по весу. В предпочтительной концентрации интервал представлен от 0,02 до 1,0% по весу. Когда используют ликорицидин и ликоризофлаван А в качестве антимикробных средств в препарате для чистки зубов по данному изобретению, их можно использовать отдельно или в смеси при концентрациях примерно от 0,01 масс.% до 1,0 масс.%, при общих концентрациях примерно от 0,05 масс.% до 0,5 масс.% или при общих концентрациях примерно от 0,1 масс.% до 0,2 масс.%.

Композиции в форме зубных паст, гелей, жидких гелей, жидкостей и паст для чистки зубных протезов и тому подобного будут обычно содержать связывающее вещество или загуститель. Связывающие вещества, пригодные для использования здесь, включают каррагенан (предпочтителен) и/или природные камеди, такие как камедь карайи, ксантановая камедь (предпочтительна), аравийская камедь (предпочтительна), и можно также использовать камедь трагаканта, а также другие средства, известные специалистам в данной области. Коллоидный алюмосиликат магния или тонко измельченную гидратированную двуокись кремния можно использовать как часть загущающего средства для дополнительного улучшения текстуры. Связываюшие вещества/загустители можно использовать в количестве от примерно 0,1% до примерно 15,0%, предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 12% по весу от композиции в целом. Активными веществами являются фторид и нитрат калия, их уровни описаны в соответствующих монографиях FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США) в отношении антикавернозности и чувствительности. Еще ожидается завершение монографии по активным веществам для лечения гингивита. Абразивными веществами являются карбонат кальция, пекарская сода и гидратированная окись кремния.

Такие композиции будут обычно содержать один или более из подсластителей и вкусовых добавок. Примеры подходящих подсластителей и вкусовых добавок для использования в средствах для чистки зубов обсуждались выше. Поддерживающие рН вещества (например, лимонная кислота, NaOH), а также поверхностно-активные вещества (например, лаурилсульфат натрия), консерванты (например, бензойная кислота, сорбиновая кислота), стабилизаторы и т.д. также часто используют в композициях для чистки зубов, примеры которых также приведены выше. Композиции по данному изобретению могут включать также препараты из растений.

Кроме включения лакричного экстракта по данному изобретению могут быть также включены в средство для чистки зубов в минимальных количествах, например, от 0,01 до 2% по весу, других природных ингредиентов, таких как антиоксиданты, консерванты, поддерживающие рН средства, десенсибилизирующие средства, стабилизирующие средства, гелеобразующие средства, улучшающие вкус и запах вещества и т.д. Предпочтительное гелеобразующее или связывающее средство представляет собой одну или более из каррагенана или ксантановой камеди. Предпочтительными улучшающими вкус и запах веществами являются природные вкусовые добавки, такие как добавки из перечной мяты, кудрявой мяты, абрикоса, коричного дерева и т.д. Для чувствительных зубов препарат может содержать средство для облегчения боли у людей с чувствительными зубами. Предпочтительным ингредиентом для этой цели является нитрат калия. В данном изобретении можно использовать диспергирующие средства. Предпочтительными диспергирующими средствами являются лаурилсульфат натрия или содержащие сапонин растительные экстракты.

Также желательно включать одно или более из смягчающих веществ (удерживающее влагу вещество) в зубную пасту, чтобы удержать композицию от отвердения экспозиции на воздухе. Предпочтительными смягчающими веществами являются глицерин и сорбит. Некоторые смягчающие вещества могут также придавать желаемую сладость композициям зубной пасты. Жидкие средства для чистки зубов и полоскания для рта могут также содержать некоторое количество смягчающих веществ. Подходящие смягчающие средства хорошо известны специалистам в данной области. Когда они присутствуют, смягчающие вещества составляют от примерно 10% до примерно 70% по весу от композиций по данному изобретению.

В зубных порошках могут найти применение многие из тех же ингредиентов, что и в зубных пастах, за исключением того, что они должны быть смешаны в сухом состоянии (т.е. размолоты в сухом виде) или смешаны в виде жидкой композиции, а затем высушены путем, например, различных известных методов распылительной сушки. Распылительная сушка описывается таким образом, что жидкая форма композиции распыляется в виде аэрозоля в горячей сухой камере, причем водная часть аэрозоля испаряется сухим жаром камеры, оставляя только сухие составляющие композиции в порошковой форме. Порошковая форма композиции имеет содержание влаги между 0,1% и 5%. Зубные порошки затем снова гидратируют при использовании или путем добавления воды (например, воды, применяемой потребителем) во время использования или слюной потребителя.

Растворимые таблетки

Другим вариантом данного изобретения является растворимая очищающая таблетка для зубных протезов, содержащая экстракт Glycyrrhiza sp. по данному изобретению, полученный с помощью CO₂ в сверхкритическом состоянии. Еще одним вариантом данного изобретения является растворимая очищающая таблетка, содержащая один из ликорицидина и ликоризофлавана А или оба выделенных веществ, например, из экстракта, полученного с помощью CO₂ в сверхкритическом состоянии по данному изобретению.

Такие таблетки могут быть твердыми, слоеными, иметь заполненную жидкостью сердцевину и т.д. Таблетка должна растворяться полностью или почти полностью в водном растворе менее чем за один час, а предпочтительно менее чем за примерно 15 минут. Таблетка может быть шипучей, но в этом нет необходимости.

Водорастворимые таблетки для чистки зубных протезов изготавливают путем сначала получения и сушки гранулята ингредиентов, изготовленного с использованием подходящего связывающего вещества, например, безводного спиртового раствора. Получаемую гранулированную смесь затем сушат до содержания влаги 0,4% или менее, просеивают, а затем тщательно смешивают с желаемыми активными ингредиентами вместе со связывающими веществами, наполнителями, разбавителями, красителями, улучшающими вкус и запах веществами, улучшающими скольжение веществами и тому подобным в подходящем смесителе. Конечные смеси подают в таблетирующий пресс с формами и пуансонами, где их прессуют в таблетки. Затем таблетки, сформированные таким образом, освобождаются и упаковываются.

Жидкости для промывания и полоскания рта

Обычно жидкости для промывания и полоскания рта по данному изобретению содержат экстракт Glycyrrhiza sp. по данному изобретению, полученный с помощью CO₂ в сверхкритическом состоянии, например в водноглицериновом растворе, и могут дополнительно содержать один компонент или более из вкусовых добавок, смягчающих веществ, подсластителей, эмульгаторов (например, полоксамер) и красителей. Еще одним вариантом данного изобретения является жидкость для промывания рта, содержащая один из ликорицидина и ликоризофлавана А или оба выделенных веществ, например из экстракта, полученного с помощью CO₂ в сверхкритическом состоянии, по данному изобретению.

Жидкости для промывания рта могут включать глицерин на уровне от 0 до 60%, предпочтительно от 0 до 30% по весу. Значение рН таких препаратов для промывания рта обычно находится в интервале от примерно 3,5 до примерно 8,0, а предпочтительно от примерно 4,0 до примерно 7,5. Показатель рН более 8,7 приводил бы к неприятному ощущению во рту. Жидкие препараты для ротовой полости могут также содержать поверхностно-активные вещества, т.е. сурфактанты, в количестве до примерно 5,0%, а более предпочтительно между примерно 0,5 и 2,0%; и дающие фторид соединения в количестве до примерно 2,0% по весу от препарата, а более предпочтительно примерно 0,0442% фторида натрия или 0,025% фторидного иона.

Жидкости для промывания и полоскания рта по данному изобретению могут также содержать один или более из спиртов, например этанол.

Пастилки, лепешки и жевательная резинка

Композиции жевательной резинки, которые содержат экстракт Glycyrrhiza sp. по данному изобретению, полученный с помощью CO₂ в сверхкритическом состоянии, могут быть в форме обычной жевательной резинки или в любой другой форме продукта, которая пригодна для жевания. Еще одним вариантом данного изобретения является жевательная резинка, содержащая один из ликорицидина и ликоризофлавана А или оба выделенных веществ, например из экстракта, полученного с помощью CO₂ в сверхкритическом состоянии, по данному изобретению. Подходящие физические формы включают палочки, квадратики и драже (т.е. покрытую сахаром жевательную резинку, например, Chiciets™). Жевательная резинка может также иметь заполненную жидкостью сердцевину, причем жидкая сердцевина содержит композиции на основе лакричника (см., например, патент США № 6280780). Жевательная резинка может быть также перевариваемой или растворимой жевательной резинкой, пригодной для жевания. Жевательная резинка обычно остается в ротовой полости в течение времени, достаточного для того, чтобы дать возможность ингредиентам высвободиться для контакта, по существу, со всеми поверхностями зубов и/или тканей в ротовой полости в целях осуществления действия во рту.

Термин «вещества носителя» в соответствии с описанием означает любые безопасные и эффективные компоненты жевательной резинки, используемые в составах жевательной резинки по данному изобретению. Такие вещества включают эластомеры, смолы, пластификаторы, жиры, растворители, воски, эмульгаторы, смягчающие вещества, увеличивающие объем вещества, подсластители, адсорбенты, активные в ротовой полости ионы металлов, катионные вещества, источники фторидных ионов, дополнительные средства против зубного камня, антимикробные средства, буферные вещества, отбеливающие вещества, бикарбонатные соли щелочных металлов, загущающие вещества, смягчающие вещества, воду, поверхностно-активные вещества, диоксид титана, улучшающие вкус и запах вещества, ксилит, красители и их смеси.

Жевательная резинка по данному изобретению производится известнымм специалистам способами. Например, основу для жевательной резинки нагревают до 45°С до размягчения. Во время процесса смешивания сосуд для смешивания поддерживают при 45°С и добавляют добавки, описанные здесь, а также экстракт по данному изобретению и перемешивают до гомогенности. Затем смесь жевательной резинки формируют в палочки, квадратики и т.д., заворачивают и охлаждают. Если желательно, жевательную резинку покрывают сахарным или не содержащим сахара карамельным покрытием.

Лакричную композицию можно также использовать в композициях лепешек и пастилок. Основой для лепешек и пастилок обычно является сахар, такой как глюкоза или сахароза, или, по существу, некатионогенное вещество, например маннит, ксилит, мальтит, эритрит или сорбит.

В дополнение к активному ингредиенту и носителю лепешки предпочтительно содержат одно или более из связывающих веществ, таких как желатин (растительная смола, например предпочтительной является аравийская камедь) или жидкая глюкоза ВРС 1963, которые в целом могут обычно присутствовать в количестве от примерно 0,5 до 10% по весу от веса лепешки. Предпочтительный интервал составляет от примерно 1 до 5% по весу.

Лепешки могут, кроме того, содержать улучшающее скольжение вещество, такое как стеариновая кислота или стеарат, такой как стеарат магния, для облегчения производства лепешек. Когда присутствует один или более из улучшающих скольжение веществ, общее их содержание в лепешке составляет предпочтительно от 0,1 до 5% по весу.

Лепешки могут быть получены путем общепринятых методов изготовления, например путем смешивания 1,3-бис(2-карбоксихромон-5-илокси)-2-гидроксипропана или его соли с вспомогательным веществом, разбавителем или носителем и прессования смеси. При предпочтительной процедуре бис-хромон и вспомогательное вещество, разбавитель или носитель желательно гранулировать вместе перед прессованием в лепешки. На стадии грануляции грануляция предпочтительно является влажной, и улучшающее скольжение вещество желательно добавлять непосредственно перед стадией прессования.

Пастилки (иногда известные как ююбы или мягкие лепешки) являются твердым, желеобразным препаратом, изготовленным из смеси глицерина, желатина (или природного гелеобразующего вещества) и воды, в которую включен экстракт по данному изобретению. Также может быть добавлено улучшающее вкус и запах вещество. Глико-желатиновая основа может быть расплавлена путем легкого нагревания, и могут быть добавлены любые ингредиенты. Теплую основу затем разливают в формы и дают отвердеть. См., например, www.rpsgb.org.uk/pdfs/mussheet04.pdf.

Продукты по уходу за телом

Типичные продукты по уходу за телом включают, например, лосьоны для тела, кожные кремы, мыла, продукты по уходу за волосами (например, шампуни и кондиционеры), средства защиты от солнца, противовоспалительные средства для местного применения, депиляторные композиции, продукты для бритья (например, кремы для бритья и лосьоны после бритья), дезодоранты, продукты по уходу за младенцем и т.д. Продукты по уходу за телом являются продуктами, используемыми на наружных покровах тела (например, на коже, волосах и т.д.), обычно для местного применения.

Специалист в данной области знает, как создать такие продукты по уходу за телом. Например, в патенте США № 6861062 Silva et al. (и включенном сюда в виде ссылки) описаны типичные препараты и способы изготовления кремов для кожи. Продукты с растительными композициями для ухода за кожей также известны специалистам в данной области (см., например, патент США № 6586018, Fasano, который включен сюда в виде ссылки, где описаны примеры рецептур и способы производства).

Композиции и способы изготовления продуктов для бритья также известны специалистам. Например, в патенте США № 7179454, Lucas, который включен сюда в виде ссылки, описано несколько примеров рецептур и способов изготовления. В патенте США № 6479043, Tietjen, et al. (включенном сюда в виде ссылки) описаны типичные рецептуры и способы производства для депиляторных средств.

Подобным же образом рецептуры и способы производства мыла, солнцезащитных лосьонов и противовоспалительных средств для местного применения известны специалистам в данной области.

Продукты по уходу за телом по данному изобретению в одном из воплощений включают экстракт корней растения Glycyrrhiza sp., содержащие экстракт, по существу, без глицирризиновой кислоты, причем главными компонентами экстракта являются пренилированные флавоноиды, и причем корни экстрагированы способом с использованием СО₂ в суперкритическом состоянии.

В другом воплощении экстракт является экстрактом из Glycyrrhiza uralensis, и главными компонентами экстракта являются ликорицидин и ликоризофлаван А.

В другом воплощении экстракт является экстрактом из Glycyrrhiza glabra, и главным компонентом экстракта является глабридин.

Например, дезодорант по данному изобретению в одном из воплощений включает экстракт данного изобретения в комбинации с антиоксидантным соединением, предпочтительно с ингредиентом из группы токоферола и его производных, бутилгидроксианизолом (БГА), бутилгидрокситолуолом (БГТ), эриторбиевой кислоты, пропилгаллата, эриторбата натрия, третичного бутилгидрохинона (ТБГХ) и экстрактом розмарина, более предпочтительно с аскорбиновой кислотой и ее солями. Кроме того, дезодорант может содержать некоторые соли металлов с ненасыщенными гидроксикарбоновыми кислотами, предпочтительно рицинолеат цинка. В предпочтительном воплощении экстракт по данному изобретению находится в концентрации примерно от 0,01 до 5,0% по весу, а в более предпочтительном воплощении от примерно 0,05 до 2,0% по весу. Когда ликорицидин и ликоризофлаван А используют в качестве антимикробных средств в дезодоранте по данному изобретению, их можно использовать отдельно или в смеси при общей концентрации примерно от 0,01 масс.% до 1,0 масс.%, при общей концентрации примерно от 0,05 масс.% до 0,5 масс.% или при общей концентрации примерно от 0,1 масс.% до 0,2 масс.%.

Для лосьонов для тела, кремов для кожи, мыла, продуктов для ухода за волосами, продуктов по уходу за младенцами концентрация экстрактов по данному изобретению находится в интервале примерно от 0,01 до 2% и более предпочтительно от 0,1 до 1%. Когда ликорицидин и ликоризофлаван А используют в качестве антимикробных средств в продуктах по уходу за телом по данному изобретению, их можно использовать отдельно или в смеси при общей концентрации примерно от 0,01 масс.% до 1,0 масс.%, при общей концентрации примерно от 0,05 масс.% до 0,5 масс.% или при общей концентрации примерно от 0, 1 масс.% до 0,2 масс.%.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Процесс экстрагирования: лакричный экстракт, использованный в следующих примерах и в производстве средств для чистки зубов, по данному изобретению был изготовлен по новому и неочевидному способу с экстрагированием СО₂ в суперкритическом состоянии. Способ экстрагирования данного изобретения в одном из воплощений был следующим. Корни Glycyrrhiza uralensis резали, измельчали и превращали в порошок, чтобы получить сырьевой материал. Сырьевой материал помещали в камеру для экстрагирования (экстрактор). В камеру для экстрагирования подавали жидкий СО₂. Жидкий СО₂, доставленный из рабочего резервуара/резервуара для хранения, охлаждали и закачивали в камеру для экстрагирования при давлении 300 бар, 50°С с добавлением 5% 96%-ного этанола. Экстракт в СО₂ затем дозировали в испаритель и потоком направляли в резервуар для разделения.

В суперкритических условиях, установленных в экстракторе, СО₂ обладает свойствами растворителя для липофильных ингредиентов, тогда как СО₂ в газовой фазе не имеет свойств растворителя в условиях сепаратора (60 бар, 30°С). Таким образом, экстракт осаждался, а газ регенерировали в резервуар сепарации. Затем СО₂ ожижали путем пропускания через конденсатор и рециклизировали в рабочий резервуар.

Сравнение экстракта лакричника по данному изобретению в СО₂ в суперкритическом состоянии с экстрактами, изготовленными предшествующими способами

Минимальная подавляющая концентрация по микрометоду разведений в бульоне. Для анаэробов 190 мкл стерильного предварительно воспроизведенного бульона для анаэробов Wilkins Chalgren (WC) с 0,075% цистеина добавляли в первую лунку серии испытаний в 96-луночной планшете с последующим добавлением 100 мкл в каждую из четырех дополнительных лунок для испытания. 10 мкл стерилизованного фильтрованием стандартизованного исходного раствора экстракта лакричника в СО₂, приготовленного в этаноле при концентрации 40 мг/мл, добавляли в первую лунку серии. Содержимое первой лунки тщательно перемешивали и серийно разбавляли (1:1) в остальных четырех лунках серии; из последней лунки серии отбрасывали 100 мкл. Суспензии Porphyromanas gingivalis АТСС 33277 или Prevotella intermedia ATCC 25611, разведенные до примерно 1·10⁸ КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 мл, добавляли в лунки для испытаний в количестве 100 мкл. Были включены соответствующие контроли развития роста и стерильные. Планшеты инкубировали при 37°С анаэробно до тех пор, когда наблюдали мутность в лунке контроля роста. МПК (минимальная подавляющая концентрация) регистрировали как самую низкую концентрацию, подавляющую рост испытуемого организма, который наблюдали невооруженным глазом. Streptococcus mutans ATCC 25175 испытывали подобным же образом с триптическим соевым бульоном (ТСБ) в качестве среды для испытания и инкубацией планшет при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Staphylococcus aureus ATCC 6538 испытывали, используя триптический соевый бульон (ТСБ) в качестве среды для испытания и инкубацию планшет при 37°С. Aspergillus niger ATCC 16404 испытывали с триптическим соевым бульоном (ТСБ) в качестве среды для испытания и инкубировали при комнатной температуре (25°С).

Результаты регистрировали как наиболее вероятное значение по трем экспериментам для каждой бактерии. P. intermedia и P. gingivalis являются грамотрицательными бактериями, участвующими в патологическом процессе при периодонтите. Streptococcus mutans участвует в формировании кариеса. Оба экстракта, полученные с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии, способны подавлять рост этих 3 патогенных бактерий при самых низких концентрациях испытываемого экстракта. Полученные с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии лакричные экстракты по данному изобретению при использовании этанола или без него в качестве модификатора были способны подавлять P. intermedia в концентрации 12,5 мкг/мл. Экстракт с использованием этанола в качестве модификатора был способен подавлять рост P. gingivalis при том же уровне, что и хлоргексидин. Полученный с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии лакричный экстракт по данному изобретению (с этанолом) был способен подавлять рост S. mutans, как кариогенной бактерии, в концентрации 12,5 мкг/мл. Полученный с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии лакричный экстракт по данному изобретению без этанола был испытан только до 31,25 мкг/мл. См. таблицу 1А.

Таблица 1А Антибактериальная активность против бактерий ротовой полости
	Лакричный СО2 экстракт (мкг/мл)	Лакричный СО2-этанольный экстракт (мкг/мл)	Хлоргексидин
Prevotella intermedia	12,5	12,5	3,125
Porphyromanas gingivalis	12,5	6,25	6,25
Streptococcus mutans	<31,25*	12,5	1,56
*Самой низкой испытанной концентрацией была 31,25 мкг/мл

Антибактериальная активность ликорицидина и ликоризофлавана А

Ликорицидин и ликоризофлаван А представляют собой два компонента, полученные с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии экстракта по данному изобретению. Они оба проявили антимикробную активность в отношении Streptococcus mutans при 3,125 мкг/мл, главного причинного агента кариеса, и против Prevotella intermedia при примерно 0,78 мкг/мл и примерно 1,56 мкг/мл, и Porphyromanas gingivalis при 0,39 мкг/мл и 1,56 мкг/мл для ликорицидина и ликоризофлавана А соответственно, как показано в таблице 1В. Porphyromanas gingivalis и Prevotella sp. вовлечены в патогенез при периодонтите. Эти концентрации были минимальными подавляющими концентрациями (МПК). Оба компонента показали превосходную активность как противовоспалительные средства. МПК специалисты в данной области определяют как самую низкую концентрацию антимикробного средства, которая будет подавлять видимый рост микроорганизма при инкубации в течение ночи. Минимальные подавляющие концентрации специалисты используют для контроля активности новых антимикробных средств. Хлоргексидин использован здесь как положительный контроль и он часто находится в качестве антибактериального средства, например, в промываниях для ротовой полости.

Определение минимальной подавляющей концентрации микрометодом разведений в бульоне выполняли следующим образом. 10 мкл стерилизованного фильтрованием стандартизованного исходного раствора чистого соединения, ликорицидина или ликоризофлавана А, приготовленного с концентрацией 1 мг/мл в этаноле, добавляли в первую лунку серии. Содержимое первой лунки тщательно перемешивали и серийно разбавляли (1:1) в остальных семи лунках серии; из последней лунки серии отбрасывали 100 мкл. Суспензии Porphyromanas gingivalis АТСС 33277 или Prevotella intermedia ATCC 25611, разведенные до примерно 1·10⁸ КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 мл, добавляли в лунки для испытаний в количестве 100 мкл. Были включены соответствующие контроли развития роста и стерильные. Планшеты инкубировали при 37°С анаэробно до тех пор, когда наблюдали мутность в лунке контроля роста. МПК (минимальная подавляющая концентрация) регистрировали как самую низкую концентрацию, подавляющую рост испытуемого организма, который наблюдали невооруженным глазом. Streptococcus mutans ATCC 25175 испытывали подобным же образом с триптическим соевым бульоном (ТСБ) в качестве среды для испытания и инкубацией планшет при 37°С в атмосфере с 5% СО₂.

Результаты регистрировали как наиболее вероятное значение по трем экспериментам для каждой бактерии. P. intermedia и P. gingivalis являются грамотрицательными бактериями, участвующими в патологическом процессе при периодонтите. Streptococcus mutans участвует в формировании кариеса. Оба соединения были способны подавлять рост этих 3 патогенных бактерий.

Таблица 1В
	Экстракт (мкг/мл)	Ликорицидин (мкг/мл)	Ликоризофлаван А (мкг/мл)	Хлоргексидин (мкг/мл)
S. mutans	12,50	3,125	3,125	1,56
P. gingivalis	6,25	0,39	0,78	6,25
P. intermedia	6,25	0,78	1,56	3,125

Формирование и жизнеспособность биопленки. 24-часовую культуру P. gingivalis (ATCC 33277) в бульоне Todd-Hewitt с гемином и витамином К (THB-HK) разводили свежей бульонной средой до получения оптической плотности 655 нм (ОП₆₅₅), равной 0,07. Образцы (100 мкл) добавляли в лунки 96-луночной планшеты для культуры тканей, содержащие 100 мкл серийных разведений (от 0 до 500 мкл/мл) стерильных растительных экстрактов в THB-HK. Контрольные лунки без экстракта также засевали. После инкубирования в течение 48 часов при 37°С в анаэробных условиях отработанную среду и бактерии в свободной взвеси удаляли аспирацией с использованием иглы 26G и лунки промывали три раза дистиллированной водой. Биопленки P. gingivalis окрашивали 0,4% кристаллическим фиолетовым (100 мкл) в течение 15 минут. Лунки промывали четыре раза дистиллированной водой для удаления несвязанной краски кристаллического фиолетового и сушили в течение 2 часов при 37°С. После добавления 100 мкл 95% (объемные) этанола в каждую лунку планшету встряхивали в течение 10 минут для выделения красителя из биопленок и регистрировали поглощение при 550 нм (А₅₅₀). Исследование проводили в трех повторах и рассчитывали средние значения ± стандартное отклонение по двум независимым экспериментам. См. таблицу 2.

Действие растительных фракций на жизнеспособность клеток P. gingivalis исследовали с помощью исследования восстановления гидрата тетразолийнатрий-3'-{1-[(фениламино)карбонил]-3,4-тетразолий}-бис(4-метокси-6-нитро)бензолсульфоновой кислоты (XTT). В кратком изложении XTT растворяли в ФБФР при концентрации 1 мг/мл, и готовили менадион в ацетоне с концентрацией 1 мМ. XTT/менадионовый реагент содержал 12,5 частей XTT/1 часть менадиона. 48-часовую биопленку P. gingivalis получали, как описано выше, и обрабатывали растительными фракциями (от 0 до 250 мкг/мл) в течение 2 часов (анаэробиоз, 37°С) перед добавлением 25 мкл XTT/менадиона. После 1 часа при 37°С считывали поглощение при 490 нм (А₄₉₀) с использованием считывающего устройства для микропланшет. Лакричный экстракт по данному изобретению был способен подавлять рост P. gingivalis, а также подавлять образование P. gingivalis. Затем P. gingivalis был неспособен прикрепляться (антиадгезия). Когда лакричный экстракт применяли после того, как образовалась биопленка, десорбции бипленки не было, но жизнеспособность биопленки была снижена, что означает то, что биопленка не удалялась, но что бактерии, образующие биопленку, погибали. См. таблицу 2.

Таблица 2 Действие лакричного, полученного с помощью СО2, экстракта на формирование биопленки, свойства адгезии и жизнеспособность P. gingivalis
	Подавляет биопленку P. gingivalis (антиадгезивное) (мкг/мл)	Десорбция биопленки P. gingivalis (мкг/мл)	Рост P. gingivalis (мкг/мл)	Бактерицидное действие на P. gingivalis в биопленке (жизнеспособность клеток) (мкг/мл)
Лакричный экстракт в СО2	4,2	-	4,2	8

Препараты ЛПС. Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 29522 (синоним: Actinobacillus actinomycetemcomitans) и P. gingivalis ATCC 33277 выращивали в подходящей для них среде культивирования. ЛПС выделяли из этих бактериальных штаммов по методу, обычно применяемому в нашей лаборатории.

Обработки макрофагов. Клетки U937 (ATCC CRL-1593.2), клеточную линию человеческой монобластной лейкемии культивировали при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ в RPMI-1640, дополненной 10% ФТС (FBS) и 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина (RPMI-FBS). Моноциты (2·10⁵ клеток/мл) инкубировали в RPMI-10% FBS, содержащей 10 нг/мл форболмиристиновой кислоты (ФМК), в течение 48 часов, чтобы вызвать дифференциацию в прикрепленные макрофагоподобные клетки. После обработки ФМК среду заменяли свежей средой, и дифференцированные клетки инкубировали в течение 24 часов перед использованием. Прикрепленные макрофаги суспендировали в RPMI-10% FBS и центрифугировали при 200×g в течение 8 минут. Их промывали и суспендировали в RPMI-10% FBS до плотности 1·10⁶ клеток/мл, и засевали в 6-луночную планшету (2·10⁶ клеток/лунку в 2 мл) при 37°С в атмосфере с 5% СО₂.

Макрофаги обрабатывали лакричным экстрактом при концентрациях до 250 мкг/мл и инкубировали при 37°С и с 5% СО₂ в течение 2 часов перед стимуляцией ЛПС при конечной концентрации 1 мкг/мл. После 24-часовой инкубации (37°С и с 5% СО₂) супернатанты культуральной среды собирали и хранили при -20°С до использования. Клетки, инкубированные в культуральной среде с лакричным экстрактом и без него, но не стимулированные ЛПС, использовали в качестве контролей.

Определение уровней цитокинов. Промышленно производимые наборы для твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА; ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) использовали для количественной оценки концентраций IL-1β, IL-6, IL-8 и TNF-α в бесклеточных супернатантах в соответствии с методиками производителя. Поглощение при 450 нм считывали на считывающем устройстве для микропланшет с коррекцией длины волны, установленной на 550 нм.

Статистический анализ: Производили двухфакторный дисперсионный анализ для сравнения средних величин при разных условиях. Различия считали значимыми при уровне 0,05 (значение Р).

Противовоспалительное действие. Экстракты данного изобретения вызывали значительное подавление in vitro продукции макрофагами интерлейкина 1β, интерлейкина 8 и фактора некроза опухолей α, получаемыми из клеток U937, клеточной линии человеческой монобластной лейкемии, стимулированной ЛПС из Aggregatibacter actinomycetemcomitans в концентрации 10 мкг/мл и 5 мкг/мл в отношении интерлейкина 6. Эти результаты подтверждены в двух независимых экспериментах.

Лакричный экстракт вызывал значительное подавление продукции интерлейкина 6, интерлейкина 8 и фактора некроза опухолей-α (ФНО-α) макрофагами, стимулированными ЛПС P.gingivalis в концентрации в интервале 5-10 мкг/мл. Эти результаты подтверждены в двух независимых экспериментах.

Анализ ВЭЖХ экстракта, полученного с помощью СО₂ в сверхкритическом состоянии

Примеры экстрактов по данному изобретению и экстракты, полученные известными способами, анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Технические условия использованной методики были следующими: ВЭЖХ выполняли на приборе Zorbax Eclipse XDB C-18 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 250×4,6 мм в.д., 5 мкм, с колонкой Zorbax C-18 Guard (кат. № HP 990967-902 и HP 820950-925):

Подвижная фаза: MeCN (0,05% ТФК)-Н2О (0,05% ТФК)
0 мин	45	55
3 мин	45	55
25 мин	100	0
25,1 мин	45	55

Приведение к требуемым условиям:	по меньшей мере 20 мин
Скорость потока:	1,0 мл/мин
Темп. кол.	30°С
Детектор:	280 нм (шп 16, основная 450 нм, шп 100)
Время цикла:	25 мин
Время на оценку:	5 мин

Результаты представлены на фигуре 1. Первая хроматограмма (А) представляет экстракт после экстрагирования горячей водой и он содержит только гидрофильные соединения. Пик элюирования через 4,5 мин представляет глицирризиновую кислоту. По УФ спектру и времени удержания глицирризиновая кислота присутствует только в экстракте, полученном с помощью горячей воды. Вторая хроматограмма (В) представляет 100% этанольный экстракт, и хроматограмма (С) представляет этилацетатный экстракт, оба очень сходны по составу, за исключением того, что В содержит больше гидрофильных соединений (элюирование между 0-4 мин). Главными компонентами экстракта, полученного с помощью СО₂, являются ликорицидин (1, элюирование после 16,5 мин) и ликоризофлаван А (2, элюирование после 21 мин) вместе с пиком неидентифицированного флавоноида 3 около 18 мин. Экстракт, полученный с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии с использованием этанола (EtOH) в качестве модификатора, содержит больше гидрофильных соединений, чем такой же экстракт без модификатора, и содержит самые высокие количества ликорицидина и ликоризофлавана А. Кроме того, с точки зрения влияния на окружающую среду при экстрагировании СО₂ используется только небольшой процент этанола (5-10%) для достижения хорошего баланса гидрофильных и липофильных соединений. В обоих экстратах, полученных с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии, ликорицидин и ликоризофлаван А являются высокопреобладающими.

Ликорицидин и ликоризофлаван А выделяли из экстракта, полученного с помощью СО₂ в суперкритическом состоянии, по данному изобретению следующим образом. Количество экстракта лакричника, полученного с помощью СО₂/EtOH, равное примерно 433 мг, подвергали жидкостной хроматографии при среднем давлении (ЖХСД, MPLC) с помощью системы Büchi C-600 MPLC (Büchi Analytical, Flawil, Швейцария) с использованием стационарной фазы на основе ODS (Phenomenex Luna C-18(2), 100 Ǻ) с использованием ацетонитрила-воды (45:55) в качестве растворителя и скорости потока 5 мл/мин. Фракция 3 содержала ликорицидин (32,8 мг), и ликоризофлаван А (21,5 мг) был получен из фракции 7. Чистота ликорицидина составляла 89%, а чистота ликоризофлавана А составляла 91%. В контексте данного изобретения термин «выделенный» в отношении ликорицидина и ликоризофлавана А по данному изобретению включает чистоту примерно 50% или более, примерно 60% или более, примерно 70 масс.% или более, примерно 80 масс.% или более, примерно 90 масс.% или более, примерно 95 масс.% или более или примерно 99 масс.% или более.

1. Антибактериальная или противовоспалительная композиция по уходу за ротовой полостью или телом, включающая экстракт корней растения Glycyrrhiza sp., включающая от примерно 0,002 мас.% до примерно 10,0 мас.% экстракта, по существу, свободного от глицирризиновой кислоты, при этом главными компонентами экстракта являются пренилированные флавоноиды, и корни экстрагированы способом экстрагирования СО₂ в сверхкритическом состоянии, и где указанные пренилированные флавоноиды составляют от примерно 1,0 мас.% до примерно 20,0 мас.% указанного экстракта.

2. Композиция по п.1, в которой указанный экстракт получен из Glycyrrhiza uralensis, и главными компонентами экстракта являются ликорицидин и ликоризофлаван А.

3. Композиция по п.1, в которой указанный экстракт получен из Glycyrrhiza glabra, и главным компонентом экстракта является глабридин.

4. Композиция по п.1, которая выбрана из группы, состоящей из средства для чистки зубов, зубной пасты, средства для чистки зубных протезов, зубной нити, зубочисток, жидкости для промывания ротовой полости, жидкости для полоскания рта, пастилок, жевательной резинки, растворимых таблеток, жевательных таблеток и лепешек.

5. Композиция по п.4, где указанная композиция представляет собой средство для чистки зубов, и где указанный экстракт присутствует в концентрации, составляющей от примерно 0,002 мас.% до примерно 2,0 мас.% указанного средства.

6. Композиция по п.4, где указанная композиция представляет собой средство для чистки зубных протезов, и где указанный экстракт находится в концентрации от примерно 0,002 мас.% до примерно 2,0 мас.% указанного средства для чистки зубных протезов.

7. Композиция по п.4, где указанная композиция представляет собой средство для промывания ротовой полости или для полоскания рта, и где указанный экстракт присутствует в концентрации от примерно 0,002 мас.% до примерно 1,0 мас.% средства для промывания ротовой полости или для полоскания рта.

8. Композиция по п.4, где указанная композиция представляет собой пастилку, жевательную резинку или лепешку, в которой указанный экстракт присутствует в концентрации от примерно 0,005 мас.% до примерно 10,0 мас.% указанной пастилки, жевательной резинки или лепешки.

9. Композиция по п.4, где указанная композиция представляет собой растворимую таблетку, и где указанный экстракт присутствует в концентрации от примерно 0,01 мас.% до примерно 5,0 мас.% указанной растворимой таблетки.

10. Композиция по п.4, где указанная композиция представляет собой зубную нить, и где указанный экстракт присутствует в концентрации от примерно 0,1 мас.% до примерно 5,0 мас.% от восковой смеси, используемой для покрытия или пропитки указанной зубной нити.

11. Композиция по п.1, где указанный способ экстрагирования СО₂ в сверхкритическом состоянии включает также этанольный модификатор.

12. Композиция по п.11, в которой указанный этанольный модификатор присутствует в концентрации от примерно 2,0 мас.% до примерно 10 мас.%.

13. Композиция по п.1, в которой указанные пренилированные флавоноиды составляют от примерно 2,0 мас.% до примерно 10 мас.% указанного экстракта.

14. Композиция по п.2, в которой указанные ликорицидин и ликоризофлаван А составляют от примерно 1,0 мас.% до примерно 20 мас.% указанного экстракта.

15. Композиция по п.2, в которой указанные ликорицидин и ликоризофлаван А составляют от примерно 2,0 мас.% до примерно 10 мас.% указанного экстракта.

16. Композиция по п.3, в которой указанный экстракт содержит глабридин, метилглабридин и глаброл, и указанные глабридин, метилглабридин и глаброл составляют от примерно 1,0 мас.% до примерно 20 мас.% указанного экстракта.

17. Композиция по п.3, в которой указанный экстракт содержит глабридин, метилглабридин и глаброл, и указанные глабридин, метилглабридин и глаброл составляют от примерно 2,0 мас.% до примерно 10 мас.% указанного экстракта.

18. Композиция по п.11, в которой указанный экстракт содержит глабридин, метилглабридин и глаброл, и указанные глабридин, метилглабридин и глаброл составляют от примерно 1,0 мас.% до примерно 20 мас.% указанного экстракта.

19. Композиция по п.11, в которой указанный экстракт содержит глабридин, метилглабридин и глаброл, и указанные глабридин, метилглабридин и глаброл составляют от примерно 2,0 мас.% до примерно 10 мас.% указанного экстракта.

20. Композиция по п.2, где ликорицидин и ликоризофлаван А имеют чистоту, по меньшей мере, 90%.

21. Композиция по п.2, где указанная композиция представляет собой средство для чистки зубов, и где один или более из ликорицидина и ликоризофлавана А присутствуют в концентрации от примерно 0,01 мас.% до 2,0 мас.%.

22. Композиция по п.2, где указанная композиция представляет собой средство для чистки зубных протезов, и где один или более из ликорицидина и ликоризофлавана А присутствуют в концентрации от примерно 0,01 мас.% до 2,0 мас.%.

23. Композиция по п.2, где указанная композиция представляет собой средство для промывания ротовой полости или полоскание для рта, и где указанные ликорицидин и ликоризофлаван А присутствуют в концентрации от примерно 0,01 мас.% до 2,0 мас.%.

24. Композиция по п.2, где указанная композиция представляет собой пастилку, жевательную резинку или лепешку, и где указанные ликорицидин и ликоризофлаван А присутствуют в концентрации от 0,005 до 10,0%.

25. Композиция по п.2, где указанная композиция является растворимой таблеткой, и где указанный ликорицидин и ликоризофлаван А присутствуют в концентрации от примерно 0,01 мас.% до 5,0 мас.%.

26. Композиция по п.2, где указанная композиция является зубной нитью, и где указанные ликорицидин и ликоризофлаван А присутствуют в концентрации от примерно 0,1 мас.% до примерно 5,0 мас.% восковой смеси, используемой для покрытия или пропитывания указанной зубной нити.

27. Композиция по п.1, где композиция для ухода за телом выбрана из группы, состоящей из лосьонов для тела, кремов для кожи, мыла, шампуней и кондиционеров, средств защиты от солнечного излучения, противовоспалительных средств для местного применения, депиляторных композиций, кремов для бритья, лосьонов после бритья или дезодорантов.

28. Композиция по п.2, в которой один или более из указанных ликорицидина и ликоризофлавана А присутствуют в концентрации от примерно 0,05 мас.% до 2,0 мас.%.