Аминопиримидины в качестве ингибиторов киназ

Настоящее изобретение относится к новым соединениям общей формулы ii-d и их фармацевтически приемлемым солям, которые обладают свойствами ингибитора активности Aurora-протеинкиназы и могут быть использованы при лечении пролиферативных расстройств. В формуле ii-d:

R² представляет собой C_1-3-алкил или циклопропил; R⁵ представляет собой CH₂CH₃, CH₂CF₃, CH₂CH₂CF₃, или

R^y представляет собой или

J¹ представляет собой атом водорода или СН₃, J² представляет собой C_1-4-алкил; и Су представляет собой С_3-5-циклоалкил. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые могут быть использованы в качестве ингибиторов Аврора-протеинкиназ. Изобретение также относится к фармацевтически приемлемым композициям, включающим соединения по изобретению, способам применения соединений, к композициям для лечения различных расстройств и к способам получения соединений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Аврора-протеины представляют собой семейство трех родственных серин/треонин-киназ (обозначаемых как Аврора-A, -B и -C), играют существенную роль в прохождении через фазу митоза клеточного цикла. Более точно, Аврора-A играет ключевую роль в созревании и расщеплении центросомы, образовании митотического веретена и точном расщеплении хромосом. Аврора-B представляет собой хромосомный белок-пассажир, который играет центральную роль в регуляции выравнивания хромосом в метафазе, моменте сборки веретена и правильном завершении клеточного деления.

Сверхэкспрессия Авроры-A, -B или -C наблюдается при множестве видов рака у человека, включая колоректальный рак, рак яичников, рак желудка и инвазивные аденокарциномы протоков.

В ряде исследований было продемонстрировано, что сокращение количества или ингибирование Авроры-A или -B в линиях человеческих раковых клеток под действием siRNA, доминирующих отрицательных антител или нейтрализующих антител нарушает прохождение через митоз с накоплением клеток, имеющих 4N ДНК, что в некоторых случаях приводит к эндоредупликации и смерти клетки.

Аврора-киназы являются особенно привлекательными мишенями благодаря их участию в многочисленных видах рака у человека и той роли, которую они играют в пролиферации раковых клеток. Было бы желательно иметь ингибитор Аврора-киназы с привлекательными свойствами потенциального лекарственного средства, такими как способность ингибировать пролиферацию клеток. В связи с этим существует потребность в соединениях, которые ингибируют Аврора-киназы и также проявляют привлекательные свойства потенциального лекарственного средства.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Это изобретение предоставляет соединения и их фармацевтически приемлемые композиции, которые могут быть применены в качестве ингибиторов Аврора-протеинкиназ. Эти соединения представлены формулой I:

или их фармацевтически приемлемые соли, где переменные определены здесь.

Эти соединения и их фармацевтически приемлемые композиции являются применимыми для ингибирования киназ in vitro, in vivo и ex vivo. Такие применения включают лечение или предотвращение миелопролиферативных расстройств и пролиферативных расстройств, таких как меланома, миелома, лейкемия, лимфома, нейробластома и рак. Другие применения включают исследования роли киназ в биологических и патологических процессах; исследование внутриклеточных путей сигнальной трансдукции, опосредованных такими киназами; и сравнительное исследование новых ингибиторов киназ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемую соль, где

R² представляет собой C_1-3-алкил или циклопропил;

R⁵ представляет собой CH₂CH₃, CH₂CF₃, CH₂CH₂CF₃,

R^y представляет собой

J¹ представляет собой атом водорода или CH₃;

J² представляет собой C_1-4-алкил; и

Cy представляет собой C_3-5-циклоалкил.

В некоторых аспектах настоящего изобретения R⁵ выбран из CH₂CF₃, CH₂CH₂CF₃, или . В других вариантах осуществления R⁵ выбран из CH₂CF₃ или В следующих вариантах осуществления R⁵ представляет собой CH₂CF₃.

В других аспектах настоящего изобретения R^y представляет собой или . В некоторых вариантах осуществления R^y представляет собой . В некоторых вариантах осуществления R⁷ представляет собой циклопропил.

В других аспектах настоящего изобретения R² представляет собой метил.

В одном аспекте предоставлено соединение, выбранное из таблицы 1 (или его фармацевтически приемлемая соль):

Для целей настоящего изобретения химические элементы определены как в Периодической таблице элементов, версия CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75^th Ed. Кроме того, общие принципы органической химии описаны в документах, известных для специалистов в данной области, включая, например, "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, и "March's Advanced Organic Chemistry", 5^th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001, полное содержание которых включено сюда в виде ссылки.

Как описано здесь, определенный для атомов диапазон чисел включает любое целое число в пределах этого диапазона. Например, группа, имеющая от 1 до 4 атомов, может иметь 1, 2, 3 или 4 атома.

Как описано здесь, соединения по изобретению могут быть необязательно замещены одним или несколькими заместителями, такими как представленные в общем выше, или как проиллюстрировано на примерах отдельных классов, подклассов и примеров по изобретению. Подразумевается, что фраза "необязательно замещенный" применяется как взаимозаменяемая с фразой "замещенный или незамещенный". В целом, термин "замещенный", либо с предваряющим термином "необязательно", либо нет, относится к замене водородных радикалов в данной структуре на радикал определенного заместителя. Если не указано иное, необязательно замещенная группа может иметь заместитель при каждом замещаемом положении группы, и если более чем одно положение в любой данной структуре может быть замещено более чем одним заместителем, выбранным из определенной группы, заместитель может быть или тем же, или различным при каждом положении. Комбинации заместителей, включенные в это изобретение, предпочтительно являются такими, которые приводят к образованию стабильных или химически допустимых соединений.

Термин "стабильный", применяемый здесь, относится к соединениям, которые не изменяются существенным образом, когда подвергаются действию условий, допускающих их получение, определение и предпочтительно их выделение, очистку и применение для одной или нескольких впервые описанных здесь целей. В некоторых вариантах осуществления стабильное соединение или химически допустимое соединение представляет собой соединение, которое не изменяется существенным образом, когда хранится при температуре 40°C или менее, в отсутствие влаги или других химически реакционно-способных условий, в течение по меньшей мере недели.

Термин "алкил", применяемый здесь, обозначает неразветвленный или разветвленный линейный углеводород, который является полностью насыщенным и имеет одну точку присоединения к остатку молекулы. Специфические примеры алкильных групп включают, без ограничения, метил, этил, изопропил, н-пропил и втор-бутил.

Термин "циклоалкил" относится к моноциклическому углеводороду, который является полностью насыщенным и имеет одну точку присоединения к остатку молекулы. Подходящие циклоалкильные группы включают, без ограничения, циклопропил, циклобутил и циклопентил.

Термин "ненасыщенный", применяемый здесь, обозначает, что фрагмент имеет одно или несколько ненасыщенных звеньев.

Термин "галогеналкил" обозначает алкил, замещенный одним или несколькими атомами галогена. Термин включает перфторированные алкильные группы, такие как CF₃.

Термин "галоген" обозначает F, Cl, Br или I.

Термин "защитная группа", применяемый здесь, относится к реагенту, применяемому для временной блокировки одного или нескольких желательных реакционно-способных фрагментов в полифункциональном соединении. В определенных вариантах осуществления защитная группа имеет одну или несколько, или предпочтительно все, из следующих характеристик: a) реагирует селективно с хорошим выходом, что приводит к защищенному субстрату, который является стабильным в реакциях, имеющих место на одном или нескольких других реакционно-способных фрагментах; и b) селективно удаляется с хорошим выходом под действием реагентов, которые не атакуют высвобождаемую функциональную группу. Типичные защитные группы детально описаны в Greene, T.W., Wuts, P.G. in "Protective Groups in Organic Synthesis", Third Edition, John Wiley & Sons, New York: 1999, и других изданиях этой книги, полное содержание которой включено сюда в виде ссылки. Термин "защитная группа азота", применяемый здесь, относится к реагентам, применяемым для временной защиты одного или нескольких желательных реакционно-способных фрагментов с азотом в полифункциональном соединении. Предпочтительные защитные группы азота также обладают характеристиками, проиллюстрированными на примерах выше, и определенные типичные защитные группы азота также детально описаны в главе 7 в Greene, T.W., Wuts, P.G. in "Protective Groups in Organic Synthesis", Third Edition, John Wiley & Sons, New York: 1999, полное содержание которой включено сюда в виде ссылки.

Если не указано иное, подразумевается, что структуры, описанные здесь, включают все изомерные (например, энантиомерные, диастереомерные и геометрические (или конформационные)) формы структуры; например, R- и S-конфигурации для каждого асимметрического центра, (Z)- и (E)-изомеры по двойной связи и (Z)- и (E)-конформационные изомеры. Следовательно, отдельные стереохимические изомеры, так же как энантиомерные, диастереомерные и геометрические (или конформационные) смеси настоящих соединений, находятся в пределах объема изобретения.

Если не указано иное, все таутомерные формы соединений по изобретению находятся в пределах объема изобретения. Как должно быть понятно специалисту в данной области, пиразольная группа может быть представлена множеством способов. Например, структура, представленная как , представляет другие возможные таутомеры, такие как . Аналогичным образом, структура, представленная как , также представляет другие возможные таутомеры, такие как .

Если не указано иное, заместитель может свободно вращаться вокруг любых пригодных к вращению связей. Например, заместитель, изображенный как , также изображает . Аналогичным образом, заместитель, изображенный как , также изображает .

Кроме того, если не указано иное, подразумевается, что структуры, описанные здесь, также включают соединения, которые отличаются только присутствием одного или нескольких изотопно обогащенных атомов. Например, соединения, которые имеют структуры по настоящему изобретению, за исключением того, что атом водорода заменен на дейтерий или тритий, или углерод заменен на ¹³C- или ¹⁴C- обогащенный углерод, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Такие соединения могут быть применены, например, для аналитических целей или в качестве зондов в биологических исследованиях.

В рамках приведенного описания соединения по этому изобретению могут быть получены с применением стадий, в целом известных для специалистов в данной области. Такие соединения могут быть проанализированы известными способами, включая, без ограничения, LCMS (жидкостная хроматомасс-спектрометрия) и ЯМР (ядерный магнитный резонанс). Должно быть понятно, что специфические условия, представленные ниже, представляют собой только примеры и не предназначены для ограничения диапазона условий, которые могут быть применены для получения соединений по этому изобретению. Вместо этого, это изобретение также включает условия, которые должны быть очевидны для специалистов в данной области для получения соединений по этому изобретению, в рамках приведенного описания. Если не указано иное, все переменные определены здесь на следующих схемах.

Применяются следующие аббревиатуры:

DIPEA	диизопропилэтиламин
ДМФА	диметилформамид
н-BuOH	н-бутанол
t-BuOH	трет-бутанол
MeOH	метанол
EtOAc	этилацетат
TFA	трифторуксусная кислота
ДМСО	диметилсульфоксид
Rt	время удерживания
DCM	хлористый метилен
MeCN	ацетонитрил
ТГФ	тетрагидрофуран
TBTU	тетрафторборат 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония
ВЭЖХ	высокоэффективная жидкостная хроматография
LCMS	жидкостная хроматомасс-спектрометрия
1H-ЯМР	ядерный магнитный резонанс

Общая схема:

Общая схема выше показывает некоторые способы получения соединений по этому изобретению.

Схема I

Схема I выше показывает общий путь получения соединений формулы 4 (на схеме I), где JJ соответствуют заместителям в азетидине, как описано здесь, и где R² и R⁵ описаны выше.

Дихлорированный пиримидин формулы 1 объединяли с HQ-R¹ для получения соединения формулы 2. В некоторых вариантах осуществления два соединения нагревали в присутствии приемлемого растворителя (например, трет-BuOH) в течение 16 часов. В других вариантах осуществления два соединения смешивали при 0°C в присутствии ацетонитрила и триэтиламина в течение 1 часа. Соединение формулы 2 затем нагревали в присутствии приемлемого растворителя (например, ДМФА) и подходящего основания (например, DIPEA/NaI) с необязательно замещенным аминопиразолом для образования соединения формулы 3, которое нагревали в присутствии производного азетидина в присутствии приемлемого растворителя (например, н-BuOH) для образования соединения формулы 4.

Схема II

Схема II выше показывает общий путь получения соединений формулы 6 (на схеме II), JJ соответствуют заместителям в азетидине, как описано здесь, и где R² и R⁵ описаны здесь. Соединение формулы 5 объединяли с приемлемым хлорангидридом (где X" представляет собой Cl) в присутствии пиридина для получения промежуточного соединения, которое при смешивании в присутствии метоксида натрия и метанола образует соединение формулы 6. В некоторых вариантах осуществления X" может представлять собой OH, в таком случае подходящий реагент для конденсации с кислотой применяется для конденсации кислоты с амином. Примеры пригодных реагентов для конденсации с кислотой включают, без ограничения, EDC, DCI и HOBT. Подходящие растворители для этих реакций конденсации включают, без ограничения, ТГФ, CH₂Cl₂ и диоксан.

Следующие схемы представляют способы получения различных типов азетидинов. Данные азетидины могут быть применены для получения соединений по этому изобретению согласно описанным здесь способам.

Схема A:

Схема A выше представляет общий путь получения OH-замещенных азетидинов, где JJ представляет собой -CHJ¹J² или Cy.

Схема B

Схема B представляет общий путь получения циклопропилфтор-замещенных азетидинов. Соединение 10 окисляли в приемлемых условиях с образованием соединения 11, которое в приемлемых условиях по Гриньяру соединяется с циклопропил-MgBr для построения циклопропил-замещенного азетидина 12. Соединение 12 затем фторировали в приемлемых условиях фторирования для получения 13, которое гидрировали в условиях катализа Pd/C для получения лишенного защиты свободного азетидина 14.

Согласно этому настоящее изобретение относится к способам получения соединений по этому изобретению.

Способы исследования активности соединений по этому изобретению (например, киназные исследования) известны в технике и также описаны в примерах, приведенных ниже.

Активность соединений в качестве ингибиторов протеинкиназ может быть исследована in vitro, in vivo или на клеточной линии. Исследования in vitro включают исследования, которые определяют ингибирование или киназной активности, или АТФазной активности активированной киназы. Альтернативные исследования in vitro количественно определяют способность ингибитора связываться с протеинкиназой и могут быть измерены или путем введения радиоактивной метки в ингибитор перед связыванием, выделения комплекса ингибитор/киназа и определения количества связанной радиоактивной метки, или путем проведения конкурентного эксперимента, где новые ингибиторы инкубируются с киназой, связанной с известными радиолигандами.

Другой аспект изобретения относится к ингибированию киназной активности в биологическом образце, где способ включает контактирование указанного биологического образца с соединением формулы I или с композицией, включающей указанное соединение. Термин "биологический образец", применяемый здесь, обозначает образец in vitro или ex vivo, включая, без ограничения, клеточные культуры или их экстракты; биопсический материал, полученный из млекопитающего или его экстрактов; крови, слюны, мочи, кала, спермы, слез или других жидкостей тела или их экстрактов.

Ингибирование киназной активности в биологическом образце может быть применено для различных целей, которые известны специалисту в данной области. Примеры таких целей включают, без ограничения, переливание крови, трансплантацию органа, хранение биологического образца и биологические исследования.

Ингибирование киназной активности в биологическом образце также может быть применено для исследования роли киназ в биологических и патологических процессах; исследования путей внутриклеточной сигнальной трансдукции, опосредованной такими киназами, и сравнительного исследования новых ингибиторов киназ.

Ингибиторы Аврора-протеинкиназы или их фармацевтические соли могут быть включены в фармацевтические композиции для введения животным или людям. Эти фармацевтические композиции, которые включают количество ингибитора Аврора-протеинкиназы, эффективное для лечения или профилактики опосредованного Аврора-киназой состояния, и фармацевтически приемлемый носитель, представляют собой другой вариант осуществления настоящего изобретения.

Термин "опосредованное Аврора-киназой состояние" или "опосредованное Аврора-киназой заболевание" применяется здесь для обозначения любого заболевания или другого опасного состояния, в котором Аврора (Аврора-A, Аврора-B и Аврора-C), как известно, принимает участие. Такие состояния включают, без ограничения, рак, пролиферативные расстройства и миелопролиферативные расстройства.

Примеры миелопролиферативных расстройств включают, без ограничения, истинную полицитемию, тромбоцитемию, миелоидную метаплазию с миелофиброзом, хроническую миелогенную лейкемию (CML), хроническую миеломоноцитную лейкемию, гиперэозинофильный синдром, ювенильную миеломоноцитную лейкемию и системный мастоцитоз.

Термин "рак" также включает, без ограничения, следующие виды рака: эпидермальные ротовые: щечного кармана, губы, языка, рта, зева; сердца: саркому (ангиопластическую саркому, фибросаркому, рабдомиосаркому, липосаркому), миксому, рабдомиому, фиброму, липому и тератому; легкого: бронхогеннную карциному (сквамозно-клеточную или эпидермоидную, недифференцированную мелкоклеточную, недифференцированную крупноклеточную, аденокарциному), альвеолярную карциному (аденоматоз легких), бронхиальную аденому, саркому, лимфому, хондроматозную гамартому, мезотелиому; желудочно-кишечные: пищевода (сквамозно-клеточную карциному, гортани, аденокарциному, лейомиосаркому, лимфому), желудка (карциному, лимфому, лейомиосаркому), поджелудочной железы (аденокарциному протоков, инсулиному, глюкагонома, ульцерогенную аденому поджелудочной железы, карциноидные опухоли, випому), тонкой кишки или тонких кишок (аденокарциному, лимфому, карциноидные опухоли, саркому Капоши, лейомиому, гемангиому, липому, нейрофиброму, фиброму), толстой кишки или толстых кишок (аденокарциному, трубчатую аденому, ворсинчатую аденому, гамартому, лейомиому), ободочной кишки, ободочной кишки-прямой кишки, колоректальный; прямой кишки, мочеполового тракта: почки (аденокарциному, опухоль Уилма (Wilm) [нефробластому], лимфому, лейкемию), мочевого пузыря и уретры (сквамозно-клеточную карциному, переходно-клеточную карциному, аденокарциному), простаты (аденокарциному, саркому), яичка (сперматоцитому, тератому, эмбриональную карциному, тератокарциному, хориокарциному, саркому, интерстициально-клеточную карциному, фиброму, фиброаденому, аденоматоидные опухоли, липому); печени: гепатому (печеночно-клеточную карциному), холангиокарциному, гепатобластому, ангиосаркому, печеночно-клеточную аденому, гемангиому, желчных протоков; кости: остеогенную саркому (остеосаркому), фибросаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, хондросаркому, саркому Юинга (Ewing), злокачественную лимфому (ретикуло-клеточную саркому), множественную миелому, злокачественную гигантско-клеточную хордому, остеохондроматоз (костно-хрящевой экзостоз), доброкачественную хондрому, хондробластому, хондромиксоидную фиброму, остеоид-остеому и гигантско-клеточные опухоли; нервной системы: черепные (остеому, гемангиому, гранулему, ксантому, деформирующий остоз), мягких мозговых оболочек (менингиому, менингиосаркому, глиоматоз), мозга (астроцитому, медуллобластому, глиому, эпендимальную глиому, герминому [аденому шишковидного тела], многообразные глиобластомы, олигодендроглиому, шванному, ретинобластому, внутренние опухоли), нейрофиброму спинного мозга, менингиому, глиому, саркому); гинекологические: матки (внутриматочную карциному), шейки матки (карциному шейки матки, предопухолевую дисплазию шейки матки), яичников (карциному яичников [серозную цистаденокарциному, слизеобразующую цистаденокарциному, неклассифицированную карциному], гранулезоклеточные опухоли, опухоли клеток Сертоли-Лейдинга (Sertoli-Leydig), семиному яичника, злокачественную тератому), вульвы (сквамозно-клеточную карциному, внутриэпителиальную карциному, аденокарциному, фибросаркому, меланому), влагалища (прозрачно-клеточную карциному, сквамозно-клеточную карциному, ботриоидную саркому (эмбриональную рабдомиосаркому), фаллопиевых труб (карциному), груди; гематологические: крови (миелоидную лейкемию [острую и хроническую], острую лимфобластную лейкемию, хроническую лимфоцитарную лейкемию, миелопролиферативные заболевания, множественную миелому, миелодисплазивный синдром), болезнь Ходжкина, не-ходжкинскую лимфому [злокачественную лимфому] волосковых клеток; лимфатические расстройства; кожи: злокачественную меланому, базально-клеточную карциному, сквамозно-клеточную карциному, саркому Капоши, кератоакантому, синдром бородавочного диспластического невуса, липому, ангиому, дерматофиброму, келоиды, псориаз, щитовидной железы: папиллярную карциному щитовидной железы, фолликулярную карциному щитовидной железы; медуллярную карциному щитовидной железы, недифференцированный рак щитовидной железы, множественную эндокринную неоплазию типа 2A, множественную эндокринную неоплазию типа 2B, наследственный медуллярный рак щитовидной железы, хромаффиноцитому, параганглиому; и надпочечников: нейробластому. Таким образом, термин "раковая клетка", как здесь описано, включает клетку, пораженную любым из идентифицированных выше состояний. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из колоректального, рака щитовидной железы или рака груди.

В некоторых вариантах осуществления соединения по этому изобретению являются применимыми для лечения рака, такого как колоректальный, щитовидной железы, груди и рак легкого; и миелопролиферативных расстройств, таких как истинная полицитемия, тромбоцитемия, миелоидная метаплазия с миелофиброзом, хроническая миелогенная лейкемия, хроническая миеломоноцитная лейкемия, гиперэозинофильный синдром, ювенильная миеломоноцитная лейкемия и системный мастоцитоз.

В некоторых вариантах осуществления соединения по этому изобретению являются применимыми для лечения гемопоэтических расстройств, в частности острой миелогенной лейкемии (AML), хронической миелогенной лейкемии (CML), острой промиелоцитарной лейкемии (APL) и острой лимфоцитарной лейкемии (ALL).

В добавление к соединениям по этому изобретению в композициях для лечения или профилактики идентифицированных выше расстройств также могут быть применены фармацевтически приемлемые производные или пролекарства соединений по этому изобретению.

"Фармацевтически приемлемое производное или пролекарство" обозначает любой фармацевтически приемлемый сложный эфир, соль сложного эфира или другое производное соединения по этому изобретению, которое при введении реципиенту способно образовывать, прямо или косвенно, соединение по этому изобретению, или активный в качестве ингибитора метаболит, или его остаток. Такие производные или пролекарства включают те, что увеличивают биодоступность соединений по этому изобретению, когда такие соединения вводят пациенту (например, при пероральном введении соединения для более легкого абсорбирования в кровь), или которые усиливают доставку исходного соединения к биологической мишени (например, в мозг или лимфатическую систему) по сравнению с исходными образцами.

Примеры фармацевтически приемлемых пролекарств соединений по этому изобретению включают, без ограничения, сложные эфиры, сложные эфиры аминокислот, фосфатные эфиры, соли с металлами и сульфонатные эфиры.

Соединения по этому изобретению могут существовать в свободной форме для лечения или, если необходимо, в виде фармацевтически приемлемой соли.

Применяемый здесь термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к солям соединения, которые, с точки зрения медицинской практики, являются подходящими для применения в контакте с тканями людей и низших животных без непомерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и подобного и соответствуют благоприятному отношению польза/риск.

Фармацевтически приемлемые соли соединений по этому изобретению включают те, что получают из приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Эти соли могут быть получены in situ при конечном выделении и очистке соединений. Соли присоединения кислоты могут быть получены путем 1) реакции очищенного соединения в форме его свободного основания с пригодной органической или неорганической кислотой и 2) выделения образуемой таким образом соли.

Примеры приемлемых солей с кислотами включают ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гликолят, полусульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Другие кислоты, такие как щавелевая, в то время как они не являются сами по себе фармацевтически приемлемыми, могут быть применены при получении солей, которые могут быть применены в качестве промежуточных соединений при получении соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты.

Соли присоединения основания могут быть получены путем 1) реакции очищенного соединения в форме его кислоты с приемлемым органическим или неорганическим основанием и 2) выделения образуемой таким образом соли.

Соли, полученные из соответствующих оснований, включают соли со щелочным металлом (например, натрий и калий), щелочноземельным металлом (например, магний), аммонием и N⁺(C_1-4-алкил)₄. Это изобретение также включает кватернизацию любых основных азотсодержащих групп соединений, впервые описанных здесь. Путем такой кватернизации могут быть получены водо- или маслорастворимые или диспергируемые продукты.

Соли присоединения основания также включают соли со щелочным или щелочноземельным металлом. Репрезентативные соли со щелочным или щелочноземельным металлом включают натриевые, литиевые, калиевые, кальциевые, магниевые и подобные. Далее, фармацевтически приемлемые соли включают, когда необходимо, нетоксичные аммониевые, четвертичные аммониевые и аминные катионы, образуемые с использованием противоионов, таких как галогенид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, низший алкилсульфонат и арилсульфонат. Другие кислоты и основания, в то время как они сами не являются фармацевтически приемлемыми, могут быть применены для получения солей, которые могут быть применены в качестве промежуточных соединений при получении соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты или основания.

Фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть применены в этих фармацевтических композициях, включают, без ограничения, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, протеины сыворотки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси частично этерифицированных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрогенфосфат динатрия, гидрогенфосфат калия, хлорид натрия, цинковые соли, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, основанные на целлюлозе вещества, полиэтиленгликоль, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блок-сополимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

Композиции по настоящему изобретению могут быть введены перорально, парентерально, путем спрея для ингаляции, местно, ректально, назально, буккально, вагинально или путем имплантантируемой емкости. Термин "парентерально", применяемый здесь, включает подкожные, внутривенные, внутримышечные, внутрисуставные, внутрисиновиальные, надчревные, интратекальные, внутрибрюшинные, внутрипеченочные, путем введения внутрь пораженных тканей и внутричерепные методики инъекции или инфузии.

Стерильные инъецируемые формы композиции по этому изобретению могут представлять собой водную или масляную суспензию. Эти суспензии могут быть составлены согласно методикам, известным в технике, с применением пригодных диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильная инъецируемая композиция также может представлять собой стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном парентерально-приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Приемлемые носители и растворители, которые могут быть применены, представляют собой воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. В добавление, стерильные нелетучие масла обычно применяются в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может быть применено безвкусное нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, могут быть применены при получении инъецируемых растворов, поскольку они представляют собой природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных вариантах. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или дисперсант, такой как карбоксиметилцеллюлоза или подобные диспергирующие агенты, которые обычно применяются при приготовлении композиции фармацевтически приемлемых лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. Другие обычно применяемые поверхностно-активные вещества, такие как Tweens, Spans и другие эмульгирующие агенты, или усиливающие биодоступность агенты, которые обычно применяются при производстве фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм, могут также быть применены для целей составления композиций.

Фармацевтические композиции по этому изобретению могут быть введены перорально в любой орально приемлемой лекарственной форме, включая, без ограничения, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для орального применения обычно применяемые носители могут включать лактозу и кукурузный крахмал. Также могут быть добавлены смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в капсульной форме применяемые разбавители могут включать лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Когда водные суспензии требуются для орального применения, активный компонент может быть объединен с эмульгирующими и суспендирующими агентами. Если желательно, могут также быть добавлены определенные посластители, отдушки или окрашивающие агенты.

Альтернативно, фармацевтические композиции по этому изобретению могут быть назначены в форме суппозиториев для ректального введения. Они могут быть получены путем смешивания агента с подходящим не вызывающим раздражения наполнителем, который представляет собой твердое вещество при комнатной температуре, но жидкость при ректальной температуре и, следовательно, будет расплавляться в прямой кишке для высвобождения лекарственного средства. Такие вещества могут включать кокосовое масло, воск и полиэтиленгликоли.

Фармацевтические композиции по этому изобретению также могут быть нанесены местно, особенно когда мишень для лечения включает области или органы, легко доступные путем местного применения, включая болезни глаз, кожи или нижнюю часть кишечного тракта. Подходящие местные композиции могут быть получены для каждого из этих областей или органов.

Местное применение для нижней части кишечного тракта может быть достигнуто в форме ректального суппозитория (см. выше) или в композиции, пригодной для клизмы. Также могут быть применены местные чрескожные пластыри.

Для местных применений фармацевтические композиции могут быть составлены в виде приемлемой мази, содержащей активный компонент, суспендированный или растворенный в одном или нескольких носителях. Носители для местного нанесения соединений по этому изобретению могут включать, без ограничения, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, полиоксипропиленовое соединение, эмульгированный воск и воду. Альтернативно, фармацевтические композиции могут быть составлены в виде подходящего лосьона или крема, содержащего активные компоненты, суспендированные или растворенные в одном или нескольких фармацевтически приемлемых носителях. Подходящие носители могут включать, без ограничения, минеральное масло, моностеарат сорбитана, полисорбат 60, цетиловый эфирный воск, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду.

Для офтальмологического применения фармацевтические композиции могут быть составлены в виде тонкоизмельченных суспензий в изотоническом, с установленным pH, стерильном физиологическом растворе или в виде растворов в изотоническом, с установленным pH, стерильном физиологическом растворе, или с консервантом, или без, таким как бензилалконий хлорид. Альтернативно, для офтальмологических применений фармацевтические композиции могут быть составлены в виде мази, такой как вазелин.

Фармацевтические композиции по этому изобретению также могут быть введены путем назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции могут быть получены в виде растворов в физиологическом растворе, использующем бензиловый спирт или другие подходящие консерванты, промоторы абсорбции для усиления биодоступности, фторуглероды и/или другие традиционные способствующие растворению или диспергированию агенты.

Количество ингибитора киназы, который может быть объединен с несущими материалами для приготовления единичной формы дозировки, будет изменяться в зависимости от состояния излечиваемого пациента, особенности режима введения и симптомов. В варианте осуществления композиции должны быть составлены так, чтобы дозировка ингибитора в диапазоне 0,01-100 мг/кг массы тела/день могла быть введена пациенту, получающему эти композиции. В другом варианте осуществления композиции должны быть составлены так, чтобы дозировка ингибитора в диапазоне 0,1-100 мг/кг массы тела/день могла быть введена пациенту, получающему эти композиции.

Также должно быть понятно, что специфические дозировки и режим лечения для любого отдельного пациента будут зависеть от разнообразных факторов, включая активность специфического применяемого соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, скорости выделения, лекарственной комбинации, мнения лечащего врача и тяжести конкретной излечиваемой болезни. Количество ингибитора будет также зависеть от конкретного соединения в композиции.

Согласно другому варианту осуществления изобретение предоставляет способы лечения или профилактики рака, пролиферативного расстройства или миелопролиферативного расстройства, включая стадию введения пациенту одного из описанных здесь соединений или фармацевтических композиций.

Применяемый здесь термин "пациент" обозначает животное, включая человека.

В некоторых вариантах осуществления указанный способ применяется для лечения или профилактики гемопоэтического расстройства, такого как острая миелогенная лейкемия (AML), острая промиелоцитарная лейкемия (APL), хроническая миелогенная лейкемия (CML) или острая лимфоцитарная лейкемия (ALL).

В других вариантах осуществления указанный способ применяется для лечения или профилактики миелопролиферативных расстройств, таких как истинная полицитемия, тромбоцитемия, миелоидная метаплазия с миелофиброзом, хроническая миелогенная лейкемия (CML), хроническая миеломоноцитная лейкемия, гиперэозинофильный синдром, ювенильная миеломоноцитная лейкемия и системный мастоцитоз.

В следующих вариантах осуществления указанный способ применяется для лечения или профилактики рака, такого как рак груди, толстой кишки, простаты, кожи, поджелудочной железы, мозга, мочеполового тракта, лимфатической системы, желудка, гортани и легкого, включая аденокарциному легкого, мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого.

Другой вариант осуществления предоставляет способ лечения или профилактики рака, включающий стадию введения пациенту соединения формулы I или композиции, включающей указанное соединение.

Другой аспект изобретения относится к ингибированию киназной активности у пациента, где способ включает введение пациенту соединения формулы I или композиции, включающей указанное соединение. В некоторых вариантах осуществления указанная киназа представляет собой Аврора-киназу (Аврора-A, Аврора-B, Аврора-C), Abl, Abl(T315I), Arg, FLT-3, JAK-1, MLK1, PLK4, Tie2 или TrkA.

В зависимости от особенных излечиваемых или предотвращаемых состояний дополнительные лекарственные средства могут быть введены совместно с соединениями по этому изобретению. В некоторых случаях эти дополнительные лекарственные средства обычно назначаются для лечения или профилактики того же состояния. Например, химиотерапевтические агенты или другие антипролиферативные агенты могут быть объединены с соединениями по этому изобретению для лечения пролиферативных заболеваний.

Другой аспект этого изобретения ориентирован на способ лечения рака у индивидуума, нуждающегося в лечении, включающий последовательное или совместное введение соединения по этому изобретению или его фармацевтически приемлемой соли и другого терапевтического агента. В некоторых вариантах осуществления указанный дополнительный терапевтический агент выбран из противоракового агента, антипролиферативного агента или химиотерапевтического агента.

В некоторых вариантах осуществления указанный дополнительный терапевтический агент выбран из камптотецина, ингибитора MEK: U0126, ингибитора KSP (белок движения веретена), адриамицина, интерферонов и производных платины, таких как цисплатин.

В других вариантах осуществления указанный дополнительный терапевтический агент выбран из таксанов; ингибиторов bcr-abl (таких как гливек, дасатиниб и нилотиниб); ингибиторов EGFR (таких как тарсева и иресса); повреждающих ДНК агентов (таких как цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, ингибиторов топоизомеразы и антрациклинов); и антиметаболитов (таких как AraC и 5-FU).

В следующих вариантах осуществления указанный дополнительный терапевтический агент выбран из камптотецина, доксорубицина, идарубицина, цисплатина, таксола, таксотера, винкристина, тарсева, ингибитора MEK, U0126, ингибитора KSP, вориностата, гливека, дасатиниба и нилотиниба.

В другом варианте осуществления указанный дополнительный терапевтический агент выбран из ингибиторов Her-2 (такого как Herceptin); ингибиторов HDAC (таких как вориностат), ингибиторов VEGFR (таких как авастин), ингибиторов c-KIT и FLT-3 (таких как сунитиниб), ингибиторов BRAF (таких как BAY 43-9006 от Bayer), ингибиторов MEK (таких как PD0325901 от Pfizer); веретенных ядов (таких как эпотилоны) и мелкодисперсного связанного с белком паклитаксела (таких как Abraxane^®).

Другие терапевтические средства или противораковые агенты, которые могут быть применены в комбинации с противораковыми агентами по настоящему изобретению, включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию (в качестве примеров можно указать гамма-облучение, лучевую терапию нейтронным пучком, лучевую терапию электронным пучком, протонную терапию, близкофокусную лучевую терапию и системное действие радиоактивных изотопов), эндокринную терапию, модификаторы биологического отклика (в качестве примеров можно указать интерфероны, интерлейкины и фактор некроза опухолей (TNF)), гипертермию и криотерапию, агенты для ослабления любых побочных эффектов (например, противорвотные средства) и другие разрешенные химиотерапевтические лекарственные средства, включая, без ограничения, алкилаторные лекарственные средства (мехлоретамин, хлорамбуцил, циклофосфамид, мелфалан, ифосфамид), антиметаболиты (метотрексат), антагонисты пуринов и антагонисты пиримидинов (6-меркаптопурин, 5-фторурацил, цитарабил, гемцитабин), веретенные яды (винбластин, винкристин, винорелбин, паклитаксел), подофилотоксины (этопозид, иринотекан, топотекан), антибиотики (доксорубицин, блеомицин, митомицин), нитрозомочевины (кармустин, ломустин), неорганические ионы (цисплатин, карбоплатин), ферменты (аспарагиназа) и гормоны (тамоксифен, лейпролид, флутамид и мегестрол), Gleevec™, дексаметазон и циклофосфамид.

Соединение по настоящему изобретению также может быть применено для лечения рака в комбинации со следующими терапевтическими агентами: абареликс (Plenaxis depot^®); алдеслейкин (Prokine^®); алдеслейкин (Proleukin^®); алемтузумаб (Campath^®); алитретиноин (Panretin^®); аллопуринол (Zyloprim^®); алтретамин (Hexalen^®); амифостин (Ethyol^®); анастрозол (Arimidex^®); триоксид мышьяка (Trisenox^®); аспарагиназа (Elspar^®); азацитидин (Vidaza^®); бевацузимаб (Avastin^®); бексаротен в капсулах (Targretin^®); бексаротен-гель (Targretin^®); блеомицин (Blenoxane^®); бортезомиб (Velcade^®); бусулфан внутривенный (Busulfex^®); бусулфан оральный (Myleran^®); калустерон (Methosarb^®); капецитабин (Xeloda^®); карбоплатин (Paraplatin^®); кармустин (BCNU^®, BiCNU^®); кармустин (Gliadel^®); кармустин с имплантантом полифепросан 20 (Gliadel Wafer^®); целекоксиб (Celebrex^®); цетуксимаб (Erbitux^®); хлорамбуцил (Leukeran^®); цисплатин (Platinol^®); кладрибин (Leustatin^®, 2-CdA^®); клофарабин (Clolar^®); циклофосфамид (Cytoxan^®, Neosar^®); циклофосфамид (Cytoxan Injection^®); циклофосфамид (Cytoxan Tablet^®); цитарабин (Cytosar-U^®); цитарабин липосомальный (DepoCyt^®); дакарбазин (DTIC-Dome^®); дактиномицин, актиномицин D (Cosmegen^®); дарбепоэтин альфа (Aranesp^®); даунорубицин липосомальный (Danuoxome^®); даунорубицин, дауномицин (Daunorubicine^®); даунорубицин, дауномицин (Cerubidine^®); денилейкин дифтитокс (Ontak^®); дексразоксан (Zinecard^®); доцетаксел (Taxotere^®); доксорубицин (Adriamycin PFS^®); доксорубицин (Adriamycin^®, Rubex^®); доксорубицин (Adriamycin PFS Injection^®); доксорубицин липосомальный (Doxil^®); дромостанолон пропионат (Dromostanolone^®); дромостанолон пропионат (Masterone Injection^®); раствор B по Эллиоту (Elliott) (Elliott's B Solution^®); эпирубицин (Ellence^®); эпоэтин альфа (Epogen^®); эрлотиниб (Tarceva^®); эстрамустин (Emcyt^®); этопозид фосфат (Etopophos^®); этопозид, VP-16 (Vepesid^®); эксеместан (Aromasin^®); Филграстим (Neupogen^®); флоксуридин (внутриартериальный) (FUDR^®); флударабин (Fludara^®); фторурацил, 5-FU (Adrucil^®); фулвестрант (Faslodex^®); гефитиниб (Iressa^®); гемцитабин (Gemzar^®); гемтузумаб озогамицин (Mylotarg^®); госерелин ацетат (Zoladex Implant^®); госерелин ацетат (Zoladex^®); гистрелин ацетат (Histrelin Implant^®); гидроксимочевина (Hydrea^®); ибритумомаб тиуксетан (Zevalin^®); идарубицин (Idamycin^®); ифосфамид (IFEX^®); мезилат иматиниба (Gleevec^®); интерферон альфа-2a (Roferon A^®); интерферон альфа-2b (Intron A^®); иринотекан (Camptosar^®); леналидомид (Revlimid^®); летрозол (Femara^®); лейковорин (Wellcovorin^®, Leucovorin^®); лейпролид ацетат (Eligard^®); левамизол (Ergamisol^®); ломустин, CCNU (CeeBU^®); меклоретамин, азотное горчичное масло (Mustargen^®); мегестрол ацетат (Megace^®); мелфалан, L-PAM (Alkeran^®); меркаптопурин, 6-MP (Purinethol^®); месна (Mesnex^®); месна (Mesnex tabs^®); метотрексат (Methotrexate^®); метоксален (Uvadex^®); митомицин C (Mutamycin^®); митотан (Lysodren^®); митоксантрон (Novantrone^®); фенпропионат нандролона (Durabolin-50^®); неларабин (Arranon^®); нофетумомаб (Verluma^®); опрелвекин (Neumega^®); оксалиплатин (Eloxatin^®); паклитаксел (Paxene^®); паклитаксел (Taxol^®); мелкодисперсный паклитаксел, связанный с белком (Abraxane^®); палифермин (Kepivance^®); памидронат (Aredia^®); пегадемаза (Adagen (Pegademase Bovine)^®); пегаспаргаза (Oncaspar^®); пегфилграстим (Neulasta^®); пеметрекс-динатрий (Alimta^®); пентостатин (Nipent^®); пипоброман (Vercyte^®); пликамицин, митрамицин (Mithracin^®); порфимер натрий (Photofrin^®); прокарбазин (Matulane^®); хинакрин (Atabrine^®); расбуриказа (Elitek^®); ритуксимаб (Rituxan^®); сарграмостим (Leukine^®); сарграмостим (Prokine^®); зорафениб (Nexavar^®); стрептозоцин (Zanosar^®); малеат сунитиниба (Sutent^®); тальк (Sclerosol^®); тамоксифен (Nolvadex^®); темозоломид (Temodar^®); тенипозид, VM-26 (Vumon^®); тестолактон (Teslac^®); тиогуанин, 6-TG (Thioguanine^®); тиотепа (Thioplex^®); топотекан (Hycamtin^®); торемифен (Fareston^®); тоситумомаб (Bexxar^®); Тоситумомаб/I-131, тоситумомаб (Bexxar^®); трастузумаб (Herceptin^®); третиноин, ATRA (Vesanoid^®); урацильное горчичное масло (Uracil Mustard Capsules^®); валрубицин (Valstar^®); винбластин (Velban^®); винкристин (Oncovin^®); винорелбин (Navelbine^®); золедронат (Zometa^®) и вориностат (Zolinza^®).

Для более подробного обсуждения современных видов противораковой терапии см. http://www.nci.nih.gov/, перечень противораковых лекарственных средств, утвержденных Управлением по контролю за продуктами и лекарственными средствами (FDA) на сайте http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm и справочник Merck, Seventeenth Ed. 1999, полное содержание которых включено сюда в виде ссылки.

Другой вариант осуществления предоставляет одновременное, раздельное или последовательное применение комбинированной композиции.

Эти дополнительные агенты могут быть назначены отдельно, в виде части режима с множественным дозированием, от соединения или композиции, содержащей ингибитор киназы. Альтернативно, такие агенты могут представлять собой часть единичной формы дозировки, смешанной совместно с киназным ингибитором в отдельной композиции.

Для того чтобы это изобретение было более полно понятно, далее представлены следующие препаративные примеры и примеры тестирования. Эти примеры даны только для целей иллюстрации и не должны обсуждаться любым способом, как ограничивающие объем изобретения. Все документы, цитированные здесь, таким образом, являются включенными сюда в виде ссылки.

ПРИМЕРЫ

Применяемый здесь термин "Rt(мин)" относится ко времени удерживания в методе ВЭЖХ, приводимому для данного соединения в минутах. Если не указано иное, метод ВЭЖХ использовали для получения указанного времени удерживания, как указано ниже:

колонка: колонка ACE C8, 4,6×150 мм,

градиент: 0-100% ацетонитрил + метанол 60:40 (20 мМ трисфосфата),

скорость потока: 1,5 мл/мин,

анализ: 225 нм.

Образцы для масс-спектроскопии анализировали на масс-спектрометре MicroMass Quattro Micro, функционирующем в режиме одиночного масс-спектра с электроспрей-ионизацией. Образцы вводили в масс-спектрометр с применением хроматографии. Подвижная фаза для всех масс-спектрометрических анализов состояла из 10 мМ раствора, при pH 7, ацетата аммония и смеси 1:1 ацетонитрил-метанол, условия градиента на колонке: 5%-100% ацетонитрил-метанол в течение 3,5 минут времени градиента и 5 минут времени элюирования на колонке ACE C8 3,0×75 мм. Скорость потока составляла 1,2 мл/мин.

¹H-ЯМР спектры измеряли при 400 МГц с применением прибора Bruker DPX 400. Следующие соединения формулы I получали и анализировали, как описано ниже.

Пример 1

N-(4-(4,6-дихлорпиримидин-2-илтио)фенил)циклопентанкарбоксамид

Раствор 4,6-дихлор-2-(метилсульфонил)пиримидина (1,96 г, 8,69 ммоль) и N-(4-меркаптофенил)циклопентанкарбоксамида (2,06 г, 8,69 ммоль) в ацетонитриле (40 мл) охлаждали до 0°C. По каплям добавляли триэтиламин (0,88 г, 8,69 ммоль, 1,21 мл) и раствор перемешивали в течение 10 минут при 0°C, затем при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли воду (15 мл) и фильтровали суспензию, промывали водой (30 мл), затем высушивали с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (1,87 г, 49%).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) 1,50-1,61 (2H, м), 1,65-1,78 (4H, м), 1,82-1,93 (2H, м), 2,76-1,82 (1H, м), 7,52 (2H, д), 1,70-1,75 (3H, м), 10,08 (1H, с). ES+ 368.

Пример 2

N-(4-(4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-хлорпиримидин-2-илтио)фенил)циклопентанкарбоксамид

К раствору 3-метил-1Н-пиразол-5-амина (160 мг, 1,63 ммоль) и N-(4-(4,6-дихлорпиримидин-2-илтио)фенил)циклопентанкарбоксамида (600 мг, 1,63 ммоль) в диметилформамиде (10 мл) добавляли диизопропилэтиламин (248 мг, 1,96 ммоль, 0,34 мл). Затем смесь нагревали до 80°C в течение 18 часов и позволяли охладиться до комнатной температуры. Добавляли EtOAc (40 мл) и промывали насыщенным солевым раствором, высушивали (MgSO₄) и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт затем очищали методом флэш-хроматографии 7:3 EtOAc:гексан, EtOAc/5% MeOH:EtOAc с получением указанного в заголовке соединения в виде не совсем белого твердого вещества (431 мг, 62%).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) 1,50-1,55 (2H, м), 1,61-1,78 (4H, м), 1,79-1,85 (2H, м), 1,90 (3H, ушир.с), 2,72-1,81 (1H, м), 5,21 (1H, ушир.с), 6,46 (1H, ушир.с), 7,52 (2H, д), 7,78 (2H, д), 10,11 (1H, с), 10,18 (1H, ушир.с), 11,95 (1H, ушир.с). ES+ 429.

Пример 3

N-(4-((4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-(3-циклопропил-3-гидроксиазетидин-1-ил)пиримидин-2-ил)сульфанил)фенил)циклопентанкарбоксамид (I-9)

К суспензии N-(4-(4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-хлорпиримидин-2-илтио)фенил)циклопентанкарбоксамида (200 мг, 0,47 ммоль) и гидрохлорида 3-циклопропилазетидин-3-ола (70 мг, 0,47 ммоль) в н-BuOH (5 мл) добавляли диизопропилэтиламин (239 мг, 1,88 ммоль, 0,30 мл). Смесь нагревали до l00°C в течение 16 часов, затем позволяли охладиться до комнатной температуры и разбавляли EtOAc (30 мл) и насыщенным раствором NaHCO₃. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали. Затем неочищенный продукт очищали методом флэш-хроматографии EtOAc/5% MeOH:EtOAc с получением указанного в заголовке соединения в виде не совсем белого твердого вещества (70 мг, 30%).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) 0,30-0,35 (2H, м), 0,39-0,44 (2H, м), 1,16-1,21 (1H, м), 1,56-1,75 (6H, м), 1,83-1,90 (2H, м), 2,00 (3H, с), 2,76-2,82 (1H, м), 3,65 (4H, дд), 5,35 (1H, с), 5,58 (1H, с), 7,47 (2H, д), 7,72 (2H, д), 9,19 (1H, с), 10,06 (1H, с), 11,65 (1H, с). ES+ 506.

В таблице 2 ниже представлены данные для определенных типичных соединений, полученных согласно способу, описанному на схеме I и в примерах 1-3. Номера соединений соответствуют тем соединениям, что приведены в таблице 1.

Таблица 2
№ соединения	М+1 (наблюдаемый)	1H-ЯМР	Время удерживания (минуты)
1-1	496,00	(ДМСО-d6): 0,98 (9H, с), 1,10 (3H, т), 1,66 (2H, ушир.с), 1,98 (3H, ушир.с), 2,34 (2H, кв.), 3,69 (2H, д), 3,83 (2H, д), 5,35 (1H, ушир.с), 5,70 (1H, с), 5,75 (1H, оч.шир.,с), 7,46 (2H, д), 7,70 (2H, д), 9,18 (1H, ушир.с), 10,08 (1H, с), 11,68 (1H, ушир.с).	8,93
1-2	466,00	(ДМСО-d6): 0,29-0,33 (2H, м), 0,40-0,49 (2H, м), 1,10 (3H, т), 1,18-1,21 (1H, м), 1,99 (3H, ушир.с), 2,34 (2H, кв.), 3,63 (2H, д), 3,68 (2H, д), 5,36 (1H, с), 5,60 (1H, с), 7,47 (2H, д), 7,70 (2H, д), 9,21 (1H, ушир.с), 10,08 (1H, с), 11,67 (1H, ушир.с)	7,63
1-3	494,50	(ДМСО-d6): 1,15 (3H, т), 1,3-1,4 (2H, м), 1,5-1,8 (6H, м), 2,02 (3H, с), 2,17-2,23 (1H, м), 2,42 (2H, кв.), 3,68 (2H, д), 3,82 (2H, д), 5,5 (1H, с), 5,65 (1H, с), 5,72 (1H, ушир.с), 7,52 (2H, д), 7,78 (2H, д), 9,22 (1H, ушир.с), 10,12 (1H, с), 11,7 (1Н, ушир.с)	8,9
1-4	454,00	(ДМСО-d6): 0,89 (3H, т), 1,10 (3H, т), 1,65 (2H, ушир.кв.), 1,99 (3H, ушир.с), 2,35 (2H, кв.), 3,64 (2H, д), 3,75 (2H, д), 5,38 (1H, ушир.с), 5,51 (1H, с), 5,62 (1H, оч.шир.,с), 7,47 (2H, д), 7,70 (2H, д), 9,16 (1H, ушир.с), 10,05 (1H, ушир.с), 11,65 (1H, ушир.с).	7,87
1-5	468,00	(ДМСО-d6): 0,87 (6H, д), 1,10 (3H, т), 1,81 (1H, септ.), 1,99 (3H, ушир.с), 2,34 (2H, кв.), 3,61 (2H, д), 3,81 (2H, д), 5,37 (1H, ушир.с), 5,47 (1H, ушир.с), 5,63 (1H, оч.шир.,с), 7,47 (2H, д), 7,70 (2H, д), 9,17 (1H, ушир.с), 10,05 (1H, с), 11,65 (1H, ушир.с).	8,35
1-6	482,49	(ДМСО-d6): 0,90-0,83 (6H, м), 1,12-1,08 (4H, м), 1,54-1,46 (2H, м), 2,02 (3H, с), 2,35 (2H, кв.), 3,14 (1H, ушир.м), 3,68 (2H, т), 3,88 (2H, т), 5,40 (1H, с), 5,61 (1H, ушир.с), 7,50 (2H, д), 7,72 (2H, д), 9,63 (1H, ушир.с), 10,14 (1H, с).	8,830
1-7	492,84	(ДМСО-d6)? 0,32 (2H, д), 0,41 (2H, д), 0,53 (2H, д), 0,82 (2H, д), 1,08 (3H, т), 1,20 (1H, м), 1,70 (1H, м), 2,34 (2H, кв.), 3,65 (4H, кв.), 5,34 (1H, с), 5,68 (1H,ушир.с), 7,52 (2H, д), 7,71 (2H, д), 9,33 (1H, с), 10,04 (1H, с).	8,402
1-8	478,78	(ДМСО-d6): 0,34 (2H, д), 0,40 (2H, д), 0,81 (4H, д), 1,19 (1H, м), 1,81 (1H, м), 2,01 (3H, с), 3,66 (4H, кв.), 5,40 (1H, с), 5,61 (1H, ушир.с), 7,48 (2H, д), 7,71 (2H, д), 9,37 (1H, с), 10,39 (1H, с).	8,229
1-9	506,00	(ДМСО-d6): 0,30-0,35 (2H, м), 0,39-0,44 (2H, м), 1,16-1,21 (1H, м), 1,56-1,75 (6H, м), 1,83-1,90 (2H, м), 2,00 (3H, с), 2,76-2,82 (1H, м), 3,65 (4H, дд), 5,35 (1H, с), 5,58 (1H, с), 7,47 (2H, д), 7,72 (2H, д), 9,19 (1H, с), 10,06 (1H, с), 11,65 (1H, с).	8,938
1-10	504,83	(ДМСО-d6): 0,32 (2H, д), 0,42 (2H, д), 0,55 (2H, м), 0,82 (6H, м), 1,19 (1H, м), 1,70 (1H, м), 1,80 (1H, м), 3,65 (4H, кв.), 5,43 (1H, с), 5,65 (1H, ушир.с), 7,47 (2H, д), 7,69 (2H, д), 9,68 (1H, с), 10,42 (1H, с)	8,544
1-12	514,80	(ДМСО-d6): 0,35-0,41 (2H, м), 0,45-0,51 (2H, м), 1,2-1,28 (2H, с), 2,1-2,15 (5H, м), 2,8-2,9 (1H, м), 3,68-3,75 (4H, м), 5,45 (1H, с), 5,65 (1H, ушир.с), 7,58 (2H, д), 7,78 (2H, д), 9,23 (1H, ушир.с), 10,7 (1H, с), 11,7 (1H, ушир.с)	8,18
1-13	480,00	(MeOD): 0,40-0,45 (2H, м), 0,57-0,62 (2H, м), 0,80-0,85 (2H, м), 0,90-0,95 (2H, м), 1,30-1,40 (1H, м), 1,80-1,85 (1H, м), 2,05-2,10 (1H, с), 3,80-4,00 (4H, м), 5,40-5,50 (2H, м), 7,50-7,55 (2H, д), 7,65-7,70 (2H, д).	9,148
1-14	522,00	(MeOD): 0,40-0,45 (2H, м), 0,60-0,65 (2H, м), 1,3-1,4 (1H, м), 2,05 (2H, с), 3,25-3,40 (2H, м), 3,85-3,40 (4H, м), 5,40-5,50 (2H, м), 7,50-7,55 (2H, д), 7,65-7,70 (2H, д).	9,235
1-15	548,00	(MeOD): 0,35-0,40 (2H, м), 0,55-0,60 (2H, м), 1,25-1,35 (6H, м), 2,0 (3H, м), 3,80-3,90 (4H, м), 5,35-5,40 (2H, м), 7,45-7,50 (2H, д), 7,60-7,65 (2H, д).	9,715
1-16	468,40	(CD3OD): 0,80 (2H, м), 1,10 (2H, д), 1,65 (3H, т), 1,90 (1H, м), 2,50 (3H, с), 2,88 (2H, кв.), 4,40 (4H, м), 5,94 (2H, м), 7,49 (2H, д), 8,10 (2H, д).	9,035
1-17	536,36	(ДМСО-d6): 0,42-0,46 (2H, м), 0,60-0,63 (2H, м), 1,4 (1H, м), 1,98 (3H, с), 2,59-2,68 (4H, м), 3,80-3,93 (4H, м), 5,36 (1H, ушир.с), 5,75 (1H, ушир.с), 7,50-7,52 (2H, д), 7,69-7,71 (2H, д), 9,37 (1H, с), 10,31 (1H, с) и 11,75 (1H, ушир.с).	9,58

Пример 4

N-(4-((4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-(3-циклопропил-3-гидроксиазетидин-1-ил)пиримидин-2-ил)сульфанил)-3-фторфенил)циклопропанкарбоксамид (I-11)

6-Хлор-N-(3-метил-1Н-пиразол-5-ил)-2-(метилтио)пиримидин-4-амин

К перемешиваемому раствору 4,6-дихлор-2-(метилтио)пиримидина (25 г, 0,128 моль) в ДМФА (100 мл) добавляли диизопропиламин (19,8 г, 0,154 моль), затем добавляли 3-амино-5-метилпиразол (13,7 г, 0,154 моль), порциями, за 10 минут. Раствор нагревали до 50°C в течение 16 часов, после указанного времени все исходное вещество вступало в реакцию (по данным ЖХ/МС анализа). Смесь охлаждали до температуры окружающей среды и выливали в воду (250 мл). Осадок фильтровали и сырое твердое вещество суспендировали в диэтиловом эфире (300 мл). Твердое снова фильтровали и повторно суспендировали в метаноле (100 мл). Фильтрованный продукт высушивали на воздухе до состояния агломерата, затем далее высушивали в вакууме. Это приводило к соединению, обозначенному в заголовке примера, в виде не совсем белого твердого вещества (22,1 г, 66% выход).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ 2,22 (3H, с, CH₃), 3,31 (3H, с, CH₃,), 6,00-7,50 (2H, ушир. CH), 10,17 (1H, с, NH), 12,10 (1H, с, NH); MS ES + 256,08, ES - 254,25.

6-хлор-N-(3-метил-1Н-пиразол-5-ил)-2-(метилсульфонил)пиримидин-4-амин

К перемешиваемой суспензии 6-хлор-N-(3-метил-1H-пиразол-5-ил)-2-(метилсульфинил)пиримидин-4-амина (8 г, 31,2 ммоль) в метаноле (200 мл) при 0°C добавляли суспензию оксона (44 г, 71,7 ммоль) в воде (100 мл), порциями, за 10 минут. Смесь перемешивали в течение 30 минут при 0°C, затем нагревали до температуры окружающей среды и перемешивали в течение еще 2 часов. Реакционную смесь фильтровали и полученное твердое вещество суспендировали в водном бикарбонате натрия. Смесь фильтровали и твердое вещество промывали водой, затем диэтиловым эфиром. Твердое вещество суспендировали в этилацетате, фильтровали и высушивали. Это дало продукт, обозначенный в заголовке примера, в виде не совсем белого твердого вещества (7,9 г, 88%);

¹H ЯМР (ДМСО-d₆) δ 2,24 (3H, с), 3,35 (3H, с), 5,85 (0,5H, ушир.с), 6,50 (0,5H, ушир.с), 6,95 (0,5H, ушир.с), 8,00 (0,5H, ушир.с), 10,95 (1H, с), 12,28 (1H, с); MS ES + 288,07, ES - 286,25.

N-4-(4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-хлорпиримидин-2-илтио)-3-фторфенил)циклопропанкарбоксамид

Раствор N-(3-фтор-4-меркаптофенил)циклопропанкарбоксамида (1,0 г, 4,8 ммоль) и 6-хлор-N-(3-метил-1H-пиразол-5-ил)-2-(метилсульфонил)пиримидин-4-амина (1,4 г, 4,8 ммоль) в трет-бутаноле (10 мл) нагревали 70°C в течение 18 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, затем разбавленный с EtOAc (60 мл), промывали с насыщенным раствором NaHCO₃ (30 мл), насыщенным солевым раствором (30 мл), высушивали (MgSO₄), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали методом флэш-хроматографии на силикагеле (EtOAc/петролейный эфир 20-60%) с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (800 мг, 40%). ES+ 419.

N-(4-((4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-(3-циклопропил-3-гидроксиазетидин-1-ил)пиримидин-2-ил)сульфанил)-3-фторфенил)циклопропанкарбоксамид (I-11)

Смесь N-(4-(4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-хлорпиримидин-2-илтио)-3-фторфенил)циклопропанкарбоксамида (160 мг, 0,38 ммоль), гидрохлорида 3-циклопропилазетидин-3-ола (70 мг, 0,49 ммоль) и DIPEA (0,20 мл) в н-бутаноле (1,5 мл) нагревали в микроволновой печи при 130°C в течение 1 часа. Реакционную смесь затем охлаждали до комнатной температуры, разбавляли с EtOAc (20 мл), промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (10 мл), водой (2×10 мл), насыщенным солевым раствором (10 мл), высушивали (MgSO₄), фильтровали и упаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали методом флэш-хроматографии на силикагеле (EtOAc/петролейный эфир 30-80%) с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (55 мг, 29%).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) 0,33-0,36 (2H, м), 0,42-0,48 (2H, м), 0,82-0,86 (4H, м), 1,21-1,24 (2H, м), 1,85-1,89 (1H, м), 2,08 (3H, с), 2,10-2,15 (1H, м), 3,66-3,75 (4H, м), 5,42 (1H, ушир.с), 5,67 (1H, 1H, с), 5,8 (1H, ушир.с), 7,42 (1H, д), 7,52-7,58 (1H, м), 7,75 (1H, д), 9,27 (1H, с), 10,65 (1H, с), 11,9 (1H, ушир.с). ES+ 496,90.

В таблице 3 представлены данные для определенных типичных соединений, полученных согласно способу, описанному на общей схеме (способ B) и в примере 6. Номера соединений соответствуют тем соединениям, что приведены в таблице 1.

Таблица 3
№ соединения	М+1 (наблюдаемый)	1H-ЯМР	Время удерживания (минуты)
1-11	496,90	(ДМСО-d6) 0,33-0,36 (2H, м), 0,42-0,48 (2H, м), 0,82-0,86 (4H, м), 1,21-1,24 (2H, м), 1,85-1,89 (1H, м), 2,08 (3H, с), 2,10-2,15 (1H, м), 3,66-3,75 (4H, м), 5,42 (1H, ушир.с), 5,67 (1H, с), 5,8 (1H, ушир.с), 7,42 (1H, д), 7,52-7,58 (1H, м), 7,75 (1H, д), 9,27 (1H, с), 10,65 (1H, с), 11,9 (1H, ушир.с).	8,52
1-19	494,58	(ДМСО-d6) 0,20 (2H, м), 0,42-0,51 (4H, м), 0,59 (2H, ), 1,07 (1H, м), 1,40 (1H, м), 1,99 (3H, м), 2,24 (2H, м), 3,81-3,94 (4H, м), 5,36 (1H, с), 5,70 (1H, ушир.с), 7,47 (2H, м), 7,72 (2H, м), 9,27 (1H, с), 9,99 (1H, с), 11,65 (1H, ушир.с).	9,304

Пример 5

N-Бензгидрилазетидин-3-он

К перемешиваемой суспензии 1-(дифенилметил)-3-гидроксиазетидина (30 г, 0,126 моль) в триэтиламине (63 г, 0,628 моль) добавляли раствор комплекса триоксид серы-пиридин (60 г, 0,376 моль) в безводном ДМСО (300 мл) по каплям за 30 минут. Полученную смесь нагревали до 50°C в течение 30 минут. Реакционную смесь затем охлаждали до температуры внешней среды и выливали в смесь воды (1 л) и этилацетата (800 мл). Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (3×200 мл). Объединенные органические растворы затем промывали водой (3×200 мл), затем насыщенным солевым раствором (200 мл), высушивали (сульфат магния), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на силикагеле, элюирование смесью 5-10% этилацетат/петролейный эфир. Продукт получали в виде белого твердого вещества (26,2 г, 86%);

¹H ЯМР (CDCl₃) δ 4,07 (4Н, с), 4,62 (1H, с), 7,20-7,39 (6H, м), 7,53 (4H, д).

Гидрохлорид 1-бензгидрил-3-циклопропилазетидин-3-ола

Раствор циклопропилмагнийбромида в ТГФ (0,5 М, 600 мл, 0,5 моль) охлаждали до -78°C в атмосфере азота. Выпадение в осадок начиналось при этой температуре. Раствор N-бензгидрилазетидин-3-она (24,2 г, 0,102 моль) в безводном ТГФ (130 мл) добавляли по каплям в течение 30 минут. Смесь перемешивали в течение еще 90 минут при -78°C, после указанного времени медленно добавляли насыщенный раствор бикарбоната натрия (400 мл) и воду (100 мл). Затем смесь разбавляли этилацетатом (1 л) и позволяли нагреться до температуры окружающей среды. Органическую фазу затем отделяли (водный слой представлял собой эмульсию магниевых солей, но легко отделялся от органического слоя) и водный слой экстрагировали этилацетатом (3×300 мл). Объединенные органические растворы затем промывали насыщенным солевым раствором (300 мл), высушивали (сульфат магния), фильтровали и концентрировали, что дало бледно-желтое масло. Неочищенное масло очищали на силикагеле, при элюировании смесью 20-30% этилацетат/петролейный эфир. Полученный спирт (28,3 г) растворяли в простом эфире (350 мл) и раствор охлаждали до 0°C. Затем по каплям добавляли раствор HCl в эфире (2М, 130 мл) за 15 минут. Соль HCl выпадала в осадок из раствора. Полученную суспензию перемешивали при 0°C в течение еще 10 минут, затем фильтровали. Осадок на фильтре промывали эфиром (2×100 мл) и твердое вещество высушивали в вакууме. Это приводило к продукту в виде белого твердого вещества (28,2 г, 88%);

¹H ЯМР (ДМСО-d₆) δ 0,31-0,50 (4H, м), 1,35 (0,3H, м), 0,51 (0,7H, м), 3,41-4,10 (5H, м), 5,88 (0,3H, д), 6,05 (0,7H, д), 6,35 (1H, ушир.с), 7,30-7,50 (6H, м), 7,61-7,82 (4H, м); ES+ 280,71.

Гидрохлорид 1-бензгидрил-3-циклопропил-3-фторазетидина

Насыщенный раствор NaHCO₃ (100 мл) добавляли к суспензии гидрохлорида 1-бензгидрил-3-циклопропилазетидин-3-ола (7,78 г, 24,50 ммоль) в этилацетате (100 мл). Смесь переносили в делительную воронку и интенсивно трясли до тех пор, пока все твердое вещество растворялось. Органический слой отделяли и водный экстрагировали далее этилацетатом (50 мл). Объединенные органические экстракты сушили (Na₂SO₄) и концентрировали до масла. Масло растворяли в хлористом метилене (100 мл) и охлаждали до -78°C. По каплям добавляли трифторид [бис(2-метоксиэтил)амино]серы (5,98 г, 27,05 ммоль, 5,0 мл) и раствор перемешивали в течение 30 минут при -78°C, затем нагревали до 0°C и перемешивали в течение еще 1 часа. Реакционную смесь гасили насыщенным NaHCO₃ (50 мл) и насыщенным солевым раствором (50 мл), водный слой экстрагировали хлористым метиленом (50 мл). Объединенные органические экстракты сушили (Na₂SO₄) и концентрировали с получением желтого масла. Неочищенный продукт очищали на силикагеле, элюировали смесью 5% этилацетат/петролейный эфир. Полученный спирт растворяли в эфире (100 мл), раствор охлаждали до 0°C. Затем по каплям добавляли раствор HCl в эфире (2 М, 25 мл) за 5 минут. Соль HCl выпадала в осадок из раствора. Полученную суспензию перемешивали при 0°C в течение еще 10 минут, затем фильтровали. Осадок на фильтре промывали эфиром (20 мл), твердое вещество высушивали в вакууме с получением белого твердого вещества (4,71 г, 61%).

¹H ЯМР (d₄-MeOH) δ 0,30-0,52 (4H, м), 1,22 (1H, ушир.с), 4,01-4,23 (4H, м), 5,50-5,60 (1H, ушир.с), 7,13-7,46 (10H, м); ES+ 282.

Гидрохлорид 3-циклопропил-3-фторазетидина

К влажному 10% палладию-на-саже (катализатор Degussa) в атмосфере азота добавляли этанол (100 мл). Раствор гидрохлорид 1-бензгидрил-3-циклопропил-3-фторазетидин (6,74 г, 21,23 ммоль) в этаноле (50 мл) добавляли к катализатору и смесь гидрировали при 60 psi в аппарате Парра для гидрирования в течение 5 часов. Реакционную смесь фильтровали через целит и концентрировали до масла. Добавляли эфир (50 мл) и смесь охлаждали до 0°C и перемешивали до образования осадка. Фильтровали суспензию, осадок на фильтре промывали эфиром (20 мл) и твердое вещество высушивали в вакууме с получением не совсем белого твердого вещества (3,00 г, 93%).

¹H ЯМР (ДМСО-d₆) δ 0,52-0,56 (2H, м), 0,59-0,64 (2H, м), 1,35-1,40 (1H, м), 3,91-4,10 (4H, м), 4,01-4,23 (4H, м), 9,50 (1H, ушир.с), 9,63 (1H, ушир.с).

Пример 6

N-(4-(4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-(3-циклопропил-3-фторазетидин-1-ил)пиримидин-2-илтио)фенил)-3,3,3-трифторпропанамид (соединение I-14)

6-(3-циклопропил-3-фторазетидин-1-ил)-N-(3-метил-1H-пиразол-5-ил)-2-(метилтио)пиримидин-4-амин

К смеси гидрохлорида 6-хлор-N-(3-метил-1Н-пиразол-5-ил)-2-(метилтио)пиримидин-4-амина (150 г, 0,58 моль), 3-циклопропил-3-фторазетидина (132,2 г, 0,87 моль) добавляли диизопропилэтиламин (208 г, 1,61 моль) и изопропанол (1,125 л), затем нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 23 часов. Реакционную смесь охлаждали до легкого замутнения раствора, до 85°C, фильтровали и гомогенный раствор концентрировали до минимального объема. Добавляли EtOAc (1 л) и концентрировали до минимального объема. Добавляли EtOAc (1 л) и H₂O (1 л) и слои разделяли (из органического слоя во время экстракции начинал кристаллизоваться продукт). Водный слой далее экстрагировали EtOAc (500 мл). Концентрировали первый органический раствор досуха, что дало белое твердое вещество. Гексан (750 мл) добавляли ко второму органическому экстракту и суспензию перемешивали при температуре окружающей среды, затем охлаждали до 0°C в течение 30 мин, фильтровали и обильно промывали гептаном. Осадок на фильтре сушили в вакууме. Осадок на фильтре и белое твердое вещество из первой экстракции объединяли, что дало 155,1 г желаемого продукта (155,1 г, 77%).

¹H-ЯМР (ДМСО, 400 МГц) 0,44 (2H, м), 0,60 (2H, м), 1,38-1,43 (1H, м), 2,18 (3H, с), 2,42 (3H, с), 3,89-3,97 (4H, м), 5,92 (1H, ушир.с), 6,04 (1H, ушир.с), 9,23 (1H, с), 11,86 (1H, с). ES+ 335.

6-(3-циклопропил-3-фторазетидин-1-ил)-N-(3-метил-1H-пиразол-5-ил)-2-(метилсульфонил)пиримидин-4-амин

Раствор 6-(3-циклопропил-3-фторазетидин-1-ил)-N-(3-метил-1Н-пиразол-5-ил)-2-(метилтио)пиримидин-4-амина (130 г, 389 ммоль) в MeOH (5,2 л) охлаждали до 0°C. Раствор оксона (526 г, 855 ммоль) в H₂O (5,2 л) медленно добавляли к суспензии при удерживании температуры ниже 5°C. После добавления реакционной смеси позволили нагреться до комнатной температуры в течение ночи. Затем добавляли 10% раствор NaHSO₃ (325 мл) и 10% раствор K₂CO₃ (2,6 л) для нейтрализации реакционной смеси, раствор фильтровали и осадок на фильтре промывали H₂O (3,3 л). Твердое вещество суспендировали в H₂O (2,6 л), раствор фильтровали и осадок на фильтре промывали H₂O (3,3 л). Твердое вещество сушили в вакууме (72,3 г, 51%).

¹H-ЯМР (ДМСО): 0,47 (2H, м), 0,60 (2H, м), 1,43-1,46 (1H, м), 2,20 (3H, с), 3,25 (3H, с), 3,97-4,11 (4H, м), 5,93 (1H, ушир.с), 6,47 (1H, ушир.с). 9,88 (1H, с), 12,01 (1H, ушир.с). ES+ 367.

N-(4-(4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-(3-циклопропил-3-фторазетидин-1-ил)пиримидин-2-илтио)фенил)-3,3,3-трифторпропанамид (соединение I-14)

Суспензия 6-(3-циклопропил-3-фторазетидин-1-ил)-N-(3-метил-1Н-пиразол-5-ил)-2-(метилсульфонил)пиримидин-4-амина (61 г, 170 ммоль) и 3,3,3-трифтор-N-(4-меркаптофенил)пропанамида (41 г, 175 ммоль) в CH₃CN (1300 мл) нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 1,5 часов. В течение этого времени суспензия трансформировалась из подвижной и желтоватой в густую и ярко-белую. Затем смесь охлаждали до 0°C и перемешивали при этой температуре в течение 15 мин; фильтровали и промывали холодным CH₃CN (650 мл). Полученное твердое вещество сушили в течение 20 часов при 38°C в вакууме стандартной линии. Белое твердое вещество помещали в подходящий реактор с EtOAc (1300 мл) и NaHCO₃ (насыщенный) (1300 мл). Смесь перемешивали до момента, когда твердого вещества не оставалось. Затем слои разделяли и промывали водный слой EtOAc (390 мл). Объединенные органические слои сушили над MgSO₄, фильтровали, промывали EtOAc (130 мл) и концентрировали до минимального объема на роторном испарителе. Полученную смесь повторно перекристаллизовывали из EtOAc и гексана с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (56,2 г, 72%).

¹H-ЯМР (MeOD, 400 МГц): 0,40-0,45 (2H, м), 0,60-0,65 (2H, м), 1,3-1,4 (1H, м), 2,05 (2H, с), 3,25-3,40 (2H, м), 3,85-3,40 (4H, м), 5,40-5,50 (2H, м), 7,50-7,55 (2H, д), 7,65-7,70 (2H, д). ES+ 522.

В таблице 4 ниже представлены данные для определенных типичных соединений, полученных согласно способу, описанному на общей схеме (способ A) и в примере 6. Номера соединений соответствуют тем соединениям, что приведены в таблице 1.

Таблица 4
№ соединения	М+1 (наблюдаемый)	1H-ЯМР	Время удерживания (минуты)
1-14	522,00	(MeOD): 0,40-0,45 (2H, м), 0,60-0,65 (2H, м), 1,3-1,4 (1H, м), 2,05 (2H, с), 3,25-3,40 (2H, м), 3,85-3,40 (4H, м), 5,40-5,50 (2H, м), 7,50-7,55 (2H, д), 7,65-7,70 (2H, д).	9,235
1-18	498,70	(ДМСО-d6): 0,45-0,48 (2H, м), 0,6-0,63 (2H, м), 0,87-0,92 (4H, м), 1,45 (1H, ушир.с), 1,82-1,85 (1H, м), 2,02 (3H, с), 3,8-3,95 (4H, м), 5,3 (1H, оч.шир.,с), 5,75 (1H, ушир.с), 7,4 (1H, д), 7,52-7,55 (1H, м), 7,8 (1H, д), 9,4 (1H, ушир.с), 10,7 (1H, ушир.с), 11,7 (1H, ушир.с).	9,2
1-20	516,60	(ДМСО-d6): 0,22-0,25 (2H, м), 0,42-0,45 (2H, м), 1,20-1,26 (1H, м), 1,75-1,9 (5H, м), 2,6-2,7 (1H, м), 3,65-3,8 (4H, м), 5,1 (1H, ушир.с), 5,4 (1H, оч.шир.,с), 7,3 (2H, д), 7,52 (2H, д), 9,1 (1H, ушир.с), 10,4 (1H, с), 11,5 (1H, ушир.с).	9,34

Пример 7

N-(5-(4-(3-метил-1Н-пиразол-5-иламино)-6-(3-циклопропил-3-фторазетидин-1-ил)пиримидин-2-илтио)пиридин-2-ил)-3,3,3-трифторпропанамида (I-21)

К раствору 2-(6-аминопиридин-3-илтио)-6-(3-циклопропил-3-фторазетидин-1-ил)-N-(3-метил-1Н-пиразол-5-ил)пиримидин-4-амина (300 мг, 0,7 ммоль) и BOC₂O (220 мг, 1 ммоль) в 4,5 М растворе гидроксида натрия (0,470 мл) и DCM (10 мл) добавляли DMAP (5 мг). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем промывали насыщенным раствором NaHCO₃, насыщенным солевым раствором, высушивали (MgSO₄), фильтровали и упаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали методом флэш-хроматографии (12 г SiO₂, EtOAc/петролейный эфир), что дало желаемое промежуточное соединение (60 мг, 17%) ES+ 513. Это промежуточное соединение (60 мг, 0,12 ммоль) растворяли в пиридине (2 мл), по каплям добавляли 3,3,3-трифторпропаноилхлорид (34 мг, 0,23 ммоль) и затем перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем добавляли 3 капли 3,3,3-трифторпропаноилхлорида, что приводило к полной конверсии в продукт после перемешивания в течение еще 30 минут. Затем реакционную смесь концентрировали в вакууме, остаток повторно растворяли в DCM (2 мл)/TFA (1 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Смесь концентрировали в вакууме и неочищенный продукт очищали методом препаративной LCMS и лиофильно высушивали (MeCN/H₂O/TFA) с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества, соль с TFA (25 мг, 33%).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) 0,20-0,21 (2H, м), 0,36-0,38 (2H, м), 1,15-1,20 (1H, м), 1,77 (3H, с), 3,40-3,50 (2H, м), 3,57-3,72 (4H, м), 5,10-5,15 (12H, с), 7,75-7,80 (1H, д), 7,92-7,97 (1H, д), 8,22 (1H, с), 9,20 (1H, с), 10,91 (1H, с). ES+ 523.

Данные экспериментов, представленные ниже, описывают получение некоторых соединений, примененных в описанных здесь примерах.

Соединение a:

3,3,3-трифтор-N-(4-меркаптофенил)пропанамид

S-4-{3,3,3-трифторпропанамидо)фенил 3,3,3-трифторпропантиоат

4-Аминотиофенол расплавляли и помещали в колбу. Добавляли дегазированный EtOAc (1950 мл). Добавляли раствор K₂CO₃ (92 г, 670 ммоль) в дегазированной H₂O (1300 мл). Раствор охлаждали до 0°C и медленно добавляли 3,3,3-трифторпропаноилхлорид (55,2 г, 600 ммоль) для удерживания температуры ниже 10°C). Реакцию нагревали до комнатной температуры. Органический слой отделяли и промывали насыщенным солевым раствором (1300 мл); затем концентрировали на роторном испарителе. Твердое вещество суспендировали в смеси гептан/EtOAc (390 мл/390 мл) в течение 30 мин. Добавляли гептан (780 мл) и суспензию охлаждали до 0°C в течение 30 мин. Суспензию фильтровали. Осадок с фильтра высушивали в вакууме с получением желаемого соединения (51,3 г, 87,2%).

3,3,3-трифтор-N-(4-меркаптофенил)пропанамид

В колбу помещали S-4-(3,3,3-трифторпропанамидо)фенил 3,3,3-трифторпропантиоат (44,8 г, 189 ммоль) и EtOH (70 мл). Медленно добавляли концентрированный HCl (22,5 мл) при удерживании температуры ниже 30°C. Затем реакционную смесь нагревали до 50°C в течение 17,5 часов. Реакционную смесь упаривали до 41 мл путем вакуумной дистилляции при 50°C. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и добавляли H₂O (51 мл). Суспензию фильтровали и осадок с фильтра промывали H₂O (3×35 мл). Твердое вещество сушили в вакууме до получения желаемого соединения (19,9 г, 58%).

Пример 9: Исследование ингибирования Авроры-2 (Авроры-A)

Соединения подвергали скринингу на их способность ингибировать Аврору-2 с применением стандартного сопряженного ферментного анализа (Fox et al., Protein Sci., (1998) 7, 2249). Исследования проводили в смеси 100 мМ Hepes (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 25 мМ NaCl, 2,5 мМ фосфоенолпирувата, 300 мкМ NADH, 30 мкг/мл пируват-киназы и 10 мкг/мл лактат-дегидрогеназы. Конечные концентрации субстрата в исследовании составляли 400 мкМ АТФ (Sigma Chemicals) и 570 мкМ пептида (Kemptide, American Peptide, Sunnyvale, CA). Исследования проводили при 30°C и в присутствии 40 нМ Авроры-2.

Исходный буферный раствор для исследования содержал все реагенты, перечисленные выше, за исключением Авроры-2 и тестируемого интересующего соединения. 55 мкл исходного раствора помещали в 96-луночный планшет с последующим добавлением 2 мкл исходного раствора в ДМСО, содержащего серийные разбавления тестируемого соединения (типично исходя из конечной концентрации 7,5 мкМ). Планшет предварительно инкубировали в течение 10 минут при 30°C и реакцию инициировали путем добавления 10 мкл Авроры-2. Начальные скорости реакции определяли на ридере планшетов Molecular Devices SpectraMax Plus в течение 10-минутного отрезка времени. Данные для IC₅₀ и Ki вычисляли методом нелинейного регрессионного анализа с применением пакета программного обеспечения Prism (GraphPad Prism версия 3,0cx для Macintosh, GraphPad Software, San Diego California, USA).

Пример 10: Исследование ингибирования Авроры-1 (Авроры-B) (радиометрическое)

Приготавливали буферный раствор для исследования, который состоял из 25 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 0,1% BSA и 10% глицерина. В буфере для исследования приготавливали 22 нМ раствор Авроры-B, также содержащего 1,7 мМ DTT и 1,5 мМ Kemptide (LRRASLG). К 22 мкл раствора Авроры-B в 96-луночном планшете добавляли 2 мкл исходного раствора соединения в ДМСО и смеси позволяли приходить к состоянию равновесия в течение 10 минут при 25°C. Ферментативную реакцию инициировали путем добавления 16 мкл исходного раствора [γ-³³P]-АТФ (~20 nCi/мкл), полученного в буфере для исследования, до конечной концентрации для исследования 800 мкМ. Реакцию останавливали через 3 часа путем добавления 16 мкл 500 мМ фосфорной кислоты и уровни включения ³³P в пептидный субстрат определяли следующим способом.

Фосфоцеллюлозный 96-луночный планшет (Millipore, Cat no. MAPHNOB50) предварительно обрабатывали 100 мкл 100 мМ фосфорной кислоты перед добавлением ферментативной реакционной смеси (40 мкл). Раствор оставляли впитываться на фосфоцеллюлозной мембране в течение 30 минут и планшет затем промывали четыре раза 200 мкл 100 мМ фосфорной кислоты. К каждой лунке сухого планшета добавляли 30 мкл жидкого коктейля Optiphase "SuperMix" для сцинтилляционного измерения (Perkin Elmer) перед сцинтилляционным считыванием (счетчик сцинтилляции жидкости 1450 Microbeta, Wallac). Уровни не катализируемой ферментом фоновой радиоактивности определяли путем добавления 16 мкл 500 мМ фосфорной кислоты к контрольным лункам, содержащим все компоненты для исследования (которые действуют в направлении денатурации фермента), перед добавлением раствора [γ-³³P]-АТФ. Уровни катализируемого ферментом включения ³³P вычисляли путем вычитания измеренных фоновых значений из тех значений, что измерены для каждой концентрации ингибитора. Для каждого измерения Ki получали по 8 точек, типично покрывающих диапазон концентраций соединения 0-10 мкМ, в виде двух дублирующих экспериментов (исходные растворы в ДМСО получали из начального 10 мМ раствора соединения с последующими 1:2,5 серийными разбавлениями). Величины Ki вычисляли из данных начальной скорости путем нелинейной регрессии с применением пакета программного обеспечения Prism (Prism 3.0, GraphPad Software, San Diego, CA).

Пример 11: Исследование ингибирования Itk: радиоизотопное исследование

Соединения по настоящему изобретению исследовали в качестве ингибиторов Itk-киназы человека с использованием радиоизотопного исследования.

Исследования проводили в смеси 20 мМ MOPS (pH 7,0), 10 мМ MgCl₂, 0,1% BSA и 1 мМ DTT. Конечные концентрации субстрата в исследовании составляли 7,5 мкМ [γ-³³P]АТФ (400 мкCi ³³P АТФ/мкмоль АТФ, Amersham Pharmacia Biotech/Sigma Chemicals) и 3 мкМ пептида (SAM68, белок Δ332-443). Исследования проводили при 25°C в присутствии 50 нМ Itk. Исходный буферный раствор для исследования содержал все реагенты, перечисленные выше, за исключением АТФ и тестируемого интересующего соединения. 50 мкл исходного раствора помещали в 96-луночный планшет с последующим добавлением 2 мкл исходного раствора в ДМСО, содержащего серийные разбавления тестируемого соединения (типично исходя из конечной концентрации 50 мкМ с 2-кратными серийными разбавлениями) в виде двух дублирующих экспериментов (конечная концентрация в ДМСО 2%). Планшет предварительно инкубировали в течение 10 минут при 25°C и реакцию инициировали путем добавления 50 мкл [γ-³³P]АТФ (конечная концентрация 7,5 мкМ).

Реакцию останавливали через 10 минут путем добавления l00 мкл 0,2М фосфорной кислоты + 0,01% TWEEN 20. Многооконный фосфоцеллюлозный фильтрующий 96-луночный планшет (Millipore, Cat. № MAPHN0B50) предварительно обрабатывали l00 мкл 0,2М фосфорной кислоты + 0,01% TWEEN 20 перед добавлением 170 мкл остановленной смеси для исследования. Планшет промывали 4×200 мкл 0,2М фосфорной кислоты + 0,01% TWEEN 20. После высушивания добавляли 30 мкл жидкого коктейля Optiphase "SuperMix" для сцинтилляционного измерения (Perkin Elmer) к лунке перед сцинтилляционным считыванием (счетчик сцинтилляции жидкости 1450 Microbeta, Wallac).

Величины Ki (апроксимированные) вычисляли путем нелинейного регрессионного анализа данных начальной скорости с применением пакета программного обеспечения Prism (GraphPad Prism версия 3.0cx для Macintosh, GraphPad Software, San Diego California, USA).

Пример 12: Исследование ингибирования JAK3

Соединения подвергали скринингу на их способность ингибировать JAK с использованием исследования, описанного ниже. Реакции проводили в киназном буфере, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,4), 1 мМ DTT, 10 мМ MgCl₂, 25 мМ NaCl, и 0,01% BSA. Концентрации субстрата в исследовании составляли 5 мкМ АТФ (200 мкCi/мкмоль АТФ) и 1 мкМ поли(Glu)₄Tyr. Реакции проводили при 25°C и 1 нМ JAK3.

К каждой лунке 96-луночного поликарбонатного планшета добавляли 1,5 мкл тестируемого ингибитора JAK3 в соответствии с 50 мкл киназного буфера, содержащего 2 мкМ поли(Glu)₄Tyr и 10 мкМ АТФ. Смесь затем перемешивали и для начала реакции добавляли 50 мкл киназного буфера, содержащего 2 нМ фермента JAK3. Через 20 минут при комнатной температуре (25°C) реакцию останавливали действием 50 мкл 20% трихлоруксусной кислоты (TCA), которая также содержала 0,4 мМ АТФ. Все содержимое каждой лунки затем переносили в 96-луночный стекловолоконный планшет для фильтрования с использованием клеточного харвестера TomTek. После промывания добавляли 60 мкл сцинтилляционной жидкости и измеряли включение ³³P на счетчике Perkin Elmer TopCount.

Пример 13: Исследование ингибирования JAK2

Исследования проводили, как описано выше в примере 12, за исключением того, что применяли фермент JAK-2, конечная концентрация поли(Glu)₄Tyr составляла 15 мкМ, конечная концентрация АТФ составляла 12 мкМ.

Пример 14: Исследование ингибирования FLT-3

Соединения подвергали скринингу на их способность ингибировать активность FLT-3 с применением радиометрического анализа по степени связывания вещества с мембранным фильтром. Это исследование измеряет включение ³³P в субстрат поли(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). Реакции проводили в растворе, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 25 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,01% BSA и 2,5% ДМСО. Конечные концентрации субстрата в исследовании составляли 90 мкМ АТФ и 0,5 мг/мл pE4Y (оба от Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Конечная концентрация соединения по настоящему изобретению находилась обычно между 0,01 и 5 мкМ. Типично титрование по 12 точкам проводили путем серийных разбавлений от 10 мМ исходного раствора тестового соединения в ДМСО. Реакции проводили при комнатной температуре.

Получали два раствора для исследования. Раствор 1 содержит 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 25 мМ NaCl, 1 мг/мл pE4Y и 180 мМ АТФ (содержит 0,3 мCi [γ-³³P] АТФ для каждой реакции). Раствор 2 содержит 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 25 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 0,02% BSA и 3 нМ FLT-3. Исследование проводили в 96-луночном планшете путем смешивания 50 мкл раствора 1 и 2,5 мл раствора соединения по настоящему изобретению. Реакцию инициировали действием раствора 2. После инкубирования в течение 20 минут при комнатной температуре реакцию останавливали действием 50 мкл 20% TCA, содержащего 0,4 мМ АТФ. Весь реакционный объем затем переносили на фильтрующий планшет и промывали 5% TCA в аппарате Harvester 9600 от TOMTEC (Hamden, CT). Количество включенного ³³P в pE4y анализировали на микропланшетном сцинтилляционном счетчике Packard Top Count (Meriden, CT). Для получения величин IC₅₀ или Ki данные аппроксимировали с использованием программного обеспечения Prism.

Пример 15: Исследование микросомальной стабильности

Микросомальную стабильность измеряли путем измерения профиля исчерпания в микросомах из различных источников (самец мыши CD-1, самец крысы Sprague-Dawley, самец собаки Бигль, самец макаки-крабоеда и человека, объединенный от разных полов). Пиковые растворы соединения приготавливали путем разбавления исходного раствора соединения в ДМСО (типично 10 мМ), что давало раствор в ацетонитриле (0,5 мМ). Соединение (с получением конечной концентрации 5 мкМ) инкубировали с конечной реакционной смесью (1000 мкл), состоящей из белка микросом печени (1 мг/мл) и β-никотинамидаденин динуклеотидфосфата, регенерирующей восстановленную форму (NADPH) системы (RGS) [состоящей из 2 мМ β-никотинамидаденин динуклеотидфосфата (NADP), 20,5 мМ изолимонной кислоты, 0,5 U изоцитрат-дегидрогеназы/мл, 30 мМ хлорида магния и 0,1 М фосфатного буфера (PB) pH 7,4] в присутствии 0,1 М PB (pH 7,4).

Реакцию инициировали путем добавления (250 мкл) предварительно инкубированной RGS к предварительно инкубированной смеси микросом/VRT/PB (предварительная инкубация в обоих случаях составляла 10 минут при 37°C). Образцы инкубировали в сосудах Эппендорфа (1,5 мл) на нагревающем вибростенде (DPC Micromix 5 (установки: форма 20, амплитуда 4), модифицированном для нагревания до 37°C, двумя планшетными нагревателями, закрепленными на деке, с контролем от Packard Manual Heater), присоединенными к автоматическому жидкостному манипулятору Multiprobe II HT Ex. Жидкостной манипулятор был запрограммирован (программное обеспечение WinPREP) на отбор образца из смеси микросомальной инкубации через 0, 2, 10, 30 и 60 минут инкубации и перенесение аликвоты (100 мкл) в останавливающий модуль (96-луночный модуль), содержащий 100 мкл охлажденного метанола. Процент органики в останавливаемой смеси оптимизировали для анализа путем добавления соответствующих объемов водно-органической смеси (типично 100 мкл 50:50 метанол:вода).

Перед анализом остановленный модуль помещали на вибростенд (DPC Micromix 5; 10 мин, форма 20, амплитуда 5) для осаждения белков. Модуль затем центрифугировали (Jouan GR412; 2000 об/мин, 15 мин, 4°C). Затем аликвоту образца (200 мкл) переносили в модуль для анализа и модуль центрифугировали повторно (Jouan GR412; 2000 об/мин, 5 мин, 4°C) перед отправкой на анализ. Профиль уменьшения определяли путем контроля исчезновения VRT методом жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией (LC-MS/MS). Образцы инжектировали в аналитическую колонку (20 мкл; жидкостная хроматографическая система Agilent 1100, снабженная автоматическим пробоотборником). Подвижная фаза состояла из воды + 0,05% (об./об.) муравьиной кислоты (A) и метанола + 0,05% (об./об.) муравьиной кислоты (B).

Пропускание в градиентном способе, оптимизированном для интересующего соединения, проводили путем элюирования соединения из аналитической колонки. Общее время пропускания составляло 6 минут при скорости потока 0,35 мл/мин. Полный поток, исходящий с колонки, между 0,5 и 5,9 мин пробега, вводился в источник электроспрей-ионизации (режим положительного иона) на Micromass Quattro LC, соединенный с масс-спектрометром. Масс-спектрометрию оптимизировали для интересующего соединения. Все инкубации проводили как два дублирующих эксперимента и результаты выражали в виде % остатка от исходного при или 30 минутах, или 60 минутах относительно образца при 0 минут.

Пример 16: Анализ клеточной пролиферации и жизнеспособности

Соединения подвергали скринингу на их способность ингибировать клеточную пролиферацию и их влияние на жизнеспособность клеток с использованием клеток Colo205, полученных из ECACC с применением исследования, описанного ниже.

Клетки Colo205 высевали в 96-луночные планшеты и серийно разбавленное соединение добавляли в лунки в виде двух дублирующих экспериментов. Контрольные группы включали необработанные клетки, разбавитель соединения (0,1% чистого ДМСО) и культуральную среду без клеток. Затем клетки инкубировали в течение 72 или 96 часов при 37°C в атмосфере 5% CO₂/95% влажности.

Для измерения пролиферации к каждой лунке добавляли за 3 часа до конца эксперимента 0,5 мкCi 3H-тимидина. Затем клетки собирали и включенную радиоактивность измеряли на бета-счетчике микропланшетов от Wallac. Жизнеспособность клеток оценивали с применением Promega CellTiter 96AQ для измерения конверсии MTS. Кривые доза-отклик вычисляли с применением или программного обеспечения Prism 3.0 (GraphPad), или SoftMax Pro 4.3.1 LS (Molecular Devices).

Пример 17: Исследование ингибирования активности Abl-киназы и определение константы ингибирования Ki

Соединения подвергали скринингу на их способность ингибировать активность усеченной на N-конце (∧27) Abl-киназы с применением стандартной сопряженной ферментативной системы (Fox et al., Protein Sci., 7, pp. 2249 (1998)). Реакции проводили в растворе, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 25 мМ NaCl, 300 мкМ NADH, 1 мМ DTT и 3% ДМСО. Конечные концентрации субстрата в исследовании составляли 110 мкМ АТФ (Sigma Chemicals, St Louis, MO) и 70 мкМ пептида (EAIYAAPFAKKK, American Peptide, Sunnyvale, CA). Реакции проводили при 30°C и 21 нМ Abl-киназы. Конечные концентрации компонентов сопряженной ферментативной системы составляли 2,5 мМ фосфоенолпирувата, 200 мкМ NADH, 60 мкг/мл пируват-киназы и 20 мкг/мл лактат-дегидрогеназы.

Исходный буферный раствор для исследования содержал все реагенты, перечисленные выше, за исключением АТФ и тестового интересующего соединения. Исходный буферный раствор для исследования (60 мкл) инкубировали в 96-луночном планшете с 2 мкл тестового интересующего соединения при конечных концентрациях типично в небольшом диапазоне от 0,002 мкМ до 30 мкМ при 30°C в течение 10 мин. Типично титрование по 12 точкам получали путем серийных разбавлений (из 1 мМ исходных растворов соединения) с тестовыми соединениями в ДМСО в дочерних планшетах. Реакцию инициировали путем добавления 5 мкл АТФ (конечная концентрация 110 мкМ). Скорости реакции измеряли с применением ридера планшетов Molecular Devices Spectamax (Sunnyvale, CA) в течение 10 мин при 30°C. Величины Ki определяли из данных по остаточной скорости как функцию концентрации ингибитора с применением нелинейной регрессии (Prism 3.0, GraphPad Software, San Diego, CA).

Пример 18: Исследование ингибирования активности мутантной Abl киназы (T315I) и определение константы ингибирования IC₅₀

Соединения подвергали скринингу на их способность ингибировать T315I мутантную форму Abl человека на приборе Upstate Cell Signaling Solutions (Dundee, UK). В конечном реакционном объеме 25 мкл мутантный Abl человека T315I (5-10 mU) инкубировали с 8 мМ MOPS pH 7,0, 0,2 мМ EDTA, 50 мкМ EAIYAAPFAKKK, 10 мМ ацетата Mg, [γ-³³P-АТФ] (специфическая активность приблизительно 500 cpm/пмоль, при конечной концентрации для исследования 10 мМ) и тестовое интересующее соединение при конечных концентрациях в диапазоне 0-4 µнМ. Реакцию инициировали путем добавления смеси Mg-АТФ. После инкубирования в течение 40 минут при комнатной температуре реакцию останавливали путем добавления 5 мкл 3% раствора фосфорной кислоты. Затем 10 мкл реакционной смеси наносили компактным пятном на плоский фильтр P30 и промывали три раза в течение 5 минут в 75 мМ фосфорной кислоты и один раз в метаноле перед высушиванием и измерением сцинтилляции. Величины ингибирования IC₅₀ определяли методом нелинейного регрессионного анализа остаточных активностей фермента как функцию концентрации ингибитора (Prism 3.0, GraphPad Software, San Diego, CA).

Пример 19: Исследование ингибирования Plk4

Соединения подвергали скринингу на их способность ингибировать Plk4 с использованием исследования включения радиоактивного фосфата. Исследования проводили в смеси 8 мМ MOPS (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 0,1% BSA и 2 мМ DTT. Конечные концентрации субстрата составляли 15 мкМ [γ-³³P]АТФ (227 mCi ³³P АТФ/ммоль АТФ, Amersham Pharmacia Biotech/Sigma Chemicals) и 300 мкМ пептида (KKKMDATFADQ). Исследования проводили при 25°C в присутствии 25 нМ Plk4. Исходный буферный раствор для исследования содержал все реагенты, перечисленные выше, за исключением АТФ и тестируемого интересующего соединения. 30 мкл исходного раствора помещали в 96-луночный планшет, затем добавляли 2 мкл исходного раствора в ДМСО, содержащего серийные разбавления тестируемого соединения (типично исходя из конечной концентрации 10 мкМ с 2-кратными серийными разбавлениями) в виде двух дублирующих экспериментов (конечная концентрация в ДМСО 5%). Планшет предварительно инкубировали в течение 10 минут при 25°C и реакцию инициировали путем добавления 8 мкл [γ-³³P] АТФ (конечная концентрация 15 мкМ). Реакцию останавливали через 180 минут путем добавления l00 мкл 0,14 М фосфорной кислоты. Многооконный фосфоцеллюлозный фильтрующий 96-луночный планшет (Millipore, Cat no. MAPHN0B50) предварительно обрабатывали l00 мкл 0,2 М фосфорной кислоты перед добавлением 125 мкл остановленной смеси для исследования. Планшет промывали 4×200 мкл 0,2 М фосфорной кислоты. После высушивания к лунке добавляли l00 мкл жидкого коктейля Optiphase "SuperMix" для сцинтилляционного счета (Perkin Elmer) перед сцинтилляционным считыванием (счетчик сцинтилляции жидкости 1450 Microbeta, Wallac). После удаления величин значений фона для всех данных точек данные Ki(аппроксим.) вычисляли методом нелинейного регрессионного анализа данных начальной скорости с применением пакета программного обеспечения Prism (GraphPad Prism версия 3.0cx для Macintosh, GraphPad Software, San Diego California, USA).

Пример 20. Исследование ингибирования FGFR1, MLK1, Tie2 и TrkA

Соединение(я) подвергали скринингу на их способность ингибировать Arg (Abl-2), FGFR1, MLK1, Tie2 и TrkA с применением способов скрининга, известных специалисту в данной области техники.

Все указанные ферменты подвергали скринингу при концентрациях АТФ, равных или близких к K_m для АТФ.

В таблице 5 ниже представлены Ki величины, полученные из примера 20.

Таблица 5
Номер соединения	Arg IC50 (мкМ)	FGFR1 IC50 (мкМ)	MLK1 IC50 (мкМ)	Tie2 IC50 (мкМ)	TrkA IC50 (мкМ)
I-14	0,014	0,121	0,027	0,089	0,018
I-17	0,21	0,088	-	-	-
I-18	0,053	0,022	-	-	-
I-19	0,13	0,035	-	-	-

В таблице 6 ниже представлены данные, полученные из примера 20.

Таблица 6
Номер соединения	Arg IC50 (мкМ)	FGFR1 IC50 (мкМ)	MLK1 IC50 (мкМ)	Tie2 IC50 (мкМ)	TrkA IC50 (мкМ)
I-14	0,0033	0,065	0,014	0,047	0,005

В таблице 7 ниже представлены данные из описанных выше примеров 9, 10 и 16.

Таблица 7
Номер соединения	Ki для Авроры А (мкМ)	Ki для Авроры B (мкМ)	Ингибирование включения 3H-Thy в Colo205 после 72 часов, IC50 (мкМ)	Ингибирование включения 3H-Thy в Colo205 после 96 часов, IC50 (мкМ)
I-1	0,00040	0,007	-	0,047
I-2	0,00039	0,0076	0,026	0,026
I-3	0,00067	0,0065	0,002	0,004
I-4	0,0017	0,015	-	0,092
I-5	0,0012	0,014	-	0,033
I-6	0,00077	0,0062	-	0,024
I-7	0,00036	<0,006	-	0,022
I-8	0,00087	0,0071	0,04	0,033
I-9	0,00043	<0,006	-	0,016
I-10	0,00042	0,007	-	0,042
I-11	0,00041	0,009	-	0,028
I-12	0,00035	0,003	0,019	-
I-13	0,0011	0,022	0,072	0,039
I-14	0,00035	0,0068	0,006	0,006
I-15	0,00040	0,0096	0,026	-
I-16	0,0010	0,024	0,051	-
I-17	0,00062	0,012	0,026	0,019
I-18	0,00035	0,018	0,027	-
I-19	0,00044	0,021	0,05	-
I-20	0,00077	0,018	0,012	-
I-21	0,00044	0,0095	0,02	-

В таблице 8 ниже представлены данные из примеров 12-14 и 17-18.

Таблица 8
Номер соединения	Ki для FLT-3 (мкМ)	Ki для JAK-2 (мкМ)	Ki для JAK-3 (мкМ)	Ki для Abl (T315I) (мкМ)	Ki для Abl (немутантный) (мкМ)
I-1	-	-	-	0,43	-
I-2	0,036	0,026	0,16	-	0,064
I-3	0,026	0,034	0,15	-	0,030
I-4	-	-	-	-	-
I-5	0,021	0,026	0,1	-	-
I-6	0,048	0,044	0,19	-	-
I-7	0,023	0,023	0,037	-	-
I-8	0,028	0,041	0,14	-	0,030
I-9	0,11	0,022	0,15	-	-
I-10	0,0025	0,054	0,051	-	-
I-11	0,02	0,015	0,056	-	-
I-12	0,015	0,0029	0,028	-	-
I-13	0,043	0,11	0,29	0,21	0,088
I-14	0,065	0,011	0,077	0,033	0,023
I-15	-	-	-	0,2	0,057
I-16	-	-	-	0,18	0,17
I-17	-	-	-	0,053	0,022
I-18	0,16	0,36	0,22	-	-
I-19	0,14	0,13	0,62	-	-
I-20	0,072	0,051	0,11	-	-
I-21	0,12	0,028	0,1	-	-

В то время как авторы описали ряд вариантов осуществления по настоящему изобретению, очевидно, что приведенные в настоящем описании основные примеры могут быть модифицированы для предоставления других вариантов осуществления, которые применяют или включают соединения, способы и процессы по настоящему изобретению. Следовательно, подразумевается, что объем этого изобретения определен в прилагаемой формуле изобретения.

1. Соединение формулы ii-d:

или его фармацевтически приемлемая соль,
в котором R² представляет собой C_1-3-алкил или циклопропил;
R⁵ представляет собой CH₂CH₃, CH₂CF₃, CH₂CH₂CF₃, или
R^y представляет собой или
J¹ представляет собой атом водорода или СН₃,
J² представляет собой C_1-4-алкил; и
Су представляет собой С_3-5-циклоалкил.

2. Соединение по п.1, в котором R⁵ выбран из CH₂CF₃, CH₂CH₂CF₃, или

3. Соединение по п.2, в котором R⁵ выбран из CH₂CF₃ или

4. Соединение по п.3, в котором R⁵ представляет собой CH₂CF₃.

5. Соединение по любому из пп.1-4,
где R^y представляет собой или .

6. Соединение по п.5, где R^y представляет собой

7. Соединение по п.6, где Су представляет собой циклопропил.

8. Соединение по п.1, в котором R² представляет собой метил.

9. Соединение, выбранное из следующих:

10. Фармацевтическая композиция, обладающая свойствами ингибитора активности Aurora-протеинкиназы, включающая соединение по любому из пп.1-9 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель, адьювант или разбавитель.

11. Способ ингибирования активности Aurora-протеинкиназы в биологическом образце, включающий контактирование указанного биологического образца с соединением по любому из пп.1-9.

12. Способ лечения пролиферативного расстройства, включающий введение соединения по любому из пп.1-9 в эффективном количестве.