Способ получения рекомбинантного белка
Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает культивирование рекомбинантных плесневых грибков коджи в жидкой среде, сбор рекомбинантного белка из полученного продукта. Среда для культивирования содержит в качестве сырьевого вещества, по меньшей мере, одно, выбранное из группы, состоящей из ячменя и пшеницы, поверхность которого полностью или частично покрыта, по меньшей мере, оболочкой, в концентрации от 1 до 20% (масса/объем) и в качестве питательных веществ, по меньшей мере, одну неорганическую соль. Рекомбинантные плесневые грибки коджи получают тем, что ген, кодирующий целевой белок, лигируют ниже промотора гена, кодирующего фермент, подвергающийся катаболитной репрессии вследствие концентрирования питательных веществ, таких как сахариды и аминокислоты, для получения тем самым продукта лигирования и продукт лигирования вводят в плесневые грибки коджи в качестве организма-хозяина. Изобретение позволяет повысить эффективность получения белка. 3 з.п. ф-лы, 3 табл.
Техническая область
Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, более конкретно к способу получения рекомбинантного белка путем использования плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина.
Предпосылки изобретения
Коджи с давних времен используют в качестве источников ферментов для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков. В качестве кожди для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков традиционно применяли твердые кожди, которые получают при выращивании плесневых грибков коджи на поверхности зерновых злаков и подобных. Твердые кожди получают традиционным способом производства. Однако способ представляет собой особый метод культивирования, а именно культивирование в виде твердой культуры, что непригодно для крупномасштабного производства.
С другой стороны, жидкий кожди, который представляет собой продукт культивирования плесневых грибков коджи, полученный путем культивирования плесневых грибков коджи в жидкости, можно легко контролировать в культуре, и это является пригодным способом культивирования для эффективного производства.
Тем не менее хорошо известно, что жидкий плесневой грибок коджи не дает достаточной ферментативной активности, требуемой для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков, поэтому существует мало примеров, в которых жидкий кожди применяют в реальном производстве (см. непатентные документы 1-4).
Плесневые грибки коджи легко размножаются, соответственно, можно приготовить среду с низкой стоимостью, и для культивирования не требуется специальное оборудование, поэтому стоимость культивирования является низкой. Плесневые грибки коджи применяли для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков с давних времен, поэтому признаются как безопасный организм-хозяин. Поэтому традиционно предпринимались попытки встраивания генов, полученных из плесневых грибков коджи или из других организмов, путем использования плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина для высокой экспрессии генов, для производства посредством этого продуктов, полученных от генов, то есть рекомбинантных белков (см. непатентный документ 5).
Кроме того, сообщалось об успешных примерах получения рекомбинантного белка с высокими выходами при помощи твердой культуры с пшеничными отрубями (см. непатентный документ 6). Однако производство проводилось специальным способом культивирования, а именно, твердой культуры, что является неподходящим для крупномасштабного производства.
С другой стороны, считается, что по своей природе жидкая культура дает незначительное количество белков вне клеток, как описано выше, и следовательно, не является подходящей для крупномасштабного производства рекомбинантного белка.
Непатентный документ 1: Hata Y. et al.: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997).
Непатентный документ 2: Hata Y. et al.: Gene, 207, 127-134 (1998).
Непатентный документ 3: Ishida H. et al.: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998).
Непатентный документ 4: Ishida H. et al.: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000).
Непатентный документ 5: R. J. Gouka, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, 1-11 (1997).
Непатентный документ 6: K. Tsuchiya, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 895-899 (1994).
Описание изобретения
Вопросы, которые решаются при помощи изобретения
Предметом настоящего изобретения является предоставление способа масштабного получения рекомбинантного белка способом жидкой культуры при помощи плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина, который традиционно считался неподходящим для получения рекомбинантного белка по вышеизложенным причинам.
Средства для решения проблем
Авторы настоящего изобретения уже предложили способы производства жидкого кожди, обладающего достаточными ферментативными активностями (см. Japanese Patent Application Nos. 2004-350661, 2004-352320, 2004-352324, 2004-378453 и 2005-290648, и JP-A-2003-265165). В этих способах применяют в качестве среды сырьевое вещество, поверхность которого полностью или частично покрыта, по меньшей мере, пленкой, предохраняющей высвобождение питательных веществ из сырьевого материала в систему культивирования, и этим достигается необходимая активность ферментов, именно, амилолитических ферментов, целлюлозолитических ферментов и протеолитических ферментов. По способам достигаются ферментативные активности выше, чем активности, получаемые при помощи жидкой культуры с использованием в качестве сырьевого вещества полированного ячменя или полированного риса, который представляет собой сырьевой материал для шочу. Примеры плесневых грибков коджи включают белые плесневые грибки коджи, черные плесневые грибки коджи, желтые плесневые грибки коджи и красные плесневые грибки коджи.
Предполагают, что вышеприведенные способы получения жидкого кожди увеличивают уровни транскрипции генов, которые кодируют ферменты, подвергающиеся катаболитной репрессии из-за концентрирования питательных веществ, таких как сахариды и аминокислоты, и, таким образом, продукты (а именно, целевые ферменты), полученные на основе этих генов, образуются и секретируются из клеток плесневых грибков коджи.
Ген, кодирующий целевой белок, лигируют ниже промотора гена, кодирующего фермент, подвергающийся катаболитной репрессии из-за концентрирования питательных веществ, таких как сахариды и аминокислоты, для создания тем самым рекомбинантных плесневых грибков коджи, обладающих включенным в них продуктом лигирования; культивируют рекомбинантные плесневые грибки коджи вышеприведенными способами производства жидкого коджи, вследствие чего образуется целевой рекомбинантный белок с высокими выходами.
Дополнительным существенным фактором при производстве рекомбинантного белка является то, чтобы транслированный рекомбинантный белок правильно транспортировался из клеток организма-хозяина. Даже если уровни транскрипции просто увеличены, транслированные рекомбинантные белки зачастую могут накапливаться к клетке или разлагаться под действием ферментов в норме секретируемых организмом-хозяином. К тому же белки, которые правильно свернуты и обладают активностью, эквивалентной активности натурального белка не образуются до тех пор, пока рекомбинантный белок не подвергся необходимой модификации при его транспортировке из клеток организма-хозяина.
Принимая это во внимание, весьма вероятно получать и секретировать большое число рекомбинантных белков при помощи технологии производства жидкого коджи, как описано выше, с использованием плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина. Целевой рекомбинантный белок можно также получить с высокими выходами за счет того, что он может продуцироваться вовне организма-хозяина плесневых грибков коджи, в качестве слитого белка рекомбинантного белка с ферментом, который в норме продуцируется и секретируется организмом-хозяином плесневых грибков коджи, и что слитый белок, содержащийся в культуральном супернатанте, расщепляется в его участке лигирования сайт-специфической протеазой.
Таким образом, на основании приведенных выше данных настоящее изобретении является завершенным.
То есть настоящее изобретение по п.1 предоставляет способ получения рекомбинантного белка при помощи рекомбинантных плесневых грибков коджи, которые образуются при трансформации плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина, включающий: культивирование рекомбинантных плесневых грибков коджи в жидкой среде, которая содержит в качестве культурального сырьевого вещества, по меньшей мере, одно, выбранное из группы, состоящей из зерна, поверхность которого полностью или частично покрыта, по меньшей мере, оболочкой, боба и/или клубня, поверхность которого покрыта оболочкой, и амаранта и/или семян киноя без предобработки, такой как помол или измельчение; и сбор рекомбинантного белка из культурального продукта.
Настоящее изобретение по п.2 предоставляет способ получения рекомбинантного белка по п.1, при котором рекомбинантные плесневые грибки коджи получают тем, что ген, кодирующий целевой белок, лигируют ниже промотора гена, кодирующего фермент, подвергающийся катаболитной репрессии из-за концентрирования питательных веществ, таких как сахариды и аминокислоты, для получения тем самым продукта лигирования, и что продукт лигирования вводят в плесневые грибки коджи в качестве организма-хозяина.
Настоящее изобретение по п.3 предоставляет способ получения рекомбинантного белка по п.2, при котором промотор представляет собой промотор гена, кодирующего любой фермент, выбранный из группы, состоящей из амилолитических ферментов, целлюлозолитических ферментов и протеолитических ферментов.
Полезный эффект изобретения
Согласно настоящему изобретению предоставлен способ массового получения рекомбинантного белка способом жидкой культуры плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина. Плесневые грибки коджи легко размножаются, поэтому среду можно приготовить с низкими затратами, и не требуется никакого специального оборудования. Плесневые грибки коджи использовали для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков с давних времен, поэтому они представляют собой безопасный организм-хозяин.
Далее, жидкую культуру плесневых грибков коджи можно контролировать более строго по сравнению с твердой культурой, поэтому она пригодна для эффективного производства.
Кроме того, можно выбрать множество схем производства путем использования различных сырьевых веществ и штаммов плесневых грибков коджи и эффективно и стабильно в масштабе получать целевой рекомбинантный белок.
Наилучший вариант осуществления для проведения изобретения
Далее, настоящее изобретение будет описано подробно.
Жидкая среда, используемая по настоящему изобретению, содержит, по меньшей мере, одно сырьевое вещество для культивирования, выбранное из группы, состоящей из зерна, поверхность которого полностью или частично покрыта, по меньшей мере, оболочкой, боба и/или клубня, поверхность которого покрыта оболочкой, и амаранта и/или семян киноя без предобработки, такой как помол или измельчение.
По настоящему изобретению примеры зерновых культур, используемых в качестве сырьевого вещества для культивирования, включают ячмень, рис, пшеницу, гречиху, просо японское, просо итальянское, просо, сорго японское, кукурузу и подобные. Сырьевые вещества для культивирования должны обладать поверхностью, полностью или частично покрытой, по меньшей мере, оболочкой (шелухой). Можно использовать неполированное вещество или вещество, обладающее равным или большим соотношением полирования, при котором оно было полировано так, что оболочка, по меньшей мере, остается на поверхности зерна, и можно использовать необработанный рис, необработанный ячмень и подобные. В случае риса можно использовать необработанный рис, рис, полностью покрытый оболочкой, и рис, частично покрытый оболочкой.
Когда сырьевым веществом для культивирования является ячмень, можно использовать неполированный материал с соотношением полирования в 100%. Альтернативно, основываясь на том, что соотношение полирования неполированного материала принято за 100%, можно использовать материал с соотношением полирования не менее, чем значение, определенное вычитанием соотношения доли оболочки в ячмене (как правило, от 7 до 8%) из соотношения полирования неполированного материала (100%), то есть приблизительно от 92% до 93%.
Термин «соотношение полирования» относится к остаточному соотношению зерна после полировки зерна. Например, термин «процент полировки 90%» означает, что 10% оболочки, или подобной, на части поверхностного слоя зерна удалено. По настоящему изобретению термин «необработанный ячмень» охватывает зерна в диапазоне от неполированного ячменя до полированного ячменя, обладающего оболочками, оставшимися на поверхности зерна, то есть вещество, имеющее соотношение полирования 90% и более. Термин «оболочка» относится к внешней части, которая покрывает поверхность зерна.
По настоящему изобретению примеры боба и клубня, используемые в качестве сырьевого вещества для культивирования, включают соевый боб, красную фасоль, сладкий картофель и подобные. Эти сырьевые вещества для культивирования подвергают лишь тому, что смывают загрязнения на их оболочке (кожуре), но не подвергают процессам, таким как нарезание, измельчение и подобные, и применяют для приготовления жидкой среды в виде полностью покрытых оболочкой.
По настоящему изобретению бобы и клубни в качестве сырьевого вещества для культивирования можно подвергать нагреванию или замораживанию с оставшейся на них оболочкой.
По настоящему изобретению «амарант» для использования в качестве сырьевого вещества для культивирования представляет собой общее обозначение растений, относящихся к роду Amaranthus семейства Amaranthaceae. Среди зерновых культур амарант обладает высоким содержанием белка, а по содержанию лизина, который является одной из аминокислот, близок к соевому бобу. Кроме того, амарант представляет собой очень питательную зерновую культуру, содержащую большие количества кальция, железа и клетчатки, по сравнению с полированным рисом. Странами происхождения являются определенные районы стран Южной/Центральной Америки, Индии, Гималаев и Непала. С другой стороны, киноа представляет собой однолетнее растение семейства Agatha, которое культивируется главным образом в гористых местностях, таких как Анды, расположенные в южной части Перу и западной части Боливии. Киноа богата минеральными веществами, витаминами, белками и пищевыми волокнами.
Амарант и киноа, предназначенные в качестве сырьевого вещества для культивирования, можно использовать по отдельности или в сочетании. Эти сырьевые вещества можно непосредственно использовать для приготовления жидкой среды без предварительной обработки, такой как помол или измельчение.
Одно из указанных выше сырьевых веществ для культивирования или сочетание двух таких веществ или более применяют для приготовления жидкой среды, как описано выше. Указанные выше сырьевые вещества для культивирования смешивают с водой для приготовления жидкой среды. Соотношение компонентов сырьевого вещества можно адаптировать в пределах, что целевой рекомбинантный белок селективно образуется и накапливается в культуральном продукте плесневой грибок коджи.
Например, при использовании ячменя в качестве сырьевого вещества для культивирования жидкую среду готовят добавлением от 1 до 20% (масса/объем) ячменя к воде. При использовании неполированного ячменя жидкую среду готовят добавлением, более предпочтительно, от 8 до 10% (масса/объем). При использовании 95% полированного ячменя в качестве сырьевого вещества жидкую среду готовят с добавлением его, более предпочтительно, от 1 до 4% (масса/объем).
Затем, при использовании в качестве сырьевого вещества для культивирования неполированного риса, у которого удалена оболочка, жидкую среду готовят добавлением от 1 до 20%, предпочтительно от 5 до 13%, или, более предпочтительно, от 8 до 10% (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем) неполированного риса к воде.
При использовании бобов в качестве сырьевого вещества для культивирования жидкую среду готовят добавлением от 1 до 10% бобов к воде, предпочтительно, добавлением от 8 до 10% соевых бобов или от 1 до 2% (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем) красной фасоли к воде. При использовании клубней в качестве сырьевого вещества для культивирования жидкую среду готовят добавлением от 1 до 10% (масса/объем) клубней к воде.
При использовании амаранта в качестве сырьевого вещества для культивирования жидкую среду готовят добавлением от 1,5 до 15%, предпочтительно, от 2 до 10%, или более предпочтительно, от 2 до 8% (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем) амаранта к воде. При использовании киноа в качестве сырьевого вещества для культивирования жидкую среду готовят добавлением от 1,5 до 7%, предпочтительно, от 2 до 6%, или более предпочтительно, от 2 до 4% (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем) киноа к воде.
Количество используемых для смешивания сырьевых веществ для культивирования можно соответствующим образом выбрать, поскольку оптимальные количества меняются в зависимости от степеней полировки или разновидности используемых сырьевых веществ для культивирования, используемого в качестве организма-хозяина штамма плесневых грибков коджи, используемого промотора, производимого рекомбинантного белка и подобных.
Если количество используемого сырьевого вещества для культивирования превышает верхнюю границу, вязкость культуральной жидкости возрастает и обеспечение кислородом или воздухом, необходимым для аэробного культивирования рекомбинантных плесневых грибков коджи, становится недостаточным. Это уменьшает содержание кислорода в культуральном продукте, ограничивает развитие культуры и не является предпочтительным. С другой стороны, если количество используемого сырьевого вещества ниже нижней границы, целевой рекомбинантный фермент в большом количестве не образуется.
Крахмалы, содержащиеся в сырьевом веществе для культивирования, перед культивированием можно предварительно желатинизировать. Желатинизированные крахмалы можно получить при помощи, но без специфических ограничений, любым из традиционных способов, включающих способ пропаривания, способ обжаривания и подобные. Крахмалы можно желатинизировать на стадии стерилизации жидкой среды, как описано ниже, когда они нагреты до температуры желатинизации или выше, путем стерилизации при высоких температурах и высоких давлениях.
В дополнение к указанному выше сырьевому веществу для культивирования в жидкой среде, используемой по настоящему изобретению, желательно добавлять органические вещества, неорганические соли и подобные в качестве источников питательных веществ.
Например, при использовании белых плесневых грибков коджи, таких как Aspergillus kawachii, или черных плесневых грибков коджи, таких как Aspergillus awamori и Aspergillus niger, в качестве организма-хозяина применяется нитратная соль и фосфатная соль, предпочтительно, в сочетании, или более предпочтительно, применяется сульфатная соль в сочетании дополнительно к ним. Примеры нитратной соли включают нитрат натрия и нитрат калия, и нитрат калия особенно предпочтителен. Примеры фосфатной соли включают фосфорнокислый калий и фосфат аммония, и фосфорнокислый калий особенно предпочтителен. Примеры сульфатной соль включают сульфатированный гептагидрат магния, сульфатированный гептагидрат железа и сульфат аммония, и сульфатированный гептагидрат магния и сульфатированный гептагидрат железа являются особенно предпочтительными. Две или более из них можно применять в сочетании.
Концентрацию неорганических солей в жидкой среде при использовании белых плесневых грибков коджи или черных плесневых грибков коджи подбирают в пределах, чтобы целевой рекомбинантный белок селективно образовывался и накапливался в культуральном продукте плесневых грибков коджи. Чтобы быть конкретным, концентрация нитратной соли составляет от 0,1 до 2,0%, предпочтительно, от 0,2 до 1,5%, концентрация фосфатной соли составляет от 0,05 до 1,0%, предпочтительно, 0,1 до 0,5%, и концентрация сульфатной соли составляет от 0,01 до 0,5%, предпочтительно, 0,02 до 0,1% (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем).
При использовании желтых плесневых грибков коджи, таких как Aspergillus oryzae и Aspergillus sojae, нитратную соль, фосфатную соль и сульфатную соль применяют, предпочтительно, вместе в жидкой среде. Примеры нитратной соли включают нитрат натрия и нитрат калия, и нитрат натрия особенно предпочтителен. Примеры фосфатной соли включают фосфорнокислый калий и фосфат аммония, и фосфорнокислый калий особенно предпочтителен. Примеры сульфатной соли включают сульфатированный гептагидрат магния, сульфатированный гептагидрат железа и сульфат аммония, и сульфатированный гептагидрат магния и сульфатированный гептагидрат железа особенно предпочтительны. Две или более из этих неорганических солей можно применять в сочетании.
Концентрация неорганических солей в жидкой среде при использовании желтых плесневых грибков коджи подбирают в пределах, чтобы целевой рекомбинантный белок селективно образовывался и накапливался в культуральном продукте плесневых грибков коджи. Чтобы быть конкретным, концентрация нитратной соли составляет от 0,1 до 2,0%, предпочтительно, от 0,2 до 1,5%, концентрация фосфатной соли составляет от 0,05 до 1,0%, предпочтительно, 0,1 до 0,5%, и концентрация сульфатной соли составляет от 0,01 до 0,5%, предпочтительно, 0,02 до 0,1% (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем).
Органические вещества и неорганические соли, за исключением отмеченных выше неорганических солей, соответственно можно добавлять в качестве источников питательных веществ к жидкой среде по настоящему изобретению. Эти добавки не являются особенно ограниченными, поскольку их обычно применяют для культивирования плесневых грибков коджи. Примеры органического вещества включают отруби риса, пшеничный глютен, кукурузный сироп, соевый жмых и обезжиренные соевые бобы. Примеры неорганических солей включают водорастворимые соединения, такие как соль аммония, соль калия, соль кальция и соль магния. Два или более органических веществ и/или неорганических солей можно применять одновременно. Дополнительные количества их не являются особенно ограниченными, поскольку вызывают размножение рекомбинантного плесневого грибка коджи. Дополнительные количества органического вещества составляет, предпочтительно, приблизительно от 0,1 до 5% (масса/объем) и дополнительное количество неорганической соли составляет, предпочтительно, приблизительно от 0,1 до 1% (масса/объем).
Добавление этих источников питательных веществ в количестве, превышающем верхний предел, не является предпочтительным, поскольку ингибирует рост рекомбинантных плесневых грибков коджи. Количество меньше нижнего предела также не является предпочтительным, поскольку целевой рекомбинантный белок не образуется в больших количествах.
Полученную таким образом жидкую среду можно при необходимости подвергать обработке стерилизацией, и процедуры обработки не являются особенно ограниченными. Например, это может быть способ стерилизации при увеличенных температуре и давлении, проводимой при температуре 121°C в течение 15 минут.
Стерилизованную жидкую среду охлаждают до температуры культивирования, и затем засевают рекомбинантные плесневые грибки коджи в жидкую среду.
Рекомбинантные плесневые грибки коджи, используемые по настоящему изобретению, представляют собой продукт, полученный трансформацией плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина, и могут быть продуктом, культивируемым в указанной выше жидкой среде при помощи описанного ниже культурального способа. Используемые в качестве организма-хозяина плесневые грибки коджи могут быть продуктом, который продуцирует ферменты, подвергающиеся катаболитной репрессии вследствие концентрирования питательных веществ, таких как сахариды и аминокислоты. Примеры таковых включают белые плесневые грибки коджи, такие как Aspergillus kawachii, черные плесневые грибки коджи, такие как Aspergillus awamori и Aspergillus niger, и желтые плесневые грибки коджи, такие как Aspergillus oryzae и Aspergillus sojae.
Рекомбинантные плесневые грибки коджи по настоящему изобретению получены путем лигирования гена, кодирующего целевой белок ниже промотора, и введения продукта лигирования в плесневые грибки коджи в качестве организма-хозяина. Любой промотор можно использовать по настоящему изобретению, поскольку он экспрессирует нижележащий ген в плесневых грибках коджи в качестве организма-хозяина, и предпочтительным является промотор фермента, который с высоким выходом образуется вне клеток плесневых грибков коджи. Более предпочтительно использовать промотор гена, кодирующего фермент, подвергающийся катаболитной репрессии вследствие концентрирования питательных веществ, таких как сахариды и аминокислоты. Конкретные примеры таковых включают промоторы генов, кодирующих амилолитические ферменты, такие как глюкоамилаза (GlaA или GlaB) и α-амилаза (AmyB), целлюлозолитические ферменты, такие как глюканаза (EglA), и протеолитические ферменты, такие как протеаза (PepA).
Согласно настоящему изобретению рекомбинантные плесневые грибки коджи культивируют с использованием указанного выше сырьевого вещества для культивирования, поэтому расщепление питательных веществ, таких как сахариды и аминокислоты, в сырьевом веществе занимает много времени, а скорость высвобождения питательных веществ в систему культивирования ограничена. Соответственно, активируется промотор гена, кодирующего фермент, подвергающийся катаболитной репрессии, вследствие концентрирования этих питательных веществ, и увеличивается уровень транскрипции гена, кодирующего целевой белок, который расположен ниже промотора, в результате чего в массовом количестве происходит образование целевого рекомбинантного белка.
Согласно настоящему изобретению, ген, кодирующий целевой белок, может быть материалом, который можно экспрессировать в плесневых грибках коджи в качестве организма-хозяина, и может представлять собой кДНК или хромосомную ДНК. В настоящем изобретении термин «белок» включает гликопротеины. Ген, кодирующий целевой белок, не ограничивается генами, полученными из плесневых грибков коджи. Можно также использовать гены, полученные из организмов других видов, поскольку гены пригодны для получения рекомбинантных белков при помощи плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина.
Дополнительно к промотору и гену, кодирующему целевой белок, продукт лигирования, имеющий терминатор, селективный маркер и подобные, лигированные в нем, может быть необязательно введен в рекомбинантные плесневые грибки коджи по настоящему изобретению. Терминатором может быть продукт, который функционирует в плесневых грибках коджи в качестве организма-хозяина, и предпочтительно использование терминатора фермента, который образуется с высоким выходом вне клеток плесневых грибков коджи.
По настоящему изобретению трансформацию плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина можно проводить стандартным способом, таким как способ введения плазмидного вектора в протопласт организма-хозяина в присутствии PEG (Unkles, et al., Mol. Gen. Genet., 218, 99-104 (1989)).
В качестве вектора можно использовать любую плазмиду, при условии, что она подходит для организма-хозяина плесневых грибков коджи. Например, плазмиду можно создать с использованием pPTRIДНК, pPTRIIДНК (TAKARA BIO INC.) и подобных, в зависимости от задач. Впрочем, выбор плазмиды этим не ограничивается.
Для того чтобы ввести ген, кодирующий отмеченный выше целевой белок в упомянутый выше вектор, можно применять общеизвестный способ. Один из способов включает расщепление выделенного гена, кодирующего целевой белок, соответствующим ферментом рестрикции, встраивание вырезанного гена в участок узнавания ферментом рестрикции или участок для множественного клонирования соответствующей векторной ДНК для лигирования тем самым вырезанного гена в вектор.
Плесневые грибки коджи, трансформированные, как описано выше, культивируют с использованием соответствующей селективной среды. После этого образующуюся колонию выделяют для получения рекомбинантных плесневых грибков коджи, в которые встроен ген, кодирующий целевой белок.
Полученные таким образом рекомбинантные плесневые грибки коджи можно использовать для культивирования одного штамма или для культивирования смеси двух или более гомологичных или гетерологичных штаммов. Это позволяет использовать любую форму спор или мицелия, полученную в предварительном выращивании. Тем не менее предпочтительно применяют мицелий, поскольку требуется более короткий промежуток времени для логарифмической фазы роста. Количество рекомбинантных плесневых грибков коджи для засева в жидкую среду не является особенно ограниченным, но число спор может быть в диапазоне приблизительно от 1×104 до 1×106 в мл жидкой среды. В случае мицелия предпочтительно засевают приблизительно от 0,1 до 10% предварительно выращенной жидкой культуры.
Температура культивирования рекомбинантных плесневых грибков коджи может быть предпочтительно установлена от 25 до 45°C, или более предпочтительно, от 30 до 40°C, но не особенно ограниченна, поскольку не действует подавляюще на рост. Если температура культивирования ниже, существует тенденция загрязнения инфекционными микроорганизмами, поскольку рост рекомбинантных плесневых грибков коджи замедляется.
Если в качестве организма-хозяина используют желтые плесневые грибки коджи, ферментативная активность усиливается посредством контролирования температуры культивирования в соответствии с фазой роста желтых плесневых грибков коджи. Чтобы быть конкретным, культуральную температуру можно поддерживать от 25 до 35°C, предпочтительно, от 28 до 33°C во время фазы пролиферации клеток, которая начинается от запуска культивирования и заканчивается после 12 до 36 часов от момента запуска, и во время последующей фазы продукции фермента от 35 до 45°C, предпочтительно, от 37 до 42°C.
Оборудование для культивирования может быть любым из предназначенных для работы с жидкой культурой. Плесневые грибки коджи нужно культивировать аэробно, поэтому культивирование следует проводить в аэробных условиях, при которых кислород или воздух подаются в среду. Кроме того, предпочтительно перемешивание среды во время культивирования для того, чтобы сырьевое вещество, кислород и рекомбинантные плесневые грибки коджи равномерно распределялись в установке при культивировании. Условия перемешивания и степень аэрации могут быть произвольными, поскольку культуральные условия поддерживаются аэробными, и могут быть соответственно выбраны в зависимости от оборудования для культивирования, вязкости среды и подобных.
Рекомбинантные плесневые грибки коджи выращивают при помощи указанного выше способа культивирования для получения в культуральном продукте целевого рекомбинантного белка с высоким выходом.
Согласно настоящему изобретению рекомбинантный белок затем собирают из образованного культурального продукта плесневых грибков коджи. Можно использовать любую общеизвестную методику в качестве способа для сбора рекомбинантного белка. Например, можно выбрать способ, по которому культуральный продукт фильтруют, центрифугируют или подобные для получения культурального супернатанта, и что культуральный супернатант необязательно концентрируют, очищают или подобные при помощи адсорбционных смол, электрофореза или подобных.
Примеры
В дальнейшем настоящее изобретение будет описано более подробно при помощи примеров и подобных. Однако настоящее изобретение этим не ограничено.
Пример 1 (Способ получения рекомбинантного белка путем использования желтых плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина)
(Приготовление среды)
Состав жидкой среды для желтых плесневых грибков коджи представлял собой следующее: 2,0% 98%-полированного ячменя (Starling, произведен в Австралии), 1,2% нитрата натрия, 0,8% хлорида калия, 0,4% фосфорнокислого калия, 0,2% сульфатированного гептагидрата магния и 0,08% сульфатированного гептагидрата железа (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем).
В качестве контроля была использована среда DPY (содержащая 2% декстрина, 1% полипептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% фосфорнокислого калия и 0,05% сульфата магния (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем)).
В 100-мл конические колбы для перемешивания помещали по 20 мл среды, соответственно, и стерилизовали путем автоклавирования при 121°C в течение 15 минут.
(Рекомбинантный плесневой грибок коджи)
В качестве рекомбинантных плесневых грибков коджи был использован niaD 300-Der fI, который был депонирован с номером доступа FERM BP-10667 в International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science и Technology, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (Старое название и адрес: Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science и Technology, Ministry of International Trade и Industry, 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 30 июля 1997 и который был перенесен в международный депозитарий из первоначального депозитария 28 августа 2006. Рекомбинантный плесневой грибок коджи niaD 300-Der fI был получен способом, описанным в JP-A-11-75840, с использованием в качестве организма-хозяина мутантного по усвоению нитратов штамма niaD 300 Aspergillus oryzae, путем введения в него Der fI E(-1)K, то есть фрагмента ДНК, полученного заменой кодона глутаминовой кислоты на 3'-конце на кодон лизина в кДНК последовательности-предшественнике гликопротеина Der fI, который представляет основной аллерген, присутствующий в Dermatophagoides farinae (см. H. Shoji, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61(10), 1668-1673, 1997).
В ДНК niaD 300-Der fI промотор glaA, полученный из Aspergillus oryzae, лигирован в положение апстрим в ДНК Der fI E(-1)K и терминатор amyB, полученный из Aspergillus oryzae, лигирован в положении даунстрим в ДНК Der fI E(-1)K.
(Культивирование рекомбинантных плесневых грибков коджи)
Приблизительно 106 конидий полученного рекомбинантного плесневого грибка коджи niaD 300-Der fI инокулировали в 20 мл среды, приготовленной как описано выше, соответственно, и наращивали с покачиванием при 30°C и 100 об/мин в течение 24 часов.
(Очистка рекомбинантного белка Der fI E(-1)K)
После завершения культивирования в жидкой среде каждую из культуральных жидкостей центрифугировали при 3000×g и 4°C в течение 10 минут. Эндоглюкозидазу Hf (Biolabs Company) добавляли непосредственно в концентрации 10 единиц/мл к культуральному супернатанту и оставляли для реакции при 37°C в течение 3 часов для осуществления отщепления сахаридных цепей. Образовавшуюся после реакции жидкость пропускали через колонку с сильным анионобменником (Торговое название: QMA, Waters Corporation), уравновешенную раствором 20 мM фосфатного буфера (pH 6,0), для адсорбции α-амилазы, большое количество которой присутствовало в реакционной жидкости. Для расщепления последовательности-предшественника Der fI E(-1)K лизил-специфическую эндопептидазу (Wako Pure Chemical Industries Inc.) добавляли к фракции, которую пропускали без адсорбирования на колонке QMA, с тем, чтобы конечная концентрация составила 10 мкг/мл. После этого продукт реакции диализовали против 50 мM Tris-HCl (pH 9,0) в течение ночи при 4°C.
Полученным таким образом концентратом нагрузили колонку DEAE-Sephacel (Amersham Bio-Sciences K.K.), уравновешенную 50 мM Tris-HCl (pH 8,0), и промыли 20 мM Tris-HCl (pH 8,0) в количестве, в 3 раза превышающем объем колонки. Затем зрелый рекомбинантный белок Der fI E(-1)K, который был адсорбирован на колонке, был элюирован при помощи градиента концентрации NaCl. Фракцию, содержащую зрелый рекомбинантный белок Der fI E(-1)K, выявили при помощи Western-анализа с использованием антител против Der fI для сбора обладающих наибольшей чистотой фракций и использовали в качестве очищенного образца. Электрофорезом в натрийдодецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) было подтверждено, что чистота очищенных образцов составляет 90% или более.
Очищенный образец подвергали количественному анализу на содержание белка при помощи BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce Biotechnology, Inc.).
(Результаты) Выход рекомбинантного белка Der fI E(-1)K
При использовании среды DPY было получено приблизительно 8 мг зрелого рекомбинантного белка Der fI E(-1)K на литр среды. При использовании жидкой среды для желтых плесневых грибков коджи было получено приблизительно 24 мг зрелого рекомбинантного белка Der fI E(-1)K на литр среды.
При этом способе обнаружено, что по настоящему изобретению рекомбинантный белок образовывался в количестве, в три раза превышающем количество, которое образуется при помощи способа с использованием традиционной среды DPY.
Рекомбинантный белок Der fI E(-1)K обладает сахаридной цепью, отличающейся от сахаридной цепи натурального Der fI. Тем не менее рекомбинантный белок Der fI E(-1)K проявлял способность связываться с IgE и способностью раздражать кожу, которые были эквивалентны таковым натурального Der fI. Таким образом, рекомбинантный белок используют в качестве альтернативы натуральному Der fI для приготовления антител, лечения аллергии и подобного.
Экспериментальный Пример 1 (Определение промоторных активностей генов различных ферментнов в белых плесневых грибках коджи для шочу)
Для того чтобы подтвердить, что промоторы генов различных ферментнов у белых плесневых грибков коджи неприменимы для настоящего изобретения, уровни экспрессии этих промоторов определяли следующим способом.
<Используемый штамм> Aspergillus kawachii NBRC4308
<Условия культивирования> Состав среды был следующим: 2,0% 98%-полированного ячменя (Starling, произведен в Австралии), 0,2% нитрата натрия и 0,3% фосфорнокислого калия (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем). 100 мл среды помещали в 500-мл коническую колбу для перемешивания и стерилизовали автоклавированием при 121°C в течение 15 минут. Приблизительно 106 конидий Aspergillus kawachii NBRC4308 инокулировали в 100 мл среды, полученной как описано выше, и культивировали с покачиванием при 37°C и 100 об/мин в течение 18 часов.
В качестве контроля для сравнения культивирование проводили со средой того же состава и при условиях культивирования, описанных выше, за исключением того, что вместо 98%-полированного ячменя в среде использовали 65%-полированный ячмень или продукт измельченного 98%-полированного ячменя (каждый из которых от Stirling, произведены в Австралии).
<Получение общей РНК> После завершения культивирования клетки быстро собирали и тщательно разрушали в присутствии жидкого азота. Из разрушенных клеток плесневого грибка коджи при помощи набора для выделения общей РНК (т.е., RNeasy Plant mini kit, производства QIAGEN) по прилагаемому протоколу была выделена общая РНК.
<Выделение кДНК> Из полученной общей РНК при помощи High-capacity cDNA Archive Kit (производства Applied Biosystems) по прилагаемому протоколу была синтезирована кДНК.
<Количественная ПЦР в реальном времени> Количественная ПЦР в реальном времени осуществлялась путем использования полученной кДНК в качестве матрицы и путем использования праймеров, сконструированных исходя из основных последовательностей генов целевых ферментов, как описано ниже, для определения тем самым уровней экспрессии генов ферментов. Каждый праймер, использованный для количественной ПЦР в реальном времени, был сконструирован при помощи Primer Express software (производства Applied Biosystems). Последовательности праймеров представлены конкретно, как приведено ниже. Ген H2A, кодирующий гистон, был использован в качестве внутреннего стандарта для количественного способа сравнения.
ПЦР и обнаружение сигнала проводили при помощи SYBR Green PCR Master Mix (производства Applied Biosystems) в качестве реагента для количественной ПЦР в реальном времени по прилагаемому протоколу. ПЦР и обнаружение сигнала проводили путем использования ABI PRISM 7700 (производства Applied Biosystems).
<Последовательности генов и праймеров, которые были использованы>
(1) Ген глюкоамилазы gla-1 (полученный из Aspergillus kawachii, GenBank, No. D00427)
Прямой праймер: 1589-ccagctcgacctatagcagcat (SEQ ID NO: 1 в Списке последовательностей)
Обратный праймер: 1761-aagtctgatggcgacgagct (SEQ ID NO: 2)
Пары праймеров были сконструированы таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 1589-й до 1780-й пары нуклеотидов указанного выше gla-1 (GenBank, No. D00427).
(2) Ген кислотоустойчивой α-амилазы asaA (полученный из Aspergillus kawachii, GenBank, No. AB008370)
Прямой праймер: 994-cggcacggcagatgatc (SEQ ID NO: 3)
Обратный праймер: 1044-gaatgtacctcatggtcgacgtc (SEQ ID NO: 4)
Пары праймеров были сконструированы таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 994-й до 1066-й пары нуклеотидов указанного выше asaA (GenBank, No. AB008370).
(3) Ген α-амилазы amyA (полученный из Aspergillus kawachii, GenBank, No. AB109452)
Прямой праймер: 1874-acactcctgggcacattcg (SEQ ID NO: 5)
Обратный праймер: 1989-ttacaccaacgacatagccct (SEQ ID NO: 6)
Пары праймеров были сконструированы таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 1874-й до 2009-й пары нуклеотидов указанного выше amyA (GenBank, No. AB109452).
(4) Ген гистона H2A (полученный из Aspergillus niger, GenBank, No. Y15320)
Прямой праймер: 289-actgaacaagctcctgggtca (SEQ ID NO: 7)
Обратный праймер: 322-ccagggtggtgtcctcccc (SEQ ID NO: 8)
Пары праймеров были сконструированы таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 289-й до 340-й пары нуклеотидов указанного выше H2A (GenBank, No. Y15320).
<Результаты> Уровни экспрессии генов соответствующих ферментов количественно определяли относительно уровня экспрессии гистона H2A. Результаты приведены в таблице 1. В экспериментальных графиках (настоящее изобретение) при использовании 98%-полированного ячменя уровни экспрессии соответствующих генов возросли по сравнению с уровнями экспрессии в контрольных графиках. Таким образом, было обнаружено, что промоторы генов этих ферментов были эффективно использованы в способе получения рекомбинантного белка по настоящему изобретению.
| Таблица 1 | ||
| Использованное сырьевое вещество | Уровень экспрессии | |
| gla-1 | Настоящее изобретение (98%-полированный ячмень) | 8,49 |
| Контроль 1 (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 3,95 | |
| Контроль 2 (65%-полированный ячмень) | 2,35 | |
| asaA | Настоящее изобретение (98%-полированный ячмень) | 2,89 |
| Контроль 1 (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 1,99 | |
| Контроль 2 (65%-полированный ячмень) | 1,05 | |
| amyA | Настоящее изобретение (98%-полированный ячмень) | 23,86 |
| Контроль 1 (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 17,65 | |
| Контроль 2 (65%-полированный ячмень) | 14,59 |
Экспериментальный Пример 2 (Определение промоторной активности генов ферментов у черных плесневых грибков коджи для шочу)
Для подтверждения того, что промоторы генов различных ферментов у черных плесневых грибков коджи пригодны для настоящего изобретения, уровни экспрессии этих промоторов были определены следующим способом.
В частности, Aspergillus awamori NBRC4388 выращивали тем же способом, что и в Экспериментальном Примере 1. После этого общую РНК экстрагировали из клеток, полученных после завершения выращивания тем же способом, что и в Экспериментальном Примере 1, и синтезировали кДНК. Затем уровни экспрессии генов целевых ферментов, как описано ниже, были количественно оценены при помощи полученной кДНК в качестве матрицы тем же способом, что и в Экспериментальном Примере 1. Последовательности праймеров, использованных для количественной ПЦР в реальном времени, представляли собой, как описано ниже.
<Последовательности генов и праймеров, которые были использованы>
(1) Ген α-амилазы amyA (тот же amyA, что и описанный в Экспериментальном Примере 1)
Были использованы те же пары праймеров (SEQ ID NO: 5 и 6), что и в Экспериментальном Примере 1.
(2) Ген кислой протеаза pepA (полученный из Aspergillus awamori, GenBank, No. M34454)
Прямой праймер: 793-ttttgggactggcctttagct (SEQ ID NO: 9 в Списке последовательностей)
Обратный праймер: 900-ttcttcgacaccgtcaagtcc (SEQ ID NO: 10)
Пара праймеров была сконструирована таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 793-й до 920-й пары оснований указанного выше pepA (GenBank, No. M34454).
(3) Ген гистона H2A (тот же H2A, что и описанный в Экспериментальном Примере 1)
Были использованы те же пары праймеров (SEQ ID NO: 7 и 8), что и в Экспериментальном Примере 1.
<Результаты> Уровни экспрессии генов соответствующих ферментов количественно оценивали как значения относительно уровня экспрессии гистона H2A. Результаты приведены в Таблице 2. В Экспериментальных графиках (настоящее изобретение) при использовании 98%-полированного ячменя уровни экспрессии соответствующих генов увеличились по сравнению с уровнями экспрессии в контрольных графиках. Таким образом, было обнаружено, что промоторы генов этих ферментов были эффективно использованы в способе получения рекомбинантного белка по настоящему изобретению.
| Таблица 2 | ||
| Используемое сырьевое вещество | Уровень экспрессии | |
| amyA | Настоящее изобретение (98%-полированный ячмень) | 19,1 |
| Контроль 1 (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 0,1 | |
| Контроль 2 (65%-полированный ячмень) | 0,3 | |
| pepA | Настоящее изобретение (98%-полированный ячмень) | 2,4 |
| Контроль 1 (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 0,7 | |
| Контроль 2 (65%-полированный ячмень) | 1,5 |
Экспериментальный Пример 3 (Определение промоторной активности генов ферментов в желтых плесневых грибках коджи для сакэ)
Для подтверждения того, что промоторы генов различных ферментов в желтых плесневых грибках коджи применимы для настоящего изобретения, уровни экспрессии этих промоторов были определены следующим способом.
<Используемый штамм> Aspergillus oryzae NRIB40
<Условия культивирования> Состав среды был следующий: 2,0% 98%-полированного ячменя (Starling, произведен в Австралии), 1,2% нитрата натрия, 0,8% хлорида калия, 0,4% фосфорнокислого калия, 0,2% сульфатированного гептагидрата магния и 0,08% сульфатированного гептагидрата железа (каждое значение представляет собой соотношение масса/объем). 100 мл среды помещали в 500-мл коническую колбу для перемешивания и стерилизовали автоклавированием при 121°C в течение 15 минут. Приблизительно 106 конидий Aspergillus oryzae RIB40 инокулировали в 100 мл среды, полученной как описано выше, и культивировали при покачивании при 30°C и 100 об/мин в течение 42 часов.
В качестве контроля для сравнения была приготовлена культура с тем же составом среды и условиями культивирования, что и описанные выше, за исключением того, что вместо 98%-полированного ячменя использовали 65%-полированный ячмень или продукт измельчения 98%-полированного ячменя (каждый из которых были от Stirling, произведены в Австралии).
После этого из клеток, полученных после завершения культивирования тем же способом, что и в Экспериментальном Примере 1, выделили общую РНК и синтезировали кДНК. Затем количественно определили уровни экспрессии генов целевых ферментов, описанных ниже, при помощи полученной кДНК в качестве матрицы тем же способом, что и в Экспериментальном Примере 1. Последовательности праймеров, использованных для количественной ПЦР в реальном времени, представляли собой, как описано ниже. Ген, кодирующий гистон H4, использовали в качестве внутреннего стандарта для способа количественного сравнения.
<Последовательности генов и праймеров, которые были использованы>
(1) Ген глюкоамилазы glaA (выделен из Aspergillus oryzae, GenBank, No. D01035)
Прямой праймер: 1247-cgtgcagatcgtccaaacct (SEQ ID NO: 11 в Списке последовательностей)
Обратный праймер: 1357-acttctcacggccaacaacc (SEQ ID NO: 12)
Пара праймеров была сконструирована таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 1247-й до 1376-й пары оснований указанного выше glaA (GenBank, No. D01035).
(2) Ген α-амилазы amyA (выделен из Aspergillus oryzae, GenBank, No. AB021876)
Прямой праймер: 21762-cactcctgggcacattcgt (SEQ ID NO: 13)
Обратный праймер: 21875-gttacaccaacgacatagccctc (SEQ ID NO: 14)
Пары праймеров были сконструированы таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 21762-й до 21897-й пары нуклеотидов указанного выше amyA (GenBank, No. AB021876).
(3) Ген β-глюканазы celB (выделен из Aspergillus oryzae, GenBank, No. D83732)
Прямой праймер: 1137-caaactgggaatgccacaaa (SEQ ID NO: 15)
Обратный праймер: 1187-tgaagacggagagaactattccatg (SEQ ID NO: 16)
Пары праймеров были сконструированы таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 1137-й до 1211-й пары нуклеотидов указанного выше celB (GenBank, No. D83732).
(4) Ген кислой протеазы pepA (выделен из Aspergillus oryzae, GenBank, No. D13894)
Прямой праймер: 897-cgctagcaagattagcgatcagt (SEQ ID NO: 17)
Обратный праймер: 958-gctttcagctcgatcaacactg (SEQ ID NO: 18)
Пары праймеров были сконструированы таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 897-й до 979-й пары нуклеотидов указанного выше pepA (GenBank, No. D13894).
(5) Ген гистона H4 (выделен из Aspergillus oryzae, GenBank, No. AB033943)
Прямой праймер: 110-cgtgacaacatccagggtatca (SEQ ID NO: 19)
Обратный праймер: 171-tcaagcgtatctctgccatga (SEQ ID NO: 20)
Пары праймеров были сконструированы таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК от 110-й до 191-й пары нуклеотидов указанного выше H4 (GenBank, No. AB033943).
<Результаты> Уровни экспрессии генов соответствующих ферментов количественно оценивали как значения относительно уровня экспрессии гистона H4. Результаты приведены в таблице 3. В Экспериментальных графиках (настоящее изобретение) при использовании продукта измельчения 98%-полированного ячменя уровни экспрессии соответствующих генов увеличились по сравнению с уровнями экспрессии в контрольных графиках. Таким образом, было обнаружено, что промоторы генов этих ферментов были эффективно использованы в способе получения рекомбинантного белка по настоящему изобретению.
| Таблица 3 | ||
| Используемое сырьевое вещество | Уровень экспрессии | |
| glaA | Настоящее изобретение (98%-полированный ячмень) | 0,31 |
| Контроль 1 (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 0,04 | |
| Контроль 2 (65%-полированный ячмень) | 0,10 | |
| amyA | Настоящее изобретение (98%-полированный ячмень) | 21,0 |
| Контроль 1 (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 3,3 | |
| Контроль 2 (65%-полированный ячмень) | 9,3 | |
| celB | Настоящее изобретение (98%-полированный ячмень) | 0,018 |
| Контроль 1 (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 0,003 | |
| Контроль 2 (65%-полированный ячмень) | 0,006 | |
| pepA | Настоящее изобретение (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 0,15 |
| Контроль 1 (продукт измельчения 98%-полированного ячменя) | 0,07 | |
| Контроль 2 (65%-полированный ячмень) | 0,05 |
Промышленная применимость
В настоящем изобретении предоставлен способ массового производства рекомбинантного белка путем использования плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина. Плесневые грибки коджи культивируют в недорогостоящей среде, специальное оборудование для культивирования не требуется, поэтому необходимый белок получается с низкой стоимостью. Кроме того, плесневые грибки коджи применяли для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков с давних времен, и они в значительной степени являются безопасным организмом-хозяином, а образуемые рекомбинантные белки можно использовать для различных целей.
1. Способ получения рекомбинантного белка с использованием рекомбинантных плесневых грибков коджи, которые получены трансформацией плесневых грибков коджи в качестве организма-хозяина, включающий:
культивирование рекомбинантных плесневых грибков коджи в жидкой среде, которая содержит в качестве сырьевого вещества для культивирования, по меньшей мере, одно, выбранное из группы, состоящей из ячменя и пшеницы, поверхность которых полностью или частично покрыта, по меньшей мере, оболочкой, в концентрации от 1 до 20%(мас./об.) и в качестве питательных веществ, по меньшей мере, одну неорганическую соль; и
сбор рекомбинантного белка из культурального продукта, где
рекомбинантные плесневые грибки коджи получают тем, что ген, кодирующий целевой белок, лигируют ниже промотора гена, кодирующего фермент, подвергающийся катаболитной репрессии вследствие концентрирования питательных веществ, таких как сахариды и аминокислоты, для получения тем самым продукта лигирования, и продукт лигирования вводят в плесневые грибки коджи в качестве организма-хозяина.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что промотор является промотором гена, кодирующего любой фермент, выбранный из группы, состоящей из амилолитических ферментов, целлюлозолитических ферментов и протеолитических ферментов.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что используют неорганическую соль, выбранную из группы, состоящей из нитратов, фосфатов и сульфатов.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что используют неорганическую соль, содержащую комбинацию нитрата, фосфата и сульфата.
