Способ получения полифенольного средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида и обладающего цитотоксической активностью
Владельцы патента RU 2425690:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГОУВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России) (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности, к способу получения полифенольного средства, снижающего токсичность циклофосфамида. Способ получения полифенольного средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида, в котором измельченные листья и верхушки цветоносов с бутонами и цветками манжетки обыкновенной экстрагируют 40% спиртом этиловым при определенных условиях, упаривают и остаток лиофильно высушивают. Средство, полученное вышеописанным способом, эффективно снижает токсичность циклофосфамида и обладает цитотоксической активностью. 2 табл.
За последние годы значительно вырос уровень смертности населения от онкологических заболеваний, уступающий лишь летальности от заболеваний, связанных с сердечно-сосудистой патологией. С каждым годом арсенал средств терапии злокачественных опухолей стремительно пополняется. Новые препараты характеризуются высокой эффективностью и лучшей переносимостью относительно препаратов, разработанных ранее, которые в свою очередь не потеряли актуальности и продолжают широко использоваться для терапии опухолевых процессов. Данные препараты даже в современных условиях не находят адекватной замены и характеризуются высокой эффективностью, но в то же время высокой токсичностью, обуславливающей плохую переносимость для пациента. К таким средствам относится алкилирующий цитостатический препарат - циклофосфамид - производное бис-(β-хлорэтил)-амина, характеризующийся высокой токсичностью даже в дозах, близких к лечебным, что вызывает значительные трудности при его применении.
В то же время с каждым годом растет интерес к препаратам, полученным из растительного сырья. Это обусловлено комплексным действием биологически активных веществ, содержащихся в них, высокой безопасностью, низкой токсичностью и аллергенностью. При этом особое внимание заслуживают лекарственные растения, традиционно применяемые в народной медицине. К таким растениям относится манжетка обыкновенная - Alchemilla vulgaris L.
Трава манжетки с успехом используется как официнальное сырье в Западно-европейских странах и входит в фармакопеи Великобритании, Франции, Германии, Югославии (используется в виде порошка из сухой травы для внутреннего применения). Для нее установлен широкий спектр фармакологического действия: противовоспалительное, кровоостанавливающее, лимфотропное, гипотензивное, гипогликемическое и др. [Hager H. Pharmacopoe ia Anglica, Gall ica, Germanae, Hevetica, Russae inter se collatae. Vratistaiae. Impesis Emesti Gunteri. - MDCCCLXIX. - S.10].
Это обусловлено богатством химического состава, обнаружены:
флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и их эфиры, танины, аминокислоты, а также эссенциальные макро- и микроэлементы, такие как кальций, калий, магний, фосфор, хром, медь, кобальт и др.
Общеизвестен радикалсвязывающий механизм действия полифенолов на супероксидный анион-радикал, а также их ингибирующая активность по отношению к моноаминоксидазе, играющей роль в окислительном стрессе нервной системы, липогеназы, обуславливающей перекисное окисление линолевой кислоты, т.е. антиоксидантная активность полифенолов. Следовательно, целевой продукт обладает не только P-витаминной активностью, адаптогенными, антиоксидантными свойствами, но и токсикомодулирующей и цитотоксической активностью.
Задачей изобретения является способ получения средства, снижающего токсичность циклофосфамида и обладающего цитотоксической активностью.
Поставленная задача решается способом получения полифенольного средства из травы манжетки, характеризующегося тем, что измельченные до 2 мм листья и верхушки цветоносов с бутонами и цветками манжетки обыкновенной экстрагируют 40% спиртом этиловым в соотношении 1:8-12 при нагревании до 35-45°С в течение 55-65 мин, операцию повторяют 2-3 раза, спирт этиловый отгоняют, 2/3 объема водного экстракта упаривают, остаток лиофильно высушивают. Выход целевого продукта 7-8%.
Таблица 1 показывает, что 40% спирт этиловый является оптимальным экстрагентом для решения поставленной задачи.
| Таблица 1 | |
| Влияние условий экстракции на содержание полифенольных соединений в надземной части манжетки обыкновенной | |
| Условия экстракции | Содержание суммы полифенольных соединений, % |
| Экстрагент: | |
| Вода очищенная | 1,79±0,04 |
| Спирт этиловый 40% | 3,85±0,03 |
| Спирт этиловый 70% | 3,75±0,01 |
| Спирт этиловый 95% | 0,69±0,01 |
| Ацетон 25% | 1,08±0,04 |
| Соотношение сырье-экстрагент: | |
| 1:5 | 1,46±0,02 |
| 1:10 | 3,97±0,02 |
| 1:50 | 2,87±0,06 |
| 1:100 | 2,54±0,05 |
| Время экстракции, мин: | |
| 30 | 1,76±0,02 |
| 45 | 2,47±0,05 |
| 60 | 3,87±0,06 |
| 90 | 3,84±0,06 |
Фиг.1 показывает хроматограмму, на которой отражена многокомпонентность полифенольного комплекса травы манжетки, состоящего из галловой кислоты (1), хлорогеновой кислоты (2), кофейной кислоты (3), рутина (4), коричной кислоты (5), кемпферола (6), кверцетина (7) и агримониина (8).
Попытка получить полифенольный препарат из надземной части манжетки обыкновенной по известной методике (А.С. №2128516, МКИ A61K 35/78) не дала ожидаемого выхода полифенольного средства, которое не обладало цитотоксической активностью и способностью снижать токсичность циклофосфамида. Эту способность проявило лишь средство, полученное по предлагаемому способу.
Пример 1. Получение полифенольного средства из травы манжетки
100 г измельченных до 2 мм листьев и верхушек цветоносов с бутонами и цветками манжетки обыкновенной экстрагируют 40% спиртом этиловым в соотношении 1:8 при нагревании до 35°С в течение 55 мин, операцию повторяют 2 раза до полноты извлечения, спирт этиловый отгоняют, 2/3 объема водного экстракта упаривают, остаток лиофильно высушивают.
Выход целевого продукта 7%.
Пример 2. Получение полифенольного средства из травы манжетки
100 г измельченных до 2 мм листьев и верхушек цветоносов с бутонами и цветками манжетки обыкновенной экстрагируют 40% спиртом этиловым в соотношении 1:12 при нагревании до 45°С в течение 65 мин, операцию повторяют 3 раза до полноты извлечения, спирт этиловый отгоняют, 2/3 объема водного экстракта упаривают, остаток лиофильно высушивают.
Выход целевого продукта 8%.
Пример 3. Влияние на токсичность циклофосфамида.
Исследование проводили на мышах-самцах линии BDF1 массой 19-23 г. В качестве модели использовали карциному легкого Льюис (LLC). Опухоль солидная, неиммуногенная, метастазирует в легкие. Прививается подкожно взвесью опухолевых клеток по 60 мг в 0,5 мл питательной среды на мышь.
Животных разделили на 2 группы по 10 особей: 1-й группе вводили однократно циклофосфамид в дозе 450 мг/кг внутрибрюшинно, 2-й группе - однократно циклофосфамид в дозе 450 мг/кг внутрибрюшинно и 10-кратно водный раствор суммы полифенолов перорально по 0,3 мл/мышь (10 мг/кг) с интервалом 24 часа.
За критерии оценки общетоксического действия взяли среднюю продолжительность жизни (СПЖ). За животными наблюдали, оценивая их среднюю продолжительность жизни (СПЖ). В ходе проведения эксперимента в 1-й группе животных, получавших только циклофосфамид, на 11-й день эксперимента пали 83% мышей, во 2-й группе, при сочетанном применении циклофосфамида с водным раствором суммы полифенолов - 0%. Установили, что от токсичности мыши в 1-й группе пали в среднем на 5-й день, а во 2-й группе на 11-й день эксперимента все мыши живы. Животные 2-й группы пали от опухоли на 50-й день. Гибель от токсичности не зафиксирована.
Данные таблицы 2 свидетельствуют о высокой способности суммы полифенолов из травы манжетки снижать общетоксическое действие циклофосфамида.
| Таблица 2 | ||
| Влияние суммы полифенолов из травы манжетки на среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей с карциномой легкого Льюис (LLC) | ||
| Группа мышей № п/п | Схема лечения | СПЖ, дни |
| 1 | 450 мг/кг Х 1 циклофосфамид внутрибрюшинно | 5,1±0,3 |
| 2 | 450 мг/кг Х 1 циклофосфамид внутрибрюшинно + 0,3 мл/мышь (10 мг/кг) Х 10 водный раствор суммы полифенолов per os | 50,2±0,6 |
Пример 4. Цитотоксическая активность средства.
Изучили цитотоксическую активность суммы полифенолов, выделенных из травы манжетки in vitro в МТТ-тесте. В качестве модели использовали клетки экспериментальной меланомы В-16 (линия F-10).
Выживаемость клеток, подвергшихся воздействию изучаемых соединений, оценивали в процентах, принимая за 100% выживаемость контрольной группы:
К=(В/А)×100%,
А - выживаемость клеток контрольной группы,
В - выживаемость клеток в присутствии тестируемых соединений.
Кривая, отображающая выживаемость (в %) опухолевых клеток меланомы В-16 при добавлении в культуральную среду полифенольного средства в концентрации от 1×10-4 до 1×10-10 моль, свидетельствует о значительной цитотоксической активности препарата (фиг.2).
Индекс IC50 (показатель концентрации, при которой выживаемость опухолевых клеток ингибируется на 50%) находился на уровне 5×10-6 моль.
1. Характеристика средства. Предлагаемое средство представляет собой природную смесь высокоактивных полифенолов (агримониина, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот), выделенных из травы манжетки - herba Alchemillae, производящими растениями являются виды рода манжетка - Alchemilla sp.семейства розоцветных - Rosaceae, в виде зеленоватого порошка горьковато-вяжущего вкуса, хорошо растворимого в воде и спирте.
2. Проверка на токсичность. Средство в дозе 10 г/кг не обнаруживало токсического действия.
3. Сумма полифенолов травы манжетки снижает общетоксическое действие циклофосфамида. Выживаемость и общее состояние животных в группе, получавшей сочетанное лечение водным раствором суммы полифенолов, выше, чем в группе, получавшей монотерапию циклофосфамидом, в 10 раз; препарат обладает значительной цитотоксической активностью in vitro (IC50=5×10-6 моль).
Полученные данные позволяют сделать вывод, что полифенольное средство из травы манжетки, полученное по предложенному способу, может быть использовано как средство, снижающее общетоксическое действие противоопухолевых препаратов в терапии злокачественных новообразований, и в качестве потенциального противоопухолевого средства.
Способ получения полифенольного средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида и обладающего цитотоксической активностью, характеризующийся тем, что измельченные до 2 мм листья и верхушки цветоносов с бутонами и цветками манжетки обыкновенной экстрагируют 40%-ным спиртом этиловым в соотношении 1:8-12 при нагревании до 35-45°С в течение 55-65 мин, операцию повторяют 2-3 раза, спирт этиловый отгоняют, 2/3 объема водного экстракта упаривают, остаток лиофильно высушивают.
