Способ производства сычужного фермента



Способ производства сычужного фермента
Способ производства сычужного фермента

 


Владельцы патента RU 2425878:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)

Изобретение относится к производству сычужного фермента из сычугов телят, ягнят и козлят-молочников и может быть использовано в молочной промышленности при производстве молокосвертывающих ферментных препаратов, а также в ветеринарии, микробиологической промышленности и медицине. Приготавливают солевой экстракт сычугов и проводят экстрагирование сычужного фермента раствором хлористого натрия при температуре 35-40°С в течение 3-3,5 ч, и медленном постоянном перемешивании без дополнительного доведения pH. Экстракт отделяют от сырья и проводят активацию сычужного фермента в экстракте при pH 4,6-4,7 путем выдержки его в течение 8-16 ч при температуре 25-35°С. Активированный экстракт обрабатывают перлитом и затем фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°С. Полученный фермент стабилизируют путем внесения в фильтрат сухого хлористого натрия до содержания его в готовом препарате 17-18%, доведения pH до 5,3-7,0 1 н раствором гидроокиси натрия и внесения бензоата натрия до содержания его в готовом препарате 0,1-0,5%. Изобретение обеспечивает оптимизацию технологических режимов процесса получения сычужного фермента для достижения максимальной его активности и чистоты, упрощение, удешевление и ускорение технологического процесса (за счет сокращения его длительности и энергоемкости). 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

 

Изобретение относится к производству сычужного фермента из сычугов телят, ягнят и козлят-молочников и может быть использовано в пищевой промышленности при производстве молокосвертывающих ферментных препаратов, а также в ветеринарии, микробиологической промышленности и медицине.

Известен способ получения сычужного фермента (патент РФ №2044772), предусматривающий измельчение сычугов, трехкратную экстракцию фермента раствором хлористого натрия, отделение жидкой фазы, фильтрование раствора, концентрирование фермента, фильтрование концентрата или сушку. В качестве экстрагента используют 5-12% раствор хлористого натрия с добавлением 0,1-3% консерванта - бензоата натрия, перемешивая раствор 10-30 мин каждого часа, а затем снижают pH раствора до 4,0-5,8, экстрагируют фермент в течение 12-24 часов при 4-20°C, при этом соотношение сырья и раствора составляет 1:(6-30), экстракцию повторяют трижды, причем третью экстракцию проводят при соотношении сырья и раствора 1:(3-15), после фильтрования концентрируют ультрафильтрацией, затем концентрат фильтруют и жидким расфасовывают или сушат. Ультрафильтрат повторно используют в качестве экстрагирующей жидкости при соответствующей коррекции pH и процентного содержания консерванта.

К недостаткам прототипа относится, в первую очередь, очень неэффективный диапазон экстракции при pH 4,0-5,8. Работа в диапазоне около pH 4,0 снижает экстрагируемость и приводит к необратимым потерям активного фермента, так как при таком уровне pH желудочные ферменты проявляют максимальную активность по расщеплению белка, в том числе и собственно сычужного фермента. Это «самопереваривание» повышается в присутствии обычной соли - хлористого натрия. Напротив, в области pH около 5,8 проэкстрагированный сычужный фермент остается в форме неактивного предшественника - прохимозина, то есть резко снижается качество получаемого фермента.

Во-вторых, низкие температуры (4-20°C) замедляют процесс экстракции и одновременно усложняют аппаратурное оформление и удорожают сам процесс.

В-третьих, ведение экстракции в присутствии бензоата натрия порождает проблему утилизации отработанного белка сычугов: такие белки нельзя использовать для кормовых целей или нужд микробиологической промышленности. Кроме того, процесс остается чрезвычайно длительным (три экстракции по 17-32 часа). За это время способна развиться нежелательная микрофлора, может разрушиться фермент, снижается производительность процесса производства.

В результате технология по прототипу приводит к образованию неконтролируемой по составу смеси неактивного прохимозина, активного и потерявшего активность сычужного фермента (при pH 4,0 потеря активности происходит с большой скоростью - до 50% за сутки). Конечный продукт содержит большое количество (несколько процентов) балластных веществ - нерастворимого остатка, а известно, что это приводит к появлению горечи и снижению качества молочных продуктов, в частности сыров, выработанных с таким препаратом. В этом самый большой порок отечественных молокосвертывающих препаратов.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является оптимизация технологических режимов процесса получения сычужного фермента для достижения максимальной его активности и чистоты, упрощение, удешевление и ускорение технологического процесса (за счет сокращения его длительности и энергоемкости).

Указанный технический результат достигается тем, что в способе производства сычужного фермента, включающем измельчение сычугов, экстракцию фермента раствором хлористого натрия, внесение консерванта бензоата натрия для предотвращения бактериального роста, отделение жидкой фазы, фильтрование, согласно изобретению экстракцию фермента проводят однократно 3,0-10,0%-ным раствором хлористого натрия при температуре 35-40°C в течение 3-3,5 часов без дополнительного доведения pH и медленном постоянном перемешивании, экстракт отделяют от сырья, осуществляют активацию сычужного фермента в экстракте путем установления pH 4,6-4,7 и выдержки его в течение 8-16 часов при температуре 25-35°C, активированный экстракт обрабатывают веществами, облегчающими и ускоряющими процесс фильтрования, фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°C, полученный фермент стабилизируют путем внесения в фильтрат сухого хлористого натрия до содержания его в готовом препарате 17-18%, и доведения pH готового препарата до 5,3-7,0 ед. pH 1 н раствором гидроокиси натрия, а консервант бензоат натрия вносят на стадии стабилизации до содержания его в готовом препарате 0,1-0,5%.

Для облегчения фильтрования предлагаемая технология предусматривает использование перлита фильтровального в количестве 1-2% от веса экстракта. Экспериментально установлено, что данный технологический прием в 2 раза ускоряет процесс фильтрования.

Для более полного извлечения фермента возможно повторное экстрагирование. Вторую экстракцию проводят раствором хлористого натрия в тех же условиях, при этом объем раствора хлористого натрия снижают втрое во избежание разбавления препарата.

Предлагаемое изобретение реализуется следующим образом.

Измельченные сычуги телят, ягнят и козлят-молочников экстрагируют 3-10% раствором хлористого натрия. Для экстракции используют 5-30 дм3 раствора на 1 кг измельченных сычугов. Продолжительность экстракции составляет 3-3,5 ч при температуре от 35°C до 40°C без дополнительного доведения pH. Повышенные по сравнению с прототипом температуры экстракции ускоряют диффузию экстрагируемого фермента из сырья, что ведет к существенному сокращению производственного процесса (с недели до двух дней). В процессе экстрагирования содержимое экстрактора постоянно медленно перемешивают.

После завершения экстракции экстракт (надосадочную жидкость) сливают через фильтрующий материал (лавсан или 3-4 слоя марли) в отдельную емкость.

С помощью раствора соляной кислоты устанавливают pH экстракта равным 4,6-4,7 ед. pH и оставляют на 8-16 часов при температуре 25-35°C для активации - перехода неактивного прохимозина в активный сычужный фермент. Дополнительного охлаждения экстракта не требуется. При более низких температурах активация замедляется. Процесс перехода в активный сычужный фермент - активация - представляет собой необратимое отщепление пептида от молекулы прохимозина и жестко связан с активной кислотностью среды. При показателях pH 4,6-4,7 процесс активации идет в оптимальных для образования истинного сычужного фермента условиях, становится управляемым и контролируемым. При переводе pH на уровень 5,3-7,0 готовый фермент попадает в зону максимальной устойчивости при хранении.

Фиг.1 наглядно иллюстрирует зависимость выхода активного фермента от pH во время экстракции: процесс по прототипу при pH 4,0 приводит к потере активности уже после 1 суток, тогда как процесс по предлагаемому изобретению (экстракция в течение 3,5 час с последующей активацией посредством выдержки при pH 4,7) дает прирост активности в 4 раза.

Отработанную массу сычугов по завершении экстрагирования направляют на промышленную переработку (например, для производства гидролизатов белка).

Замеряют объем активированного экстракта, для облегчения фильтрования вносят в него вещества, облегчающие и ускоряющие фильтрование, например перлит фильтровальный в количестве 1-2% от объема экстрактами вымешивают 1,5-2 часа. Затем фильтруют на фильтр-прессе с использованием в качестве фильтрующей перегородки фильтровальной бумаги и фильтровальной ткани под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°C. Низкие температуры замедляют фильтрование.

Замеряют объем фильтрата и для создания условий стабильности (стойкости в хранении) сычужного фермента вносят сухой хлористый натрий до содержания его в готовом препарате 17-18%, бензоат натрия для предотвращения бактериального роста до содержания его в готовом препарате 0,1-0,5%, тщательно перемешивают до растворения, не допуская образования пены. Доводят активную кислотность готового препарата до 5,3-7,0 ед. pH, осторожно, при перемешивании, добавляя 1 н раствор гидроокиси натрия, не допуская очагов защелачивания, губительных для фермента.

Определяют молокосвертывающую активность и ферментный состав готового препарата для квалификации его кондиционности по методикам ГОСТ Р 52688-2006.

Фасование сычужного фермента проводят на специальном оборудовании, используя герметично закрывающиеся банки, изготовленные из полимерных материалов. Хранение готового продукта осуществляется при температуре 4-8°C и относительной влажности воздуха не более 85,0%. При установленных экспериментально параметрах стабилизации сычужного фермента гарантированный срок хранения готового препарата составляет 6-8 месяцев (фиг.2).

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что отличительными признаками от прототипа являются следующие:

- однородный по составу препарат сычужного фермента, не содержащий неактивного прохимозина и потерявшего активность сычужного фермента;

- максимальный выход готового сычужного фермента: расход сычугов на эквивалентное 1 кг сухого фермента с активностью 100000 усл. ед. количество жидкого сычужного фермента составляет 7-12 штук против 16-30 в прототипе;

- полное отсутствие в препарате нерастворимого остатка (0%);

- упрощение и ускорение по меньшей мере в 3 раза технологического процесса посредством оптимизации его параметров и использования перлита фильтровального в качестве одного из технологических приемов;

- снижение энергоемкости и удешевление процесса, так как жидкая форма препарата позволяет избежать затрат энергии на сушку.

Пример 1

Измельченные сухие сычуги телят, ягнят и козлят-молочников в количестве 2 кг заливают раствором хлористого натрия 5%-ной концентрации в объеме 60 л и при температуре 35°C медленно перемешивают в течение 3,5 часов. Затем отцеживают экстракт через лавсан. Получают 53 л экстракта, pH экстракта равен 5,3. Путем внесения 1 н соляной кислоты pH снижают до 4,7 и оставляют экстракт на ночь в помещении с температурой 25°C. Расход кислоты для снижения pH равен 130 мл. Утром в экстракт вносят 530 г перлита фильтровального и вымешивают 2 часа. Фильтруют на фильтр-прессе с использованием в качестве фильтрующей перегородки лабораторной фильтровальной бумаги и фильтровальной ткани под давлением 0,02 МПа. Вносят 6 кг сухого хлористого натрия и 225 г бензоата натрия, тщательно перемешивают до растворения, не допуская образования пены. Для создания условий стабильности (стойкости в хранении) сычужного фермента (химозина) доводят активную кислотность среды до 6,0 ед. pH путем медленного, осторожного добавления 1 н раствора гидроокиси натрия при перемешивании, не допуская очагов защелачивания.

Молокосвертывающая активность препарата равна 12000 усл. ед. на мл раствора; содержание химозина в препарате 92% по молокосвертывающей активности; нерастворимый остаток отсутствует. Объем препарата - 49 литров.

Пример 2

Измельченные сухие сычуги телят, ягнят и козлят-молочников в количестве 2 кг заливают раствором хлористого натрия 10%-ной концентрации в объеме 30 л и при температуре 40°C медленно перемешивают в течение 3 часов. Затем отцеживают экстракт через лавсан. Получают 27 л экстракта, pH экстракта равен 5,2. Путем внесения 1 н соляной кислоты pH снижают до 4,7 и оставляют экстракт на ночь при температуре 35°C. Утром в экстракт вносят 540 г перлита фильтровального и вымешивают 2 часа. Фильтруют на фильтр-прессе с использованием в качестве фильтрующей перегородки лабораторной фильтровальной бумаги и фильтровальной ткани под давлением 0,02 МПа. Вносят 2,2 кг сухого хлористого натрия и 135 г бензоата натрия, тщательно перемешивают до растворения, не допуская образования пены. Для создания условий стабильности (стойкости в хранении) сычужного фермента (химозина) доводят активную кислотность среды до 5,9 ед. pH путем медленного, осторожного добавления 1 н раствора гидроокиси натрия при перемешивании, не допуская очагов защелачивания.

Молокосвертывающая активность препарата равна 20000 усл. ед. на мл раствора; содержание химозина в препарате 93% по молокосвертывающей активности; нерастворимый остаток отсутствует. Объем препарата - 25 л.

1. Способ производства сычужного фермента, включающий измельчение сычугов, экстракцию фермента раствором хлористого натрия, внесение консерванта бензоата натрия для предотвращения бактериального роста, отделение жидкой фазы, фильтрование, отличающийся тем, что экстракцию фермента проводят однократно 3,0-10,0%-ным раствором хлористого натрия при температуре 35-40°С в течение 3-3,5 ч и медленном постоянном перемешивании без дополнительного доведения pH, экстракт отделяют от сырья, осуществляют активацию сычужного фермента в экстракте путем установления pH 4,6-4,7 и выдержки его в течение 8-16 ч при температуре 25-35°С, активированный экстракт обрабатывают веществами, облегчающими и ускоряющими процесс фильтрования, фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°С, полученный фермент стабилизируют путем внесения в фильтрат сухого хлористого натрия до содержания его в готовом препарате 17-18% и доведения pH готового препарата до 5,3-7,0 ед. pH 1 н раствором гидроокиси натрия, а консервант бензоат натрия вносят на стадии стабилизации до содержания его в готовом препарате 0,1-0,5%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для облегчения фильтрования используют перлит фильтровальный в количестве 1-2% от веса экстракта.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных высокоактивных препаратов ингибиторов, которые могут быть использованы в биохимии, медицине, фармакологии, патофизиологии, для терапии тромбоэмболических заболеваний, а также для исследовательских целей.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выделению сериновых протеаз, содержащих GLA-остаток, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полипептидов фактора VII, и может быть использовано в медицине. .
Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерных продуктов. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой олигопептид, способный блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток, содержащий олигопептидную последовательность (приведена в заявке) или ее фрагмент, также представляет собой фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения дегенеративных заболеваний, или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР), диагностическую композицию для выявления дегенеративных заболеваний или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР).
Изобретение относится к области медицины и касается гликоформ фактора VII и к композициям, содержащим фактор VII, имеющим измененные конфигурации на основе аспарагинсвязанных олигосахаридных цепей.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых с альбумином полипептидов фактора VII (FVII) и фактора VIIa (FVIIa), и может быть использовано в медицине
Изобретение относится к способам производства ферментных препаратов, главным образом из сырья животного происхождения, и может быть использовано на предприятиях по переработке животного сырья, например для приготовления применяемых в сыроделии молокосвертывающих ферментных препаратов

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к лечению гемофилии. Конъюгаты фактора IX модифицированы для включения биосовместимого полимерного фрагмента. Конъюгаты фактора IX, по существу, свободны от загрязнения фактором IХа. Конъюгаты фактора IX имеют улучшенные фармакокинетические свойства, такие как увеличенное время полужизни. Группа изобретений позволяет снизить дозировку и частоту введения, а также снижает риск гемартроза, геморрагии, желудочно-кишечного кровотечения и меноррагии у млекопитающих с гемофилией В. 6 н. и 24 з.п. ф-лы, 4 ил., 9 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ экстрагирования говяжьего пепсина. Готовят кислотный экстракт слизистых оболочек сычугов КРС. Фермент экстрагируют одновременно с размораживанием замороженных блоков слизистых оболочек сычугов КРС однократно раствором соляной кислоты с pH 1,3-1,5 при медленном периодическом перемешивании. Экстракт отделяют от сырья и фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа. Преимуществом способа является упрощение и сокращение продолжительности технологического процесса и повышение качества получаемого фермента. 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба, заключающийся в том, что из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtchaticus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК ингибитора PC из суммарной РНК методом обратной транскрипции, которую амплифицируют методом полимеразной цепной реакции с праймерами, полученный ПЦР-продукт, содержащий ген ингибитора PC, кодирующий ингибитор PC c аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 2, клонируют в экспрессионный вектор, с последующей трансформацией в клетки E. coli, полученные при этом рекомбинантные штаммы E. coli культивируют в течение не более 20 час при 37°C, а полученную биомассу подвергают центрифугированию, отмывают от остатков среды, ресуспендируют в буфере лизиса и лизируют, выделяют тельца включения из полученной биомассы разрушением ультразвуком, лизат ресуспендируют в буфере промывки и снова осаждают тельца включения, полученные тельца включения растворяют в 8 М мочевине и повергают предварительной очистке на сорбенте с градиентной элюцией буфером, содержащем 8 М мочевину и 0,7 М NaCl, после чего проводят ренатурацию растворенного ингибитора, методом снижения концентрации денатуранта в буфере 20 мМ MES-NaOH pH 6.0 или 20 мМ MES-NaOH pH 6.0, 2 М NaCl, 0,05% PEG 6000 и последующую очистку препарата ионообменной хроматографией. Изобретение позволяет получить ингибитор сериновых протеиназ, обладающий улучшенными ингибиторными свойствами по отношению к коллагеназе, трипсину и субтилизину. 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полинуклеотидную молекулу с SEQ ID №4 или 6, кодирующую легкую цепь энтерокиназы. Изобретение относится также к дрожжевому экспрессионному конструкту, содержащему указанную последовательность, а также к дрожжевой клетке, трансформированной конструктом. Изобретение касается также способа продуцирования энтерокиназы с использованием такой клетки. Изобретение позволяет эффективно получать энтерокиназу. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 6 пр.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки коагуляционного фактора IX (FIX). Способ включает хроматографию с использованием мультимодальной смолы, при которой осуществляется контакт фракции, содержащей FIX, с мультимодальной смолой, промывка промывочным буфером для удаления примесей и элюирование FIX с мультимодальной смолы буфером, содержащим аргинин, с последующим сбором фракций, содержащих FIX, в очищенной или обогащенной форме. Предложенный способ дает возможность дальнейшего использования стадии очистки целевого белка, связанного с мультимодальной смолой, перед элюированием, а также возможность проведения элюирования в мягких условиях. Предложенный способ может быть использован в биохимии для очистки коагуляционного фактора IX. 15 з.п. ф-лы, 1 ил., 17 табл., 7 пр.
Наверх