Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ


 


Владельцы патента RU 2425879:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровский технологический институт пищевой промышленности" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ. Способ заключается в модификации содержащих сложноэфирные группы наночастиц Fе3О4. Затем полученные частицы обрабатывают аминопропилтриэтоксисиланом. Далее суспензию наночастиц инкубируют с конденсирующим агентом и осуществляют иммобилизацию фермента. Способ позволяет получать иммобилизованные препараты с удельной активностью фермента более 70%. 3 табл.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии, а именно к способу ковалентной иммобилизации биомолекул на поверхности наноматериалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы, и его применению при создании иммобилизованных ферментных препаратов. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, в том числе в пищевой промышленности.

В данной области известно большое число технических решений, среди которых наибольшее распространение получили химические способы иммобилизации, заключающиеся в ковалентном связывании биомолекул с предварительно активированным носителем. Предварительная активация носителя предусматривает модификацию его поверхности путем обработки химическими соединениями, имеющими реакционноспособные функциональные группы (NH2, -NH-NH2, -ОН и др.), посредством которых реализуется химическое присоединение биомолекул. Однако в своей массе эти технические решения обладают рядом недостатков, а именно: использование дорогостоящих материалов и реактивов для иммобилизации, трудоемкость методик.

Известен способ иммобилизации (см. пат. РФ №94024389, МПК C12N 11/00, заявл. 29.06.1994, опубл. 10.06.1996) биообъектов на поверхности стекла (керамики), заключающийся в обработке поверхности носителя раствором алкоксибензоата металла. В качестве растворителя используют полярный апротонный растворитель, в частности тетрагидрофуран, диметоксиэтан. Концентрация раствора составляет 0,05-0,8 моль/л. Раствор алкоксибензоата металла наносят на поверхность центрифугированием или окунанием и сушат на воздухе при температуре 15-30°С. В качестве биообъекта используют глюкозооксидазу, которую в виде 3%-ного раствора наносят на модифицированную поверхность. Степень фиксации составляет 90%. Главными недостатками данного подхода являются низкая плотность функциональных групп на поверхности носителя, что приводит к невысокой эффективности ковалентного связывания, а также трудоемкость процедуры иммобилизации.

Известен также способ получения иммобилизованного протеолитического фермента (см. пат. РФ №1041567, МПК C12N 11/10, опубл. 15.09.1983), предусматривающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического фермента. В качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трисоксиметиламинометановом буфере (рН 8,5), а присоединение фермента осуществляют при соотношении носитель-фермент 1:1. К основным недостаткам данного способа относятся следующие: дефицитный и дорогостоящий носитель - ксилоуронид, низкая стабильность целевого продукта, необходимость хранения препарата при низкой температуре (0-4°С).

Также известен подход к получению иммобилизованного фермента, заключающийся в следующем (см. пат. РФ №586182, МПК C07G 7/02, заявл. 30.08.1974, опубл. 30.12.1977). Фермент вводят в водную или спиртовую среду вместе с сочетающим агентом - карбодиимидом, используя в качестве носителя карбоксилсодержащий материал, например, полипропиленовую ткань с привитыми группами акриловой кислоты, частично гидролизованный полиэтилентерефталат, в форме тканей, пленок, гранул, волокон и т.д. При этом в случае проведения иммобилизации в водной среде при значениях рН порядка 5 в соответствующем буфере, когда фермент полностью растворим, в качестве сочетающего агента применяют водорастворимые карбодиимиды, например, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-м-п-толуолсульфонат и т.д. Основной недостаток этого способа иммобилизации связан с низкой удельной активностью полученных препаратов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом - является изобретение, описывающее ковалентную иммобилизацию биомолекул на поверхности полимерных материалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы (см. пат. РФ №2321574, МПК С07В 43/06, заявл. 06.04.2006, опубл. 10.04.2008). Данный способ основан на решении проведения модификации поверхности биочипа путем двухстадийной обработки, причем одна из стадий осуществляется в газовой фазе. Это позволяет снизить вероятность отслаивания модифицирующего слоя от поверхности носителя и увеличить количество иммобилизованных биообъектов. На первой стадии обработки поверхности чипа проводят аминолиз поверхностных сложноэфирных групп полимера, для чего подложку обрабатывают в газовой фазе аминосиланом (аминопропилтриэтоксисилан, аминопропилтриметоксисилан). На второй стадии формируют большое количество функциональных групп, необходимых для иммобилизации биомолекул, путем проведения совместной поликонденсации соответствующего силана с триалкоксисилановыми фрагментами.

На заключительном этапе формирования чипа выбирают способ нанесения и иммобилизации биомолекул на модифицированную поверхность подложки и проводят иммобилизацию.

Основным недостатком данного решения следует считать тот факт, что ковалентная иммобилизация описана только для органических полимерных носителей, таких как полиметилметакрилат, поливинилхлорид, поликарбонат, по-либутилметакрилат, сополимеры бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол и акрилонитрил.

Задачей технического решения является упрощение процедуры иммобилизации ферментных препаратов и улучшение их физико-химических характеристик.

Технический результат достигается за счет использования в качестве матрицы наночастиц Fe3O4, а также недорогих и доступных реактивов. Совокупность предложенных операций позволяет получать иммобилизованные ферментные препараты, отличающиеся от известных аналогов рядом признаков, прежде всего удельной активностью фермента, оптимальными значениями рН и температур.

Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц Fe3O4 для иммобилизации биологических веществ включает выполнение следующих операций. На первом этапе осуществляется получение наночастиц магнетита, содержащих на поверхности электрофильные сложноэфирные группы, путем взаимодействия полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Полученные наночастицы служат для последующей иммобилизации ферментов с использованием конденсирующего агента карбодиимида.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Смесь полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля нагревают при перемешивании в атмосфере азота до 220°С, после чего к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле, через несколько минут образовавшиеся наночастицы Fe3O4 со сложноэфирными группами отделяют центрифугированием. Полученные магнитные наночастицы защищены от агрегации в силу межчастичных взаимодействий и влияния среды, а также модифицированы и пригодны для иммобилизации биологических веществ посредством конденсирующего агента. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Следует отметить, что на второй стадии присутствие воды в системе должно быть ограничено, поскольку ее наличие приводит к гидролизу аминопропилтриэтоксисилана и образованию олигомерных силанов. Поэтому в отдельной камере объемом 50 см3 наночастицы (5,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см3) при атмосферном давлении и температуре 70°С в течение 60 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 1 см3 и высушивают на воздухе. Далее частицы (5,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол:вода 1:1) в течение двух часов при температуре 50°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы Fe3O4 несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).

Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 0,1М фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 0,025М фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера. На следующей стадии растворяют 500 мкг α-химотрипсина в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в 0,1М фосфатном буфере при температуре 30°С в течение двух часов. По окончании иммобилизации наночастицы промывают 0,025М фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 0,1М фосфатного буфера. Физико-химические характеристики химотрипсина, иммобилизованного на наночастицах Fe3O4, представлены в табл.1. В качестве контроля в данном случае используют химотрипсин, иммобилизованный на немодифицированных наночастицах Fe3O4 адсорбционным способом.

Таблица 1
Физико-химические параметры иммобилизованного химотрипсина
Способ иммобилизации Содержание белка в иммобилизован-ном препарате, мкг/мг носителя Удельная активность фермента, ед./мг белка Удельная активно-сть фермента, % от нативного Оптимум, рН Температурный оптимум, °С
Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe3O4 14,5 30,5 76,3 7,5-9,0 40
Контрольный опыт 9,8 22,5 56,3 7,4-9,0 35

Пример 2

Получение наночастиц Fe3O4 с поверхностными сложноэфирными группами и их модификацию силаном осуществляют аналогично примеру 1. Затем готовят суспензию наночастиц (5 мг/см3) в 200 мМ фосфатном буфере (рН 7,0). В качестве иммобилизуемого протеолитического фермента используют термолизин. Для его иммобилизации 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 200 мМ фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 200 мМ фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 200 мМ фосфатного буфера. Затем подготавливают раствор термолизина, растворив 1000 мг фермента в 1000 мкл 200 мМ фосфатного буферного раствора, который инкубируют с 500 мкл суспензии наночастиц в 200 мМ фосфатном буфере при температуре 45°С в течение трех часов. По окончании иммобилизации наночастицы Fe3O4 промывают 200 мМ фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 200 мМ фосфатного буфера (рН 7,0). Физико-химические характеристики термолизина, иммобилизованного на наночастицах Fe3O4, представлены в табл.2. В качестве контроля используют термолизин, иммобилизованный на немодифицированных наночастицах Fe3O4 адсорбционным способом.

Таблица 2
Физико-химические параметры иммобилизованного термолизина
Способ иммобилизации Содержание белка в иммобилизо-ванном препарате, мкг/мг носителя Удельная активно-сть фермента, ед./мг белка Удельная активно-сть фермента, % от нативного Оптимум, рН Температурный оптимум, °С
Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe3O4 21,5 38,9 76,4 6,9-8,6 45
Контрольный опыт 13,2 24,0 47,2 7,6-8,2 30

Пример 3

Для получения наночастиц Fe3O4 со сложноэфирными группами на поверхности и их модификации силаном осуществляют последовательность операций, аналогичную примеру 1, после чего готовят суспензию наночастиц (5 мг/см3) в 100 мМ фосфатном буфере (рН 6,8). Иммобилизуемым объектом является протеолитический фермент эластаза. 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 100 мМ фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 100 мМ фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 100 мМ фосфатного буфера. На следующем этапе иммобилизации растворяют 1000 мг эластазы в 1000 мкл 100 мМ фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии модифицированных наночастиц в 100 мМ фосфатном буфере при температуре 40°С в течение четырех часов. По окончании иммобилизации наночастицы промывают 100 мМ фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 100 мМ фосфатного буфера (рН 6,8). Физико-химические характеристики эластазы, иммобилизованной на наночастицах Fe3O4, представлены в табл.3. В качестве контроля используют эластазу, иммобилизованную на немодифицированных наночастицах Fe3O4 адсорбционным способом.

Таблица 3
Физико-химические параметры иммобилизованной эластазы
Способ иммобилизации Содержание белка в иммобилизо-ванном препарате, мкг/мг носителя Удельная активность фермента, ед./мг белка Удельная активно-сть фермента, % от нативного Оптимум рН Температурный оптимум, °С
Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe3O4 11,3 5,8 70,7 6,5-7,2 35
Контрольный опыт 7,7 4,5 54,8 6,8-7,1 28

Таким образом, иммобилизация протеолитических ферментов на поверхности модифицированных наночастиц Fe3O4 позволяет получить гетерогенные ферментные препараты с высокой удельной активностью по сравнению с известными способами иммобилизации ферментов на органических полимерных носителях. Преимущества данного изобретения перед прототипом следующие:

- обеспечение возможности использования в качестве носителя для иммобилизации наночастиц, обладающих рядом преимуществ перед макрообъектами;

- повышение удельной активности иммобилизованных препаратов;

- оптимизация условий функционирования иммобилизованных препаратов;

- упрощение технологии получения иммобилизованных препаратов.

Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ, состоящий в формировании большого количества активных функциональных групп с использованием алкоксисиланов на поверхности носителя со сложноэфирными фрагментами, отличающийся тем, что в качестве поверхностно-модифицированного носителя используются наночастицы Fe3O4.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к технологии инвертирования сахарных сиропов, используемых в безалкогольной, ликероводочной, консервной, кондитерской и хлебопекарной промышленностях для производства изделий, мороженого и напитков, а также в пчеловодстве.
Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения иммобилизованной -фруктофуранозидазы, и может быть использовано при производстве инвертного сахара.

Изобретение относится к способам получения мезопористых наноструктурированных пленок диоксида титана (TiO2) и к способам иммобилизации на них ферментов с целью получения фотобиокатализаторов и может быть использовано в биотехнологии.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в качестве носителя иммобилизованных клеток и ферментов. .

Изобретение относится к соединению формулы I, его изомеру формулы IA, смеси его изомеров IA/C, способам их получения, а также к способам получения соединения формулы IVA из соединения формулы IA, включающим восстановление и удаление защиты с соединения формулы IA путем гидрогенолиза, используя Н2 и каталитическое количество Pd/C, в присутствии трифторуксусной кислоты с получением соединения формулы VA; дальнейшее взаимодействие этого соединения с Cbz-t-leu-OH, EDC и HOBt с получением соединения формулы VIA; взаимодействие соединения VIA с Н2 и каталитическим количеством Pd/C в присутствии лимонной кислоты с получением амина и взаимодействие данного амина и 4-амино-3-хлорбензойной кислоты в присутствии CDMT и NMM с получением соединения формулы IVA

Изобретение относится к области биохимии

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен фотобиокатализатор, включающий гидрогеназу, иммобилизованную в количестве не менее 0,1 нмоль на 1 см2 на наноструктурированной мезопористой пленке TiO2. Мезопористая плёнка приготовлена из нанокристаллов TiO2 размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м2/г. Совместно с ферментом гидрогеназой на пленке диоксида титана иммобилизован фотосенсибилизатор ФС 1 - пигмент-белковый комплекс фотосистемы 1 - в количестве 0,01-0,04 нмоль ФС 1 на 1 см2. Полученная пленка TiO2 имеет толщину 4-8 мкм, удельную поверхность 50-65 м2/г, поры со средним радиусом 11,5 нм и удельным объемом 0,50-0,65 см3/г. Также предложен фотокаталитический способ получения водорода в анаэробных условиях с использованием описанного фотобиокатализатора при освещении светом с λ=490-750 нм в присутствии органического донора электрона и переносчика электрона. Изобретения обеспечивают повышение устойчивости пигмент-белкового комплекса фотосистемы 1 и гидрогеназы, а также позволяют получать водород под действием видимого света с высокой скоростью. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.
Группа изобретений относится к биотехнологии и пищевой промышленности. Предложен способ получения биокатализатора для переэтерификации жиров. Проводят аминирование гранулированного силикагеля или диоксида кремния дисперсностью 0,3-1,0 мм аминопропилтриэтоксисиланом. Затем полученный аминированный носитель обрабатывают водным раствором глутарового альдегида или глиоксаля концентрацией 2,0 мас.% или 5,0 мас.% в течение 2 ч. Иммобилизуют на обработанном носителе путем рециркуляции через него раствора термостабильной липазы бактерий Geobacillus lituanicus в фосфатном буфере при температуре 0ºC или 4ºC при pH 6,5 в течение 12 ч. Затем промывают полученный биокатализатор водным раствором трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида. Также предложен биокатализатор для переэтерификации жиров, полученный указанным способом. Достигаемый технический результат заключается в упрощении технологии способа и в получении биокатализатора, обладающего высокой каталитической активностью и высокой механической прочностью. 2 н.п. ф-лы, 4 пр.
Изобретение относится к биотехнологии. Бактериальная система предназначена для нормализации микробиоценоза организма человека и животных. Она содержит носитель, представляющий собой углеродминеральный энтеросорбент (энтерумин), иммобилизованные на нем бактерии-эубиотики (бифидобактерии) и компоненты питательной и защитной среды. При этом углеродминеральный энтеросорбент модифицирован окислительной обработкой (перекисью водорода), а титр бактерий в готовом препарате составляет 1 х 107 КОЕ/грамм бактериальной системы. Изобретение позволяет увеличить функциональную и колониеобразующую активности бактерий-эубиотиков и повысить их сорбционную способность. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 7 пр.

Изобретение относится к способу получения эфиров жирных кислот - биодизеля, которые могут использоваться в качестве альтернативного биотоплива. Способ производства биодизеля осуществляют путем переэтерификации при смешении растительного масла, спирта и катализатора и последующего выделении целевого продукта. Способ отличается тем, что, на первой стадии переэтерификации в качестве катализатора используют сульфат железа (ll), после чего отделяют сульфат железа и выпавший в осадок глицерол, смесь из спирта, масла и эфиров жирных кислот направляют на вторую стадию перэтерификации, на которой в качестве катализатора используют фермент - липазу, иммобилизованную на поверхности, после чего отделяют глицерол и ферментный катализатор, а смесь спирта и биодизеля направляют на стадию выделения целевого продукта.Технический результат - способ позволяет упростить процесс проведения реакции переэтерификации и увеличить полноту протекания реакции до 96-98%. 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

Заявленная группа изобретений относится к области биотехнологии. Заявлен биокатализатор для переэтерификации растительных масел, содержащий в качестве ферментативно-активной субстанции частично разрушенные клетки или клеточные лизаты рекомбинантного штамма-продуцента rE. coli/lip, носитель, состоящий из диоксида кремния и наноструктурированного углерода, и мальтодекстрина или высокомолекулярного полисахарида в качестве влагоудерживающего агента. Биокатализатор готовят путем смешения клеток или клеточных лизатов рекомбинантного штамма-продуцента rE. coli/lip с носителем и влагоудерживающим агентом углеводной природы с последующей сушкой и фракционированием. Способ переэтерификации растительных масел осуществляют как в периодическом режиме в реакторе смешения, так и в непрерывном режиме в проточном реакторе с неподвижным слоем биокатализатора при температуре 60-80°C. Преимуществом изобретения является высокая ферментативная активность биокатализаторов в процессах переэтерификации растительных масел. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 25 пр.
Наверх