Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов



Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов
Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов
Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов
Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов
Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов
Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов

 


Владельцы патента RU 2426109:

Меграбян Казарос Аршалуйсович (RU)

Изобретение может быть использовано в пищевой, косметической, фармацевтической промышленностях, а также в медицине и криминалистике. Предлагаемый способ позволяет измерять активность антиоксидантов по отношению к наиболее опасным для организма ОН радикалам. При осуществлении способа в процессе восстановления вещества на электроде в растворе фонового электролита используют модельную реакцию, генерирующую ОН радикалы, регистрацию катодных волн восстановления вещества ведут в интервале потенциалов -1,2÷-1,9 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения. В указанном интервале появляется пик, предположительно .ОН радикалов, который уменьшается пропорционально количеству добавленного антиоксиданта. Активность антиоксидантов определяют по относительному уменьшению этого пика. Изобретение позволяет повысить чувствительность способа определения активности антиоксидантов в 277 раз. 6 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к области определения активности антиоксидантов и может быть использовано в пищевой, косметической, фармацевтической промышленностях, а также в медицине и криминалистике.

Известен способ определения суммарной антиоксидантной активности (АОА) биологически активных веществ (патент РФ №2238554, МПК7 G01N 33/15, G01N 27/26, опубл. 20.10.2004), включающий подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление в ячейке амперометрического детектора, усиление электрических сигналов, их регистрацию и расчет АОА по предложенной математической зависимости. В этом способе подготовку анализируемых проб осуществляют путем смешения соответствующих веществ с растворителем, не обладающим антиоксидантной способностью. Кроме того, в качестве стандартных веществ используют вещества, обладающие высоким редокс-потенциалом, выбранные из ряда: рутин, кверцетин, дигидрокверцетин.

Основными недостатками данного способа являются "относительно низкая чувствительность, а также сложность аппаратурного оформления, т.к. для реализации способа требуется насос, термостатируемая электрохимическая ячейка, кран дозатор. Кроме того, в этом способе окисление антиоксидантов идет электрохимическим путем на поверхности рабочего электрода, на котором происходит глубокое окисление, не характерное для процессов, происходящих в организме.

Известен также выбранный нами за прототип вольтамперометрический способ определения суммарной активности антиоксидантов (патент РФ №2224997, МПК7 G01N 33/00, опубл. 27.02.2004), включающий процесс восстановления вещества на электроде в растворе электролита. В этом способе в качестве модельной реакции используют процесс электровосстановления кислорода, который проводят на ртутно-пленочном электроде на фоне 0,1М Na2SO4 в водной среде, 0,1 М NaClO4 в апротонной среде или 0,9% NaCl в биологических объектах, регистрацию катодных волн одноэлектронного восстановления кислорода ведут в режиме дифференцирования при скорости развертки потенциала 50-100 мВ/с, суммарную антиоксидантную активность определяют по относительному изменению тока электровосстановления кислорода в интервале потенциалов от 0 до -0,6 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения.

Основным недостатком этого способа является низкая чувствительность. Кроме того, способ не достаточно объективно оценивает активность антиоксидантов по отношению к процессам, происходящим в организме, т.к. с помощью модельной реакции, указанной в прототипе, невозможно определять активность антиоксидантов по отношению к .ОН радикалам. Как показано в работе (Ю.А.Владимиров. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. - 2000. - №12, т.6. - С.16), наибольший вред здоровью приносят свободные .ОН радикалы, т.к. «в нуклеиновых кислотах .ОН разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и, таким образом, разрывает цепи ДНК и РНК, в результате чего происходят мутации и гибель клеток. Таким образом, радикал .ОН - это радикал-разрушитель, радикал-убийца».

Основным техническим результатом предложенного изобретения является повышение чувствительности способа определения активности антиоксидантов в 277 раз. Кроме того, предлагаемый способ позволяет измерять активность антиоксидантов по отношению к наиболее опасным для организма .ОН радикалам.

Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом вольтамперометрическом способе определения активности антиоксидантов, включающем использование модельной реакции в процессе восстановления вещества на электроде в растворе фонового электролита, регистрацию катодных волн восстановления вещества в заданном интервале потенциалов относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения, добавление антиоксиданта и определение антиоксидантной активности по относительному изменению тока электровосстановления, согласно предложенному решению, в качестве модельной реакции используют реакцию, генерирующую .ОН радикалы, а регистрацию катодных волн ведут в интервале потенциалов -1,2÷-1,9 В.

В предлагаемом способе определения активности антиоксидантов используют метод вольтамперометрии. Измерение вольтамперных зависимостей восстановления вещества проводят с помощью вольтамперометрического анализатора или полярографа любого типа, который подключают к электрохимической ячейке. Электрохимическая ячейка состоит из емкости, в которую наливают фоновый раствор электролита и опускают два электрода - рабочий и электрод сравнения. В качестве фоновых растворов используют хорошо проводящие водные растворы сильных электролитов: KCl, Na2SO4, ацетатный или цитратный буферы, а также неводные растворы спиртов, в частности этиленгликоль с добавкой тетраалкиламмония бромида (ТААБ) для электропроводности. В качестве электродов используют хлорид-серебряный электрод сравнения, в качестве рабочего - электрод, инертный в рабочей области потенциалов -1,2÷-1,9 В, например, ртутный пленочный, ртутный сферический, пленочный висмутовый и пленочный свинцовый на графитовых подложках. Как правило, используют ртутный пленочный электрод на серебряной подложке. Подготовленные электроды подключают к анализатору, опускают в электрохимическую ячейку с 10-20 мл фонового раствора и записывают вольтамперограмму фона. Затем проводят модельную реакцию, генерирующую .ОН радикалы, с помощью одной из модельных систем: Fe2+-ЭДТА, Cu2+-ЭДТА, Fe2+-HPO42-, Na2SO3-O2 и Fe2+-H2O2 (реакция Фентона). Методика эксперимента заключается в измерении вольтамперометрических зависимостей катодного тока электровосстановления в области потенциалов -1,2÷-1,9 В. При проведении в фоновом растворе электролита модельной реакции, генерирующей .ОН радикалы, на вольтамперограммах появляется новая катодная волна, предположительно .ОН радикала. При используемых скоростях развертки катодная волна имеет форму пика с максимумом -1,4÷-1,6 В в зависимости от фона. Затем в фоновый раствор электролита добавляют навеску растворимого антиоксиданта или измеренный объем его раствора известной концентрации и повторно измеряют вольтамперометрическую зависимость. При этом величина новой катодной волны, предположительно .ОН радикала, уменьшается пропорционально количеству добавленного антиоксиданта.

Оценку антиоксидантной способности (К) проводят, сравнивая высоту катодной волны, предположительно .ОН радикала, до (I0, мкА) и после (It, мкА) внесения антиоксиданта по формуле:

К=X/C·V, г-1, где Х=(I0-It)/I0, С - концентрация вносимого раствора антиоксиданта, г/мл, V - объем вносимого раствора антиоксиданта, мл.

Пример конкретного выполнения 1.

Подготавливают прибор - вольтамперометрический анализатор типа СТА-1 (производства ООО «ИТМ», г.Томск), совмещенный с компьютером, к работе. Для этого устанавливают вид полярографии: постояннотоковая, скорость развертки потенциала 50 мВ/с, начальный потенциал - 0 В, конец развертки потенциала -1,9 В. Развертка в катодную область от 0 до -1,9 В. В качестве рабочего электрода применяют ртутно-пленочный, а в качестве электрода сравнения - хлорид-серебряный.

При осуществлении способа в стеклянный стаканчик (электрохимическую ячейку) наливают 10 мл раствора фонового электролита, а именно 0,1 М Na2SO4, в него опускают электроды и подключают к прибору. После этого записывают вольтамперограмму (фиг.1) в фоновом растворе в указанной области потенциалов, регистрируя катодные волны кислорода и пероксида водорода (Скуг Д., Уэст Д. Основы аналитической химии / Пер. с англ. под ред. Ю.А.Золотова. - М.: Мир, 1979. - С.69). Затем проводят модельную реакцию, генерирующую .ОН радикалы, с помощью модельной системы Fe2+-ЭДТА. Для этого дозатором вносят в ячейку 0,03 мл 0,01М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,025 мл 0,01 М раствора соли Мора - FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O. Перемешивают раствор путем вибрации электродов в течение 5 с. При этом, согласно (X.F.Yang, X.Q.Guo. Fe(II)-EDTA Chelate-Induced Aromatic Hydroxylation of Terephtalate as a New Method for the Evalution of Hydroxil Radical-Scavenging Ability // The Analist. - 2001. - #126. - P.926-932), генерация .ОН радикалов протекает из кислорода при участии комплексов железа (II) с ЭДТА. После успокоения раствора в течение 5 с записывают вольтамперограмму и регистрируют исчезновение катодной волны Н2О2, и появление новой катодной волны, возможно .ОН радикала, в интервале потенциалов -1,3÷-1,8 В, с максимумом при -1,52 В (фиг.2). Затем добавляют в электрохимическую ячейку 0,045 мл раствора, содержащего 45 мкг антиоксиданта - аскорбиновой кислоты и перемешивают. Далее записывают вольтамперограмму и регистрируют при этом уменьшение катодной волны при -1,52 В и сдвиг ее на 20 мВ в положительную область, т.е. при -1,50 В (фиг.3). Оценивают высоту катодных волн при -1,52÷-1,50 В до (Iо, мкА) и после (It, мкА) внесения антиоксиданта и рассчитывают активность антиоксиданта по формуле:

K=X/C·V, г-1,

где Х=(I0-It)/I0, С - концентрация вносимого раствора антиоксиданта, г/мл, V - объем вносимого раствора антиоксиданта, мл.

Х=(4,41-2,46)/4,4=0,44, С=1·10-3 г/мл, V=0,045 мл,

K=0,44/1·10-3·0,045=9,8·103 г-1.

С помощью модельной системы Fe2+-ЭДТА на фоне 0,1 М Na2SO4 определяют также антиоксидантную активность других антиоксидантов: сульфита натрия и глюкозы, а на фоне 0,1 М KCl определяют активность аскорбиновой кислоты, сульфита натрия, пирогаллола, пирокатехина и резорцина (см. табл.1). Полученные значения АОА для аскорбиновой кислоты, пирогаллола, пирокатехина и резорцина удовлетворительно коррелируют со способом-прототипом.

Аналогичные результаты были получены при различных концентрациях раствора фонового электролита Na2SO4: 0,2 M, 0,5 М и 1 М.

Пример конкретного выполнения 2.

Подготавливают прибор к работе так, как описано в примере 1.

В электрохимическую ячейку наливают 10 мл раствора фонового электролита, а именно 0,1 М KCl, в него опускают электроды и подключают к прибору. После этого записывают вольтамперограмму в фоновом растворе, регистрируя катодные волны кислорода и Н2О2 (фиг.4, кривая 1). Затем проводят модельную реакцию, генерирующую .ОН радикалы, с помощью модельной системы Cu2+-ЭДТА. Для этого дозатором вносят в ячейку 0,03 мл 0,01М раствора ЭДТА и 0,025 мл 0,01М раствора соли меди - CuSO4·5H2O. Перемешивают раствор в течение 5 с. При этом генерация .ОН радикалов протекает из кислорода при участии комплексов меди с ЭДТА (Christelle Hureau, Peter Faller. Aβ-mediated ROS production by Cu ions: Structural insights, mechanisms and relevance to Alzheimer's disease // Biochimie. - 2009. - V.91, Issue 10. - P.1212-1217). После успокоения раствора в течение 5 с записывают вольтамперограмму и регистрируют исчезновение катодной волны Н2O2, и появление новой катодной волны, возможно .ОН радикала, в интервале потенциалов -1,2÷-1,7 В с максимумом при -1,48 В (фиг.4, кривая 2). Затем добавляют в электрохимическую ячейку 0,06 мл раствора, содержащего 60 мкг антиоксиданта - аскорбиновой кислоты, и перемешивают. Записывают вольтамперограмму и регистрируют при этом уменьшение и сдвиг катодной волны при -1,45 В (фиг.4, кривая 3). Оценивают высоту катодных волн при -1,48÷-1,45 В до (I0) и после (It) внесения антиоксиданта и рассчитывают активность антиоксиданта К по формуле, приведенной в примере 1:

K=X/C·V=(4,49-2,62)/4,49/1·10-3·0,06=6,9·103 г-1.

С помощью модельной системы Cu+2-ЭДТА определяют также активность аскорбиновой кислоты на другом фоне - 0,1 М Na2SO4 (см. табл.1).

Таблица 1
№ образца Фоновый раствор Модельная система Антиоксидант Антиоксид. активность, К·103, г-1 Интервал потенциалов регистрации катодных волн, В
1 2 3 4 5 6
1 Na2SO4 Fe2+-ЭДТА Аскорбиновая кислота 9,80 -1,3÷-1,8
2 Na2SO4 Fe2+-ЭДТА Глюкоза 0,51 -1,3÷-1,8
3 Na2SO4 Fe2+-ЭДТА Сульфит натрия 2,05 -1,3÷-1,8
4 Na2SO4 Cu2+-ЭДТА Аскорбиновая кислота 7,15 -1,3÷-1,75
5 KCl Cu2+-ЭДТА Аскорбиновая кислота 6,90 -1,2÷-1,7
6 KCl Fe2+-ЭДТА Пирокатехин 0,21 -1,2÷-1,7
7 KCl Fe2+-ЭДТА Аскорбиновая кислота 8,20 -1,2÷-1,7
8 KCl Fe2+-ЭДТА Сульфит натрия 1,73 -1,2÷-1,7
9 KCl Fe2+-ЭДТА Резорцин 0,13 -1,3÷-1,7
10 KCl Fe2+-НРО42- Аскорбиновая кислота 4,09 -1,3÷-1,65
11 KCl Fe2+-H2O2 Аскорбиновая кислота 5,48 -1,3÷-1,7
12 KCl Na2SO3-O2 Аскорбиновая кислота 8,56 -1,2÷-1,65
13 Ацетатный буфер Fe2+-ЭДТА Аскорбиновая кислота 9,70 -1,4÷-1,85
14 Этиленгликоль с ТААБ Fe2+-ЭДТА Аскорбиновая кислота 4,30 -1,2÷-1,9
15 Na2SO4 Fe2+-ЭДТА Этиловый спирт 0,007 -1,2÷-1,7
16 Na2SO4 Fe2+-ЭДТА Пирогаллол 1,13 -1,3÷-1,7

Аналогичные результаты по измерению активности аскорбиновой кислоты получают при использовании других рабочих электродов: ртутного сферического электрода, пленочного висмутового и пленочного свинцового на графитовых подложках, а также в апротонной среде при использовании неводного электролита - этиленгликоля с добавкой 0,1 М тетраалкиламмония бромида (см. табл.1).

В табл.1 представлены также результаты по определению антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты на фоне КСl с использованием модельных реакций, генерирующих .ОН радикалы, с помощью других модельных систем: Fe2+2О2, Fe2+-HPO42- и Na2SO3-O2.

Из табл.1 следует, что заявляемый интервал потенциалов регистрации катодных волн -1,2÷-1,9 В.

С помощью модельной системы Fe2+-ЭДТА на фоне 0,1 М Na2SO4 предлагаемым способом определяют также антиоксидантную активность водных экстрактов продуктов природного происхождения - чеснока, мандарина и яблока (см. табл.2).

Таблица 2
№ образца Фоновый раствор Модельная система Антиоксидант Антиоксидантная активность, К, г-1 Интервал потенциалов регистрации катодных волн, В
1 2 3 4 5 6
1 Na2SO4 Fe2+-ЭДТА Чеснок 16,62 -1,3÷-1,8
2 Na2SO4 Fe2+-ЭДТА Мандарин 9,59 -1,3÷-1,8
3 Na2SO4 Fe2+-ЭДТА Яблоко 6,20 -1,3÷-1,8

Пример конкретного выполнения 3.

Определение чувствительности способа.

Чувствительность предлагаемого способа определения активности антиоксидантов рассчитывают с помощью критерия Зайделя (А.Н.Зайдель. Основы спектрального анализа. - М.: Наука. - 1965). При этом аналитическим сигналом является разность ΔI, мкА между значениями тока пика .ОН радикала до (I0) внесения антиоксиданта и после (It) внесения определенной концентрации С, мг/л антиоксиданта. Сначала находят среднеквадратичное отклонение σi при определении ΔI в 3-х параллельных опытах (в 3-х ячейках) при одинаковой добавке антиоксиданта. Затем строят график в координатах ΔI-С (фиг.5 и 6). Определяют тангенс угла наклона прямой и подставляют в формулу: Cmin=2σi·C/ΔIcp.Таким образом рассчитывают минимальную концентрацию антиоксиданта (предел обнаружения), при которой можно заметить уменьшение пика.

Нами был рассчитан предел обнаружения способа-прототипа. Для этого была измерена величина ΔI - снижение пика кислорода от добавок аскорбиновой кислоты, построен график в координатах ΔI-С (фиг.5) и рассчитан предел обнаружения по критерию Зайделя. Для способа прототипа он равен:

Cmin=2·0,078·400/0,623=100,2 (мг/л).

Для предлагаемого способа предел обнаружения, рассчитанный с помощью графика (фиг.6), равен:

Cmin=2·0,069·3.15/1.194=0,36 (мг/л).

Таким образом, из фиг.5 и 6, а также из расчетов на примере аскорбиновой кислоты следует, что чувствительность предлагаемого вольтамперометрического способа определения активности антиоксиданта в 277 раз выше чувствительности способа-прототипа. Кроме того, как видно из примеров 1 и 2, предлагаемый способ позволяет определить активность антиоксидантов по отношению к .ОН радикалам.

Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов, включающий использование модельной реакции в процессе восстановления вещества на электроде в растворе фонового электролита, регистрацию катодных волн восстановления вещества в заданном интервале потенциалов относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения, добавление антиоксиданта и определение антиоксидантной активности по относительному изменению тока электровосстановления, отличающийся тем, что в качестве модельной реакции используют реакцию, генерирующую ОН радикалы, а регистрацию катодных волн ведут в интервале потенциалов -1,2÷-1,9 В.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения ионов металлов, и может быть использовано в гидрометаллургии, в различных геологических разработках при поиске и разведке в случае анализа руд, для определения содержания ионов платины методом инверсионной вольтамперометрии (ИВ).

Изобретение относится к количественному определению аналитов в биологических жидкостях. .

Изобретение относится к медицине и описывает способ инверсионно-вольтамперометрического определения бензилпенициллина, включающий приготовление раствора меди (II) и определение ее концентрации после предварительного электровосстановления по высоте пика анодного растворения, где медь (II) переводят в комплексное соединение с бензилпенициллином, и определение бензилпенициллина проводят по разности между первоначальной концентрацией ионов меди (II) (Сн) и остаточной концентрацией ионов меди (II), не вступивших в реакцию с бензилпенициллином (Со ), в присутствии фонового электролита муравьиной кислоты, описываемой формулой CPen=2·(Сн-Со).

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения ионов металлов сурьмы, висмута, меди, и может быть использовано для определения их содержания в водных растворах в присутствии растворенного кислорода методом инверсионной анодно-катодной вольтамперометрии (АКВА).

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в пищевой, фармакологической, медицинской и химической промышленности при определении микроколичеств селена и йода в пищевых продуктах, биологических объектах, лекарственных препаратах, БАДах, объектах окружающей среды.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для экспресс-анализа технологических растворов, сточных и оборотных вод предприятий свинцово-цинковой отрасли цветной металлургии.
Изобретение относится к методам вольтамперометрического определения олова в водных растворах и может быть рекомендовано для определения микроконцентраций олова в питьевой, природной и сточной воде.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для количественного определения тяжелых металлов в объектах технического и природного происхождения.

Изобретение относится к области физических измерений. .

Изобретение относится к аналитической химии

Изобретение относится к аналитической химии платиновых металлов

Изобретение относится к области фармацевтической химии и касается способов количественного определения биологически активных веществ, в частности суммарного содержания флавоноидов - веществ с выраженными антиоксидантными свойствами

Изобретение относится к области фармацевтической химии и касается способов количественного определения биологически активных веществ, в частности стампирина (антипириламида стеариновой кислоты) - синтезированного вещества с выраженными противовоспалительными и антиоксидантными свойствами
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения неметаллов, и может быть использовано при анализе полупроводниковых соединений типа AIII BV с гексагональной кристаллической решеткой для определения серы в легированном селениде галлия

Изобретение относится к аналитической химии и описывает способ кондуктометрического количественного определения гидрохлоридов 5-аминолевулиновой (5-амино-4-оксопентановой) кислоты или ее сложных эфиров, включающий подготовку проб анализируемого вещества, измерение удельной электропроводности растворов, титрование, построение кондуктометрической кривой, определение эквивалентных точек и расчет содержания основного вещества, при этом титрование образцов гидрохлоридов 5-аминолевулиновой кислоты или ее сложных эфиров осуществляют титрованием раствором нитрата серебра, а расчет содержания основного вещества в гидрохлоридах 5-аминолевулиновой кислоты или ее сложных эфиров проводят по формуле

Изобретение относится к области фармацевтической химии и касается способов количественного определения биологически активных веществ, в частности диборнола - нового синтезированного вещества с выраженными нейропротекторными и антиоксидантными свойствами

Изобретение относится к области интегрального контроля металлических гальванопокрытий

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к вольтамперометрическому анализу природных и сточных вод в фоновом электролите после электрохимической обработки
Наверх