Способ биосинтеза цефалоспорина с с использованием нового штамма acremonium chrysogenum вкм f-4081d

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения антибиотика цефалоспорина С. Используют новый штамм-продуцент антибиотика Acremonium chrysogenum BKM F-4081D. Acremonium chrysogenum BKM F-4081D культивируют на ферментационной питательной среде, содержащей источники углеводов - глюкозу, крахмал кукурузный, декстрин, источники азота - кукурузный экстракт, Фармамедиа, сульфат аммония, а также неорганические соли - фосфорнокислый калий, сернокислый калий, мел, сернокислую медь, сернокислый цинк, сернокислый марганец, сернокислое железо, а в качестве растительного жира - рапсовое масло и дополнительно фосфатидилхолин и/или ситостерин. Изобретение способствует увеличению уровня антибиотикообразования в 2 раза, сокращению времени ферментации на 20%. 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Техническим результатом изобретения является увеличение уровня антибиотической активности, сокращение времени ферментации и уменьшение содержания предшественника в культуральной жидкости, что достигается использованием нового штамма - продуцента цефалоспорина С Acremonium chrysogenum BKM F-4081D, новой технологии биосинтеза антибиотика и приводит в целом к повышению рентабельности промышленного производства субстанции цефалоспорина С.

Мицелиальные грибы Acremonuim chrysogenum являются продуцентами β-лактамного антибиотика цефалоспорина С. Природный цефалоспорин С обладает слабой антибактериальной активностью, но он является исходным материалом для химического синтеза различных лекарственных субстанций, обладающих широким спектром антибактериального действия и более устойчивых к действию β-лактомаз, чем пенициллины. Благодаря этому β-лактамные антибиотики цефалоспоринового ряда нашли широкое применение в антимикробной химиотерапии (1).

Процесс микробиологического образования цефалоспорина C с помощью гриба-продуцента из рода Acremonium широко изучен и документирован. Известна способность различных штаммов Acremonium chrysogenum к биосинтезу цефалоспорина С. Одним из близких является штамм Acremonium chrysogenum 12/9.

Культивирование гриба Acremonium chrysogenum осуществляют на питательных средах, содержащих различные источники углерода, азота, неорганические соли, аминокислоты, жиры в условиях интенсивной аэрации и перемешивания. Изучению влияния компонентного состава питательных сред посвящено большое число исследований (2, 3).

Образование цефалоспорина С у многих штаммов Acremonium chrysogenum стимулируется добавлением в среду культивирования аминокислоты метионин. Одним из механизмов этого влияния на синтез цефалоспорина С является роль метионина в процессе дифференциации культуры (4). Образование из фрагментируемого мицелия клеток типа артроспор в присутствии метионина является определяющим фактором развития высокопродуктивных культур. Однако добавление метионина в питательную среду удорожает процесс и неблагоприятно влияет на экологию окружающей среды за счет выделения меркаптана.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения цефалоспорина C с использованием культуры Acremonium chrysogenum при культивировании продуцента в жидкой питательной среде в отсутствие метионина. Процесс антибиотикообразования заканчивается на 140 часов роста при активности культуральной жидкости 24000 мкг/мл (5). Недостатком этого процесса является длительность ферментации при относительно невысоком уровне активности культуральной жидкости.

Задача, решение которой предусмотрено настоящим изобретением, заключается в интенсификации процесса биосинтеза цефалоспорина С путем использования нового штамма Acremonium chrysogenum BKM F-4081D и оптимизации питательных сред в условиях глубинного культивирования. Сущность изобретения заключается в том, что согласно способу микробиологического синтеза цефалоспорина С используют новый штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D, а в составе питательных сред используют новые соединения различной химической природы.

Новый штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D отличается от штамма Acremonium chrysogenum 12/9 повышенной чувствительностью к метионину, замедленным ростом на твердых питательных средах, ускоренным биосинтезом цефалоспорина С при культивировании в глубинных условиях культивирования и более высоким уровнем антибиотикообразования. Штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками:

на среде, содержащей бакто-пептон 10 г/л, мальтозу 40 г/л, мальт-экстракт сухой 20 г/л на 15 сутки роста имеет диаметр колонии 0,7 мм. Колонии приподнятые, конусообразные, нерегулярно складчатые, поверхность молодых колоний игольчатая, цвет слоновой кости или розоватые, пигмента в среду не выделяют, воздушный мицелий очень слабо выраженный. Прототроф, строгий аэроб, оптимальная температура роста на агаровой среде - 24-28°С. Видимый рост колоний проявляется на 8 сутки инкубации при 28°С. На вышеприведенной среде с добавлением 0,1% метионина на 15 сутки роста диаметр колоний в среднем 0,9 мм. Колонии приподнятые, слабо нерегулярно складчатые, светло бежевые, воздушный мицелий практически отсутствует, пигмента в среду не выделяет (таблица 1).

Таблица 1
Сравнение скорости роста и накопления биомассы штаммов 12/9 (родительский штамм) и ВКМ F-4081D (новый штамм)
Штамм	Появление видимого роста колоний на среде без метионина (сутки)	Диаметр (мм) колоний на агаровой среде на 15 сутки роста	Сухая биомасса, при ферментации в колбах (г/мл)
		Среда без метионина	Среда с метионином	На посевной среде, 48 час	На ферментационной среде, 120 час
без метионина	с метионином
12/9 (контроль)	4	3,9	2,7	0,0474	0,1176	0,1206
ВKМ F-4081D (новый штамм)	8	2.8	0,9	0,0314	0,1087	0,1012

Указанный штамм получен путем многоступенчатой селекции на средах, содержащих низкие концентрации метионина: 0,3-0,01%. Штамм Acremonium chrysogenum депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВKМ) под номером F-4081D.

Биосинтез цефалоспорина С, с использованием нового штамма Acremonium chrysogenum ВKМ F-4081D, осуществляют на ферментационной питательной среде, содержащей источники углеводов, такие как глюкоза, крахмал кукурузный, декстрин, и источники азота, такие как кукурузный экстракт, Фармамедиа, сульфат аммония. Питательная среда содержит также неорганические соли, такие как фосфорнокислый калий, сернокислый магний, микроэлементы, и отличается от заявленной в прототипе (5) тем, что в качестве растительного жира содержит рапсовое масло. Кроме того, в среду вводят сложные органические соединения такие, как фосфолипид и ситостерин. Фосфолипиды являются источником «метаболического топлива», наряду с полиненасыщенными жирными кислотами входят в состав рапсового масла. Ситостерин, добавленный к ферментационной среде, способствует более раннему началу дифференциации мицелия и образованию артроспороподобных клеток с укороченной стадией прорастания в гифы. Это имеет большое значение в условиях промышленного производства, так как раннее образование артроспор и быстрая смена генераций улучшает реологические свойства культуральной жидкости, в первую очередь вязкость, что немаловажно для протекания биохимических процессов в стадии ферментации и дает возможность заканчивать биосинтез на более ранний срок при достижении высокого уровня антибиотикообразования. Культивирование осуществляют в колбах при перемешивании при температуре 24-28°С или в ферментаторе вместимостью 20 л в условиях регулируемой ферментации. Активность культуральной жидкости в нерегулируемом процессе в колбах 15000-17000 мкг/мл на 115-120 час, при культивировании в ферментаторе 32000-34000 мкг/мл на 106-110 часов. Количество цефалоспорина определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Преимуществами заявляемого способа являются:

1. Новый штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D со сниженным уровнем образования мицелия в поверхностных и глубинных условиях роста.

2. Увеличение уровня антибиотикообразования по сравнению с прототипом при нерегулируемом процессе биосинтеза в 2 раза, а в условиях регуляции на 40%.

3. Сокращение времени ферментации на 20%.

4. Промежуточный продукт дазацетилцефалоспорин С образуется в количестве не более 5%.

Следующие примеры иллюстрируют антибиотикообразующую способность штамма Acremonium chrysogenum BKM F-4081D.

Пример №1

Культуру штамма Acremonium chrysogenum BKM F-4081D смывают с агаровой среды, суспензию дезинтегрируют, вносят в колбы Эрленмейера вместимостью 0,75 л, содержащие 0,04 л посевной среды следующего состава, г/л:

дрожжевой экстракт	28,0
пептон (мясной)	10,0
мальт-экстракт	28,3
мел	4,0
рапсовое масло	3,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное.

Значение pH доводят до стерилизации до 7,0-7,1 конц. NaOH.

Инокулюм выращивают 48 часов при 28°С на качалке, делающей 230-240 об/мин. В выросшем посевном мицелии определяют количество биомассы методом центрифугирования при 3000 об/мин 15 мин. Биомасса составляет 28-30 об.%.

Инокулюм в количестве 15 об.% вносят в колбу Эрленмейера вместимостью 0,75 л, содержащую 0,04 л питательной среды следующего состава, г/л:

кукурузный экстракт	93,0
крахмал кукурузный	32,0
Фармамедиа	12
декстрин	43,0
глюкоза	4,0
СаСО3	11,0
(NH4)2SO4	13,5
MgSO4	3,5
KH2PO4	4,0
CuSO4·5H2O	0,017
ZnSO4·7H2O	0,16
MnSO4·7H2O	0,03
FeSO4·7H2O	0,08
масло рапсовое	30,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.

Ферментацию осуществляют на круговой качалке, делающей 230-240 об/мин, первые сутки при 28°С, затем до конца ферментации при 24°С. Содержание цефалоспорина С в культуральной жидкости на 115 часов составляет 15500 мкг/мл.

Пример №2

Для выращивания инокулюма используют среду следующего состава, г/л:

Сахароза	32,0
мясной экстракт	17,0
кукурузный экстракт	6,0
рапсовое масло	3,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН до стерилизации 7,0.

Инокулюм выращивают 48 часов при 28°С на качалке с 230-240 об/мин. Количество биомассы на 48 часов роста составляет 28-29 об.%. Ферментацию проводят как указано в примере №1. Активность культуральной жидкости на 120 часов 15000 мкг/мл.

Пример №3

Инокулюм культуры Acremonium chrysogenum BKM F-4081D выращивают, соблюдая условия культивирования и посевную среду как в примере №1.

Инокулюм в количестве 15% вносят в ферментационную среду следующего состава, г/л:

кукурузный экстракт	105,0
крахмал кукурузный	38,0
Фармамедиа	16,0
декстрин	42,0
глюкоза	4,5
СаСО3	11,0
ситостерин	0,1
(NH4)2SO4	13,5
MgSO4	3,5
KH2PO4	4,0
CuSO4·5H2O	0,017
ZnSO4·7H2O	0,16
MnSO4·7H2O	0,03
FeSO4·7H2O	0,08
масло рапсовое	35,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.

Ферментацию осуществляют согласно примеру №1. Активность культуральной жидкости на 115 часов роста составляет 16000 мкг/мл.

Пример №4

Выращивание инокулюма культуры Acremonium chrysogenum BKM F-4081D и ферментацию осуществляют как в примере 1. Для ферментации используют среду следующего состава, г/л:

кукурузный экстракт	105,0
крахмал кукурузный	38,0
Фармамедиа	16,0
декстрин	43,0
глюкоза	4,0
СаСО3	11,0
фосфатидилхолин	1,0
(NH4)2SO4	13,5
MgSO4	3,5
KH2PO4	4,0
CuSO4·5H2O	0,017
ZnSO4·7H2O	0,16
MnSO4·7H2O	0,03
FeSO4·7H2O	0,08
масло рапсовое	35,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.

Ферментацию осуществляют согласно примеру №1. Активность культуральной жидкости на 115 часов роста составляет 16600 мкг/мл.

Пример №5

Способ ферментации осуществляют согласно примеру №4 с содержанием фосфатидилхолина 2 г/л и рапсового масла 40 г/л. Активность культуральной жидкости на 120 часов ферментации 16400 мкг/мл.

Пример №6

Культуру Acremonium chrysogenum BKM F-4081D для засева ферментационной среды получают согласно примеру №1. Ферментацию проводят как в примере №1 на следующей среде, г/л:

кукурузный экстракт	105,0
крахмал кукурузный	38,0
Фармамедиа	16,0
декстрин	43,0
глюкоза	4,0
СаСО3	11,0
фосфатидилхолин	1,0
ситостерин	0,1
(NH4)2SO4	13,5
MgSO4	3,5
KH2PO4	4,0
CuSO4·5H2O	0,017
ZnSO4·7H2O	0,16
MnSO4·7H2O	0,03
FeSO4·7H2O	0,08
масло рапсовое	40,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.

Содержание цефалоспорина С в культуральной жидкости на 115 часов ферментации составляет 17000 мкг/мл. Содержание дезацетилцефалоспорина С составляет 4,8%.

Пример №7

Вегетативный посевной материал культуры Acremonium chrysogenum ВKМ F-4081D передают в количестве 15 об.% в ферментатор вместимостью 20 л, содержащий 12 л ферментационной среды, состав которой указан в примере №1. Процесс культивирования ведут при следующем режиме: температура 28°С от начала культивирования до 30 часов, а затем 24°С до конца ферментации. Вводимая мощность 4,5 кВт/час. При вспенивании добавляют пеногаситель пропинол Б-400. Аэрацию и перемешивание осуществляют таким образом, чтобы поддерживалась максимальная интенсивность дыхания при избыточном воздушном давлении (0,04±0,01 МПа) и парциальном давлении растворенного кислорода не ниже 30% от насыщения. Значение рН на уровне 5,7±0,2 поддерживают дозированием аммиачной воды и 12%-ных растворов NaOH, (NH₄)₂SO₄ и дозированием рапсового масла. При этом массовая доля аммонийного азота должна быть в пределах 0,04-0,1%, а слой масла на поверхности при определении влажной биомассы методом центрифугирования при 3000 об/мин, в течение 15 минут не превышал 1 мм. Расход масла 9,06% от объема загружаемой среды.

Через 110 часов культивирования активность культуральной жидкости, определенной методом ВЭЖХ, составляет 32000 мкг/мл. Дезацетилцефалоспорин - 4,8%.

Пример №8

Вегетативный посевной материал Acremonium chrysogenum BKM F-4081D передают в количестве 15 об.% в ферментатор вместимостью 20 л, содержащий 12 л ферментационной среды, состав которой указан в примере №6. Процесс культивирования ведут при следующем режиме: температура 28°С от начала культивирования до 25 часов, а затем 24°С до конца ферментации. Значение водородного показателя, массовой доли аммонийного азота, рапсового масла и парциального давления растворенного кислорода поддерживают в пределах, указанных в примере №7. Расход масла 8,0%. Содержание цефалоспорина С на 106 часов ферментации составляет 34000 мкг/мл, дезацетилцефалоспорина С - 4,1%.

Источники информации

1. Elander R.P. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003,v61, №5-6, p.385-392.

2. Shen Y-Q, Heim J., Solomon N.A., Demain A.L. The journal of Antibiotics. May 1984, v.37 n 5, p.503-511.

3. Demain A.L., Vaishnar P. Critical Reviews in Biotechnology, 2006, v 26, n 2, p.67-82.

4. Queener S.W., Ellis L.F. Canadian Journal of Microbiology. 1975, v 21, n 12, p.1981-1996.

5. Патент РФ «Способ биосинтеза цефалоспорина С», №2241038, 27 ноября 2004 г.

Способ биосинтеза цефалоспорина С путем культивирования его продуцента Acremonium chrysogenum на ферментационной питательной среде, содержащей источники углеводов - глюкозу, крахмал кукурузный, декстрин, источники азота - кукурузный экстракт, Фармамедиа, сульфат аммония, а также неорганические соли - фосфорно-кислый калий, серно-кислый калий, мел, серно-кислую медь, серно-кислый цинк, серно-кислый марганец, серно-кислое железо, отличающийся тем, что в качестве продуцента антибиотика используют штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D, а ферментационная среда в качестве растительного жира содержит рапсовое масло и дополнительно фосфатидилхолин и/или ситостерин.