Питательная среда для культивирования клеточной культуры saussurea orgaadayi v. khan. et krasnob

Авторы патента:

C12N5/04 - клетки или ткани растений

C12N5/02 - размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них

Владельцы патента RU 2428472:

Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования "Томский государственный университет" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. Питательная среда содержит KNO₃, NH₄NO₃, СаСl₂6Н₂О, MgSO₄7H₂O, KH₂PO₄, FeSO₄7H₂O, Nа₂ЭДТА2Н₂О, Н₃ВО₃, MnSO₄4H₂O, ZnSO₄7H₂O, KI, Na₂MoO₄2H₂O, CuSO₄5H₂O, CoCl₂6H₂O, никотиновую кислоту, тиамин, пиридоксин, 2,4-Д, БАП, сахарозу, агар-агар и воду при заданных соотношениях компонентов. Изобретение позволяет культивировать клеточную культуру SAUSSUREA ORGAADAYI V. KHAN. ET KRASNOB.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. Область применения - фармацевтическая промышленность, получение нового вида сырья в качестве источника биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения.

В доступных отечественных и зарубежных источниках не заявлена питательная среда для получения и культивирования Saussurea orgaadayi (сем. Asteraceae).

Известны опубликованные работы зарубежных авторов по исследованию и культивированию других видов рода Saussurea.

Виды рода Saussurea обладают широким спектром фармакологической активности и применяются в народной медицине в качестве антибактериальных, гемостатических, общеукрепляющих средств, оказывают противовоспалительное, жаропонижающее и др. действия. Saussurea orgaadayi в отличие от других видов этого рода является также очень редким, ограниченным своим местообитанием эндемиком, и введение данного вида в культуру in vitro может стать перспективной возможностью решения этой проблемы.

Известна питательная среда для выращивания Saussurea medusa. В работе авторы (Chun-Xiang Fu. Cellular aggregate size as the critical factor for flavanoid production by suspension cultures of Saussurea medusa / Chun-xiang Fu, De-Xio Zhao, Yan Huang, Feng-Snan Ma // Biotechnology Letters. 2005. C.91-95.) культивировали каллусную культуру S.medusa на среде MS (Мурасиге и Скуга), содержащей глюкозу (10 г/л), миоинозитол (100 мг/л), НУК (2 мг/л), 6-бензиладенин (0,5 мг/л), в условиях освещения (60 µmol m^-2s^-1) при 25±2°C в течение 9 дней.

Недостатками питательной среды для культивирования клеточной культуры Saussurea medusa является использование, кроме регуляторов роста, дополнительных компонентов, таких как глюкоза и миоинозитол, а в качестве одного из гормонов роста используют синтетический аналог ауксина (НУК) в высоких концентрациях (до 2 мг/л), что делает питательную среду экономично невыгодной.

Известна питательная среда для выращивания Saussurea obvallata. В работе авторы (Uppeandra Dhar. Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea obvallata (DC.) Edgew. (Asteraceae): effect of explant type, age and plant growth regulators / Uppeandra Dhar, Mitali Joshi // Plant Cell Rep (2005) 24:195-200) получили каллусную культуру S.obvallata на среде MS, содержащей бензиладенин (2,5 µМ) в комбинации с НУК (1,0 µM) в течение 30 дней.

Недостатками питательной среды для культивирования клеточной культуры Saussurea obvallata является то, что в качестве гормонов роста используют высокие концентрации бензиладенина (до 2,5 мг/л).

Известна питательная среда для выращивания Saussurea involucrate, выбранная в качестве прототипа. В работе авторы (Jing Ming JIA. Antiinflammatory and Analgesic Activities of the Tissue Culture of Saussurea involucrate // Jing Ming JIA, Chun Fu WU, Wen LIU, Hai YU, Yue HAO, Jian Hua ZHENG, and Yu Rong JI // Biol. Pharm. Bull. (2005) 28(9):1612-1614) получили каллусную культуру S.involucrate от стеблевых и листовых эксплантов на среде MS, содержащей НУК (2,0 мг/л), 6-бензиламинопурин (0,5 мг/л) в условиях 12-часового освещения (58,4 µmol m^-2s^-1) при 24±1°C в течение 4-х недель.

Недостатком питательной среды для культивирования клеточной культуры Saussurea involucrate является то, что в качестве одного из гормонов роста используют синтетический аналог ауксина (НУК) в высоких концентрациях (до 2 мг/л).

Недостатком известных аналогов является их направленность на культивирование видов растений рода Saussurea, отличных от изучаемого: Saussurea orgaadayi, который был впервые введен в клеточную культуру на заявленной питательной среде.

Задачей настоящего изобретения является разработка качественного и количественного состава питательной среды для получения клеточной культуры Saussurea orgaadayi Khan. Et Krasnob. Поставленная задача решается тем, что питательная среда для культивирования каллусной культуры Saussurea orgaadayi Khan. Et Krasnob. характеризуется тем, что она содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:

KNO₃ - 1900

NH₄NO₃ - 1650

CaCl₂6H₂O - 440

MgSO₄7H₂O - 370

KН₂РО₄ - 170

FeSO₄7H₂O - 27,8

Na₂ЭДTA2H₂O - 37,3

H₃BO₃ - 6,2

MnSO₄4H₂O - 22,3

ZnSO₄7H₂O - 8,6

KI - 0,83

Na₂MoO₄2H₂O - 0,25

CuSO₄5H₂O - 0,025

CoCl₂6H₂O - 0,025

Никотиновая кислота - 0,50-0,10

Тиамин - 0,50-0,10

Пиридоксин - 0,50-0,10

2,4-Д - 0,5-1,0

БАП - 0,2-0,8

Сахароза - 30000

Агар-агар - 0,1-6700

Вода - до 1 л.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, хелата железа, витаминов. Макро- и микросоли, хелат железа, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 2,4-Д, БАП, сахарозу и агар и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. Все сосуды с питательными средами закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, скальпель, пинцет стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160°C. Питательные среды после из стерилизации помещают в сосуды для культивирования клеточной культуры в стерильных условиях ламинарного бокса. Клеточную культуру высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 25-27°C и 70%-ной влажности воздуха в условиях непрерывной темноты.

Ниже представлен пример осуществления изобретения.

Пример

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄7H₂O - 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄4H₂O - 22,3 мг/л, ZnSO₄7H₂O - 8,6 мг/л, KI - 0,83 мг/л, Na₂MoO₄2H₂O - 0,25 мг/л, CuSO₄5H₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂6H₂O - 0,025 мг/л), хелата железа (FeSO₄7H₂O - 27,8 мг/л, Na₂ЭДTA2H₂O - 37,3 мг/л), CaCl₂ (CaCl₂6H₂O - 440 мг/л), витаминов (никотиновая кислота - 0,50 мг/л, тиамин - 0,50 мг/л, пиридоксин - 0,50 мг/л). Макро- и микросоли, хелат железа, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют БАП (0,5 мг/л) и 2,4-Д (0,8 мг/л), сахарозу (30000 мг/л), агар (6700 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. Все сосуды (колбы) с питательными средами закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, скальпель, пинцет заворачивают в бумагу, сосуды для культивирования (пробирки, флаконы) закрывают фольгой и стерилизуют в течение 2,5 ч в сухожаровом шкафу при 160°C. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса размещают по культуральным сосудам в условиях ламинарного бокса. Культивирование каллусной культуры проводится при 25-27°C и 70%-ной влажности воздуха в условиях непрерывной темноты. Для сбора биомассы и дальнейшего субкультивирования используется культура 30 суток.

В настоящем изобретении для получения и культивирования клеточной культуры Saussurea orgaadayi Khan. Et Krasnob. применяют среду Мурасиге-Скуга (МС), модифицированную добавлением гормонов роста: 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и БАП (6-бензиламинопурин). Преимущества такого сочетания компонентов в питательной среде таковы, что в качестве оного из гормонов роста - ауксина - используется его синтетический аналог 2,4-Д, который является наиболее сильным по сравнению с другими часто используемыми аналогами (ИУК, НУК), что позволяет добавлять его в довольно небольших количествах. Второй применяемый гормон роста (БАП) также берется в низких концентрациях, что в целом делает питательную среду экономично более выгодной. Именно такой качественный и количественный состав позволил впервые успешно получить и культивировать клеточную культуру Saussurea orgaadayi.

Питательная среда для культивирования каллусной культуры Saussurea orgaadayi V Khan. Et Krasnob., имеющая следующее соотношение компонентов, мг/л:

KNO₃	1900
NH₄NO₃	1650
CaCl₂6H₂O	440
MgSO₄7H₂O	370
KH₂PO₄	170
FeSO₄7H₂O	27,8
Na₂ЭДТА2H₂O	37,3
H₃BO₃	6,2
MnSO₄4H₂O	22,3
ZnSO₄7H₂O	8,6
KI	0,83
Na₂MoO₄2H₂O	0,25
CuSO₄5H₂O	0,025
CoCl₂6H₂O	0,025
никотиновая кислота	0,50-0,10
тиамин	0,50-0,10
пиридоксин	0,50-0,10
2,4-Д	0,5-0,1
БАП	0,2-0,8
сахароза	30000
агар-агар	0,1-6700
вода	до 1 л

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. .

Способ получения "искусственных семян" из культуры корня шлемника байкальского (scutellaria baicalensis georgi) // 2415928

Штамм культивируемых клеток растения женьшеня настоящего pg-1 (panax ginseng c.a. mey) в условиях in vitro - продуцент гинзенозидов // 2415927

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения женьшеня настоящего, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - гинзенозидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности и косметологии.

Способ получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая // 2399666

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения субстанции медицинского препарата - стефаглабрина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая.

Способ получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая // 2399665

Клеточные клоны камбия, способ их выделения и консервации // 2398874

Способ получения алкалоидов // 2394100

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для накопления фармакологически ценных алкалоидов аймалина и йохимбина. .

Питательная среда для культивирования каллусной культуры artemisia annua l. // 2393217

Штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая (stephania glabra (roxb) miers) ифр sg 113 - продуцент стефарина и способ его культивирования в биореакторе // 2377296

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения стефании гладкой, адаптированной к выращиванию в биореакторе, и предназначено для получения при глубинном культивировании штамма ценных биологически активных соединений, в частности стефарина, и может быть использован в фармацевтической промышленности.

Способ создания восстановителей фертильности ярового рапса (brassica napus l.) // 2366705

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения восстановителей фертильности. .

Биотрансплантат, способ его получения и способ лечения заболеваний пародонта // 2418571

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и касается лекарственных средств для восстановления тканей пародонта и устранения послеоперационной ретракции тканей альвеолярных отростков при проведении пародонтологических и имплантологических вмешательств.

Способ определения продукции факторов хоминга стволовых клеток // 2399664

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу определения продукции факторов хоминга стволовых клеток костного мозга, и может быть использовано в клеточной терапии для определения пролиферативно-дифференцировочного статуса стволовых клеток.

Среда для культивирования доимплантационных эмбрионов коз in vitro // 2396344

Изобретение относится к области ветеринарии. .

Активация экспрессии гена костного морфогенетического белка (вмр) в костных клетках посредством электромагнитных сигналов // 2388817

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к устройствам для активации остеогенеза, и может быть использовано в медицине. .

Не содержащая животных белков среда для культивирования клеток // 2383616

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению питательных сред для культивирования клеток, и может быть использовано для значительного снижения вариаций продукции рекомбинантных белков, которые имеют место при культивировании клеток с использованием разных партий коммерчески доступного соевого гидролизата.

Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих // 2377295

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к питательным средам, пригодным для роста и пролиферации клеток млекопитающих и для репродукции в них вирусов, например вируса гриппа.

Способ лечения язвенного проктосигмоидита // 2367450

Изобретение относится к медицине, а именно гастроэнтерологии, и может быть использовано для лечения язвенного проктосигмоидита. .

Генерирование дендритных клеток из моноцитарных предшественников дендритных клеток с помощью gm-csf в отсутствие дополнительных цитокинов // 2364625

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и клеточной биологии. .

Среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированных хондроцитов в хондроциты при повторной дифференцировке // 2355761

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. .

Композиция (варианты), способ и набор для разделения клеток // 2346039

Среда для криоконсервации спермы козлов // 2436299

Изобретение относится к животноводству