Способ получения лимонной кислоты

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения лимонной кислоты предусматривает подготовку конидий штамма гриба-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-696. Для выращивания посевного мицелия готовят питательную среду на основе сахара-песка в присутствии водорастворимого комплекса фуллерена С₆₀ с поливинилпирролидоном в количестве 0,75-1,25 мг на 1 см³ питательной среды с содержанием фуллерена С₆₀ 0,5-0,7%. Выращивают посевной мицелий. Готовят питательную среду на основе сахара-песка для ферментации, засевают питательную среду посевным мицелием с последующей ферментацией. Способ обеспечивает увеличение выхода лимонной кислоты. Выход лимонной кислоты составляет 97,1-98,4%. 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения органических кислот, в частности лимонной кислоты, ферментацией углеводсодержащего сырья погруженной культурой мицелиального гриба Aspergillus niger.

Известен способ получения лимонной кислоты из кристаллического сахара, применяемого в качестве основного сырья, в период становления производства лимонной кислоты в России [Журавский Г.И., Шкопоров А.Н., Краснощеков Д.П. и др. Получение лимонной кислоты глубинным способом брожения в производственных условиях. Пищевые кислоты: Труды ВНИИ кондит. промышленности. М., Пищепромиздат., 1958, с.4-19]. Для роста и кислотообразования гриба Aspergillus niger. штамм 82 (Д) служила среда А₄, в литре которой содержалось 2,5 г нитрата аммония, 0,16 г дигидроортофосфата калия, 0,25 г сульфата магния гидрата, 140-150 г сахара. Среда подкислялась соляной кислотой до рН 3-3,2. Конверсия сахара в лимонную кислоту на такой среде достигала 52% при длительности ферментации 6,5 суток. Низкий выход от сахара следует, по-видимому, отнести за счет малой продуктивности используемого в то время продуцента штамма Aspergillus niger 82 (Д).

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения лимонной кислоты, предусматривающий подготовку конидий штамма гриба-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-696, приготовление питательной среды на основе сахара-песка для выращивания посевного мицелия, выращивание посевного мицелия, приготовление питательной среды на основе сахара-песка для ферментации, засев питательной среды посевным мицелием с последующей ферментацией [Патент РФ, №2078810, С12N 1/14, опубл. 10.05.97. Бюл. №13]. Известный способ позволяет довести конверсию сахаров в лимонную кислоту до 87,6,0% и повысить продуктивность процесса по лимонной кислоте до 23,4 г/(дм³·сутки).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является увеличение выхода лимонной кислоты за счет повышения интенсивности кислотообразования гриба-продуцента.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения лимонной кислоты, предусматривающем подготовку конидий штамма гриба-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-696, приготовление питательной среды на основе сахара-песка для выращивания посевного мицелия, выращивание посевного мицелия, приготовление питательной среды на основе сахара-песка для ферментации, засев питательной среды посевным мицелием с последующей ферментацией, согласно изобретению в питательную среду для выращивания посевного мицелия дополнительно вводят водорастворимый комплекс фуллерена С₆₀ с поливинилпирролидоном в количестве 0,75-1,25 мг на 1 см³ питательной среды с содержанием фуллерена С₆₀ 0,5-0,7%. Введение водорастворимого комплекса С₆₀/ПВП и подбор оптимальных его значений обеспечивает увеличение активности цитратсинтазы - ключевого биокатализатора синтеза лимонной кислоты - в среднем на 28,6% к 3 суткам процесса и тем самым повышает интенсивность кислотообразования и конверсию углеводов в лимонную кислоту на 10,8-12,3%. Водорастворимый комплекс фуллерена С₆₀ с поливинилпирролидоном представляет собой твердое вещество коричневого цвета, растворимое в воде и этаноле. В качестве характеристики комплекса используют данные ультрафиолетовых спектров. При содержании в комплексе фуллерена С₆₀ 0,5-0,7% УФ-спектр комплекса имеет два четко выраженных максимума на длине волны 260 нм и 332 нм и два минимума 242 нм и 310 нм. Для получения комплекса использовали низкомолекулярный медицинский поливинилпирролидон 12600±2700 и фуллерен С₆₀ чистотой 99,9%. Комплекс получен по описанной ранее методике [Пиотровский Л.Б., Козелецкая К.Н., Медведева Н.А., Думпис М.А., Познякова Л.Н., Киселев О.И. Влияние комплексов фуллерена С₆₀ с поливинилпирролидоном на репродукцию вирусов гриппа. Вопросы вирусологии, 2001, №3, с.38-42].

В качестве контроля при определении активности цитратсинтазы был принят известный способ получения лимонной кислоты (прототип).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование Aspergillus niger осуществляют в лабораторных условиях в колбах Эрленмейера вместимостью 750 см³ на качалке АВУ-50Р с числом качаний 160-180 мин^-1. В качестве продуцента используют штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-696.

Подготовку конидий гриба-продуцента осуществляют путем выдерживания их в течение 6 часов в сахарозоминеральной среде следующего состава, г/дм³:

сахар-песок	50,0
нитрат аммония	2,5
дигидрофосфат калия	0,16
сульфат магния семиводный	0,25

Для приготовления питательных сред используют сахар-песок.

Для выращивания посевного мицелия готовят питательную среду следующего состава, г/дм³:

сахар-песок	50,0
нитрат аммония	2,5
дигидрофосфат калия	0,16
сульфат магния семиводный	0,25
меласса свекловичная	17,0

Дополнительно в нее вводят водорастворимый комплекс фуллерена С₆₀ с поливинилпирролидоном с содержанием фуллерена С₆₀ 0,5% в количестве 0,75 г на 1 дм³ питательной среды.

Выращивание посевного мицелия проводят путем засева 50 см³ питательной среды гомогенной суспензией конидий Aspergillus niger. Длительность выращивания мицелия составляет 48 часов.

Для ферментации готовят питательную среду следующего состава, г/дм³:

сахар-песок	150,0
нитрат аммония	2,5
сульфат магния семиводный	0,25
дигидрофосфат калия	0,16

В колбы помещают 50 см³ ферментационной среды, засевают ее 10 см³ посевного мицелия и далее проводят ферментацию при температуре 32°С в течение 5 суток. К 3 суткам процесса активность цитратсинтазы составляет 0,35 мкмоль/см³·мин. За 5 суток ферментации с колбы получено 7,76 г лимонной кислоты, интенсивность биосинтеза лимонной кислоты составила 25,9 г/(дм³·сутки). Выход лимонной кислоты от сахара 97,1%. Данные сведены в таблицу.

Пример 2. Подготовку конидий продуцента, приготовление питательных сред для выращивания посевного мицелия, ферментации, выращивание посевного мицелия, засев питательной среды посевным мицелием, ферментацию проводят аналогично примеру 1. Отличие - в питательную среду для выращивания посевного мицелия вводят водорастворимый комплекс фуллерена С₆₀ с поливинилпирролидоном, содержащий С₆₀ 0,6%, в количестве 1 г на 1 дм³ питательной среды. К 3 суткам процесса активность цитратсинтазы составляет 0,36 мкмоль/см³·мин. В результате по окончании ферментации получено 7,84 г лимонной кислоты, при этом интенсивность биосинтеза лимонной кислоты с 1 дм³ в сутки составила 26,2 г, конверсия сахаров в лимонную кислоту - 98,4%. Данные сведены таблицу.

Пример 3. Все операции предлагаемого способа аналогичны примеру 1. Отличие - содержание фуллерена С₆₀ в комплексе С₆₀/ПВП составляет 0,7% и водорасторимый комплекс вводят в питательную среду для выращивания посевного мицелия в количестве 1,25 г на 1 дм³ среды. К 3 суткам процесса активность цитратсинтазы составляет 0,33 мкмоль/см³·мин. Через 5 суток ферментации с колбы получено 7,82 г лимонной кислоты, интенсивность биосинтеза лимонной кислоты составляет 26,0 г/(дм³·сутки), выход лимонной кислоты от затраченного сахара 97,7%. Данные сведены в таблицу.

Как следует из приведенных данных, применение предлагаемой технологии обеспечивает увеличение активности цитратсинтазы к третьим суткам биосинтеза в среднем на 28,6%, что приводит к повышению интенсивности кислотообразования и к увеличению выхода лимонной кислоты на 10,8-12,3% по сравнению с известным способом, что составляет 97,1-98,4%.

Способ получения лимонной кислоты, предусматривающий подготовку конидий штамма гриба-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-696, приготовление питательной среды на основе сахара-песка для выращивания посевного мицелия, выращивание посевного мицелия, приготовление питательной среды на основе сахара-песка для ферментации, засев питательной среды посевным мицелием с последующей ферментацией, отличающийся тем, что в питательную среду для выращивания посевного мицелия дополнительно вводят водорастворимый комплекс фуллерена С₆₀ с поливинилпирролидоном в количестве 0,75-1,25 мг на 1 см³ питательной среды с содержанием фуллерена С₆₀ 0,5-0,7%.