Способ получения высокоактивных и высокоспецифичных антигенов для диагностики бабезиоза собак в серологических реакциях

Изобретение относится к области ветеринарной протозоологии. Способ включает заражение возбудителем бабезиоза собак, выделение бабезий из крови путем центрифугирования, определение активности в РДСК. В качестве лабораторной модели используют подсосных щенят 3-4-недельного возраста, у которых не сформировалась иммунная система, и которые не контактировали с бабезийными иммуногенами, не спленэктомированных. Заражают их 1,5…2,0 мл инвазированной крови при паразитемии от 25-50%. Обескровливают через 3-4 дня после заражения и получают соматические антигены в титрах от 1:16 до 1:1024. Оставшуюся плазму после получения соматического антигена обрабатывают 20-25% ПЭГ и центрифугируют. Полученный осадок используют как экзоантиген с титром от 1:16 до 1:4096. Полученные антигены обладают высокой активностью и специфичностью, позволяют диагностировать заболевание во время его инкубационного периода. 1 з.п. ф-лы, 6 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной протозоологии, в частности, для получения активных и специфичных антигенов для диагностики бабезиоза собак в серологических реакциях.

Бабезиоз - остро протекающее заболевание собак, вызванное паразитированием в эритроцитах животного простейших из отряда Piroplasmida и сопровождающееся высокой температурой тела, угнетением, анемичностью и желтушностью слизистых оболочек, гемоглобинурией, нарушением сердечной деятельности, и нередко приводящее к летальному исходу (Davis J.W., Anderson R.C. 1971; Jacobson L.S. et al., 1996).

Переносчиками бабезиоза является клещ Dermacentor pictus, Dermacentor marginatus, Rhipicephalus sanguineus, Rhipicephalus turanicus, а за рубежом отмечены клещи: Rhipicephalus sanguineus, Haemaphysalis leachi (Марков A.A. и др. 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S. et al., 1995). Многими исследователями отмечена трансовариальная передача клещами возбудителя бабезиоза, а если учитывать, что восприимчивыми животными к заражению B.canis являются и дикие плотоядные семейства собачьих (Canis) (Якимов В.Л. 1931; Button С, 1979), то они, следовательно, могут служить и природными резервуарами (Henning M.W., 1956). Заболевание обладает ярко выраженной весенней и осенней сезонностью (Sanders D.A., 1937; Matthewman L.A. et al., 1993; Zahler M. et al. 1998). Срок носительства после переболевания отмечен более 130 дней (Botros В.A.M. et al., 1975; Yonamine H.et al., 1984).

Заболевание широко распространено во всех регионах земного шара, чаще в тропической зоне (Марков А.А. и др., 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S.etal., 1995).

Бабезиоз является одним из распространенных заболеваний собак, до сих пор наносящим значительный экономический ущерб служебному собаководству и частным владельцам животных.

За последнее время картина распространения бабезиоза собак сильно изменилась в результате расширения ареала обитания клещей-переносчиков бабезий. Также изменилась и картина клинического проявления болезни, возможно из-за участившегося туризма с собаками. Несмотря на профилактическую обработку против клещей, смертность остается значительной. Это обусловлено отсутствием надежной диагностики при массовом обследовании животных и выявлении природных очагов.

Диагностика бабезиоза собак основана на учете эпизоотического состояния, сезона года, клинических изменений. Решающими в диагностике являются положительные результаты микроскопического исследования мазков крови.

Ограниченные возможности световой микроскопии сдерживают своевременное проведение лечебных и других мер борьбы с болезнью. Трудности в идентификации бабезий и особенно при паразитоносительстве вызвали необходимость изыскивать специфические и более эффективные средства диагностики, такие как серологические.

Известен способ получения бабезийного антигена, применяемого в серологических реакциях, с использованием крови от больного животного, из которой после разрушения эритроцитов выделяют чистые бабезии. Антиген имел продолжительный инкубационный периода и не обладал высокой активностью [1].

В связи с этим перед нами была поставлена задача - разработать способ получения специфичного высокоактивного антигена и сокращения инкубационного периода до выявления заболевания.

Учитывая литературные данные о различной длительности инкубационного периода у зараженных бабезиозом животных в зависимости от дозы введенного возбудителя и способа заражения, мы обратили внимание на факторы, способствующие сокращению инкубационного периода и появлению максимальной паразитемии.

Сущность предложенного способа получении антигенов состоит в следующем.

Для достижения поставленной цели мы использовали интактных, спленэктомированных и подсосных щенят, которых разделили на три группы по три щенка в каждой группе. Для заражения щенят первой группы использовали кровь от больной бабезиозом собаки с невысокой паразитемией. Второй группе щенят ввели по 2 мл крови при паразитемии (19-29%), третьей группе ввели 1 мл крови при паразитемии от 25 до 50%. Через 6-8 дней 4-месячные и через 3-4 дня 3-4-недельные животные были обескровлены для приготовления соматического бабезийного антигена. Способ приготовления антигена представляет собой выделение из крови зараженных животных с помощью центрифугирования бабезий, с последующей 2-3-кратной отмывкой их физиологическим раствором при pH 6,8-7,2. Разрушение инвазированных эритроцитов осуществляем путем 2-3-кратного замораживания их и оттаивания, концентрированием полученного материала и титрацией его в РДСК с положительными и отрицательными сыворотками. Таким образом получают соматический бабезийный антиген для серологической диагностики в РДСК, при этом плазму крови зараженных животных, которая образуется после первого центрифугирования, выбрасывают, а из осадка после соответствующей обработки готовят соматический бабезийный антиген. Титры приготовленных антигенов были в пределах:- от 1:16…1:64 у неспленэктомированных, от 1:16…1:128 у спленэктомированных и от 1:16…1:1024 у подсосных щенят (табл.1..3).

Сравнивая результаты наших опытов, установили, что щенков трех групп можно использовать для получения бабезийного антигена. Однако самый лучший результат можно получить от щенков 3-ей группы, зараженных кровью, взятой от спленэктомированных собак при паразитемии 25 - 50% и обескровленных через 3-4 дня после заражения.

Кроме соматических приготовили и экзоантигены: из крови собак, зараженных B.canis, получают путем однократного центрифугирования (6000 об/ мин в течение 16-25 мин) плазму, которую обрабатывают 20-25% раствором полиэтиленгликоля - 6000, взятого в объеме, равном объему плазмы крови; далее полученную смесь оставляют при комнатной температуре на 13-20 мин, повторно центрифугируют при 6000 об/м 16-25 мин, после чего надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок используют как бабезийный экзоантиген в серологических реакциях.

У щенят первой группы титры экзоантигенов были - от 1:6…1:512 (табл.1). У спленэктомированных щенят экзоантигены не обнаружены (табл.2). У подсосных щенков титры экзоантигенов были очень высокие - от 1:16 до 1:4096 (табл.3).

Таблица 1
Получение антигенов от зараженных бабезиозом неспленэктомированных щенят
Положительная сыворотка B.canis	Соматические	Экзоантигены
	1:16	1:32	1:64	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	БА
	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	-
Отрицательная сыворотка	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Таблица 2
Получение бабезийных антигенов от спленэктомированных щенят
Сыворотки	Антигены
Положительная сыворотка B.canis	Соматические	Экзоантигены
	1:16	1:32	1:64	1:128	1:16	1:32	1:64	1:128	БА
4+	4+	4+	4+	-	-	-	-	-
Отрицательная сыворотка	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Таблица 3
Получение антигенов от зараженных бабезиозом подсосных щенят
Сыворотки	Антигены
Положитель- ная сыворотка B.canis	Соматические	Экзоантигены
	1:128	1:256	1:512	1:1024	1:256	1:512	1:1024	1:2048	1:4096	БА
4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	-
Отрицательная сыворотка	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Сравнивая результаты наших опытов, установили, что щенков трех групп можно использовать для получения бабезийного антигена. Однако самый лучший результат можно получить от щенков 3-ей группы, зараженных кровью, взятой от спленэктомированных собак при паразитемии 25-50% и обескровленных через 3-4 дня после заражения.

Таким образом, для получения высокоактивных соматических и экзоантигенов необходимо использовать кровь от подсосных щенят, зараженных 1,5-2 мл инвазированной крови при паразитемии 25-50%. На 3…4 день после заражения паразитемия у этих щенят достигает 10-15%, а уровень антител становится максимальным. Кровь от спленэктомированных щенят для получения экзоантигенов непригодна.

Результаты наших исследований показали, что титры полученных соматических антигенов и экзоантигенов от подсосных щенят значительно выше чем титры антигенов, полученных от интактных щенков.

Высокие титры 1:16…1:1024 соматических антигенов и 1:16…1:4096 экзоантигенов от подсосных щенков объясняется тем, что у них еще не сформировался иммунитет, и организм не смог выработать адекватный иммунный ответ и тем, что их организм не успел контактировать с бабезийными иммуногенами. Используя таких животных, можно обеспечить получение высокоактивных антигенов.

Бабезийный экзоантиген, приготовленный предложенным способом, испытан на специфичность и чувствительность в РСК (РДСК) с сыворотками крови от собак, больных чумой, трипаносомозом и бруцеллезом (табл.4).

Таблица 4
Определение специфичности в РДСК с бабезийным антигеном
№	Сыворотки	Разведение сывороток	БА
1:5	1:10
1	Положительная сыворотка от больных бруцеллезом собак	Отрицат.	Отрицат.	Отрицат.
2	Положительная сыворотка от больных чумой собак	Отрицат.	Отрицат.	Отрицат.
3	Положительная сыворотка от больных трипаносомозом собак	Отрицат.	Отрицат.	Отрицат.
4	Положительная сыворотка от больных бабезиозом собак	Полож.	Полож.	Отрицат.
5	Положительная сыворотка от больных бабезиозом собак	Полож.	Полож.	Отрицат.
6	Отрицательная	Отрицат.	Отрицат.	Отрицат.
7	Отрицательная	Отрицат.	Отрицат.	Отрицат.

Ни в одном случае эти сыворотки, кроме сывороток от зараженных бабезиозом, не реагировали с растворимыми антигенами B.canis.

Приготовленный предложенным способом бабезийный антиген сравнительно испытан на чувствительность с соматическим антигеном, изготовленным традиционным способом табл.5.

Таблица 5
Сравнительные исследования экзогенного и соматического антигенов B.canis в РДСК
Происхождение сыворотки	Разведение экзогенного антигена	Разведение соматического антигена
1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024	1:2048- 1:4096	1:64	1:128	1:256	1:512	БА
Положительная сыворотка при бабезиозе собак	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	3+	2+	-
-«-	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	3+	2+	-
Отрицательная	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
-«-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Положительная сыворотка при бруцеллезе собак	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Положительная сыворотка при чуме собак	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Положительная сыворотка при трипаносомозе собак	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Сравнительные испытания показали, что экзоантигены по активности превосходят соматические. Надосадочная жидкость, полученная после центрифугирования лизата форменных элементов инвазированной крови, также содержит экзоантигены бабезий (табл.6).

Таблица 6
Сравнительные исследования трех антигенов B.canis, полученных от 3-х групп животных
Происхождение сыворотки	Разведение экзогенного антигена из плазмы крови	Разведение экзогенного антигена из лизата форменных элементов крови	Разведение соматического антигена
1:512	1:1024	1:4096	1:64	1:128	1:256	1:64	1:128		1:512	БА
Положительная сыворотка от больных бабезиозом собак	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	3+	2+	-
-«-	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	3+	2+	-
Отрицательная	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
-«-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Положительная сыворотка от больных бруцеллезом собак	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Положительная сыворотка от больных чумой собак	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Положительная сыворотка от больных трипаносомозом собак	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Титры экзогенного антигена из лизата форменных элементов крови уступают титрам экзогенного антигена, полученного из плазмы, но не соматического антигена бабезий.

Как видно из приведенных сравнительных данных испытания, антиген, полученный предложенным способом, обладает высокой специфичностью и активностью при сокращении инкубационного периода.

Антиген, полученный предложенным способом, апробирован с положительным результатом в серологических исследованиях на бабезиоз собак из разных регионов России 2000-2009 г. Установлено, что бабезионосительство выявлялось в Москве, Перми, Воронеже, Калуге, Оренбурге и в Оренбургской области.

Предложенный способ найдет применение при диагностике бабезиоза собак в частном секторе и собаководческих хозяйствах на границе.

Источники информации

1. Диссертация Георгиу Христофиса на соискание ученой степени доктора биологических наук. М., 1997, стр.58-59.

1. Способ получения высокоактивных и высокоспецифичных антигенов для диагностики бабезиоза собак в серологических реакциях, включающий заражение возбудителем бабезиоза собак, выделение бабезий из крови путем центрифугирования, определение активности в РДСК, отличающийся тем, что в качестве лабораторной модели используют подсосных щенят 3-4-х недельного возраста, у которых не сформировалась иммунная система, и которые не контактировали с бабезийными иммуногенами, не спленэктомированных, заражают их 1,5…2,0 мл инвазированной крови при паразитемии от 25-50%, обескровливают через 3-4 дня после заражения и получают соматические антигены в титрах от 1:16 до 1:1024.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что оставшуюся плазму после получения соматического антигена обрабатывают 20-25% ПЭГ, центрифугируют и полученный осадок используют как экзоантиген с титром от 1:16 до 1:4096.