Гуманизированное антитело против остеопонтина человека

Изобретение относится к области медицины и касается гуманизированного антитела против остеопонтина человека. Сущность изобретения включает гуманизированное антитело против остеопонтина человека, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3. Далее изобретение включает полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область соответственно легкой и тяжелой цепи гуманизированного антитела, экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, клетку-хозяин, лекарственное средство, способ получения гуманизированного антитела, лекарственное средство для лечения аутоиммунного заболевания, способ лечения и применение гуманизированного антитела для получения фармацевтического средства. Преимущество изобретения заключается в создании гуманизированного антитела, обладающего улучшенной активностью (антигенсвязывающая активность, ингибирующая миграцию лейкоцитов, активность и т.п.) и/или стабильностью (устойчивость к действию тепла, условиям с низким рН, денатурирующим средствам и т.п.), чем активность и стабильность стандартных антител против остеопонтина человека. 10 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл. 16 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против остеопонтина человека с очень высокой активностью и стабильностью и способу терапевтического и диагностического применения антитела при различных заболеваниях.

Уровень техники

Остеопонтин (обозначаемый далее в настоящем документе как "OPN") представляет собой кислый кальций-связывающий гликопротеин, находящийся в большом количестве в кости, и, у людей, как известно, вследствие различий в сплайсинге мРНК, представленный по меньшей мере, в трех изоформах: остеопонтин-a (далее в настоящем документе, обозначаемый как "OPN-a"), остеопонтин-b (далее в настоящем документе, обозначаемый как "OPN-b") и остеопонтин-c (далее в настоящем документе, обозначаемый как "OPN-c") (непатентный документ 1). В частности, предшественник OPN-a имеет аминокислотную последовательность, указанную в приведенном ниже списке последовательностей как SEQ ID NO:23, и как полагают, после секреции от последовательности отщепляется сигнальный пептид с образованием зрелой формы OPN-a, состоящей из I17-N314. Зрелая форма OPN in vivo расщепляется тромбином по 168 (в случае OPN-a) остатку аргинина в области C-конца с образованием N-концевого фрагмента и C-концевого фрагмента.

Описанный выше OPN отвечает за большое разнообразие физиологически и патологически важных функций и обладает функциями, например клеточной адгезии, клеточной миграции, онкогенеза, иммунного ответа, ингибирования опосредованного комплементом цитолиза и т.п. Эти разнообразные функции опосредованы широким спектром рецепторов, расположенных на клеточной поверхности. OPN содержит RGD-последовательность (например, для OPN-a, от 159 до 161 остатков); интегрины, которые распознают эту RGD-последовательность, такие как αVβ3, αVβ1 и αVβ5, представляют собой основные рецепторы OPN, из которых интегрины αVβ3, αVβ1 и αVβ5 опосредуют клеточную адгезию в гладкомышечных клетках сосудов; кроме того, αVβ3 связан с миграцией макрофагов, лимфоцитов, эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и т.п.

Кроме того, проведенное до настоящего времени исследование также показало, что OPN связывается с интегринами α9β1, α4β1 и α4β7 через последовательность SVVYGLR (SEQ ID NO:10), а отличие в способе связывания состоит в том, что α4β1 связывается с обоими OPN: нерасщепленным тромбином (нерасщепленный тип OPN) и отщепляемым тромбином N-концевым фрагментом (расщепленный тип OPN), тогда как α9β1 связывается только с расщепленным типом OPN (непатентные документы от 2 до 4). Эти субъединицы интегринов α9 и α4, и β1, и β7 очень схожи друг с другом по аминокислотной последовательности. Интегрины α4β1 и α4β7 в основном находятся в лимфоцитах и моноцитах, но очень низкий уровень экспрессии отмечается и в нейтрофилах. С другой стороны, α9β1 селективно экспрессируется на высоком уровне в нейтрофилах и ответственен за жизненно важные функции миграции нейтрофила посредством VCAM-1, Тенасцина-C и т.п. Вариант α9β1 широко экспрессируется в миоцитах, эпителиальных клетках, гепатоцитах и т.п. Таким образом, полагают, что цитоплазматические домены субъединиц α4 и α9 интегринов через соответствующие незначительно отличающиеся внутриклеточные пути передачи сигнала вовлечены в различные воспалительные реакции путем совместной стимуляции миграции и агрегации лейкоцитов к очагам воспаления для усиления их инфильтрационной активности.

Как описано выше, вследствие того, что большое разнообразие интегринов стимулируют миграцию лейкоцитов и вовлечены в воспалительные реакции, полагают, что лекарства, ингибирующие эти виды активности интегринов могут крайне эффективно использоваться в качестве противовоспалительных средств. Например, интегрин αVβ3 экспрессируется в остеокластах, эндотелиальных клетках сосудов, гладкомышечных клетках и т.п.; так как полагают, что ингибирование связывания интегрина с различными связывающимися лигандами оказывает супрессирующее действие на разрушение суставов, например, в суставах, постоянно продолжается разработка антител против αVβ3.

Тем не менее, так как экспрессия рецепторов, принадлежащих семейству интегринов, является универсальной представлена в большом числе тканей и ответственна за жизненно важные функции для поддержания различных видов биологической активности, то применение антител против интегрина при лечении ревматоидного артрита или остеоартрита может вызывать аналогичное ингибирование в других участках, а также представлять интерес с точки зрения побочных реакций.

С этой точки зрения, до настоящего времени были предприняты попытки прояснить этиологию ревматоидного артрита, остеоартрита и т.п. и обеспечить нам лучший терапевтический подход.

Например, в WO 02/081522 (патентный документ 1) обнаружено, что у пациентов с ревматизмом и у пациентов с остеоартритом отмечается высокая концентрация OPN в жидкости суставной полости, а у пациентов с ревматизмом наблюдали увеличенное отношение отщепляемого тромбином типа N-концевого фрагмента по сравнению с общим OPN, и подтверждено, что OPN непосредственно связан с возникновением этих заболеваний. В патентном документе 1 получены антитела, которые по отдельности распознают N-концевой фрагмент и C-концевой фрагмент, образовавшиеся в результате расщепления OPN тромбином, соответственно, и в исследовании с их использованием показано, что у пациентов с ревматоидным артритом отмечаются высокие концентрации отщепляемого тромбином N-концевого фрагмента в суставной полости, в частности. В таком N-концевом фрагменте одновременно присутствуют последовательность RGD и последовательность SVVYGLR (SEQ ID NO:10), обе распознаваемые типами интегринов человека; подтверждено, что антитело, которое одновременно блокирует эти две последовательности, значительно ингибирует связывание OPN и интегрина и эффективно для лечения ревматоидного артрита, остеоартрита и т.п.

В частности, в патентном документе 1 получено антитело, которое ингибирует связывание последовательности RGD OPN человека и интегрина и связывание последовательности SVVYGLR OPN человека (SEQ ID NO:10) и интегрина, и его действие подтверждено в экспериментах на клеточной адгезии, клеточной миграции и т.п. Кроме того, получено антитело против синтетического пептида, соответствующего внутренней последовательности OPN мыши, и его эффект, в качестве терапевтического лекарственного средства подтвержден с применением патологической модели артрита на мышах.

Таким образом, поскольку OPN мыши содержит последовательность RGD и последовательность SLAYGLR (SEQ ID NO:12), каждая из которых распознается интегрином мыши, в положениях на аминокислотной последовательности, гомологичным положениям OPN человека, то антитело M5 получено как антитело, одновременно блокирующее эти последовательности. Подтверждено, что связывание этого антитела M5 с OPN мыши и его отщепляемым тромбином продуктом ингибируется пептидом GRGDSP, который содержит RGD последовательность, и что это антитело M5 ингибирует миграцию активированных TNF-α моноцитов, выделенных из селезенки мыши. Когда, используя систему органной культуры свода черепа мыши, исследовали это антитело M5, наблюдали супрессирующее действие на разрушение кости. Кроме того, когда описанное выше антитело использовали на модели коллагенового артрита у мышей, был подтвержден выраженный терапевтический эффект (патентный документ 1 и непатентный документ 5).

Эти результаты убедительно указывают на то, что антитело, которое одновременно блокирует связывание последовательности RGD и типом интегрина человека, и последовательности SVVYGLR (SEQ ID NO:10) и типом интегрина человека, ингибирует связывание OPN и интегрином и является эффективным для лечения ревматоидного артрита и т.п., и, кроме того, показывают, что можно ожидать, что антитело будет эффективным не только при лечении таких форм ревматизма, как ювенильный ревматоидный артрит и хронический ревматизм, но также при лечении псориатического артрита и псориаза. Хроническое отторжение трансплантата после трансплантации органа характеризуется обструктивными очагами поражения кровеносных сосудов и бронхиол; на основании их гистологического исследования было сделано предположение, что так как активация T-клеток и макрофагов вызывает продукцию цитокинов и факторов роста и повреждение эндотелиальных клеток сосудов, а также основываясь на том, что рост гладких мышц сосудов служит причиной фиброза и т.п., состояние прогрессирует до обструкции сосудов (непатентные документы от 6 до 8).

Опубликовано, что OPN действует как важнейший белок для активации макрофагов и гладкомышечном сосудистом фиброзе (непатентный документ 9); ингибирующее OPN антитело может супрессировать процесс, приводящий к фиброзу, подавляя миграцию моноцитов и нейтрофилов. Таким образом, предполагают, что антитело супрессирует хроническое отторжение трансплантата после трансплантации органа, способствуя приживлению органов, и является эффективным при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как системное аутоиммунное заболевание, эритематоз, увеит, болезнь Бехчета, дерматомиозит, гломерулопролиферативный нефрит и саркоидоз. Также подтверждено, что уровень экспрессии OPN возрастает при различных злокачественных опухолях и, что OPN способствует развитию злокачественных опухолей и метастазированию (непатентные документы от 10 до 12) и, что рост и метастазирование злокачественных клеток супрессируется антителом против OPN (патентный документ 3, непатентный документ 13). Таким образом, полагают, что антитело против OPN также может быть эффективно при лечении различных злокачественных опухолей.

В WO 03/027151 (патентный документ 2) описано химерное антитело против остеопонтина человека, содержащее вариабельную область антитела 2K1 мыши против остеопонтина человека, описанного в патентном документе 1, и константную область антитела человека; и гуманизированное антитело против остеопонтина человека, содержащее определяющую комплементарность область антитела 2K1 и каркасную область и константную область антитела человека.

Тем временем, на рынке доступно большое число моноклональных антител для лечения, включая антитела для лечения злокачественных опухолей (например, ритуксимаб, трастузумаб, бевацизумаб), антител для лечения ревматизма (например, инфликсимаб, адалимумаб), антител для супрессии отторжения трансплантата (например, муромонаб, базиликсимаб) и т.п.

Благодаря их основным свойствам высокой специфичности и безопасности полагают, что изучение и разработка препаратов моноклональных антител, в частности, предназначенных для широкого спектра заболеваний, для которых затруднено создание низкомолекулярных терапевтических лекарственных средств, будет ускорено.

С другой стороны, наибольшей проблемой, стоящей при разработке таких фармацевтических средств на основе антител, является производство антител. Как правило, клинические дозы моноклональных антител, выпущенных на рынок, представляют собой величины порядка нескольких мг/кг, так что необходимы значительные производственные затраты.

По этой причине, выбор антитела, демонстрирующего очень высокую активность, из антител со сходной активностью, антитела с высоким уровнем экспрессии и высокой стабильностью, является крайне важным требованием для фактического применения в качестве фармацевтического средства на основе антитела.

Патентный документ 1: Техническая инструкция для международной патентной публикации No. WO 02/081522.

Патентный документ 2: Техническая инструкция для международной патентной публикации No. WO 03/027151.

Патентный документ 3: Техническая инструкция для международной патентной публикации No. WO 06/043954.

Непатентный документ 1: Y. Saitoh et al., (1995): Laboratory Investigation, 72, 55-63.

Непатентный документ 2: Y. Yokosaki et al., (1999): The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334.

Непатентный документ 3: P.M. Green et al., (2001): FEBS Letters 503, 75-79.

Непатентный документ 4: S.T. Barry et al., (2000): Experimental Cell Research 258, 342-351.

Непатентный документ 5: Yamamoto et al., (2003): The Journal of Clinical Investigation, 112, 181-188.

Непатентный документ 6: P. Freese et al., (2001): Nephrology, dialysis, transplantation, 16, 2401-2406.

Непатентный документ 7: J.R. Waller et al., (2001): British Journal of Surgery, 88, 1429-1441.

Непатентный документ 8: S.R. Lehtonen et al., (2001): Transplantation, 72, 1138-1144.

Непатентный документ 9: A. O'Regan et al., (2000): International Journal of Experimental Pathology, 81, 373-390.

Непатентный документ 10: G. F. Weber, (2001): Biochimica et Biophysica Acta, 1552, 61-85.

Непатентный документ 11: H. Rangaswami et al., (2006): TRENDS in Cell Biology 16, 79-87.

Непатентный документ 12: S.S. Forootan et al., (2006): Int. J. Cancer: 118, 2255-2261.

Непатентный документ 13: Z. Hu et al., (2005): Clin. Cancer Res. 11 4646-4652.

Описание изобретения

Задачи, решаемые изобретением

Настоящее изобретение было создано с учетом описанных выше обстоятельств, и относится к гуманизированному антителу против остеопонтина человека с улучшенной активностью (антигенсвязывающая активность, ингибирующая миграцию лейкоцитов активность и т.п.) и/или стабильностью (устойчивость к действию тепла, условиям с низким pH, денатурирующим средствам и т.п.), по сравнению с активностью и стабильностью стандартных антител против остеопонтина человека. Авторы настоящего изобретения провели глубокие исследования с целью усовершенствования объекта и им удалось создать гуманизированное антитело против остеопонтина человека с такими характеристиками.

Способы решения проблем

Таким образом, объектами настоящего изобретения являются:

(1) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3.

(2) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, описанное в (1) выше, где константная область тяжелой цепи антитела представляет собой Igγ1 человека.

(3) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, описанное в (1) выше, где константная область легкой цепи антитела представляет собой Igκ человека.

(4) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, описанное в (1) выше, где константная область тяжелой цепи антитела представляет собой Igγ1 человека, а константная область легкой цепи антитела представляет собой Igκ человека.

(5) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:25, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27.

(6) Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанного выше в (1).

(7) Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанного выше в (1).

(8) Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, описанный выше в (6) и/или (7).

(9) Клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор, описанный выше в (8).

(10) Способ получения гуманизированного антитела против остеопонтина человека, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, описанную выше в (9), позволяющей клетке экспрессировать гуманизированное антитело против остеопонтина человека.

(11) Терапевтическое лекарственное средство для аутоиммунного заболеваниия, ревматизма, ревматоидного артрита или остеоартрита, содержащее гуманизированное антитело против остеопонтина человека, описанное выше в любом из пунктов с (1) по (5).

(12) Способ профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, ревматизма, ревматоидного артрита или остеоартрита, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанного выше в любом из пунктов с (1) по (5).

(13) Применение гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанного выше в любом из пунктов с (1) по (5), для получения фармацевтического средства для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, ревматизма, ревматоидного артрита или остеоартрита.

Результат изобретения

Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против остеопонтина человека, обладающего улучшенными видами активности (антигенсвязывающая активность, ингибирующая миграцию лейкоцитов активность и т.п.) и/или стабильностью (устойчивость к действию тепла, условиям с низким pH, денатурирующим средствам и т.п.) по сравнению с активностью и стабильностью стандартных антител против остеопонтина человека. Обладая этими свойствами, антитело по настоящему изобретению является подходящим для профилактики или лечения различных воспалительных заболеваний, включающих аутоиммунное заболевание, ревматизм, ревматоидный артрит и остеоартрит.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность (верхний ряд: SEQ ID NO:15) и аминокислотная последовательность (нижний ряд: SEQ ID NO:16) соответствующая ДНК, содержащей кодирующую область R2K1-VH1.7, встроенную в вектор (подчеркнутый участок представляет собой лидерную последовательность для секреторной экспрессии).

На фиг.2 представлена нуклеотидная последовательность (верхний ряд: SEQ ID NO:17) и аминокислотная последовательность (нижний ряд: SEQ ID NO:18) соответствующая ДНК, содержащей кодирующую область R2K1-VH1.8, встроенную в вектор (подчеркнутый участок представляет собой лидерную последовательность для секреторной экспрессии).

На фиг.3 представлена нуклеотидная последовательность (верхний ряд: SEQ ID NO:19) и аминокислотная последовательность (нижний ряд: SEQ ID NO:20) соответствующая ДНК, содержащей кодирующую область R2K1-VL1.7, встроенную в вектор (подчеркнутый участок представляет собой лидерную последовательность для секреторной экспрессии).

На фиг.4 представлена нуклеотидная последовательность (верхний ряд: SEQ ID NO:21) и аминокислотная последовательность (нижний ряд: SEQ ID NO:22) соответствующая ДНК, содержащей кодирующую область R2K1-VL1.8, встроенную в вектор (подчеркнутый участок представляет собой лидерную последовательность для секреторной экспрессии).

На фиг.5 представлены результаты анализа связывания химерного антитела 2K1 и гуманизированного антитела 2K1 с пептидом hOPN5 способом ELISA.

На фиг.6 представлены результаты анализа связывания химерного 2K1 антитела и гуманизированного 2K1 антитела, подвергнутых термообработке при 70°C, с пептидом hOPN5 способом ELISA. Соотношение к способности связывания без термической обработки взято за 100%.

На фиг.7 представлены результаты анализа связывания химерного 2K1 антитела и гуманизированного 2K1 антитела, обработанных буфером при pH 5, с пептидом hOPN5 способом ELISA. Соотношение к способности связывания без обработки буфером при pH 5 взято за 100%.

На фиг.8 представлены данные диаграммы спектральных пиковых длин волн флуоресценции химерного 2K1 антитела и гуманизированного 2K1 антитела, обработанных буфером, содержащим разные концентрации гуанидин гидрохлорида.

На фиг.9 представлены результаты измерения содержания случайных структур в химерном 2K1 антителе и гуманизированном 2K1 антителе, обработанных буфером с разными уровнями pH, посредством CD.

Фиг.10 представляет собой иллюстрацию, представляющую результаты анализа термостойкости химерного антитела 2K1 и гуманизированного антитела 2K1 с использованием сверхчувствительного дифференциального сканирующего калориметра. Пунктирная стрелка и сплошная стрелка обозначают Tm химерного антитела 2K1 и антитела R2K1v1.7, соответственно.

На фиг.11 представлено ингибирующее клеточную адгезию действие R2K1v1.7 и R2K1v0 на OPN человека.

На фиг.12 представлено воздействие R2K1v1.7 на опухание суставов при индуцированном коллагеном артрите у обезьяны. Данные представлены в виде среднего ± SE для 8 животных, 7 животных и 5 животных в контрольной группе, группы с дозированием 25 мг/кг и группы с дозированием 50 мг/кг, соответственно. *p<0,05, **p<0,01: достоверно отличаются от контрольной группы, что определено с помощью критерия множественного сравнения Даннета.

На фиг.13 представлены результаты анализа очищенного ВЭЖХ R2K1v1.7-scFv.

На фиг.14 представлены результаты анализа связывания очищенного R2K1v1.7-scFv с пептидом hOPN5 способом ELISA.

На фиг.15 представлены результаты электрофореза полноразмерной молекулы антитела типа R2K1v1.7 и F(ab')₂ и очищенного F(ab')₂-ПЭГ антитела R2K1v1.7 в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

На фиг.16 представлены результаты анализа способности связывания F(ab')₂-PEG R2K1v1.7 с пептидом hOPN5 посредством BIAcore.

Наилучший способ осуществления изобретения

Ниже подробно описано настоящее изобретение.

Авторы настоящего изобретения провели глубокие исследования для решения описанных выше проблем, относительно стандартных антител против остеопонтина человека, и им удалось создать гуманизированное антитело против остеопонтина человека, обладающего улучшенными видами активности и/или стабильностью, чем активность и стабильность химерного антитела 2K1 и гуманизированного антитела 2K1, описанных в WO 03/027151 (патентный документ 2).

Основная структура молекулы антитела общая у всех классов и состоит из тяжелой цепи, имеющей молекулярную массу от 50000 до 70000, и легкой цепи, имеющей молекулярную массу от 20000 до 30000. Тяжелая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 440 аминокислот; тяжелые цепи обладают структурными характеристиками разных классов и называются γ, µ, α, δ и ε цепи, соответствующие IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Кроме того, IgG встречается как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и соответствующие цепи называются γ1, γ2, γ3 и γ4, соответственно. Легкая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 220 аминокислот; известны два типа, тип L и тип K и называются цепи λ и κ, соответственно. Что касается пептидной конфигурации основной структуры молекулы антитела, две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи связаны дисульфидной связью (S-S связь) и нековалентными связями, а молекулярная масса составляет от 150000 до 190000. Два вида легких цепей способны образовывать пары с любой тяжелой цепью. Каждая молекула антитела всегда состоит из двух одинаковых легких цепей и двух одинаковых тяжелых цепей.

В тяжелой цепи находятся четыре (пять для µ и ε цепей), а в легкой две, внутримолекулярные S-S связи; одна петля образована аминокислотными остатками в количестве от 100 до 110, и эта стерическая структура одинакова для всех петель и называется структурной единицей или доменом. Аминокислотная последовательность домена для обеих тяжелых цепей и легких цепей, расположенная на их N-концах, является непостоянной, даже в стандартном образце одного и того же класса (подкласса) у животных одного вида, и этот домен называется вариабельной областью (V-область, вариабельная область) (домены обозначают как V_H и V_L, соответственно). Аминокислотная последовательность на ее C-конце в каждом классе или подклассе практически постоянна и называется константной областью (C-область, константная область) (домены обозначают как C_H1, C_H2, C_H3 и C_L, соответственно).

Антигенраспознающий участок антитела состоит из V_H и V_L, а специфичность связывания зависит от аминокислотной последовательности этого участка. С другой стороны, такие виды биологической активности, как связывание с компонентами комплемента или различными клетками отражает различия в структуре С-области среди различных классов Ig. Выявлено, что вариабельность вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи практически ограничена тремя небольшими гипервариабельными областями, имеющимися у обеих цепей, и эти области называются CDR (определяющая комплементарность область). Оставшаяся часть вариабельной области называется каркасной областью и является относительно постоянной. Как правило, антигенсвязывающий участок образуют только 5-10 аминокислот или в определяющей комплементарность области каждой из вариабельных областей.

В настоящем описании антитело с вариабельной областью, полученной из антитела мыши (также обозначаемое как гетерологичное донорное антитело) в качестве реагирующей с антигеном вариабельной области, и константной областью, полученной из антитела человека в качестве константной области, обозначают как химерное антитело; химерное антитело, которое распознает остеопонтин и его фрагменты, обозначают как химерное антитело против остеопонтина. Рекомбинантное антитело, полученное заменой всех областей, за исключением определяющей комплементарность области (антигенсвязывающий участок) антигенспецифичной молекулы антитела млекопитающего, не являющегося человеком (например, мыши) обозначают как гуманизированное антитело. Включенными в гуманизированные антитела являются антитела с аминокислотными модификациями (замена, инсерция, делеция, добавление), сделанными в его каркасной области, подобно антителу настоящего изобретения.

В основном, известно, что при получении гуманизированного антитела, когда аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области только прививают на матрицу каркаса антитела человека, во многих случаях антигенсвязывающая активность снижается по сравнению с антигенсвязывающей активностью исходного антитела мыши. Подтверждено, что описанное выше гуманизированное антитело 2K1 обладает крайне низкой ингибирующей клеточную адгезию OPN активностью и, в результате чего, таким образом, не подходит для использования в качестве фармацевтического средства на основе антитела, несмотря на то, что оно связывается с пептидами OPN (пример 9 ниже).

Авторы настоящего изобретения провели глубокие исследования в отношении уменьшения снижения активности в гуманизированных антителах и получения гуманизированного антитела с улучшенной стабильностью, которое можно использовать в качестве фармацевтического средства на основе антитела, и установили, что гуманизированное антитело человека против остеопонтина, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, обладало значительно улучшенной активностью и/или улучшенной стабильностью с точки зрения различных индексов стабильности, по сравнению со стандартными химерными и гуманизированными антителами против остеопонтина человека. По существу, гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению получали посредством внесения модификаций по некоторым аминокислотам в каркасных областях тяжелой цепи и легкой цепи матрицы антитела человека, и содержит последовательность каркасной области отличную от последовательности стандартного гуманизированного антитела против остеопонтина человека, полученного только посредством включения определяющей комплементарность области (патентный документ 2).

Специалисты в данной области могут легко получить гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению на основании приведенной в настоящем документе информации о последовательности его вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи с использованием общеизвестного в данной области способа. В частности, получают генный фрагмент вариабельной области тяжелой цепи с последовательностью оснований, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению (SEQ ID NO:1), и генный фрагмент вариабельной области легкой цепи с последовательностью оснований, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела по настоящему изобретению (SEQ ID NO:3). Затем для получения гена гуманизированного антитела, гены вариабельной области соединяют с геном константной области соответствующего класса антитела человека. После этого, этот ген гуманизированного антитела встраивают в подходящий экспрессирующий вектор и вводят в культивируемую клетку. В заключение, культивируемую клетку культивируют, в результате чего гуманизированное антитело можно выделить из супернатанта культуры.

Каждый из описанных выше генных фрагментов вариабельной области, который кодирует аминокислоты вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи по настоящему изобретению антитела (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3), может быть получен, например, получая генный фрагмент, который кодирует вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, соответственно, гуманизированного антитела 2K1, описанного в WO 03/027151, описанным в документе способом, и индуцируя мутации в указанном участке генного фрагмента, который кодирует каркасную область гуманизированного антитела 2K1. Для индукции мутации в указанном участке в каркасной области, специалисты в данной области могут использовать разные очевидные способы, такие как сайт-специфический мутагенез (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 8.1-8.5). Альтернативно, генные фрагменты вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи антитела по настоящему изобретению также можно синтезировать на основе последовательностей оснований, сконструированных на основе аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3), или на основе последовательностей оснований вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела по настоящему изобретению, представленных в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:7, общеизвестным в данной области способом генного синтеза. В качестве способа генного синтеза антитела можно использовать различные способы, известные специалистам в данной области, такие как способы генного синтеза антител, описанные в WO 90/07861.

Затем для получения гена гуманизированного антитела соединяют описанные выше генные фрагменты вариабельной области и ген константной области антитела человека. Хотя, в качестве константной области используемого антитела человека можно выбрать любой подкласс константной области, предпочтительно, в качестве константной области тяжелой цепи можно использовать Igγ1 человека, а в качестве константной области легкой цепи можно использовать Igκ человека.

После получения данного гена гуманизированного антитела можно проводить встраивание гена гуманизированного антитела в экспрессирующий вектор, введение экспрессирующего вектора в культивируемые клетки, культивирование культивируемых клеток, очистку антитела и т.п. различными общеизвестными в данной области способами или со ссылкой на способы получения химерного антитела против остеопонтина человека или гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанные в WO 02/081522 или WO 03/027151. В качестве экспрессирующего вектора для встраивания полученного таким образом гена гуманизированного антитела можно использовать экспрессирующие векторы, описанные в International Patent Publication Official Gazette WO94/20632, такие как AG-γ1 и AG-κ, но экспрессирующий вектор не является ограничением, при условии, что он способен экспрессировать ген гуманизированного антитела. Предпочтительно использовать экспрессирующий вектор, который уже обладает геном константной области Ig человека, такой как AG-γ1 или AG-κ, так как он может стать экспрессирующим ген гуманизированного антитела вектором только при встраивании в него гена вариабельной области гуманизированного антитела.

Описанный выше экспрессирующий вектор вводят в культивируемые клетки, например, способом с использованием фосфата кальция и т.п.

В качестве примеров культивируемых клеток, в которые вводят экспрессирующий вектор, можно использовать такие культивируемые клетки, как клетки CHO-DG44, и их можно культивировать стандартным способом.

После описанного выше культивирования, антитело, накопленное в супернатанте культуры, можно очистить, например, различными способами хроматографии с использованием колонок с белком A.

Антигенную активность полученного таким образом гуманизированного антитела против остеопонтина человека, можно измерить, например, посредством ELISA, используя пептид OPN и т.п., как описано в примере ниже, BIACore (BIAcore Company) и т.п. Ингибирующую миграцию лейкоцитов активность гуманизированного антитела против остеопонтина человека можно измерить, например, культивируя моноциты периферической крови человека в присутствии тестируемого антитела и OPN или отщепляемого тромбином типа OPN, как описано в примере ниже. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению обладает биологической активностью ингибирования активированной цитокином (например, TNF-α) миграции моноцитов периферической крови человека в направлении отщепляемого тромбином типа OPN.

Затем полученное таким образом гуманизированное антитело против остеопонтина человека тестируют в отношении различных индексов стабильности. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению демонстрирует следующие индексы стабильности (от A) до D)):

A) Демонстрирует термостабильность, где активность связывания с пептидом, содержащим последовательность SVVYGLR (SEQ ID NO:10), после термической обработки в PBS при 70°C в течение 2 часов, составляет не менее чем 90% от активности связывания без термической обработки.

B) Средняя температура перехода (Tm) по меньшей мере на 5°C выше, чем средняя температура перехода химерного антитела с вариабельной областью, полученной из донорного гетерологичного антитела, и константной областью, полученной из антитела человека.

C) Обладает устойчивостью к гуанидин гидрохлориду при концентрациях, выше, по меньшей мере на 0,5 M, чем концентрации для химерного антитела с вариабельной областью, полученной из донорного гогетерологичного антитела, и константной областью, полученной из антитела человека.

D) Обладает устойчивостью к уровням pH, по меньшей мере на 0,3 меньше чем уровни pH для химерного антитела с вариабельной областью, полученной от донорного гетерологичного антитела, и константной областью, полученной от антитела человека.

В данном случае описанные выше индексы A) и B) являются индексами устойчивости к нагреванию; если у антитела улучшены показатели этих индексов, это более важно с точки зрения стабильности при долговременном хранении и лекарственной формы. То есть с препаратом антитела часто возникают трудности в отношении стабильности при хранении, так как он является белком, поэтому иногда его получают путем получения лиофилизата (это является трудным с точки зрения применимости в условиях медицинской практики, так как во время использования он должен быть растворен; в частности, препарату белка для растворения часто требуется более 30 секунд, что, в свою очередь, в условиях медицинской практики часто является затруднительным); однако любое антитело с хорошей устойчивостью к нагреванию можно хранить даже в растворе, обеспечивая долговременную стабильность при замораживании в течение 2 или более лет. Фактически, R2K1v1.7, гуманизированному антителу против остеопонтина человека по настоящему изобретению, описанному в примере ниже, обеспечена стабильность даже при комнатной температуре (25°C) в течение приблизительно 1 года. Если возможно получение раствора, то это делает возможным получение более подходящих препаратов в виде предварительно наполненных шприцев и т.п. Антитело с высокой устойчивостью к нагреванию, которое удовлетворяет описанным выше индексам, предполагает более широкую вариативность в получении препарата и делает возможным создание препаратов, удовлетворяющих более значимым терапевтическим потребностям, и увеличивает возможность выбора.

Описанный выше индекс C) представляет собой индекс устойчивости к действию солей; антитело с такой устойчивостью к действию солей позволяет провести исследование более предпочтительной формулы для создания фармацевтического препарата. В частности, этот индекс пригоден для предварительно наполненных шприцев, так как высокие концентрации солей часто используют при получении препарата белкового вещества с высокой концентрацией, такой как от 100 до 200 мкг/мл.

Описанный выше индекс D) представляет собой индекс, имеющий отношение к устойчивости антитела к pH; антитело с такой устойчивостью к pH позволяет проводить лечение при более низких уровнях pH на стадии вирусной инактивации способа получения и очистки антитела, и, таким образом, является пригодным. По этой причине, основным преимуществом может быть наличие устойчивости к pH приблизительно на 0,3 меньше, чем устойчивость к pH стандартных антител.

Ниже описан способ тестирования для индекса A). Сначала тестируемое гуманизированное антитело против остеопонтина человека разводили в PBS (предпочтительно 50 мкг/мл) и подвергали термообработке при 70°C в течение 2 часов. После этого, температуру раствора возвращали к комнатной и измеряли активность связывания антитела с пептидом, содержащим последовательность SVVYGLR (SEQ ID NO:10) с помощью, например, способа ELISA Kon et al. (Journal of Cellular Biology, 88: 420-432 (2002)). Активность связывания данного подвергнутого термической обработке антитела сравнивают с активностью связывания такого же антитела, но измеренного без термической обработки. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению, подвергнутое такой термической обработке, демонстрирует активность связывания с пептидом, содержащим последовательность SVVYGLR (SEQ ID NO:10), не менее чем 90% от активности связывания того же, но необработанного антитела. Предпочтительно, пептид, содержащий последовательность SVVYGLR (SEQ ID NO:10), используемый в данном тестировании индекса, представляет собой пептид остеопонтина с последовательностью CVDTYDGRGDSVVYGLRS (SEQ ID NO:13).

Ниже описан способ тестирования для индекса B). Сначала тестируемое гуманизированное антитело против остеопонтина человека и химерное антитело 2K1, описанное в WO 03/027151 (C2K1), уравновешивают с использованием подходящего буферного раствора (предпочтительно 20 мМ цитратный буфер + 120 мМ NaCl (pH 6,0)), и оценивают устойчивость к нагреванию, используя дифференциальный сканирующий калориметр (предпочтительно VP capillary DSC platform of MicroCal Company). Средняя температура перехода (Tm), которая показывает температуру разрушения гуманизированного антитела против остеопонтина человека по настоящему изобретению, по меньшей мере, на 5°C выше, чем средняя температура перехода C2K1.

Ниже описан способ тестирования для индекса C). Сначала тестируемое гуманизированное антитело против остеопонтина человека и описанное выше химерное антитело 2K1 (C2K1) растворяют в буферном растворе, содержащем гуанидин гидрохлорид в разных концентрациях от 0 до 5 M (предпочтительно 20 мМ фосфата натрия + 120 мМ раствора NaCl (pH 7,0)), и растворы доводят до подходящей концентрации (предпочтительно 50 мкг/мл). Затем каждому образцу раствора позволяют находиться при 10°C в течение ночи, после чего измеряют спектр флуоресценции каждого образца. В частности, флуоресценцию, излучаемую триптофаном при возбуждающем свете 280 нм, сканируют в диапазоне длин волн от 320 нм до 370 нм. Пиковая длина волны сдвигается вследствие потери пространственной структуры белка под действием гуанидин гидрохлорида. Концентрацию гуанидин гидрохлорида для сдвига пиковой длины волны измеряют для каждого из тестируемых антитела и химерного антитела. Для гуманизированного антитела против остеопонтина человека по настоящему изобретению, концентрация гуанидин гидрохлорида для сдвига пиковой длины волны, описанной выше, по меньшей мере, приблизительно на 0,5 M выше, чем концентрация гуанидин гидрохлорида для сдвига пиковой длины волны C2K1.

Ниже описан способ тестирования для индекса D). Сначала, тестируемое гуманизированное антитело против остеопонтина человека и описанное выше химерное антитело 2K1 (C2K1) доводят с использованием подходящего буферного раствора (предпочтительно 20 мМ цитратный буфер + 120 мМ NaCl (pH 6,0)) (предпочтительно 2 мг/мл), и, при добавлении к нему кислого раствора (предпочтительно 0,1н. HCl) и воды, получают образец каждого низкого уровня pH при указанной концентрации (1 мг/мл). После того как этот образец поддерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, измеряют спектр циркулярного дихроизма (CD). Спектр CD измеряют в диапазоне длин волн от 205 нм до 260 нм, и для каждого образца каждого антитела, обработанного для изменения pH, измеряют процент содержания случайных структур, на основе спектрального аналитического способа CD Yang et al. (Methods in Enzymology, 130, 208-269 (1986)). pH, при котором процентное содержание содержания случайных структур в гуманизированном антителе по настоящему изобретению начинает увеличиваться, по меньшей мере, приблизительно на 0,3 меньше чем pH C2K1.

Авторы настоящего изобретения на основе гуманизированного антитела, описанного в WO 03/027151, провели обширные исследования с использованием комбинированных модификаций в гене каркасной области посредством сайт-специфического мутагенеза и т.п., и исследования стабильности с использованием описанных выше индексов от A) до D), и впервые успешно получили гуманизированное антитело против остеопонтина человека с улучшенной активностью (антигенсвязывающая активность, ингибирующая миграцию лейкоцитов активность и т.п.) и/или стабильностью (устойчивость к действию тепла, условиям с низким pH, денатурирующим средствам и т.п.) чем активность и стабильность стандартного антитела против остеопонтина человека, посредством представления частей каркаса антитела человека (FR от 1 до 4) в виде аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 (номера аминокислот от 1 до 30, от 36 до 49, от 67 до 98 и от 106 до 116, соответственно) и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3 (номера аминокислот от 1 до 23, от 40 до 54, от 62 до 93 и от 103 до 113, соответственно). Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению тестировали на описанные выше антигенсвязывающую активность, ингибирующую миграцию лейкоцита активность и различные индексы стабильности, и выявили, что оно обладает этими видами активности и в качестве своих свойств демонстрирует все из индексов от A) до D).

Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, можно легко получать синтезируя ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, способом, общеизвестным в данной области, соединяя их с геном константной области соответствующего класса антитела человека, предпочтительно геном константной области Igγ1 для тяжелой цепи и геном константной области Igκ для легкой цепи, для конструирования гена гуманизированного антитела, встраивая ген гуманизированного антитела в экспрессирующий вектор различными общеизвестными в данной области способами или способами, описанными в WO 02/081522 или WO 03/027151 и т.п., вводя экспрессирующий вектор в культивируемые клетки, культивируя культивируемые клетки и очищая антитела от полученной культуры. В качестве предпочтительного гена тяжелой цепи гуманизированного антитела по настоящему изобретению, получаемого соединением гена вариабельной области тяжелой цепи, представленного в SEQ ID NO:1, и гена константной области тяжелой цепи Igγ1 человека можно указать ген, содержащий последовательность оснований, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25, более предпочтительно ген, содержащий последовательность оснований, представленную в SEQ ID NO:24. В качестве предпочтительного гена легкой цепи гуманизированного антитела по настоящему изобретению, получаемого соединением гена вариабельной области легкой цепи, представленного в SEQ ID NO:3 и гена константной области легкой цепи Igκ человека, можно указать ген, содержащий последовательность оснований, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27, более предпочтительно ген, содержащий последовательность оснований, представленную в SEQ ID NO:26. В качестве гуманизированного антитела против остеопонтина по настоящему изобретению, кодируемого геном тяжелой цепи, содержащим последовательность оснований, представленную в SEQ ID NO:24, и геном легкой цепи, содержащим последовательность оснований, представленную в SEQ ID NO:26, можно указать R2K1v1.7, описанный ниже в примере.

Альтернативно, гуманизированное антитело против остеопонтина по настоящему изобретению, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, также можно синтезировать с помощью ДНК, которая кодирует описанную выше аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и гена константной области тяжелой цепи антитела человека, и ДНК, которая кодирует описанную выше аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, и гена константной области легкой цепи антитела человека, в качестве матриц, с использованием бесклеточной системы транскрибции/трансляции. Используемая бесклеточная система транскрибции/трансляции может представлять собой коммерчески доступную бесклеточную систему транскрибции/трансляции и ее можно получать по существу известным способом, в частности, способом, описанным в Pratt J.M. et al., "Transcription and Translation", Hames B.D. and Higgins S.J. edt., IRL Press, Oxford 179-209 (1984) и т.п., для экстракта Escherichia coli. В качестве коммерчески доступного клеточного лизата можно указать систему экстракта E. coli S30 (производимая Promega Company), систему быстрой трансляции RTS 500 Rapid Translation System (производимая Roche Company) и т.п., полученные из Escherichia coli, можно указать систему лизата ретикулоцитов кролика Rabbit Reticulocyte Lysate System (производимая Promega Company) и т.п., полученные из ретикулоцитов кролика, и можно указать PROTEIOSTM (производимая TOYOBO Company) и т.п., полученные из лизата зародыша пшеницы. Среди них подходящими для применения являются те, в которых используют лизат зародыша пшеницы. В качестве способа получения лизата зародыша пшеницы, например, можно использовать способ, описанный в Johnston F.B. et al., Nature, 179, 160-161 (1957) или Erickson A.H. et al., Meth. Enzymol., 96, 38-50 (1996) и т.п.

Настоящее изобретение также относится к фрагментам гуманизированных антител (фрагменты антител) против остеопонтина человека, таким как одноцепочечные фрагменты вариабельной области (scFv), Fab, Fab' и F (ab')₂, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и сохраняет виды активности.

Линкер для соединения вариабельной области (VH) тяжелой цепи и вариабельной области (VL) легкой цепи, который можно использовать для получения scFv, не является предметом ограничения при условии, что фрагмент антитела по настоящему изобретению может обладать описанными выше характеристиками; например, можно указать пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной посредством GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:14). На основании настоящего изобретения специалисты в данной области могут получать слитое антитело из гуманизированного антитела против остеопонтина человека или фрагмента антитела и другого пептида или белка, и получать модифицированное антитело со связанным с ним модифицирующим средством. Другой пептид или белок, используемый для слияния, не является предметом ограничения при условии, что он не уменьшает активность связывания антитела; например, можно указать сывороточный альбумин человека, различные пептиды-метки, искусственные пептиды спиральных мотивов, связывающие мальтозу белки, глутатион-S-трансферазу, различные токсины, другие пептиды или белки, способные к активации полимеризациии и т.п. Модифицирующее средство, используемое для модификации, не является предметом ограничения при условии, что оно не снижает связывающую активность антитела, например, можно указать полиэтиленгликоль, цепи сахаров, фосфолипиды, липосомы, низкомолекулярные соединения и т.п.

Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению, получаемое таким образом, или фрагмент антитела, сохраняющий активность благодаря антителу, слитое антитело, являющееся результатом слияния антитела или фрагмента антитела с пептидом или другим белком, или модифицированное антитело, состоящее из антитела или фрагмента антитела и связанного с ним модифицирующего средства, после дополнительной очистки в соответствии с требованием, можно получать в качестве фармацевтического препарата стандартным способом и можно использовать для лечения ревматоидного артрита, таких форм ревматизма, как ювенильный ревматоидный артрит и хронический ревматизм, псориатического артрита, псориаза и т.п., для супрессии злокачественной опухоли и хронического отторжения трансплантата после трансплантации органа и для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как остеоартрит, системное аутоиммунное заболевание, эритематоз, увеит, болезнь Бехчета, дерматомиозит, гломерулопролиферативный нефрит и саркоидоз.

Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать в качестве терапевтического средства при лечении ревматизма, терапевтического средства при аутоиммунном заболевании, терапевтического средства при остеоартрите или ревматоидном артрите, более предпочтительно в качестве терапевтического средства при ревматоидном артрите. В качестве примеров лекарственных форм для терапевтического средства при ревматизме и т.п., можно получать парентеральный препарат, такой как инъекция или капельная инфузия, и его предпочтительно вводить посредством внутривенного введения, подкожного введения и т.п. (то же относится к случаю терапевтического средства при аутоиммунном заболевании). При получении фармацевтического препарата можно использовать носители и добавки, которые соответствуют этим лекарственным формам в пределах фармацевтически приемлемого диапазона.

Количество гуманизированного антитела против остеопонтина человека, добавляемого при описанном выше получении препарата, изменяется в зависимости от тяжести симптомов и возраста пациента, используемой лекарственной формы препарата или титра связывания рекомбинантного ингибирующего антитела против OPN и т.п.; например, можно использовать приблизительно от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг.

Относительно терапевтического средства, полученного таким образом, активный ингредиент гуманизированного антитела против остеопонтина человека по настоящему изобретению сильно связывается с последовательностью RGD и последовательностью SVVYGLR OPN (SEQ ID NO:10), ингибируя связыванием между данным участком OPN и интегрином, приводя к супрессии обострения симптомов ревматизма и ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний.

Так как гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению связывается, конкретно со стороной OPN, а не со стороной интегрина, очень маловероятно, что он ингибирует какую-либо другую важную функцию интегрина, и предполагают избежать последствий побочных реакций.

Кроме того, гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению также можно использовать в качестве диагностического реагента при ревматоидном артрите. Как указано выше, доказано, что в суставах пациента с ревматоидным артритом обнаруживают высокие концентрации отщепляемого тромбином N-концевого фрагмента OPN. Таким образом, целесообразным может являться измерение в образце количества OPN или его N-концевого фрагмента с использованием этого гуманизированного антитела против остеопонтина человека в диагностировании ревматоидного артрита. В качестве способа можно использовать различные способы, применяемые для стандартных иммунохимических анализов, такие как способ радиоизотопного иммуноанализа (способ РИА), способ ELISA (E. Engvall et al., (1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439), способ с применением флуоресцентных антител, способ бляшек, способ пятен, способ агглютинации и способ по Аухтерлони ("Hybridoma Method and Monoclonal Antibodies", published by R&D Planning, pages 30-53, March 5, 1982).

Хотя среди описанных выше способов, с разных точек зрения, можно выбрать один подходящий, способ ELISA является предпочтительным в терминах чувствительности, удобства и т.п. В качестве примера более предпочтительного способа, например, гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению фиксируют на носителе, антитело, которое распознает другой участок на OPN, отличный от того, который распознает гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению, метят, в результате чего детектируют OPN или его N-концевой фрагмент, и это можно использовать в качестве диагностического реагента при ревматоидном артрите.

В качестве метящего вещества, используемого для мечения описанного выше антитела, можно указать белки/пептиды для образования химерного белка/пептида, такие как глутатион-S-трансфераза, ферменты, такие как пероксидаза хрена (далее в настоящем документе, обозначаемая как "HRP") и щелочная фосфатаза (далее в настоящем документе, обозначаемая как "AP"), флуоресцентные соединения, такие как флуоресцин изоцианат и родамин, радиоактивные вещества, такие как ³²P и ¹²⁵I, и модифицирующие средства, такие как хемилюминесцентные вещества.

Например, в отношении способа детекции изоформ OPN, детекцию, можно проводить с общеизвестным в данной области способом, таким как способ сэндвича или, более конкретно, посредством использования таким же способом, как способ детекции, описанный в WO 02/081522 (патентный документ 2) или WO 03/027151 (патентный документ 3).

Настоящее изобретение также относится к гену, который кодирует антитело по настоящему изобретению или его фрагмент, и содержащему его экспрессирующему вектору. Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению не является предметом ограничения при условии, что он способен экспрессировать ген, который кодирует антитело по настоящему изобретению или его фрагмент в разных клетках-хозяевах прокариотических клетках и/или эукариотических клетках, и продуцировать эти полипептиды. Например, можно указать плазмидные векторы, вирусные векторы (например, аденовирусный, ретровирусный) и т.п.

Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать ген, который кодирует антитело по настоящему изобретению или его фрагмент, и промотор, функционально связанный с геном. В качестве промотора для экспрессии полипептида по настоящему изобретению в бактерии, когда хозяином является бактерия из рода Escherichia, например, можно указать промотор Trp, промотор lac, промотор recA, промотор λPL, промотор lpp, промотор tac и т.п. В качестве промотора для экспрессии антитела по настоящему изобретению или его фрагмента в дрожжах, например, можно указать промотор PH05, промотор PGK, промотор GAP, и промотор ADH; когда хозяином является бактерия из рода Bacillus, можно указать промотор SL01, промотор SP02, промотор penP и т.п. Когда хозяином является эукариотическая клетка, такая как клетка млекопитающего, можно указать промотор, полученный из SV40, ретровирусный промотор, промотор белков теплового шока и т.п.

Когда в качестве клетки-хозяина используют бактерию, особенно Escherichia coli, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может дополнительно содержать инициирующий кодон, стоп-кодон, область терминации и единицу репликации. Когда в качестве хозяина используют дрожжи, клетку животного или клетку насекомого, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать инициирующий кодон и стоп-кодон. В этом случае может содержаться энхансерная последовательность, некодирующие области на 5'-конце и 3'-конце гена, который кодирует полипептид по настоящему изобретению, участки соединения при сплайсинге, участок полиаденилирования или единица репликации и т.п. В соответствии с предназначенным использованием может содержаться селективный маркер (например, тетрациклин, ампициллин, канамицин).

Настоящее изобретение также относится к трансформанту, с включенным геном по настоящему изобретению. Такой трансформант можно получать, например, трансформацией клетки-хозяина экспрессирующим вектором по настоящему изобретению. Клетка-хозяин, используемая для получения трансформанта, не является предметом ограничения при условии, что она может соответствовать указанному выше экспрессирующему вектору и являться трансформируемой; в качестве примеров можно указать различные клетки, такие как природные клетки или искусственно полученные линии клеток, общеупотребимые в области техники по настоящему изобретению (например, бактерии (бактерия из рода Escherichia, бактерии из рода Bacillus), дрожжи (рода Saccharomyces, рода Pichia и т.п.), клетки животных или клетки насекомых (например, Sf9) и т.п.). Трансформацию можно проводить известным стандартным способом.

Настоящее изобретение также относится к способу продукции антитела по настоящему изобретению или его фрагмента, включающему обеспечение экспрессии клеткой-хозяином гена по настоящему изобретению, т.е., используя определенный трансформант.

При получении антитела по настоящему изобретению или его фрагмента, трансформант можно культивировать в питательной среде. Питательная среда предпочтительно содержит источник углерода и источник неорганического азота или источник органического азота, необходимых для роста трансформанта. В качестве примеров источника углерода можно указать глюкозу, декстран, растворимый крахмал, сахарозу и т.п.; в качестве примеров источника неорганического азота или источника органического азота можно указать соли аммония, нитраты, аминокислоты, водный раствор экстракта пшеницы, пептон, казеин, мясной экстракт, соевый жмых, экстракт картофеля и т.п. При желании могут содержаться другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлорид кальция, дигидрофосфат натрия, хлорид магния), витамины, антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин, канамицин и т.п.) и т.п.).

Культивирование трансформанта можно проводить известным стандартным способом. Условия культивирования, например, температуру, pH среды и время культивирования выбирают соответствующим образом. Например, когда хозяином является клетка животного, в качестве среды можно использовать среду MEM, содержащую приблизительно от 5 до 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Science, vol.122, p.501, 1952), среду DMEM (Virology, vol.8, p.396, 1959), среду RPMI-1640 (J. Am. Med. Assoc., vol.199, p.519, 1967), среду 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., vol.73, p.1, 1950) и т.п. pH среды предпочтительно составляет приблизительно от 6 до 8, культивирование как правило можно проводить при температуре приблизительно от 30 до 40°C в течение приблизительно от 15 до 72 часов, и культуру можно подвергать аэрации или перемешивать по мере необходимости. Когда хозяином является клетка насекомого, например, можно указать среду Грейса, содержащую эмбриональную телячью сыворотку (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985), и т.п., и ее pH предпочтительно составляет приблизительно от 5 до 8. Культивирование как правило можно проводить при температуре приблизительно от 20 до 40°C в течение от 15 до 100 часов, и культуру можно подвергать аэрации или перемешивать по мере необходимости. Например, когда хозяином является бактерия, актиномицеты, дрожжи или нитевидный гриб, подходящей является жидкая среда, содержащая описанные выше источники питания. Предпочтительной является среда с pH от 5 до 8. Когда хозяином является E. coli, в качестве предпочтительной среды можно указать среду LB, среду M9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) и т.п. В этом случае, культивирование как правило можно проводить при температуре от 14 до 43°C в течение приблизительно от 3 до 24 часов, проводя аэрацию или перемешивание культуры по мере необходимости. Когда хозяином является бактерия из рода Bacillus, культивирование как правило можно проводить при температуре от 30 до 40°C в течение приблизительно от 16 до 96 часов, проводя аэрацию или перемешивание культуры по мере необходимости. Когда хозяином являются дрожжи, в качестве примеров среды можно указать минимальную среду Баркхолдера (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.77, p.4505, 1980), и pH желательно составляет от 5 до 8. Культивирование как правило можно проводить при температуре от 20 до 35°C в течение приблизительно от 14 до 144 часов, и культуру можно подвергать аэрации или встряхиванию по мере необходимости.

Антитело по настоящему изобретению или его фрагмент можно получать, предпочтительно выделяя и очищая из культуры трансформанта как описано выше. В качестве примеров способа выделения и очистки, можно указать способы на основе различий в растворимости, такие как высаливание и осаждение растворителем; способы на основе различий в молекулярной массе, такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация и электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; способы на основе различий в электрическом заряде, такие как ионнообменная хроматография и хроматография на гидроксиапатите; способы на основе специфического связывания, такие как аффинная хроматография; способы на основе различий в гидрофобности, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой; способы на основе различий в изоэлектрической точке, такие как изоэлектрическое фокусирование и т.п.

В целом, настоящее изобретение описано выше; ниже приведены отдельные примеры, указанные для облегчения понимания изобретения, которые, однако, приведены только в качестве иллюстрации и ни в коем случае не ограничивают объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Ниже приведены примеры. Если не указано иначе, способы, включающие использование набора и т.п., осуществляли в соответствии с назначенным протоколом.

1. Получение гуманизированного антитела 2K1

В настоящем изобретении получают два вида гуманизированного антитела против остеопонтина человека посредством гуманизации антитела 2K1, которое представляет собой антитело против остеопонтина человека, полученное из мыши, описанное в International Patent Publication Official Gazette WO 2003/027151 (далее в настоящем документе также обозначаемое как гуманизированное антитело 2K1 или антитело R2K1).

Так как каждое гуманизированное антитело 2K1 получали, как правило, в соответствии со способом, описанным в описанном выше официальном бюллетене, краткое описание представлено ниже.

Сначала с помощью ПЦР, используя синтетические олигонуклеотиды, получали ДНК, которая кодирует вариабельные области тяжелой цепи (VH) 2 типов гуманизированных антител против OPN, имеющую последовательности оснований, представленные на фиг.1 и фиг.2, и ДНК, которая кодирует вариабельные области легкой цепи (VL) 2 типов гуманизированных антител против OPN, имеющую последовательности оснований, представленные на фиг.3 и фиг.4. Ниже в описании, для того, чтобы их различить, VH гуманизированного антитела против OPN человека, представленные на фиг.1 и фиг.2 обозначают как R2K1-VH1.7 и R2K1-VH1.8, соответственно. Точно также, VL гуманизированного антитела против OPN человека, представленные на фиг.3 и фиг.4, обозначают как R2K1-VL1.7 и R2K1-VL1.8, соответственно.

Далее, каждую из описанных выше ДНК, которая кодирует VH гуманизированного антитела против OPN человека, встраивали в AG-γ1, который представляет собой экспрессирующий вектор, содержащий ген для константной области γ1 цепи иммуноглобулина человека, используя участок распознавания рестрикционной эндонуклеазы HindIII и участок распознавания BamHI, при помощи чего получали плазмиду, экспрессирующую тяжелую цепь, обладающую R2K1-VH1.7, и плазмиду, экспрессирующую тяжелую цепь, обладающую R2K1-VH1.8. Точно также, каждую из описанных выше ДНК, которая кодирует VL гуманизированного антитела против OPN человека встраивали в AG-κ, который представляет собой экспрессирующий вектор, содержащий ген для κ цепи константной области иммуноглобулина человека, при помощи чего получали плазмиду, экспрессирующую легкую цепь, обладающую R2K1-VL1.8, и плазмиду, экспрессирующую легкую цепь, обладающую R2K1-VL1.7. Эти экспрессирующие плазмиды вводили и амплифицировали в Escherichia coli и очищали с использованием коммерчески доступного набора для очистки плазмиды (QIAGEN Company).

В результате различные сочетания описанных выше очищенных экспрессирующих плазмид подвергали трансфекции в клетки CHO-DG44 способом с использованием фосфата кальция, и клетки подвергали селекции на среде MEM (Invitrogen Company), содержащей генетецин (Invitrogen Company) и диализированную фетальную телячью сыворотку (Invitrogen Company), таким образом, получали клетки, экспрессирующие два типа гуманизированного антитела 2K1. То есть экспрессировались антитело R2K1v1.8, которое представляет собой гуманизированное антитело 2K1, состоящее из тяжелой цепи, обладающей R2K1-VH1.8 и легкой цепи, обладающей R2K1-VL1.8, и антитело R2K1v1.7, которое представляет собой гуманизированное антитело 2K1, состоящее из тяжелой цепи, обладающей R2K1-VH1.7 и легкой цепи, обладающей R2K1-VL1.7.

Клетки, продуцирующие каждое антитело R2K1, полученные описанными выше способами, позволяли полностью расти в среде MEM, дополненной 10% диализированной фетальной телячьей сывороткой, высевали в роллерные флаконы (BD Biosciences Company) и культивировали в условиях 37°C и скорости вращения 1 об/мин. Несколько дней спустя, убеждались, что клетки прикрепились и растут на стенке сосуда, культуральную жидкость сливали, меняли среду на 500 мл свободной от сыворотки среды MEM, и культивировали клетки при описанных выше условиях. Приблизительно через 2 недели, когда многие клетки отделяли от стенки сосуда суспендированием, культивирование прекращали и фильтровали культуральный супернатант через фильтр 0,22 мкм и получали супернатант культуры, содержащий каждое антитело R2K1.

С этими супернатантами культуры, в качестве исходных материалов, и с использованием колонок с белком A (MILLIPORE Company) и анионообменных колонок (Amersham Company), получали несколько миллиграмм каждого из двух типов очищенного гуманизированного антитела, то есть антитела R2K1v1.8 и антитела R2K1v1.7.

В различных экспериментах, описанных ниже, использовали очищенные антитела, полученные как описано выше. Используемое химерное антитело 2K1 (далее в настоящем документе также обозначаемое как антитело C2K1) получали способом, описанным в указанном выше International Patent Publication Official Gazette WO 2003/027151.

2. Подтверждение способности связывания с пептидом остеопонтина человека способом ELISA

Связывающую активность каждого антитела R2K1 и антитела C2K1 с пептидом остеопонтина человека (CVDTYDGRGDSVVYGLRS: SEQ ID NO:13) сравнивали в соответствии со способом ELISA Kon et al. (Journal of Cellular Biology, 88:420-432 (2002)). Основной принцип представлен ниже.

Пептид, обладающий описанной выше последовательностью (далее в настоящем документе также обозначаемый как hOPN5 пептид) реагировал с BSA, включившего малеимидную группу, введенную с использованием Sulfo-EMCS (Dojindo Laboratories), для получения конъюгата hOPN5-BSA. Конъюгат hOPN5-BSA фиксировали при 200 нг/100 мкл/лунку на планшете для ELISA (Nunc Company) при 4°C в течение ночи и промывали планшет, после чего выполняли блокирование PBS, дополненным 1% BSA при 4°C в течение ночи. Образец антитела, разведенного в PBS, дополненным 1% BSA, добавляли в планшет по 100 мкл/лунку, и они реагировали при 37°C в течение 1 часа. Детекцию проводили используя меченое пероксидазой (HRP) антитело против IgG (H + L) человека (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм, используя считывающее устройство для микропланшетов (Molecular Devices Company).

В результате подтвердили, что способность антитела R2K1v1.7 и антитела R2K1v1.8 связываться с пептидом hOPN5 эквивалентна способности связывания антитела C2K1 (фиг.5).

3. Ингибирующая миграцию моноцитов периферической крови человека активность R2K1 антитела

Ингибирующую активность очищенного антитела в отношении активированной цитокинами миграции моноцитов периферической крови исследовали как описано ниже.

Сначала в 2 раза разводили гепаринизированную кровь, полученную от здорового человека, средой RPMI-1640. Разведенную кровь наслаивали на Фиккол-Пак (Pharmacia K.K.) и центрифугировали при 400×g и комнатной температуре в течение 30 минут. Белый слой, находящийся на границе раздела между плазмой и Фиккол-Пак, извлекали и использовали в качестве моноцитов. Моноциты, полученные таким образом, культивировали и активировали TNF-α человека (20 нг/мл) в течение ночи, и использовали в экспериментах по миграции.

Эксперименты по миграции проводили используя 48-луночную камеру для микрохемотаксиса (Neuro Probe Inc.). OPN человека расщепляли реакцией с бычьим тромбином (Sigma) при 37°C в течение 2 часов. Добавляли каждое из антитело R2K1 и антитело C2K1 в разных концентрациях и смеси позволяли оставаться при 37°C в течение 15 минут, после чего ее добавляли в нижнюю камеру (конечная концентрация OPN человека была 10 мкг/мл). В верхнюю камеру добавляли 50 мкл клеточной суспензии (2×10⁶ клеток/мл) и закрепляли на ней поликарбонатный фильтр (размер пор 5 мкм).

После культивирования при 37°C в присутствие 5% CO₂ в течение 2 часов, поликарбонатный фильтр удаляли, клетки на верхней поверхности фильтра удаляли, после чего красили клетки Diff-Quick (Baxter Company). При ×40 увеличении подсчитывали количество клеток на верхней поверхности фильтра и результаты выражали в качестве среднего значения количества клеток (клеток/мм³) ± SE для шести лунок (таблица 1). Исходя из этих результатов, оба антитела R2K1v1.7 и антитело R2K1v1.8 к отщепляемому тромбином остеопонтину человека, ингибировали миграцию активированных TNF-α моноцитов периферической крови человека, как и в случае с антителом C2K1.

Таблица 1
R2K1v1.7 & R2K1v1.8
	Среднее количество клеток	SEM
Среда	701,7	24,8
Thr-0PN	881,7	24,0
R2K1v1.7 50 мкг/мл	723,3	43,0
R2K1v1.8 50 мкг/мл	688,3	16,6
C2K1
	Среднее количество клеток	SEM
Среда	686,7	15,9
Thr-0PN	860,0	30,7
C2K1 50 мкг/мл	671,7	48,5

4. Оценка термостойкости способом ELISA

Каждое из антител C2K1 и двух типов антитела R2K1 разводили до 50 мкг/мл PBS и держали на водяной бане при 70°C в течение 2 часов. После этого каждый раствор доводили до комнатной температуры и изображали в виде графика соотношения коэффициента поглощения, полученного описанным выше способом ELISA, к коэффициенту поглощения контрольного образца в качестве остаточной активности. Остаточную активность вычисляли, используя величины коэффициента поглощения, лежащие в диапазоне от 0,2 до 2,0 с линеаризацией (то же самое применяют ниже). Как результат, выявили, что остаточная активность после описанной выше обработки была выше для антитела R2K1v1.7 и антитела R2K1v1.8, чем для антитела C2K1 (фиг.6). В частности, антитело R2K1v1.7 проявляло остаточную активность, превышающую 90%. Это служит доказательством того, что антитело R2K1v1.7 и антитело R2K1v1.8 обладают улучшенной термостойкостью по сравнению с антителом C2K1.

5. Оценка устойчивости к низкому уровню pH способом ELISA

Каждое из очищенных полученных антитело C2K1 и двух типов антитела R2K1 разводили с помощью PBS до 50 мкг/мл. Каждый раствор с помощью 1н. HCl, используя pH-метр (HORIBA Company), доводили до pH 5 и поддерживали при 25°C в течение 2 часов. После этого, с помощью 1M Tris-HCl (pH 9,5), доводили pH раствора до 7 и изображали в виде графика отношения коэффициента поглощения, полученного описанным выше способом ELISA, к коэффициенту поглощения контрольного образца в качестве остаточной активности. В результате, было выявлено, что после описанной выше обработки, остаточная активность была значительно выше для антитела R2K1v1.7, чем для антитела C2K1 и антитела R2K1v1.8 (фиг.7). Это служит доказательством того, что антитело R2K1v1.7 обладают улучшенной устойчивостью к условиям с низким уровням pH, по сравнению с антителом R2K1v1.8 и антителом C2K1.

6. Оценка устойчивости к гуанидин гидрохлориду посредством флуоресцентной спектрометрии

Каждое из антитело C2K1 и двух типов антитела R2K1, используя 20 мМ натрий-фосфатный буфер + 120 мМ NaCl (pH 7), содержащий разные концентрации гуанидин гидрохлорида (для контроля гуанидин гидрохлорид не добавляли), доводили до 50 мкг/мл и позволяли оставаться при 10°C в течение ночи, после чего измеряли спектр флуоресценции для каждого образца. Измерение спектра флуоресценции проводили с использованием спектрофотометра FP-6500 (JASCO Company). Используя клетку, обладающую длиной светового пути 3 мм, сканировали флуоресценцию, испускаемую триптофаном, возбуждаемую светом 280 нм, в диапазоне длин волн от 320 нм до 370 нм. Среди антител сравнивали взаимосвязь между концентрацией гуанидин гидрохлорида и пиковой длиной волны. В результате, наблюдали сдвиг пиковой длины волны вследствие потери пространственной структуры белка с момента времени, где концентрация гуанидин гидрохлорида только что превысила 1 M для C2K1 или 2 M для R2K1v1.8, тогда как пиковая длина волны сдвинулась в сторону 3,8 M для R2K1v1.7 (фиг.8). Это служит доказательством того, что антитело R2K1v1.7 обладает улучшенной устойчивостью к гуанидин гидрохлориду по сравнению с антителом R2K1v1.8 и антителом C2K1.

7. Оценка устойчивости к низкому уровню pH посредством CD

Каждое из антитело C2K1 и антитело R2K1v1.7 с помощью 20 мМ цитратного буфера + 120 мМ NaCl (pH 6) доводили до 2 мг/мл. Туда добавляли 0,1 н. HCl и дистиллированную воду для приготовления образцов с разным уровнем pH, имеющих концентрацию антитела 1 мг/мл; после обработки измеряли спектр CD каждого образца при комнатной температуре в течение 1 часа.

Измерения CD (циркулярный дихроизм) выполняли с использованием cпектрополяриметра J-820 (JASCO Company). Используя клетку, обладающую длиной светового пути 0,1 мм, измеряли спектр CD в диапазоне длин волн от 205 нм до 260 нм. При спектральном анализе использовали программное обеспечение для моделирования вторичной структуры белка JWSSE-480 (JASCO Company), которое основано на спектральном аналитическом способе CD Yang et al. (Methods in Enzymology, 130, 208-269 (1986)). Среди антител сравнивали связь между соотношением содержания случайных структур, рассчитанных этим способом и посредством обработки pH. В результате содержание случайных структур увеличивалось от pH 3 для C2K1 антитела, где не наблюдали увеличения содержания случайных структур, до pH 2,7 для R2K1v1.7 (фиг.9). Это подтверждает, что антитело R2K1v1.7 обладает устойчивостью к уровню pH на 0,3 меньше по сравнению с устойчивостью к уровню pH антитела C2K1.

8. Оценка термостойкости с использованием дифференциального сканирующего калориметра

Каждое из антитело C2K1 и антитело R2K1v1.7 растворяли в 20 мМ цитратном буфере + 120 мМ NaCl (pH 6,0) до концентрации 1 мг/мл и исследовали его термостойкость, используя MicroCal Company ультрачувствительный дифференциальный сканирующий калориметр (VP capillary DSC platform). Результаты представлены на фиг.10. Средняя температура перехода (Tm), которая показывает температуру денатурации более сложной структуры, составляла 76,0°C для антитела C2K1 и 82,8°C для антитела R2K1v1.7; подтвердили увеличение приблизительно на 6°C. Это служит доказательством того, что антитело R2K1v1.7 обладает исключительно улучшенной термостойкостью.

9. Ингибирующее клеточную адгезию действие R2K1v1.7 на OPN

Для сравнения фармакологических эффектов R2K1v1.7 по настоящему изобретению этой заявки и общеизвестного гуманизированного антитела против OPN (см. WO 03/027151; далее в настоящем документе обозначаемый как R2K1v0), исследовали ингибирующие клеточную адгезию эффекты этих двух антител к OPN человека.

1. Культивирование и пассирование клеток

Клетки Jurkat E6.1 купили у Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. и пассировали и культивировали с использованием RPMI-1640 (10% FCS, пенициллин-стрептомицин).

2. Приготовление реактивов

Буфер для адгезии (среда L-15, 1% BSA, 50 мМ HEPES, pH 7,4)

раствор PMA (40 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA) [SIGMA] в буфере для адгезии)

окрашивающий раствор CV (0,5% кристаллического фиолетового, 1% формамид, 20% метанол)

раствор GST (5 мкг/мл глутатион-S-трансферазы (GST) [SIGMA] в PBS (-))

Раствор IgG₁ человека (400 мкг/мл в PBS (-)) [CALBIOCHEM]

3. Получение отщепляемого тромбином N-концевого остеопонтина (OPN) человека слитый с GST отщепляемый тромбином N-концевой остеопонтин человека (GST- N-OPN человека, 1,6 мг/мл) получали, как описано в WO 02/081522, и использовали в экспериментах после разведения в PBS (-) до 5 мкг/мл.

4. Получение тестируемых лекарственных средств

Каждое из R2K1v1.7 (18,6 мг/мл) и R2K1v0 (4,39 мг/мл) разводили в PBS (-) до 4, 12, 40, 120, и 400 (мкг/мл); для получения общего белка в концентрации 400 мкг/мл во все эти разведенные растворы добавляли IgG₁ человека.

5. Группирование

Группа только с маркером (GST)

Контрольная группа

Группа тестируемого лекарственного средства R2K1v1.7 (1, 3, 10, 30, 100 мкг/мл)

R2K1v0 (1, 3, 10, 30, 100 мкг/мл)

6. Эксперименты с клеточной адгезией

Во все лунки 96-луночного микропланшета, кроме лунок только с маркером, добавляли 25 мкл раствора GST-N-OPN человека или добавляли 25 мкл раствора GST к группе только с маркером, и планшет инкубировали при 37°C в течение 1 часа, после чего планшет дважды промывали PBS (-). Добавляли 50 мкл раствор PMA и планшет инкубировали при 37°C в течение 30 минут, после чего добавляли 25 мкл раствора тестируемого лекарственного средства (группа тестируемого лекарственного средства) или раствора IgG₁ человека (группа только с маркером и контрольная группа). Клетки Jurkat E6.1 суспендировали в буфере для адгезии для получения плотности клеток 2×10⁶ клеток/мл и во все лунки добавляли 25 мкл. Суспензию центрифугировали при 15×g в течение 1 минуты для осаждения клеток на дно планшета, после чего планшет инкубировали при 37°C в течение 1 часа. После окончания реакции планшет переворачивали и центрифугировали при 47×g в течение 2 минут и удаляли супернатант (не прикрепившиеся клетки). Для подсчета количества не прикрепившихся клеток, добавляли 25 мкл окрашивающего раствора CV, позволяли планшету оставаться при комнатной температуре в течение 10 минут для окрашивания и фиксации клеток, после чего планшет три раза промывали чистой водой, во все лунки добавляли 25 мкл 1% раствора Triton-X100 и после солюбилизации клеток оценивали результат, коэффициент поглощения (длину волны измеряли при 595 нм) измеряли, используя считывающее устройство для микропланшета (SPECTRAmax250, Molecular Devices).

7. Анализ

В экспериментах задействованы 5 лунок на группу. Вычисляли среднее значение коэффициента поглощения и степень супрессии для каждой группы и вычисляли IC₅₀ величины (концентрации тестируемого лекарственного средства для 50% степени супрессии). Степень супрессии для свободной группы определяли как 100%, а для контрольной группы определяли как 0%. Величины IC₅₀ вычисляли построением графика логарифмических концентраций тестируемого лекарственного средства по оси X и степени супрессии по оси Y, и способом наименьших квадратов приводили данные к уравнению линейной регрессии. Вычисления величин IC₅₀ с применением данных, полученных при тестировании концентраций лекарственного средства, показали линейную зависимость доза-эффект. Исходя из результатов, представленных на фиг.11, стало понятно, что ингибирующий клеточную адгезию эффект общеизвестного гуманизированного антитела против OPN человека является чрезвычайно низким, тогда как R2K1v1.7 обладает очень высоким ингибирующим клеточную адгезию эффектом (IC₅₀ величины: 6,4).

10. Эффекты R2K1v1.7 на коллаген-индуцированный артрит у яванских макак

Самкам яванских макак за 36 суток до лечения проводили иммунизацию в спины и хвосты бычьим коллагеном типа II (коллаген Gijyutsu Kenshukai) в эмульсии в полном адъюванте Фрейнда (Becton Dickinson and Company), и вводили бустер-дозу за 15 суток перед введением препарата. Животных случайным образом разбивали на три обработанные лекарственным средством группы (n=10) на основании процентных изменений в массе тела и продолговатых областях проксимальных межфаланговых суставов по сравнению с уровнями перед иммунизацией. R2K1v1.7 или растворитель, в качестве контроля, вводили в дозе 25 мг/кг или 50 мг/кг внутривенным инъецированием один раз в неделю, в целом восемь раз. Первые сутки введения препарата определили как сутки 0. В сутки 0, 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48 и 55 в течение периода введения, в качестве признака опухания сустава, наблюдали за продолговатой областью проксимального межфалангового сустава. Большую и малую оси сочленения проксимальных межфаланговых суставов передней и задней ног измеряли используя штангенциркули, измеряли продолговатые области, и среднюю величину продолговатых областей 16 пальцев использовали в качестве величины продолговатой области проксимального межфалангового сустава. Процентные изменения в продолговатой области проксимального межфалангового сустава вычисляли принимая величину пред введением препарата как 100. В сутки 0 и в сутки 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48 и 55 (6 суток после введения препарата), отбирали плазму и измеряли R2K1v1.7 и антитело против R2K1v1.7. Эти измеряемые в плазме концентрации R2K1v1.7 соотносятся с минимальным уровнем. Анализ данных выполняли после удаления данных об анти-R2K1v1.7 антитело-позитивных животных и животных, которые умерли в течение периода исследования.

У 1 животного в группе дозирования R2K1v1.7 25 мг/кг и 4 животных в группе дозирования R2K1v1.7 50 мг/кг, вырабатывалось антитело против R2K1v1.7. Двое животных в контрольной группе с растворителем, 2 животных в группе дозирования R2K1v1.7 25 мг/кг и 1 животное в группе дозирования R2K1v1.7 50 мг/кг умерли после введения препарата. Случаи гибели отнесли к общему истощению вследствие тяжелого воспаления. Лечение 50 мг/кг R2K1v1.7 значительно снижало опухание стопы, как измеряют посредством процентного изменения в продолговатой области проксимального межфалангового сустава по сравнению с контрольной группой с растворителем, от 27 суток до 55 суток (фиг.12). R2K1v1.7 в дозе 25 мг/кг не оказывал значимого влияния на изменение в продолговатой области проксимального межфалангового сустава. Минимальные концентрации R2K1v1.7 в плазме в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг составляли от 38,41 до 76,13 мкг/мл и от 73,91 до 125,3 мкг/мл, соответственно. У последовательности SVVYGLR OPN человека, в отличие от соответствующей последовательности OPN обезьяны (SVAYGLR) (SEQ ID NO:11), аффинность связывания R2K1v1.7 с этим пептидом OPN человека более чем в 100 раз выше, чем аффинность связывания с соответствующим пептидом OPN обезьяны. Учитывая эти данные, эффективная концентрация R2K1v1.7 в плазме при лечении артрита предположительно не более чем 100 мкг/мл.

11. Получение scFv R2K1v1.7

Посредством ПЦР с описанной выше плазмидой, экспрессирующей тяжелую цепь, обладающей R2K1-VH1.7, и плазмидой, экспрессирующей легкую цепь, обладающей R2K1-VL1.7 в качестве матрицы, получали фрагмент ДНК, который кодирует одноцепочечный фрагмент вариабельной области (scFv), имеющий структуру VH1.7-линкер-VL1.7 (линкером была последовательность оснований, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную посредством GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:14)). Встроенной в конец этого фрагмента ДНК является последовательность, распознаваемая рестрикционными эндонуклеазами SfiI и NotI. Этот фрагмент ДНК расщепляли с помощью рестрикционных эндонуклеаз SfiI и NotI и встраивали в участок SfiI и участок NotI вектора pCANTAB5E (Marks, J.D., et. al., J. Mol. Biol., vol.222, p581-97, 1991), также предварительно расщепленного с помощью SfiI и NotI, в результате чего получали экпрессирующую R2K1-VH1.7 scFv плазмиду. В эту экспрессирующую плазмиду последовательность оснований, которая кодирует E-Tag, вводят ниже кодирующей области scFv. Эту плазмиду общепринятым способом вводят в штамм HB2151 Escherichia coli и высевают на планшет с агаром SOBAG (планшет SOB, содержащий 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина) для получения клона трансформантов. Из полученного клона выделяли плазмидную ДНК; последовательность кодирующей области scFv подтверждали анализом последовательности оснований ДНК с использованием плазмидной ДНК в качестве матрицы. При анализе последовательности оснований ДНК использовали набор DTCS-Quick Start и систему анализа ДНК CEQ2000XL (оба от Beckman Coulter, K.K.). Полученная последовательность оснований представлена в SEQ ID NO:9.

После того, как клон Escherichia coli, чья последовательность оснований была подтверждена, культивировали с использованием среды 2xYT, содержащей 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина, часть его суспендировали в среде 2xYT, дополненной 1 мМ IPTG и 100 мкг/мл ампициллина, и в дальнейшем культивировали в течение ночи для индукции экспрессии scFv. После культивирования клетки выделяли центрифугированием, суспендировали в PBS, содержащем 1 мМ ЭДТА, и позволяли оставаться на льду в течение 30 минут. Далее суспензию центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 минут, а супернатант собирали и фильтровали через фильтр 0,45 мкм, при помощи чего получали фракцию периплазмы, содержащую scFv. scFv R2K1v1.7 (далее в настоящем документе обозначаемый как R2K1v1.7-scFv) очищали от этой фракции периплазмы аффинной хроматографией, используя антитело против E-Tag.

Полученное таким образом R2K1v1.7-scFv, подвергали гельфильтрационной хроматографии; исходя из паттерна разделения, представленного на фиг.13, подтвердили, что практически все являлись мономерами.

12. Подтверждение способности связывания R2K1v1.7-scFv с пептидом остеопонтина человека

Связывающую активность очищенного R2K1v1.7-scFv с пептидом hOPN5 измеряли способом ELISA. В целом способ представлял собой то же, что описано выше; при этом измерении в качестве меченого антитела использовали HRP-меченое антитело против E-Tag. Результаты представлены на фиг.14. Подтвердили, что очищенное R2K1v1.7-scFv не связывалось с отрицательным контролем BSA, но связывалось, в частности, с пептидом hOPN5.

13. Получение модифицированного полиэтиленгликолем фрагмента антитела

После того, как антитело R2K1v1.7 пепсинизировали стандартным способом, получали очищенный F(ab')₂, используя колонку HP с белком G (оба от Amersham Biosciences K.K.) и высокоразрешающую колонку Hi prep 16/60 с сефакрилом S-200 (Amersham Biosciences K.K.). Далее очищенный F(ab')₂ восстанавливали 0,1 M DTT для активации тиольной группы, после чего для удаления DTT проводили гель-фильтрацию, используя колонку с сефадексом G-25 (Amersham Biosciences K.K.). Fab', полученный таким образом, смешивали с малеимидированным полиэтиленгликолем SUNBRIGHT ME-120MA (NOF Corporation) в молярном отношении 1:10 и позволяли оставаться при 4°C в течение ночи для индукции реакции связывания. После добавления иодацетамида (Nacalai Tesque) для остановки реакции связывания, получали модифицированный полиэтиленгликолем F(ab')₂ (далее в настоящем документе также обозначаемый как F(ab')₂-ПЭГ (F(ab')₂-PEG)) посредством гель-фильтрации, используя высокоразрешающую колонку Hi prep 16/60 с сефакрилом S-200. Результаты SDS-PAGE представлены на фиг.15. По сравнению с немодифицированным F(ab')₂, подвергнутым электрофорезу для стандартного контроля, подтвердили увеличение молекулярной массы посредством модификации полиэтиленгликолем.

14. Подтверждение связывающей активности F(ab') ₂ -ПЭГ с пептидом остеопонтина

Связывающую активность очищенного F(ab')₂-ПЭГ R2K1v1.7 с пептидом hOPN5 подтвердили, используя способ поверхностного плазмонного резонанса. Биотинизированный пептид hOPN5 фиксировали на сенсорном чипе SA (BIAcore Company), и его связывающую активность подтвердили, используя F(ab')₂-ПЭГ, предварительно разведенный HBS-EP буфером(BIAcore Company) до 5 мкг/мл; результаты представлены на фиг.16. Исходя из возрастания сигнала, подтвердили, что этот F(ab')₂-ПЭГ обладает той же активностью связывания с пептидом hOPN5, что и активность связывания R2K1v1.7 с пептидом hOPN5.

Промышленное применение

Так как гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению обладает очень высокой активностью (антигенсвязывающая активность, ингибирующая миграцию лейкоцитов активность и т.п.) и/или стабильностью (устойчивость к действию тепла, условиям с низким pH, денатурирующим средствам и т.п.), оно является применимым в качестве более эффективного лекарственного средства, чем стандартные антитела против остеопонтина человека для профилактики или лечения различных воспалительных заболеваний, включая аутоиммунное заболевание, ревматизм, ревматоидный артрит и остеоартрит.

Хотя настоящее изобретение описано посредством предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области очевидно, что предпочтительные варианты осуществления можно модифицировать. Настоящее изобретение рассчитано на то, что настоящее изобретение можно осуществлять способами, отличными от способов, подробно описанными в настоящем описании. Таким образом, настоящее изобретение относится ко всем модификациям, включенным в рамки и не меняющим сущность заявленного в формуле изобретения.

Эта заявка основана на патентной заявке No. 2006-152892, зарегистрированной в Японии, и, тем самым, ее содержание полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки. Кроме того, содержание любых приведенных в настоящем описании публикациях, включая патенты и патентные заявки, таким образом, полностью включено в качестве ссылки в полном объеме.

1. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID N0:1, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3.

2. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по п.1, где константная область тяжелой цепи антитела представляет собой Igγ1 человека.

3. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по п.1, где константная область легкой цепи антитела представляет собой Igκ человека.

4. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по п.1, где константная область тяжелой цепи антитела представляет собой Igγ1 человека, а константная область легкой цепи антитела представляет собой Igκ человека.

5. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:25 и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27.

6. Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела против остеопонтина человека по п.1.

7. Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела против остеопонтина человека по п.1.

8. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, описанный в п.6 и/или 7.

9. Клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор по п.8.

10. Способ получения гуманизированного антитела против остеопонтина человека, включающий стадию культивирования клетки-хозяина по п.9, и, таким образом, экспрессии клеткой гуманизированного антитела против остеопонтина человека.

11. Лекарственное средство для лечения аутоиммунного заболевания, ревматизма, ревматоидного артрита или остеоартрита, содержащее гуманизированное антитело против остеопонтина человека по любому из пп.1-5.

12. Способ профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, ревматизма, ревматоидного артрита или остеоартрита, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества гуманизированного антитела против остеопонтина человека по любому из пп.1-5.

13. Применение гуманизированного антитела против остеопонтина человека по любому из пп.1-5 для получения фармацевтического средства для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, ревматизма, ревматоидного артрита или остеоартрита.